一种6-羧基壳寡糖-铜络合物的制备方法及其制备产品的应用与流程

1.本发明属于抗菌药剂技术领域，尤其涉及一种6-羧基壳寡糖-铜络合物的制备方法及其制备产品的应用。


背景技术：

2.壳寡糖，又称为氨基寡糖素，是一种兼具激活作物免疫系统和抑菌能力的绿色生物农药。它主要是由虾、蟹等下脚料中的甲壳素经过脱乙酰、水解反应获得，聚合度一般为2-20(分子量340-3238da)。壳寡糖是迄今为止发现的唯一的天然碱性寡糖，在防治作物病毒、细菌和真菌病害等方面已实现广泛应用。但是壳寡糖本身的直接抑菌和杀菌能力较弱，它对丁香假单胞菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，mic)为1000-3000ppm，对大丽轮枝菌的mic值为20000-40000ppm，难以作为杀菌剂直接使用。
3.壳寡糖分子中含有羟基、氨基和酰胺基团，能与二价金属离子形成络合物，同时亦可保留壳寡糖自身的免疫诱抗活性。铜离子具有较强的杀菌能力，氢氧化铜、琥胶肥酸铜、波尔多液等铜制剂已在国内外长期应用，但铜制剂的安全性不高，常常造成药害，成为限制此类产品进一步扩大应用的主要障碍。为了提高壳寡糖的抑菌能力并提升铜制剂的安全性，专利cn201410174256.4公开了一种壳寡糖铜络合物的制备方法，壳寡糖与铜离子的质量比为5∶1～1∶1.2，实际上由于铜的配位数较多，络合物中铜的最高含量不超过15％，远低于市售铜制剂产品中铜含量。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种6-羧基壳寡糖-铜络合物的制备方法及其制备产品的应用，制备得到的6-羧基壳寡糖-铜络合物具有更高的铜含量，且该络合物对多种致病菌具有较强的抑制活性。
5.本发明提供了一种6-羧基壳寡糖-铜络合物的制备方法，包括如下步骤：
6.将壳寡糖溶液的ph值调整至4.0～6.0，得到调整ph值后的壳寡糖溶液；
7.将所述调整ph值后的壳寡糖溶液、2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基和漆酶混合，在20～40℃通氧反应2～10h，得到6-羧基壳寡糖溶液；
8.将所述6-羧基壳寡糖溶液与含铜化合物混合，在44～55℃反应2～4h，得到6-羧基壳寡糖溶液-铜络合物；
9.所述含铜化合物为五水硫酸铜、一水合乙酸铜或二水合氯化铜。
10.优选的，所述壳寡糖溶液采用如下步骤制备得到：
11.将脱乙酰度≥85％的壳聚糖、水和有机酸/盐酸混合，溶胀，得到溶胀后的壳聚糖；
12.将所述溶胀后的壳聚糖采用壳聚糖酶水解，得到壳寡糖溶液。
13.优选的，所述壳聚糖与水的质量比为1∶5～20；所述有机酸/盐酸的用量为壳聚糖质量的5％～50％。
14.优选的，所述溶胀时的温度为30～65℃；时间为4～24h。
15.优选的，所述壳聚糖酶的用量为2～16u/g壳聚糖。
16.优选的，按重量百分比计，所述2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基的添加量为壳寡糖的1％～8％。
17.优选的，所述6-羧基壳寡糖溶液中的6-羧基壳寡糖与含铜化合物的质量比为1∶1～5。
18.本发明提供了一种上述任意一项方法制备得到的6-羧基壳寡糖-铜络合物作为杀菌剂的用途。
19.优选的，所述杀菌剂用于防治由丁香假单胞菌、青枯劳尔氏菌、大丽轮枝菌、灰霉菌、柑橘溃疡致病菌、苹果腐烂致病菌或小麦赤霉菌引起的植物病害。
20.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
21.本发明通过生物催化的方法使壳寡糖c6位羟基转变为羧基，提升了糖链对铜离子的络合容量及络合物的稳定性，使得6-羧基壳寡糖-铜样品中铜离子含量最高可达27.1％，与常规铜制剂中铜离子含量处于同一水平。该络合物对多种致病性细菌和真菌展现出良好的抑制效果，同时能够保持壳寡糖的免疫诱抗活性。
附图说明
22.图1为实施例1的壳寡糖maldi-tof质谱分析，
