小槐花提取物和活性成分及其在制备治疗糖脂代谢综合紊乱的产品方面中的应用的制作方法

1.本发明属于医药和功能食品技术领域，涉及天然植物提取物及其活性成分的新应用，尤其是一种小槐花提取物和活性成分及其在制备治疗糖脂代谢综合紊乱的产品方面中的应用。


背景技术：

2.由于现代生活方式的改变，越来越多的人患有糖脂代谢综合紊乱，包括2型糖尿病 (t2dm)、高血脂、肥胖、非酒精性脂肪肝、高血压、动脉粥样硬化性心脑血管病等。例如，t2dm患者一般都伴随着糖脂代谢综合紊乱，如果高血糖和/或高血脂得不到有效控制，将会产生糖尿病综合征，导致生活质量下降甚至死亡。糖脂代谢紊乱的患者使用单一靶点药物治疗很难控制高血糖、高血脂以及其他症状，因此，寻找多靶点治疗药物或功能性食品具有重要意义，中药或药食同源植物，由于其毒性低，对于需要长期服药的慢性病患者具有显著优势和信任度。
3.小槐花[desmodium caudatum(thunb.)dc.]为豆科(蝶形花亚科fabaceae)山蚂蝗属植物，根部或全株都可以作为药材使用。多生于山谷、草地、林缘和村边，少数为栽培植株。
[0004]
小槐花作为我国传统的中草药，在《全国中草药汇编》中对已其有记载，小槐花微苦、辛、平，主要的治疗作用有清热利湿、消积散瘀、消肿止痛，常用于咳嗽吐血、水肿、小儿疳积、痈疮、溃疡、跌打损伤、痢疾、黄疸型肝炎、伤风咳嗽、小儿惊风、驱蛔虫、毒蛇咬伤等，在民间使用较为广泛。小槐花在日本可用做食品添加剂，可以保护味噌不变质。
[0005]
据报道，小槐花中含有一定的黄酮类、多酚类和醇类成分。有研究报道从小槐花60％乙醇提取物中分离得到15个化合物，结构鉴定分别为豆甾醇、β-谷甾醇、柠檬酚、黄槿酮a、异柠檬酚、kenusanone i、neophellamuretin、清酒缸酚、古柯三醇、黄槿酮d、山柰酚、8-异戊烯槲皮素(1)、leachianone g、5,7,4'-三羟基-二氢黄酮醇、4h-1-benzopyran-4-one， 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-2,3-dihydro-3,5,7-trihydroxy-8-(3-methyl-2-butenyl)-,(2r-trans)
ꢀ‑
(9ci)。从小槐花的根部提取出了8-异戊烯基柚皮素，该化合物在体外具有多种生物活性，作为一种高活性植物激素，具有抗雄激素作用和抗乳腺癌活性，被认为有可能发展成一种更年期激素治疗药物。还有报道发现小槐花的醇提物和水提物可以有效延长小鼠的睡眠时间，明显减少醋酸所致小鼠扭体次数，降低小鼠血清丙二醛(mda)含量，提高超氧化物歧化酶(sod)活力，以及显著提高单核巨噬细胞吞噬指数，上述结果说明小槐花具有较好的镇静催眠、镇痛、抗氧化和免疫增强等作用。小槐花的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。除此之外，小槐花还具有抗阿尔茨海默病疾病、抗 mrsa(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)、抗真菌活性以及抑制鲁氏双糖f51的成膜的活性，推测可能与其所含黄酮类、多酚类和醇类成分有关。
[0006]
通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
[0007]
1、期刊文献：刘超等，小槐花提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性研究，《中国实验方剂学杂志》,2013,20，91-93。α-葡萄糖苷酶是口服降血糖药物作用靶点之一，α-葡萄糖苷酶抑制剂可以延缓淀粉类食物中碳水化合物水解释放葡萄糖，从而延缓血糖的升高，但是抑制该酶并不能降血脂。该文献报道了小槐花乙醇提取物具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，但没有研究提取物的降血脂活性以及对其他能量代谢相关的靶点活性，另外也没有研究提取物中具体活性成分的结构和活性。
[0008]
2、期刊文献：黄泽铖等，小槐花的化学成分和药理作用研究进展，《中药与临床》， 2020,11(4)，67-72。该论文综述了小槐花的化学成分和药理作用，其中介绍的药理作用包括解热镇痛、抗炎、抗氧化、抗真菌、增强免疫、抗癌、抗阿尔兹海默症以及抗α-葡萄糖苷酶活性，此处的抗α-葡萄糖苷酶活性为引用的上述第一篇期刊文献。
[0009]
3、小槐花提取物及提取方法和提取物的新用途(cn103263462a)，该发明涉及小槐花提取物及提取方法和提取物的新用途，以小槐花植物全草为原料，经乙醇水提取得浸膏，乙醇总提物浸膏用水分散，依次分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，从小槐花提取物乙酸乙酯萃取物浸膏中分离得到羽扇豆醇，从小槐花提取物正丁醇萃取物浸膏中分离得到当药黄素，研究发现小槐花乙酸乙酯萃取物浸膏、羽扇豆醇和当药黄素具有抗凝血活性，可用于制备抗凝血药物。该专利公开文献未涉及降血糖和降血脂活性以及在治疗糖脂代谢综合紊乱方面产品的应用。
[0010]
4、小槐花中柠檬酚的提取方法及其用途(cn110964028a)，该发明公开了一种小槐花中柠檬酚的提取方法，以及柠檬酚可以抑制人肝癌hepg2细胞的增殖和迁移，具有在制备治疗抗肝癌药物中用途。该专利公开文献未涉及降血糖和降血脂活性以及在治疗糖脂代谢综合紊乱方面产品的应用。
[0011]
5、期刊文献：孙华等，synthesis,α-glucosidase inhibitory and molecular docking studiesof prenylated and geranylated flavones,isoflavones and chalcones.bioorganic&medicinalchemistry letters(2015),25(20),4567-4571.该论文报道了包括8-异戊烯基槲皮素在内的多个黄酮的合成、α-葡萄糖苷酶抑制活性和分子对接研究。改论文只报道了8-异戊烯基槲皮素具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，α-葡萄糖苷酶是口服降血糖药物作用靶点之一，但是抑制该酶并不能降血脂。该论文没有研究8-异戊烯基槲皮素的降血脂活性以及对其他能量代谢相关的靶点活性，且没有报道该化合物兼具降血脂和降血糖双重活性。
