芫根在抗睡眠剥夺损伤中的应用的制作方法

1.本发明属于特殊医疗食品技术领域，具体涉及芫根在抗睡眠剥夺损伤中的应用。


背景技术：

2.睡眠对大脑的正常运作至关重要。但是睡眠剥夺(sd)在现代社会很常见。睡眠不足与 许多睡眠障碍、高工作量、夜班工作和时差有关。美国疾病控制和预防中心(cdc)宣布睡眠 不足为“公共卫生问题”，并被《国际疾病分类》(icd)#307.49-4认定为睡眠不足综合征。 睡眠剥夺可造成机体生理、心理功能的损伤，例如会引起认知功能和记忆障碍等应激损伤。 对中枢神经系统的毒性作用包括思维紊乱、反应迟钝、注意力分散、定向障碍、学习记忆受 损等，睡眠剥夺24h使人的认知能力下降30％-40％；持续48h，认知能力下降达60％-70％。 炎症反应升高、中枢和外周神经系统紊乱被认为是造成损伤的主要因素。睡眠剥夺与身心健 康受损、肥胖、心血管和各种疾病高度相关。此外，sd还会导致警惕性下降，在驾驶和其他 安全敏感活动中会增加风险，导致灾难性的事故。然而，日益加快的生活节律、工作压力以 及特殊职业导致睡眠剥夺在现代社会中是不可避免的。对于那些睡眠不足不可避免的人，在 医疗监督下通常使用兴奋剂或激动剂，如：安非他明、哌醋甲酯、匹莫林和莫达非尼等。然 而，长期服用这些药物存在潜在的风险，如副作用、成瘾、滥用和长期依赖性。虽然发现了 许多针对sd的中药提取物，但由于种种原因(如毒副作用等问题)，目前还没有针对sd损 伤的公认药物。
3.芫根(brassica rapa l.)，生长在海拔3800米以上的高原高寒地区，著名药典《四部医典》 和《晶珠本草》中记载，芫根具有退热解毒、缓解高原缺氧的作用。作为一种药食两用植物， 芫根具有多种活性功能成分，包括活性多糖、硫代葡萄糖苷、异硫氰酸酯、黄酮类化合物、 挥发物等，并具有滋补、抗缺氧、清热解毒等药理作用。但是，芫根提取物具有抗睡眠剥夺 损伤的作用还未被发现。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供芫根在抗睡眠剥夺损伤中的应用。具 体技术方案如下：
5.本发明提供芫根在制备抗睡眠剥夺损伤产品中的应用。
6.本发明的上述技术方案中，所述产品为药品或食品。
7.本发明提供一种抗睡眠剥夺损伤的组合物，包括芫根水提取物。
8.本发明的上述技术方案中，所述芫根水提取物的制备方法为：按照芫根与水的质量体积 比为1:(5～15)，加热至95～100℃回流提取1～3h，膜过滤，取上清液；药渣按照上述过程 重复提取一次，得到上清液；之后将两次上清液合并，减压浓缩至固形物含量为0.1～0.30g/ml， 即得芫根水提取物；
9.优选地，所述芫根与沸水的质量体积比为1:8；
10.优选地，加热至100℃回流提取2.5h；
11.优选地，减压浓缩至固形物含量为0.15g/ml。
12.本发明的上述技术方案中，所述抗睡眠剥夺损伤的组合物还包括枸杞水提取物，和/或人 参水提取物，和/或党参水提取物，和/或当归水提取物，和/或陈皮水提取物；
13.优选地，所述枸杞、人参、党参、当归或陈皮以水提取物的制备方法为：按照枸杞、人 参、党参、当归或陈皮与水的质量体积比为1:(5～15)，加热至95～100℃回流提取1～3h， 膜过滤，取上清液；药渣按照上述过程重复提取一次，得到上清液；之后将两次上清液合并， 减压浓缩至固形物含量为0.1～0.30g/ml，即得。
14.本发明的上述技术方案中，所述组合物包括如下重量份的组分：
15.30～70份芫根水提取物，30～50份枸杞水提取物；或，
16.30～70份芫根水提取物，30～50份人参水提取物；或，
17.30～70份芫根水提取物，30～50份党参水提取物；或，
18.30～70份芫根水提取物，30～50份当归水提取物；或，
19.30～70份芫根水提取物，30～50份陈皮水提取物；或，
20.30～50份芫根水提取物，10～20份枸杞水提取物，10～20份人参水提取物，5～15份党参 水提取物，5～15份当归水提取物，5～10份陈皮水提取物。
21.本发明提供一种抗睡眠剥夺损伤的保健食品，包括上述的组合物。
22.本发明提供一种抗睡眠剥夺损伤的膳食营养补充剂，包括上述的组合物。
23.本发明提供一种抗睡眠剥夺损伤的药物组合物，包括上述的组合物。