23.其中1为壳二糖，2为壳三糖，3为壳四糖，4为壳五糖，5为壳六糖，6为壳七糖，7为壳八糖，8为壳十糖；
24.图2为实施例1的壳寡糖nmr-1
h谱分析；
25.图3壳寡糖(cos)和6-羧基壳寡糖(c-cos)的红外图谱。
具体实施方式
26.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.本发明提供了一种6-羧基壳寡糖-铜络合物的制备方法，包括如下步骤：
28.将壳寡糖溶液的ph值调整至4.0～6.0，得到调整ph值后的壳寡糖溶液；
29.将所述调整ph值后的壳寡糖溶液、2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基和漆酶混合，在20～40℃通氧反应2～10h，得到6-羧基壳寡糖溶液；
30.将所述6-羧基壳寡糖溶液与含铜化合物混合，在44～55℃反应2～4h，得到6-羧基壳寡糖溶液-铜络合物；
31.所述含铜化合物为五水硫酸铜、一水合乙酸铜或二水合氯化铜。
32.本发明将壳寡糖溶液的ph值调整至4.0～6.0，得到调整ph值后的壳寡糖溶液。在本发明中，优选调整ph至5.0。
33.在本发明中，所述壳寡糖溶液优选采用如下步骤制备得到：
34.将脱乙酰度≥85％的壳聚糖、水和有机酸/盐酸混合，溶胀，得到溶胀后的壳聚糖；
35.将所述溶胀后的壳聚糖采用壳聚糖酶水解，得到壳寡糖溶液。
36.在本发明中，所述壳聚糖与水的质量比优选为1∶5～20；更优选为1∶10。在本发明中，所述有机酸/盐酸的用量优选为壳聚糖质量的5％～50％，更优选为20％～30％。在本发明中，所述有机酸优选为冰乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、丁酸和丁二酸中的一种或两种。
37.在本发明中，所述溶胀时的温度优选为30～65℃，更优选为40～50℃；溶胀的时间优选为4～24h，更优选为10～16h。
38.在本发明中，所述壳聚糖酶的用量优选为2～16u/g壳聚糖，更优选为6～10u/g壳聚糖。在本发明中，所述水解时的温度优选为30～65℃，更优选为40～60℃；水解的时间优选为3～6h。在本发明中，水解结束后优选进行过滤，得到澄清的壳寡糖溶液。在本发明中，所述过滤的方式优选为真空抽滤，优选采用硅藻土作为助滤剂。
39.本发明中壳聚糖酶采购自黄河三角洲京博化工研究院有限公司，产品形式为液体，酶活≥1000u/ml。
40.在本发明中，优选采用如下方法测定壳聚糖酶酶活：(1)壳聚糖溶胀。称取2.0g(精确到0.01g)壳聚糖样品(记为m)至烧杯中，加入100ml水，搅拌使壳聚糖充分润湿。然后加入0.75ml冰醋酸，于35℃搅拌溶胀30min，直至物料变成粘稠、均一液体。(2)酶解。按照预计的酶活水平加入一定体积(记为v)的酶液，自加入酶液开始计时。(3)终点判定。定时取样，将酶解液滴加至0.1mol/l的naoh溶液中，无白色沉淀产生时视为反应终点。记录所用时间(记为t)。控制反应时间10-20min为宜。(4)结果计算。酶活＝m*1000/(v*t)，单位为u/ml。
41.得到调整ph值后的壳寡糖溶液后，本发明将所述调整ph值后的壳寡糖溶液、2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基和漆酶混合，在20～40℃通氧反应2～10h，得到6-羧基壳寡糖溶液。在本发明中，按重量百分比计，所述2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基的添加量优选为壳寡糖的1％～8％，更优选为3％～6％。
42.在本发明中，所述漆酶的添加量优选为2.5～5.0u/g壳寡糖。在本发明中，所述漆酶购买自黄河三角洲京博化工研究院有限公司。所述漆酶的酶活≥100u/ml。
43.在本发明中，通氧反应结束后，优选进行真空抽滤。得到6-羧基壳寡糖溶液，若不急于制备6-羧基壳寡糖溶液-铜络合物，为了便于储存，还可将该6-羧基壳寡糖溶液进行喷雾干燥或真空干燥，得到固体样品。