[0012]
通过对比，本发明专利申请与上述公开文献存在本质的不同。本发明发现小槐花提取物以及活性成分兼具降血糖和降血脂双重活性，且具有多靶点协同作用的功效。


技术实现要素：

[0013]
本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种小槐花提取物和活性成分及其在制备治疗糖脂代谢综合紊乱的产品方面中的应用。
[0014]
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
[0015]
一种小槐花提取物和/或活性成分在制备治疗糖脂代谢综合紊乱的产品方面中的应用。
[0016]
进一步地，所述小槐花提取物和/或活性成分为8-异戊烯基槲皮素；
[0017]
或者，为如下五种黄酮类化合物：
[0018]
名称为：8-异戊烯基槲皮素(1)、槲皮素(2)、8-异戊烯基柚皮素(3)、柚皮素(4)、芹菜素(5)，结构式如下：
[0019][0020]
结构鉴定谱图数据如下：
[0021]
8-异戊烯基槲皮素(1)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,d-acetone)δ12.08(s,1h,oh), 7.88(d,j＝1.6hz,1h,h-2'),7.74(d,j＝8.4hz,1h,h-5'),7.02(d,j＝8.4hz,1h,h-6'),6.35 (s,1h,h-6),5.30(t,j＝6.4hz,1h,h-2”),3.57(d,j＝6.8hz,2h,h-1”),1.83(s,3h,ch
3-4”), 1.67(s,3h,ch
3-5”).
13
c nmr(100mhz,d-acetone)δ175.9(c-4),161.2(c-7),159.0(c-5), 154.1(c-9),147.4(c-4'),146.0(c-2),145.0(c-3'),135.7(c-3),131.3(c-3”),123.3(c-1'), 122.6(c-2”),120.6(c-6'),115.4(c-5'),115.0(c-2'),106.3(c-8),103.3(c-10),97.9(c-6),25.0 (c-4”),21.4(c-1”),17.3(c-5”).esi-ms m/z:[m h]

371.1；
[0022]
槲皮素(2)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.46(s,1h),7.64(d,j＝2.1hz, 1h),7.52(dd,j＝8.5,2.1hz,1h),6.87(d,j＝8.5hz,1h),6.40(d,j＝2.0hz,1h),6.17(d,j ＝2.0hz,1h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ176.3,164.3,161.1,156.6,148.1,147.3,145.5, 136.2,122.4,120.5,116.1,115.5,103.5,98.7,93.8；
[0023]
8-异戊烯基柚皮素(3)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,meod)δ12.12(s,1h,oh), 10.76(s,1h,oh),9.58(s,1h,oh),7.32(d,j＝8.4hz,2h,h-2',6'),6.81(d,j＝8.4hz,2h, h-3',5'),5.99(s,1h,h-6),5.42(dd,j＝12.4,2.8hz,1h,h-2),5.10(t,j＝7.2hz,1h,h-2”), 3.20(dd,j＝17.2,12.4hz,1h,h-3ax),3.09(d,j＝7.2hz,2h,h-1”),2.74(dd,j＝17.2,3.2 hz,1h,h-3eq),1.61(s,3h,ch
3-5”),1.55(s,3h,ch
3-4”).
13
c nmr(100mhz,meod)δ 197.2(c-4),164.8(c-7),161.6(c-5),160.1(c-9),158.0(c-4'),130.6(c-3”),129.7(c-1'), 128.5(c-2',6'),123.1(c-2”),115.6(c-3',5'),107.4(c-8),102.2(c-10),95.7(c-6),78.7(c-2), 42.4(c-3),21.7(c-1”),18.0(c-4”),26.0(c-5”).hrms-esi:m/z[m h]-calcd.for c
20h21
o5: 341.1384,found:341.1381；
[0024]
柚皮素(4)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,d
6-dmso)δ12.15(s,1h),9.69(s,1h),7.32 (d,j＝8.4hz,2h),6.80(d,j＝8.4hz,2h),5.43(dd,j＝12.7,2.7hz,1h),3.26(dd,j＝17.1, 12.8hz,1h),2.68(dd,j＝17.1,2.9hz,1h)；
13
c nmr(100mhz,d6-dmso)δ196.8,167.1, 163.9,163.4,158.1,129.3,128.8,115.7,102.2,96.3,95.4,78.9,42.4；
[0025]
芹菜素(5)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,d
6-dmso)δ12.97(s,1h),10.65(d,j＝168.4 hz,2h),7.93(d,j＝8.4hz,2h),6.93(d,j＝8.8hz,2h),6.79(s,1h),6.48(d,j＝2.0hz,1h), 6.19(s,j＝2.0hz,1h).