24.进一步地，还包括药学上可接受的辅料。
25.本发明的有益效果为：
26.1、本发明首次发现芫根具有治疗或预防睡眠剥夺损伤的功能，芫根对预防和缓解睡眠剥 夺的损伤具有良好的改善效果，同时能够很好改善睡眠剥夺诱导的认知功能和学习记忆障碍， 对海马组织能具有良好的保护作用，为开发新型的抗sd损伤的膳食营养补充剂、具有保健 效果的功能食品和药物组合物提供支持。
27.2、本发明芫根联合枸杞、人参、党参、当归、陈皮的组合物对睡眠剥夺带来的应激损伤 具有协同作用，能够发挥更大的抗睡眠剥夺应激损伤的效果。
附图说明
28.图1为芫根水提取物对sd小鼠在y迷宫中记忆和探索能力的影响。
29.图2为芫根水提取物对sd小鼠在morris水迷宫中的空间学习和记忆的影响。
30.图3为芫根水提取物对sd小鼠血清中炎症水平的影响。
31.图4为芫根水提取物对sd小鼠海马ros含量和inos活性的影响。
32.图5为芫根水提取物对sd小鼠下丘脑神经活性色氨酸代谢物的影响。
33.图6为小鼠海马ca1区神经元he染色结果。
34.上述附图中，与空白组相比，无标记表示p＞0.1，
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具体实施方式
35.为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于 解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条 件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
36.实施例1：芫根水提取物的制备
37.本发明所采用芫根种植于青藏高原东部的玉树，平均海拔4493.4m。
38.将芫根切成3-5mm的薄片，阴凉处风干2周。按照芫根与水的质量体积比为1:8，加热 至100℃回流提取2.5h，膜过滤，取上清液；药渣按照上述过程重复提取一次，得到上清液； 之后将两次上清液合并，减压浓缩至固形物含量为0.15g/ml，即得芫根水提取物，-80℃保 存，以备进一步实验。
39.实验例1：芫根水提取物抗睡眠剥夺损伤的验证
40.1.小鼠分组及其饲养条件
41.实验在c57bl/6j小鼠(22-25g)适应实验环境一周后进行。将动物随机分为6组(n＝10)： 空白组(常规睡眠)、模型组(sd)、芫根低剂量组(1.0g/kg.bw.)、芫根中剂量组(2.0g/kg.bw.)、 芫根高剂量组(3.0g/kg.bw.)、阳性组(咖啡因10mg/kg.bw.)。给药剂量组根据《四川省藏 药标准(2020)》(四川省食品药品监督管理局)中人体推荐剂量(6g/d)折算小鼠的给药量：芫 根的低剂量(相当于人体10倍摄入量)。
42.所有实验动物程序均经江南大学实验动物中心伦理委员会批准(申请标号为：jn. no.20201230c0600430)。饲养条件：动物实验设施持续保持屏障环境标准。主要环境指标的 控制范围：温度23.1
±
0.9℃。相对湿度52.8
±
3.0％。换气次数为10-20次/小时，光照明：暗 ＝12h：12h。动物饲养于标准盒内。小鼠每盒5只。由获得资格认证的人员进行饲养管理。每 周2次更换消毒后的垫料和笼具，保持盒内环境清洁干燥；每日添加饲料和饮水，保持动物 自由饮食活动。
43.2.小鼠睡眠剥夺模型的建立
44.将小鼠置于小鼠自动睡眠剥夺系统(yan-2390，上海宇研科学仪器有限公司)中，适应环 境4小时。在每个塑料笼(高11cm，直径30cm)的中央预固定一根不锈钢棒。然后，通过随机 旋转的定时运动来剥夺48小时的睡眠，以防止小鼠进入睡眠状态。将来自同一笼盒的小鼠(n ＝5)置于一台睡眠剥夺仪中，自由获得食物和水。然后，对各组小鼠进行行为学测试，最后 解剖，采集血液和组织。
45.3.行为测试
46.3.1y-maze测试
47.各组小鼠均置于y-maze中(120
°
，长55cm
×
宽16cm
×
高20cm)。小鼠在y型迷宫 (y-maze)中自由探索5min，观察每只小鼠的移动距离、平均速度和活跃度(在迷宫中的活 跃时间/总时间)。记录手臂和三合会的数目，以计算交替的百分比。只有所有四肢都在手臂内 的条目才被计数。手臂交替被定义为每一个不同的手臂中有三个连续的条目，交替被计算为 总交替数除以三个一组(总条目-2)，以百分数表示。当交替率较高时，动物的空间记忆功能趋 于良好。