44.得到6-羧基壳寡糖溶液后，本发明将所述6-羧基壳寡糖溶液与含铜化合物混合，在44～55℃反应2～4h，得到6-羧基壳寡糖溶液-铜络合物；所述含铜化合物为五水硫酸铜或一水合乙酸铜或二水合氯化铜。
45.在本发明中，所述6-羧基壳寡糖溶液中的6-羧基壳寡糖与含铜化合物的质量比优选为1∶1～5。
46.在本发明中，得到6-羧基壳寡糖溶液-铜络合物或6-羧基壳寡糖溶液后，本发明可进一步加工成悬浮剂、可湿性粉剂、可溶液剂等产品。
47.本发明通过添加漆酶进行反应的生物催化方法使壳寡糖c6位羟基转变为羧基，c6位羟基转变为羧基后可提升糖链对铜离子的络合容量及络合物的稳定性，使得6-羧基壳寡糖-铜样品中铜离子含量最高可达27.1％，与常规铜制剂中铜离子含量处于同一水平。该络合物对多种致病性细菌和真菌展现出良好的抑制效果，同时能够保持壳寡糖的免疫诱抗活性。
48.本发明提供了一种上述任意一项方法制备得到的6-羧基壳寡糖-铜络合物作为杀菌剂的用途。
49.在本发明中，所述杀菌剂用于防治由丁香假单胞菌、青枯劳尔氏菌、大丽轮枝菌、灰霉菌、柑橘溃疡致病菌、苹果腐烂致病菌或小麦赤霉菌引起的植物病害。
50.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
51.实施例1
52.将55g壳聚糖粉末(脱乙酰度91％，灰分1.5％，水分8.5％)分散到450g去离子水中，搅拌使其充分润湿；加入20g冰乙酸，于40℃、搅拌状态下使壳聚糖溶胀6h；然后加入0.2ml酶活为1000u/ml的壳聚糖酶，40℃水解3h；向该水解液中加入4g硅藻土并使其分散均匀，真空抽滤，得含量10％壳寡糖溶液(按质量百分比计)，或者进一步冷冻干燥获得壳寡糖粉末，该粉末中壳寡糖含量90％。如图1所示，经质谱分析，所得壳寡糖聚合度2-10。图2为所得壳寡糖的核磁共振氢谱，表明所得壳寡糖样品的带有部分乙酰基团，乙酰基含量为9.2％。
53.实施例2
54.(1)取实施例1中制备的含量10％壳寡糖溶液200g(ph值调整至5.0)，加入0.8g tempo(2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基)，放置35℃水浴锅中搅拌反应15min；添加0.8ml漆酶(酶活105u/ml)，进行持续8h的通氧反应；通氧结束后用液碱调节反应液至中性，加入4g硅藻土并使其分散均匀，真空抽滤，获得10％6-羧基壳寡糖溶液。将反应液进行旋蒸浓缩至100ml，转移至烧杯中并加入400ml无水乙醇，静置30min；待反应产物析出后，进行真空抽滤，反复醇洗过滤产物至醇洗液澄清；将滤饼放置真空干燥箱50℃烘干24h，烘干后研磨得样品粉末。经测定，该样品羧化率为80％-85％，说明大部分c6位羟基被氧化为羧基。图3为实施例1中所得壳寡糖和本实施例中所得6-羧基壳寡糖的红外图谱。
55.6-羧基壳寡糖粉末中羧化率测定：称取0.2g样品，溶于10ml 0.1mol/l的hcl溶液中进行酸化，溶解后再加入90ml水稀释。打开自动电位滴定仪，使用0.1mol/l的naoh标准溶液进行滴定。记录naoh的消耗体积和电导率，通过式(1)计算样品的羧化率。
[0056][0057]
式中：v1、v2、v3和v4分别为壳寡糖溶液和样品溶液滴定曲线的计量点，代表naoh的消耗体积，ml；c为naoh溶液的浓度，mol/l；m为样品质量，g；45为羧基的相对分子质量；0.257为c6位羟甲基全部转变为羧基后羧基的理论占比。
[0058]
图3为所得6-羧基壳寡糖(c-cos)与壳寡糖(cos)的红外图谱。对比可知：两者出峰位置大致相同，2 880cm-1
和2930cm-1
处为c-h的伸缩振动峰，主要代表了c6位的亚甲基和c2位所连接的乙酰氨基上的甲基；c-cos的1600cm-1
与1410cm-1
处出现了新的较为明显的c＝o不对称伸缩振动吸收峰，说明壳寡糖氧化后新生成了羧基。
[0059]
(2)取10％6-羧基壳寡糖溶液200g，加入28g-水合乙酸铜，搅拌状态下于40℃反应2h，获得6-羧基壳寡糖-铜络合物溶液。