13
c nmr(100mhz,d
6-dmso)δ182.1,166.4,163.6,161.8,
158.8, 157.7,129.2,122.9,115.8,104.5,104.4,98.3,94.0.hrms( esi-tof)m/z:[m h]

calcd. forc
15h11
o5271.0501,found 271.0593。
[0026]
一种小槐花提取物和/或活性成分在制备降血糖和降血脂的药物方面中的应用。
[0027]
进一步地，所述小槐花提取物和/或活性成分为8-异戊烯基槲皮素；
[0028]
或者，为如下五种黄酮类化合物：
[0029]
名称为：8-异戊烯基槲皮素(1)、槲皮素(2)、8-异戊烯基柚皮素(3)、柚皮素(4)、芹菜素(5)，结构式如下：
[0030][0031]
结构鉴定谱图数据如下：
[0032]
8-异戊烯基槲皮素(1)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,d-acetone)δ12.08(s,1h,oh), 7.88(d,j＝1.6hz,1h,h-2'),7.74(d,j＝8.4hz,1h,h-5'),7.02(d,j＝8.4hz,1h,h-6'),6.35 (s,1h,h-6),5.30(t,j＝6.4hz,1h,h-2”),3.57(d,j＝6.8hz,2h,h-1”),1.83(s,3h,ch
3-4”), 1.67(s,3h,ch
3-5”).
13
c nmr(100mhz,d-acetone)δ175.9(c-4),161.2(c-7),159.0(c-5), 154.1(c-9),147.4(c-4'),146.0(c-2),145.0(c-3'),135.7(c-3),131.3(c-3”),123.3(c-1'), 122.6(c-2”),120.6(c-6'),115.4(c-5'),115.0(c-2'),106.3(c-8),103.3(c-10),97.9(c-6),25.0 (c-4”),21.4(c-1”),17.3(c-5”).esi-ms m/z:[m h]

371.1；
[0033]
槲皮素(2)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.46(s,1h),7.64(d,j＝2.1hz, 1h),7.52(dd,j＝8.5,2.1hz,1h),6.87(d,j＝8.5hz,1h),6.40(d,j＝2.0hz,1h),6.17(d,j ＝2.0hz,1h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ176.3,164.3,161.1,156.6,148.1,147.3,145.5, 136.2,122.4,120.5,116.1,115.5,103.5,98.7,93.8；
[0034]
8-异戊烯基柚皮素(3)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,meod)δ12.12(s,1h,oh), 10.76(s,1h,oh),9.58(s,1h,oh),7.32(d,j＝8.4hz,2h,h-2',6'),6.81(d,j＝8.4hz,2h, h-3',5'),5.99(s,1h,h-6),5.42(dd,j＝12.4,2.8hz,1h,h-2),5.10(t,j＝7.2hz,1h,h-2”), 3.20(dd,j＝17.2,12.4hz,1h,h-3ax),3.09(d,j＝7.2hz,2h,h-1”),2.74(dd,j＝17.2,3.2 hz,1h,h-3eq),1.61(s,3h,ch
3-5”),1.55(s,3h,ch
3-4”).
13
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20h21
o5: 341.1384,found:341.1381；
[0035]
柚皮素(4)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,d
6-dmso)δ12.15(s,1h),9.69(s,1h),7.32 (d,j＝8.4hz,2h),6.80(d,j＝8.4hz,2h),5.43(dd,j＝12.7,2.7hz,1h),3.26(dd,j＝17.1, 12.8hz,1h),2.68(dd,j＝17.1,2.9hz,1h)；
13
c nmr(100mhz,d6-dmso)δ196.8,
6),78.7(c-2), 42.4(c-3),21.7(c-1”),18.0(c-4”),26.0(c-5”).hrms-esi:m/z[m h]-calcd.for c
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[0046]
柚皮素(4)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,d
6-dmso)δ12.15(s,1h),9.69(s,1h),7.32 (d,j＝8.4hz,2h),6.80(d,j＝8.4hz,2h),5.43(dd,j＝12.7,2.7hz,1h),3.26(dd,j＝17.1, 12.8hz,1h),2.68(dd,j＝17.1,2.9hz,1h)；
13
c nmr(100mhz,d6-dmso)δ196.8,167.1, 163.9,163.4,158.1,129.3,128.8,115.7,102.2,96.3,95.4,78.9,42.4；
[0047]
芹菜素(5)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,d
6-dmso)δ12.97(s,1h),10.65(d,j＝168.4 hz,2h),7.93(d,j＝8.4hz,2h),6.93(d,j＝8.8hz,2h),6.79(s,1h),6.48(d,j＝2.0hz,1h), 6.19(s,j＝2.0hz,1h).