48.3.2水迷宫测试
49.morris水迷宫是一个圆形水池，直径120cm、高50cm，水温25
±
1℃，以水池地圆 心为中心可以分为四个象限，随机划分为东北、西北、东南和西南四个象限(ne、nw、sw、 se)。向水池中加入适量的奶粉将水面染成乳白色，将平台放在水下1cm的位置。将小鼠在 任意的某一个象限中心轻轻托着放下水。小鼠的游泳行为用摄像机捕捉，摄像头固定在水迷 宫正上方、同步抓取分析小鼠的运动轨迹、记录小鼠寻找平台的潜伏期等。视频用ethvision 11.5进行分析。每只小鼠连续5天每天完成2次试验。潜伏期(s)被定义为小鼠在目标象限找 到隐藏平台所花费的时间(s)。第6天，即完成48h睡眠剥夺后，移除平台，在这种情况下， 监测小鼠在60秒内在目标象限的时间(s)和经过平台的次数(次)。
50.4.芫根的抗sd诱导的中枢疲劳作用
51.行为学测试后，将小鼠处死。取血，室温下3500rpm离心10min分离血清。白细胞介 素-6(il-6)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、c反应蛋白(crp)、5-羟基色氨酸(5-ht)、5-羟基吲 哚-3-乙酸(5-hiaa)、活性氧(ros)、诱导型一氧化氮合酶(inos)按elisa试剂盒说明书检测。
52.5.实验结果
53.5.1y-maze测试结果
54.睡眠剥夺会导致一系列神经精神疾病，如焦虑样行为和认知缺陷。y迷宫自发交替试验 依赖于啮齿动物对新环境探索的天性。本实验采用y迷宫实验检测不同剂量的芫根水提取物 对sd小鼠的工作记忆损伤是否有逆转作用。
55.不同剂量的芫根(1.0g/kg.bw.，2.0g/kg.bw.，3.0g/kg.bw.)或咖啡因(10mg/kg.bw.，纯度 ≥99.8％)预给药小鼠4周，然后剥夺睡眠48h，睡眠剥夺期间每日给药1次。48h后，进 行y迷宫试验。记录移动距离(a)、平均速度(b)、活动时间比例(c)和交替百分比(d)。
56.结果如图1所示。结果表明：sd小鼠在y迷宫实验中的移动距离、平均速度、活跃时 间和交替率(完成完整通路次数/总次数)明显降低，而芫根则显著逆转该不良影响。中高剂 量的芫根水提取物可以改善sd小鼠的平均速度(图1a)和移动距离(图1b)，y迷宫中活跃时 间比例(图1c)和交替率(图1d)显著增加。这些结果表明，中等剂量的芫根(2.0g/kg.bw.)具 有显著的改善sd所致的工作记忆损伤效果，且优于阳性组(咖啡因)。
57.5.2水迷宫测试结果
58.morris水迷宫可以客观地测量动物空间记忆、工作记忆和空间辨别能力的变化。本实验 采用morris水迷宫实验验证不同剂量的芫根水提取物对sd小鼠空间学习记忆功能的保护作 用。
59.用不同剂量的芫根水提取物(1.0g/kg.bw.，2.0g/kg.bw.，3.0g/kg.bw.)或咖啡因(10 mg/kg.bw.，纯度≥99.8％)干预小鼠28d后，然后剥夺睡眠48h，睡眠剥夺期间每日给药1 次。48h后，在morris水迷宫中测试。(图2a)在训练阶段的4天内，寻找平台的潜伏期；(图 2b)游泳时在目标象限的停留的时间；(图2c)小鼠平台象限停留次数。
60.在训练阶段，平台可见(第1天)，四组小鼠到达平台的潜伏期均无显著性差异(图2a)， 说明排除了影响小鼠视觉感知和游泳能力的因素。训练期间(sd尚未开始)，模型小鼠的潜伏 期显示与正常小鼠无显著差异，但芫根水提取物干预组小鼠的潜伏期显著缩短，表明芫根水 提取物改善小鼠的空间学习。在试验阶段(第6天)，即睡眠剥夺48h后，sd小鼠逃
逸潜伏期 (图2a)延长，在目标象限的时间百分比(图2b)和跨越平台的次数(图2c)减少，而经芫根干预组 小鼠显著逆转了该现象。在目标象限的时间百分比(图2b)和平台象限停留次数(图2c)中，芫 根小鼠的表现甚至优于咖啡因。这些结果表明，芫根可提高sd小鼠的空间学习记忆能力。
61.5.3芫根的抗sd诱导的中枢疲劳作用检测结果