[0060]
取50ml上述制备得到的6-羧基壳寡糖-铜络合物溶液，加入200ml无水乙醇使6-羧基壳寡糖-铜沉淀，过滤，并用50ml 80％乙醇(v/v)冲洗滤饼2次，分别收集滤液和滤饼；检
测滤液中铜离子含量和总量，计算络合率为87.9％；滤饼50℃烘干(水分≤5％)后粉碎，得6-羧基壳寡糖-铜粉末，该样品中铜离子含量为27.1％。
[0061]
实施例3
[0062]
制备方法同实施例2，区别在于，tempo的加入量、含铜化合物及反应条件等参数有所区别，具体步骤如下：
[0063]
(1)取实施例1中制备的含量10％壳寡糖溶液200g(ph值调整至5.0)，加入1.6g tempo(2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基)，放置35℃水浴锅中搅拌反应15min；添加0.8ml漆酶(酶活105u/ml)，进行持续6h的通氧反应；通氧结束后用液碱调节反应液至中性，加入4g硅藻土并使其分散均匀，真空抽滤，获得10％6-羧基壳寡糖溶液。将反应液进行旋蒸浓缩至100ml，转移至烧杯中并加入400ml无水乙醇，静置30min；待反应产物析出后，进行真空抽滤，反复醇洗过滤产物至醇洗液澄清；将滤饼放置真空干燥箱50℃烘干24h，烘干后研磨得样品粉末。经测定，该样品中羧化率为86.8％-92.2％，说明大部分c6位羟基被氧化为羧基。
[0064]
6-羧基壳寡糖粉末中羧化率测定：称取0.2g样品，溶于10ml 0.1mol/l的hcl溶液中进行酸化，溶解后再加入90ml水稀释。打开自动电位滴定仪，使用0.1mol/l的naoh标准溶液进行滴定。记录naoh的消耗体积和电导率，通过式(1)计算样品的羧化率。
[0065][0066]
式中：v1、v2、v3和v4分别为壳寡糖溶液和样品溶液滴定曲线的计量点，代表naoh的消耗体积，ml；c为naoh溶液的浓度，mol/l；m为样品质量，g；45为羧基的相对分子质量；0.257为c6位羟甲基全部转变为羧基后羧基的理论占比。
[0067]
(2)取10％6-羧基壳寡糖溶液200g，加入35g五水合硫酸铜，搅拌状态下于50℃反应4h，获得6-羧基壳寡糖-铜络合物溶液。
[0068]
取50ml上述制备得到的6-羧基壳寡糖-铜络合物溶液，加入200ml无水乙醇使6-羧基壳寡糖-铜沉淀，过滤，并用50ml 80％乙醇(v/v)冲洗滤饼2次，分别收集滤液和滤饼；检测滤液中铜离子含量和总量，计算络合率为87.2％；滤饼50℃烘干(水分≤5％)后粉碎，得6-羧基壳寡糖-铜粉末，该样品中铜离子含量为26.1％。
[0069]
实施例4
[0070]
制备6-羧基壳寡糖-铜可湿性粉剂
[0071]
(1)取实施例2制备得到的6-羧基壳寡糖-铜粉末50份，葡萄糖6份、淀粉5份、羧甲基纤维素0.03份、湿润剂1004 8份、分散剂nno 1份，高岭土30份，混合均匀。
[0072]
(2)将步骤(1)中混合均匀的物料在气流粉碎机中粉碎到150筛目以上，得到6-羧基壳寡糖-铜可湿性粉剂(该可湿性粉剂水分在5wt％以下，ph在6.5-7.5)。
[0073]
对比例1
[0074]
取实施例1中制备的含量10％壳寡糖溶液200g，搅拌状态下逐渐加入一水合乙酸铜，直至出现沉淀后停止加入，一水合乙酸铜的总加入量为13.3g。搅拌状态下于40℃反应2h，获得壳寡糖-铜络合物溶液。取50ml该反应液，加入200ml无水乙醇使壳寡糖-铜沉淀，真空抽滤，并用50ml 80％乙醇(v/v)冲洗滤饼2次，分别收集滤液和滤饼；检测滤液中铜离子含量和总量，计算铜离子络合率为82.3％；滤饼50℃烘干(水分≤5％)后粉碎，得壳寡糖-铜粉末，该粉末中铜离子含量为12.9％。
[0075]
通过和实施例2进行比较可知，本发明提供的方法能够提升糖链对铜的络合容量。
[0076]
性能测试1
[0077]
对作物致病性细菌的mic值测定
[0078]