13
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calcd. for c
15h11
o5271.0501,found 271.0593。
[0048]
一种小槐花提取物的制备方法，步骤如下：
[0049]
称取小槐花根和/或茎和/或叶进行粉碎，加入料液比1:1～20的提取溶剂，室温浸泡2～48 小时或回流提取2～48小时，过滤收集滤液，浓缩除去提取溶剂，即得小槐花根和/或茎和/ 或叶提取物。
[0050]
进一步地，所述提取溶剂为甲醇、乙醇、水、乙醇水混合，提取温度为0℃至100℃。
[0051]
一种小槐花活性成分的分离纯化与结构鉴定方法，步骤如下：
[0052]
称取小槐花提取物，悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯层合并，干燥浓缩得到粗提物，然后用不同填料的色谱柱进行分离纯化，直到产品纯度达到90％以上，通过光谱学鉴定其结构。
[0053]
进一步地，所述色谱柱填料为大孔树脂、硅胶、凝胶或反相硅胶；
[0054]
或者，所述光谱学方法为核磁共振氢谱、碳谱、二维谱，质谱、红外光谱和紫外光谱。
[0055]
本发明取得的有益效果是：
[0056]
1、本发明首次发现小槐花提取物和活性成分具有显著的降血糖和降血脂活性，扩大了农产品小槐花本身以及下游高附加值产品的应用领域，小槐花提取物和/或活性成分可以应用在制备治疗糖脂代谢综合紊乱以及相关疾病的产品方面中。
[0057]
2、本发明首次对不同小槐花植物部位用不同的提取溶剂和提取温度制备了12种不同的提取物，并对提取物进行了α-葡萄糖苷酶、果糖-1，6-二磷酸酶(fbpase)、胰脂肪酶抑制活性研究，并进行了细胞水平促进葡萄糖消耗和降低脂质含量活性评价，以及对能量开关ampk(adenosine 5'-monophosphate(amp)-activated protein kinase)通路的影响的评价，结果表明提取物能够同时作用于多个生物靶点上，为开发糖脂代谢综合紊乱的相关疾病的多靶点治疗药物奠定基础。
[0058]
3、本发明首次发现8-异戊烯基槲皮素为α-葡萄糖苷酶和果糖-1，6-二磷酸酶双重抑制剂，其α-葡萄苷酶抑制活性(ic
50
＝4.38μm)比阳性对照阿卡波糖(ic
50
＝330.10μm)高 75倍，其fbpase(ic
50
＝3.62μm)抑制活性与阳性对照amp(ic
50
＝330.10μm)相当。
[0059]
4、本发明分别对不同提取条件下提取物和活性单体成分进行了酶活水平与细胞水平的降血糖和降血脂活性评价。
[0060]
酶活水平上，小槐花提取物1-6和8-12对fbpase显示出一定的抑制活性，其中从小
槐花叶中用甲醇室温浸提的提取物9活性最高(ic
50
＝3.46μg/ml)。所有提取物均具有良好的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，均比临床用药阿卡波糖活性高了100多倍。其中活性最强提取物9(ic
50
＝0.24μg/ml)，活性比阿卡波糖(ic
50
＝190.65μg/ml)活性高了约800倍。所有提取物在50μg/ml和5μg/ml浓度下均具有一定的胰脂肪酶的抑制活性。
[0061]
细胞水平上，所有提取物在测试浓度下(0.5-50μg/ml)无明显的细胞毒性，且全部具有显著的葡萄糖消耗促进活性，除了5μg/ml的提取物3和0.5μg/ml的提取物12，其余提取物都具有显著的葡萄糖消耗促进活性，甚至与1mm的二甲双胍具有可比性。另外，在 5μg/ml浓度下，提取物1-4，7-10，12都能够显著减少细胞脂质含量，尤其提取物7和9 在0.5μg/ml浓度下仍具有良好的活性，其活性高于阳性对照洛伐他汀。
[0062]
降血糖和降血脂活性最优的提取物9，可以显著(p《0.001)上调ampk磷酸化水平，20 μg/ml时p-ampk/ampk相对表达量比模型组高了205％。而已报道的ampk激动剂 aicar(阿卡地新)在90μg/ml浓度下p-ampk/ampk相对表达量只上调了179％。另外，提取物9分别使p-acc/acc和cpt-1a蛋白表达量上调了156％(p《0.001)和99％ (p《0.001)，也同样优于更高浓度的aicar(上调36％和69％)。上述结果表明，提取物9 还可以通过影响能量开关ampk通路，从而影响糖和脂的双重代谢。
[0063]
小槐花中的活性单体成分8-异戊烯基槲皮素具有α-葡萄糖苷酶和fbpase双重抑制活性，8-异戊烯基槲皮素(ic
50
＝4.38μm)比阿卡波糖(ic
50
＝330.1μm)强75倍，且该化合物的fbpase抑制活性(ic
50
＝3.62μm)与阳性对照amp(ic
50
＝2.92μm)相当。另外，8-异戊烯基槲皮素在2μm浓度下可以显著促进葡萄糖消耗，活性高于阳性对照药物二甲双胍，在10μm浓度下可以显著减少细胞脂质含量，活性与阳性对照洛伐他汀相当。上述结果表明，8-异戊烯基槲皮素也具有调节糖脂代谢综合紊乱的活性，具有进一步开发的价值。
[0064]
5、本发明首次发现小槐花提取物兼具显著的降血糖和降血脂活性，其中活性单体成分8-异戊烯基槲皮素可以作为α-葡萄糖苷酶和果糖-1，6-二磷酸酶双重抑制剂，且兼具降血糖和降血脂双重活性。本发明扩大了小槐花本身以及下游高附加值产品的应用领域，小槐花提取物和部分活性成分可以应用在制备治疗糖脂代谢综合紊乱以及相关疾病的产品方面中。
附图说明
[0065]
图1为本发明中12种提取物对细胞葡萄糖消耗促进活性的影响图；其中，上图为12 种提取物的葡萄糖消耗促进活性，下图为12种提取物在相同测试浓度下细胞的存活率；
[0066]
图2为本发明中提取物9对ampk/acc/cpt-1a信号通路的影响活性图；其中，a：用提取物9处理hepg2细胞24小时后，进行ampk通路相关蛋白的分子印迹免疫分析结果；b：p-ampk/apmk蛋白表达定量比较；c：p-acc/acc蛋白表达定量比较；d：cpt-1a/tublin蛋白表达定量比较；
[0067]
*p《0.05,**p《0.01和***p《0.001与模型组比较；
[0068]
图3为本发明中8-异戊烯基槲皮素细胞水平降血糖和降血脂活性图；其中，a为8-异戊烯基槲皮素测试浓度下的细胞存活率图；b为8-异戊烯基槲皮素葡萄糖消耗促进活性图； c为8-异戊烯基槲皮素对细胞脂质含量的影响活性图。
具体实施方式
[0069]
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
[0070]
本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
[0071]