62.sd暴露小鼠的炎症反应加剧(图3)。芫根降低高敏crp浓度(一种稳定的炎症标志物)(图 3a)。同时，炎性细胞因子il-6(图3b)、tnf-α(图3c)变化与之一致。上述结果提示，芫根显 著降低了睡眠不足时血清中炎症的水平，消除了急性炎症相关器官损伤或异常。
63.急性sd可通过海马损伤或中枢神经递质加重中枢神经系统的神经炎症，进而损伤认知 功能和记忆能力。sd小鼠海马组织中ros大量积累，芫根水提取物显著降低了海马组织中 ros的积累(图4a)，inos的表达水平显著降低(图4b)。结果表明，芫根水提取物可拮抗sd 诱导的神经炎症和海马损伤，从而减少其对机体认知、记忆力的影响。
64.下丘脑-海马回路内，神经胶质-神经元交互过程的动态变化与中枢疲劳密切相关。在sd 诱导的中枢疲劳中，该回路中色氨酸代谢通路活性的提高导致记忆功能的降低。因此，通过 检测下丘脑单胺类神经递质(5-hiaa/5-ht)的表达，以评价芫根对sd暴露的中枢疲劳的影响。 长达48h的sd是中枢疲劳的重要诱因，通过5-ht/5-hiaa代谢途径激活5-ht神经元，使 小鼠脑内的5-hiaa水平升高(图5)。进一步研究了5-ht的转化率(5-ht的主要代谢产物 5-hiaa与5-ht的比值)(图5c)。结果表明，芫根水提取物通过抑制5-ht和5-hiaa的表达， 在调节神经活性色氨酸代谢物中发挥重要作用。这些结果提示，在睡眠不足的情况下，芫根 可能会延缓中枢疲劳的发生。
65.实施例2
66.本实施例抗睡眠剥夺损伤的组合物，包括70重量份芫根水提取物、30重量份枸杞水提 取物。芫根水提取物、枸杞水提取物的制备方法同实施例1。
67.实施例3
68.本实施例抗睡眠剥夺损伤的组合物，包括70重量份芫根水提取物、30重量份人参水提 取物。芫根水提取物、人参水提取物的制备方法同实施例1。
69.实施例4
70.本实施例抗睡眠剥夺损伤的组合物，包括70重量份芫根水提取物、30重量份党参水提 取物。芫根水提取物、党参水提取物的制备方法同实施例1。
71.实施例5
72.本实施例抗睡眠剥夺损伤的组合物，包括70重量份芫根水提取物、30重量份当归水提 取物。芫根水提取物、当归提取物的制备方法同实施例1。
73.实施例6
74.本实施例抗睡眠剥夺损伤的组合物，包括70重量份芫根水提取物、30重量份陈皮水提 取物。芫根水提取物、陈皮水提取物的制备方法同实施例1。
75.实施例7
76.本实施例的抗睡眠剥夺损伤的组合物，包括40份芫根水提取物，15份枸杞水提取物， 15份人参水提取物，10份党参水提取物，10份当归水提取物，10份陈皮水提取物。各组分 的水提取物的制备方法同实施例1。
型组)小鼠海马ca1区神经元层次紊乱，形态不规则，神经元萎缩，胶质细胞增生；实施例 2(芫根联合枸杞)组小鼠海马神经元排列相对规整，存在神经元萎缩。与模型组比较，实施 例1组小鼠神经元层次清楚，核型规则，着色均匀，病理结构改变明显改善。
108.实施例8
109.本实施例抗睡眠剥夺损伤的组合物，包括30重量份芫根水提取物、50重量份枸杞水提 取物。芫根水提取物、枸杞水提取物的制备方法同实施例1。
110.实施例9
111.本实施例抗睡眠剥夺损伤的组合物，包括50重量份芫根水提取物、40重量份人参水提 取物。芫根水提取物、人参水提取物的制备方法同实施例1。
112.实施例10
113.本实施例抗睡眠剥夺损伤的组合物，包括40重量份芫根水提取物、50重量份党参水提 取物。芫根水提取物、党参水提取物的制备方法同实施例1。
114.实施例11
115.本实施例抗睡眠剥夺损伤的组合物，包括70重量份芫根水提取物、50重量份当归水提 取物。芫根水提取物、当归水提取物的制备方法同实施例1。
116.实施例12
117.本实施例抗睡眠剥夺损伤的组合物，包括40重量份芫根水提取物、40重量份陈皮水提 取物。芫根水提取物、陈皮水提取物的制备方法同实施例1。
118.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所 属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。 这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处 于本发明创造的保护范围之中。