一种小槐花提取物和/或活性成分在制备治疗糖脂代谢综合紊乱的产品方面中的应用。
[0072]
较优地，所述小槐花提取物和/或活性成分为8-异戊烯基槲皮素；
[0073]
或者，为如下五种黄酮类化合物：
[0074]
名称为：8-异戊烯基槲皮素(1)、槲皮素(2)、8-异戊烯基柚皮素(3)、柚皮素(4)、芹菜素(5)，结构式如下：
[0075][0076]
结构鉴定谱图数据如下：
[0077]
8-异戊烯基槲皮素(1)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,d-acetone)δ12.08(s,1h,oh), 7.88(d,j＝1.6hz,1h,h-2'),7.74(d,j＝8.4hz,1h,h-5'),7.02(d,j＝8.4hz,1h,h-6'),6.35 (s,1h,h-6),5.30(t,j＝6.4hz,1h,h-2”),3.57(d,j＝6.8hz,2h,h-1”),1.83(s,3h,ch
3-4”), 1.67(s,3h,ch
3-5”).
13
c nmr(100mhz,d-acetone)δ175.9(c-4),161.2(c-7),159.0(c-5), 154.1(c-9),147.4(c-4'),146.0(c-2),145.0(c-3'),135.7(c-3),131.3(c-3”),123.3(c-1'), 122.6(c-2”),120.6(c-6'),115.4(c-5'),115.0(c-2'),106.3(c-8),103.3(c-10),97.9(c-6),25.0 (c-4”),21.4(c-1”),17.3(c-5”).esi-ms m/z:[m h]

371.1；
[0078]
槲皮素(2)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.46(s,1h),7.64(d,j＝2.1hz, 1h),7.52(dd,j＝8.5,2.1hz,1h),6.87(d,j＝8.5hz,1h),6.40(d,j＝2.0hz,1h),6.17(d,j ＝2.0hz,1h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ176.3,164.3,161.1,156.6,148.1,147.3,145.5, 136.2,122.4,120.5,116.1,115.5,103.5,98.7,93.8；
[0079]
8-异戊烯基柚皮素(3)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,meod)δ12.12(s,1h,oh), 10.76(s,1h,oh),9.58(s,1h,oh),7.32(d,j＝8.4hz,2h,h-2',6'),6.81(d,j＝8.4hz,2h, h-3',5'),5.99(s,1h,h-6),5.42(dd,j＝12.4,2.8hz,1h,h-2),5.10(t,j＝7.2hz,1h,h-2”), 3.20(dd,j＝17.2,12.4hz,1h,h-3ax),3.09(d,j＝7.2hz,2h,h-1”),2.74(dd,j＝17.2,3.2 hz,1h,h-3eq),1.61(s,3h,ch
3-5”),1.55(s,3h,ch
3-4”).
13
c nmr(100mhz,meod)δ 197.2(c-4),164.8(c-7),161.6(c-5),160.1(c-9),158.0(c-4'),130.6(c-3”),129.7(c-1'), 128.5(c-2',6'),123.1(c-2”),115.6(c-3',5'),107.4(c-8),102.2(c-10),95.7
＝2.0hz,1h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ176.3,164.3,161.1,156.6,148.1,147.3,145.5, 136.2,122.4,120.5,116.1,115.5,103.5,98.7,93.8；
[0101]
8-异戊烯基柚皮素(3)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,meod)δ12.12(s,1h,oh), 10.76(s,1h,oh),9.58(s,1h,oh),7.32(d,j＝8.4hz,2h,h-2',6'),6.81(d,j＝8.4hz,2h, h-3',5'),5.99(s,1h,h-6),5.42(dd,j＝12.4,2.8hz,1h,h-2),5.10(t,j＝7.2hz,1h,h-2”), 3.20(dd,j＝17.2,12.4hz,1h,h-3ax),3.09(d,j＝7.2hz,2h,h-1”),2.74(dd,j＝17.2,3.2 hz,1h,h-3eq),1.61(s,3h,ch
3-5”),1.55(s,3h,ch
3-4”).
13
c nmr(100mhz,meod)δ197.2(c-4),164.8(c-7),161.6(c-5),160.1(c-9),158.0(c-4'),130.6(c-3”),129.7(c-1'), 128.5(c-2',6'),123.1(c-2”),115.6(c-3',5'),107.4(c-8),102.2(c-10),95.7(c-6),78.7(c-2), 42.4(c-3),21.7(c-1”),18.0(c-4”),26.0(c-5”).hrms-esi:m/z[m h]-calcd.for c
20h21
o5: 341.1384,found:341.1381；
[0102]
柚皮素(4)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,d
6-dmso)δ12.15(s,1h),9.69(s,1h),7.32 (d,j＝8.4hz,2h),6.80(d,j＝8.4hz,2h),5.43(dd,j＝12.7,2.7hz,1h),3.26(dd,j＝17.1, 12.8hz,1h),2.68(dd,j＝17.1,2.9hz,1h)；
13
c nmr(100mhz,d6-dmso)δ196.8,167.1, 163.9,163.4,158.1,129.3,128.8,115.7,102.2,96.3,95.4,78.9,42.4；
[0103]
芹菜素(5)，黄色粉末，1h nmr(400mhz,d
6-dmso)δ12.97(s,1h),10.65(d,j＝168.4 hz,2h),7.93(d,j＝8.4hz,2h),6.93(d,j＝8.8hz,2h),6.79(s,1h),6.48(d,j＝2.0hz,1h), 6.19(s,j＝2.0hz,1h).
13
c nmr(100mhz,d
6-dmso)δ182.1,166.4,163.6,161.8,158.8, 157.7,129.2,122.9,115.8,104.5,104.4,98.3,94.0.hrms( esi-tof)m/z:[m h]

calcd. for c
15h11o5 271.0501,found 271.0593。
[0104]
一种小槐花提取物的制备方法，步骤如下：
[0105]
称取小槐花根和/或茎和/或叶进行粉碎，加入料液比1:1～20的提取溶剂，室温浸泡2～48 小时或回流提取2～48小时，过滤收集滤液，浓缩除去提取溶剂，即得小槐花根和/或茎和/ 或叶提取物。
[0106]
较优地，所述提取溶剂为甲醇、乙醇、水、乙醇水混合，提取温度为0℃至100℃。
[0107]
一种小槐花活性成分的分离纯化与结构鉴定方法，步骤如下：
[0108]
称取小槐花提取物，悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯层合并，干燥浓缩得到粗提物，然后用不同填料的色谱柱进行分离纯化，直到产品纯度达到90％以上，通过光谱学鉴定其结构。
[0109]
较优地，所述色谱柱填料为大孔树脂、硅胶、凝胶或反相硅胶；
[0110]
或者，所述光谱学方法为核磁共振氢谱、碳谱、二维谱，质谱、红外光谱和紫外光谱。
[0111]
具体地，相关的制备及检测如下：
[0112]
实施例1
[0113]
一种小槐花提取物制备流程：
[0114]
称取小槐花根和/或茎和/或叶进行粉碎，转移至容器中，加入料液比1:1～20的提取溶剂，室温浸泡2～48小时或回流提取2～48小时，过滤收集滤液，浓缩除去提取溶剂，即得小槐花根和/或茎和/或叶提取物。
[0115]
进一步地，所述小槐花根、茎、叶粉末中一种或多种混合进行提取；
[0116]
所述提取溶剂为甲醇、乙醇、水、乙醇水混合，提取温度为0℃至100℃。
[0117]
实施例2
[0118]
一种小槐花提取物的提取条件、提取率和黄酮含量的测试结果：
[0119]
表1小槐花提取物的提取条件、提取率和黄酮含量的测试结果
[0120][0121][0122]
由表1可知，通过对不同提取部位，使用不同提取溶剂和温度可以制备12种不同的小槐花提取物，提取温度升高有利于提取率的提高，但温度升高与提取物黄酮含量不成正比。
[0123]
实施例3
[0124]
12种小槐花提取物对果糖-1,6-二磷酸酯酶(fbpase)抑制活性评价：
[0125]
对表1方法制备的12种小槐花提取物，微孔板法进行50μg/ml和5μg/ml浓度的初步筛选，高活性产物进一步测试半数抑制浓度，以单磷酸腺苷(amp)为阳性对照，方法如下：
[0126]
缓冲液的成分为200mm tris、4mm mgcl2、4mm(nh4)2so4、0.1mm edta，调节 ph至7.5。先将上述缓冲液加入96孔酶标板中，将其分为空白组、对照组和实验组。
[0127]
实验组中每孔分别加入50和5μg/ml的提取物的二甲基亚砜溶液，对照组中加入10 μldmso后加入0.2mmnadp

,随后加入0.5u/ml的磷酸葡萄糖异构酶和0.25u/ml的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，0.05ng/μl的fbpase酶。最后加入70μm的fbp引发反应。放在 30℃环境下孵育并震荡30min，在340nm下检测nadp

生成nadph的量，实验结果见表2。
[0128]
表2 12种提取物对fbpase的抑制活性
[0129]
[0130][0131]
注：
a.
nd:表示该浓度下检测不到活性。
[0132]
通过表2可以看出，除提取物7以外，小槐花提取物对fbpase显示出一定的抑制活性，进一步对提取物1-5和9-11进行了半数抑制浓度(ic
50
)的测定，结果显示，6种提取物 ic
50
小于10μg/ml，其中从小槐花叶中用甲醇室温浸提的提取物9活性最高(ic
50
＝3.46 μg/ml)。
[0133]
实施例4
[0134]
12种小槐花提取物的α-葡萄糖苷酶活性评价：
[0135]
微孔板法检测不同浓度下12种小槐花提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以阿卡波糖为阳性对照，方法如下：
[0136]
化合物测试组(a)：30μl底物溶液 10μl待测溶液 20μl酶溶液 140μl 1
×
磷酸缓冲液(pbs)；化合物空白组(b)：30μl底物溶液 10μl待测溶液 160μl 1
×
pbs；对照组(c)：30μl底物溶液 20μl酶溶液 10μl dmso 140μl 1
×
pbs；空白组(d)：30μl 底物溶液 170μl 1
×
pbs。
[0137]
依次加入1
×
pbs缓冲液、不同浓度的待测溶液和0.04u/ml的酶溶液，将其置于96 孔酶标板中，37℃培育5min后，加入0.5mm 4-硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷的底物溶液， 37℃恒温箱中反应30min，随后立即于405nm波长下用酶标仪测定吸光值(od)。磷酸盐缓冲溶液ph值6.8，实验结果为3次独立实验，每次为2个平行。
[0138]
按下式计算出α-葡萄糖苷酶活性的抑制率：抑制率/％＝1-(od
a-odb)/(od
c-odd)]
×ꢀ
100％。
[0139]
表3 12种提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性
[0140]
提取物抑制率(％,at 5μg/ml)抑制率(％,at 0.5μg/ml)ic
50
(μg/ml)
195.86
±
2.1370.73
±
5.410.31
±
0.032100.30
±
4.1468.84
±
6.820.40
±
0.05398.83
±
2.9048.75
±
2.460.36
±
0.184101.32
±
1.8649.01
±
0.890.62
±
0.04592.55
±
17.9864.16
±
9.751.12
±
0.10687.44
±
1.6351.77
±
4.150.60
±
0.24785.20
±
5.0020.51
±
1.960.78
±
0.08859.05
±
6.5951.17
±
8.274.85
±
1.03997.51
±
1.0490.48
±
4.780.24
±
0.021098.79
±
1.7183.86
±
8.540.35
±
0.121196.26
±
1.5673.80
±
5.120.41
±
0.061256.12
±
1.1929.14
±
1.673.94
±
1.83阿卡波糖
‑‑
190.65
±
3.18
[0141]
从表3可以看出，所有提取物均具有良好的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，比临床用药阿卡波糖活性高了100多倍。其中活性最强也是从小槐花叶中用甲醇室温浸提的提取物9 (ic
50
＝0.24μg/ml)，活性比阿卡波糖(ic
50
＝190.65μg/ml)活性高了约800倍。
[0142]
实施例5
[0143]
12种小槐花提取物的胰脂肪酶的活性评价：
[0144]
微孔板法检测不同浓度下12种小槐花提取物对胰脂肪酶的抑制活性，以奥利司他为阳性对照，方法如下：
[0145]
化合物测试组(a)：50μl底物溶液 10μl待测溶液 25μl酶溶液 100μl柠檬酸钠 15μl tris-hcl；化合物空白组(b)：50μl底物溶液 10μl待测溶液 100μl柠檬酸钠 40μl tris-hcl；对照组(c)：50μl底物溶液 25μl酶溶液 100μl柠檬酸钠 25μltris-hcl；空白组(d)：50μl底物溶液 100μl柠檬酸钠 50μl tris-hcl。
[0146]
依次加入tris-hcl缓冲液、底物溶液和不同浓度的待测溶液，将其置于96孔酶标板中充分混合后加入酶溶液引发反应，25℃培育30min后，每孔加入100μl柠檬酸钠终止反应，随后立即于340nm和460nm发射光波波长下用酶标仪测定吸光值(od)。tris-hcl 缓冲液ph值8.0，实验结果为3次独立实验，每次为2个平行。
[0147]
按下式计算出胰脂肪酶活性的抑制率：抑制率/％＝1-(od
a-odb)/(od
c-odd)]
×
100％。
[0148]
表4 12种提取物的胰脂肪酶抑制活性
[0149][0150]
注：a该数据为奥利司他在0.04μg/ml浓度下的抑制率
[0151]
从表4可以看出，所有提取物在50μg/ml和5μg/ml浓度下均具有一定的胰脂肪酶的抑制活性。
[0152]
实施例6
[0153]
12种小槐花提取物细胞水平降血脂活性研究：
[0154]
用油红o染色实验评价不同浓度的挥发油、提取物和挥发油与提取物混合物的细胞水平降低脂肪含量的活性。以洛伐他汀为阳性对照，具体方法如下：
[0155]
取对数生长期的hepg2细胞，用dmem低糖培养基以细胞密度为1
×
105个/ml接种于6孔板中，每孔2ml，置于37℃培养箱中培养过夜，细胞贴壁后弃上清液，用1
×
pbs 洗1次，用无血清的dmem高糖培养基饥饿24h，用1
×
pbs洗1次，用配制好的长链脂肪酸(ffas)诱导剂诱导hepg2细胞建立脂肪蓄积模型24h，并设立药物对照组(诱导剂 待测物 细胞)，阴性对照组(诱导剂 dmso 细胞)和空白对照组(仅含1％bsa的 dmem低糖培养基溶液) 阳性对照组(诱导剂 洛伐他汀 细胞)。每一浓度均设置3个复孔，每孔加入10μl含有不同浓度受试物的稀释液，将细胞置于二氧化碳培养箱中继续培养24h后用1
×
pbs清洗3次，用4％多聚甲醛每孔2ml固定细胞30min，用1
×
pbs 清洗3次，60％异丙醇每孔2ml作用细胞5min增加细胞的通透性，在黑暗室温条件下用油红o每孔2ml染色1h，蒸馏水清洗细胞4次后每孔加入1ml异丙醇结合10min，震荡洗出，用酶标仪在492nm处测定吸光度。
[0156]
表5. 12种小槐花提取物的降低细胞脂肪含量的活性
[0157][0158]
注：*p《0.05,**p《0.01 and***p《0.001 versus untreated control.
[0159]
从表5可以看出，在5μg/ml浓度下，提取物1-4，7-10，12都能够显著减少细胞脂质含量，尤其提取物7和9在0.5μg/ml浓度下仍具有明显的活性，其活性高于阳性对照洛伐他汀。
[0160]
实施例7
[0161]
12种小槐花提取物细胞水平降血糖活性研究：
[0162]
用葡萄糖消耗实验来评价不同浓度的12种小槐花提取物的促进葡萄糖消耗的量，从而间接说明细胞水平降血糖活性。以二甲双胍为阳性对照，具体方法如下：
[0163]
取对数生长期的hepg2细胞常规消化，用dmem低糖培养基培养，接种细胞密度为 5
×
104个/ml于96孔培养板中，每孔100μl，置于培养箱中培养过夜，细胞贴壁后弃上清液，用1
×
pbs洗1次，用无血清的dmem高糖培养基饥饿24h，用1
×
pbs洗1次，换用dmem高糖培养基培养并设立药物对照组(培养基 待测物 细胞)，阴性对照组(培养基 dmso 细胞)和空白对照组(单纯培养基 待测物) 阳性对照组(培养基 二甲双胍 细胞)。每一浓度均设置3个复孔，每孔加入0.5μl含有不同浓度受试物的稀释液，将细胞置于二氧化碳培养箱中继续培养。24h后用葡萄糖测定试剂盒检测相对葡萄糖消耗量。相同条件下测定提取物对细胞的杀伤情况，以消除影响细胞活力带来的葡萄糖消耗的假阳性结果。结果详见附图1。
[0164]
从附图1可以看出，所有提取物在测试浓度下(0.5-50μg/ml)无明显的细胞毒性，且全部具有显著的葡萄糖消耗促进活性，除了5μg/ml的提取物3和0.5μg/ml的提取物12，其余提取物都具有显著的葡萄糖消耗促进活性，甚至与1mm的二甲双胍具有可比性。
[0165]
实施例8
h-3',5'),5.99(s,1h,h-6),5.42(dd,j＝12.4,2.8hz,1h,h-2),5.10(t,j＝7.2hz,1h,h-2”), 3.20(dd,j＝17.2,12.4hz,1h,h-3ax),3.09(d,j＝7.2hz,2h,h-1”),2.74(dd,j＝17.2,3.2 hz,1h,h-3eq),1.61(s,3h,ch
3-5”),1.55(s,3h,ch
3-4”).
13
c nmr(100mhz,meod)δ 197.2(c-4),164.8(c-7),161.6(c-5),160.1(c-9),158.0(c-4'),130.6(c-3”),129.7(c-1'), 128.5(c-2',6'),123.1(c-2”),115.6(c-3',5'),107.4(c-8),102.2(c-10),95.7(c-6),78.7(c-2), 42.4(c-3),21.7(c-1”),18.0(c-4”),26.0(c-5”).hrms-esi:m/z[m h]-calcd.for c
20h21
o5: 341.1384,found:341.1381.
[0176]
柚皮素(4).黄色粉末。1h nmr(400mhz,d
6-dmso)δ12.15(s,1h),9.69(s,1h),7.32 (d,j＝8.4hz,2h),6.80(d,j＝8.4hz,2h),5.43(dd,j＝12.7,2.7hz,1h),3.26(dd,j＝17.1, 12.8hz,1h),2.68(dd,j＝17.1,2.9hz,1h)；
13
c nmr(100mhz,d6-dmso)δ196.8,167.1, 163.9,163.4,158.1,129.3,128.8,115.7,102.2,96.3,95.4,78.9,42.4.
[0177]
芹菜素(5).黄色粉末。1h nmr(400mhz,d
6-dmso)δ12.97(s,1h),10.65(d,j＝168.4 hz,2h),7.93(d,j＝8.4hz,2h),6.93(d,j＝8.8hz,2h),6.79(s,1h),6.48(d,j＝2.0hz,1h), 6.19(s,j＝2.0hz,1h).
13
c nmr(100mhz,d
6-dmso)δ182.1,166.4,163.6,161.8,158.8, 157.7,129.2,122.9,115.8,104.5,104.4,98.3,94.0.hrms( esi-tof)m/z:[m h]

calcd. for c
15h11o5 271.0501,found 271.0593.
[0178]
实施例10
[0179]
小槐花活性单体1-5的α-葡萄糖苷酶和fbpase抑制活性的评价：
[0180]
fbpase抑制活性评价方法见实施例3，α-葡萄糖苷酶评价方法见实施例4。活性结果见表6。
[0181]
表6.小槐花活性单体1-5的α-葡萄糖苷酶和fbpase抑制活性
[0182][0183]
注：ana＝no active，无活性；bnt＝not tested，为测定。
[0184]
从表6可以看出，五个黄酮全部具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，比阳性对照阿卡波糖强7-75倍，其中活性最高的8-异戊烯基槲皮素比阿卡波糖强75倍，且该化合物的 fbpase抑制活性与阳性对照amp相当。该化合物作为两个降糖活性靶点双重抑制剂具有良好的发展前景。
[0185]
实施例11
[0186]
高活性的8-异戊烯基槲皮素的细胞水平降血糖和降血脂活性研究：
[0187]
细胞水平葡萄糖消耗促进活性评价方法见实施例7，细胞水平降血脂活性评价方法见实施例6。活性结果如附图3所示，8-异戊烯基槲皮素在2μm浓度下可以显著促进葡萄糖消耗，活性高于阳性对照药物二甲双胍，同时，在10μm浓度下可以显著减少细胞脂质含量，活性与阳性对照洛伐他汀相当。上述结果表明，8-异戊烯基槲皮素也具有调节糖脂代谢综合紊乱的活性，具有进一步开发的价值。
[0188]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。