分别采用实施例1制备的壳寡糖粉末、实施例2制备的6-羧基壳寡糖、6-羧基壳寡糖-铜粉末、实施例4制备的6-羧基壳寡糖-铜可湿性粉剂、对比例1制备的壳寡糖-铜粉末及市售可湿性粉剂进行测定，具体种类和基本组成如表1所示：
[0079]
表1待测药剂的种类和基本组成
[0080][0081]
采用微量肉汤稀释法测试上述表1中的药剂对丁香假单胞菌(分离自黄瓜)和青枯劳尔氏菌(分离自大姜)、柑橘溃疡致病菌的mic。
[0082]
具体步骤包括：
[0083]
a.抗菌药剂的制备：按照表1制备各药剂，并进行适当稀释使药剂浓度达到8192μg/ml，该稀释液作为贮备液。配制好的贮备液应贮存于-20℃环境，保存期不超过6个月。
[0084]
b.待测菌的制备：
①
细菌活化：将50ml lb种子培养基加入到250ml三角瓶中，接种一环保存于4℃的细菌斜面种子，160r/min，37℃培养过夜。
②
菌量确定：取1ml活化好的菌液加入到9ml无菌水中，依次稀释6个梯度，取稀释后的菌液100μl均匀涂布于固体lb培养基的平板上，37℃下培养过夜，进行平板计数。如果培养液含菌数1
×
108cfu/ml，用lb培养基稀释100倍，即得到约含菌数1
×
106cfu/ml的菌液，备用。
[0085]
c.取无菌的96孔板，第一孔加入200μl的杀菌剂，第二至十孔分别加入100μl的肉汤培养基，从第一孔吸取100μl加入第二孔，混匀，再吸取100μl至第三孔，依次类推，第十孔吸取100μl弃去。第十一孔加入200μl菌液，第十二孔加入200μl肉汤培养基。
[0086]
d.然后在1至10孔各加入100μl之前备好的菌液，使每管最终菌液浓度约为5
×
105cfu/ml。将接种好的96孔板放置37℃培养箱进行培养，24h观察菌液生长情况。
[0087]
无细菌生长孔内所含杀菌剂浓度(铜络合物以其总量为计算基准)即为该药剂对该菌的mic值。各药剂对该菌的mic值如表2所示。
[0088]
表2各药剂对三种致病性细菌的mic值(μg/ml)
[0089]
编号丁香假单胞菌青枯劳尔氏菌柑橘溃疡致病菌1102420484096251251220483102420484096425625620485128256102461282561024
[0090]
由表2可以看出：
[0091]
(1)壳寡糖及6-羧基壳寡糖对三种细菌的抑制能力均较弱，mic值为琥胶肥酸铜的4-8倍。
[0092]
(2)6-羧基壳寡糖-铜对三种细菌的抑制能力优于壳寡糖-铜，这一方面与前者铜含量较高有关；另一方面可能与络合物的微观结构有关。
[0093]
(3)6-羧基壳寡糖-铜对三种细菌的抑制能力与市售30％琥胶肥酸铜相当。
[0094]
(4)实施例4制备的6-羧基壳寡糖-铜可湿性粉剂中的铜含量低于实施例3所得6-羧基壳寡糖-铜中的铜含量，但是抑菌效果优于实施例3，可能是由于制作成制剂，助剂产生增效作用。
[0095]
性能测试2
[0096]
对作物致病性真菌的抑制效果
[0097]
具体测试用药剂及测试结果如表3所示。
[0098]
(1)真菌活化：挑取保存于4℃的斜面的真菌种子，转接于冷却凝固的pda平板中，28℃恒温培养箱中培养6天。
[0099]
(2)表1所列固体样品在紫外灯下照射杀菌30min。
[0100]
(3)分别配制不同浓度样品的的pda固体培养基，分别配制为不同浓度梯度后倒平板。
[0101]
(4)从pda上培养6天的各菌株菌落边缘打取直径6mm的菌饼，菌丝面向下，接种于已经凝固的pda培养基中央，置于28℃恒温培养箱内，培养5天，用十字交叉法量取菌落直径，每个处理3次重复。以不加任何样品的pda培养基作为空白对照，啶酰菌胺为阳性对照。
[0102]
(5)抑制率的计算：抑制率＝(对照培养基菌落直径-处理培养基菌落直径)/对照培养基菌落直径
×
100％
[0103]
表3各药剂对致病性真菌100％抑制所需浓度(％)
[0104][0105]
由表3结果看以看出，6-羧基壳寡糖-铜对四种真菌的抑制效果明显优于壳寡糖-铜。
[0106]
性能测试3
[0107]
对黄瓜角斑病的防治效果测试
[0108]
测试用药及各药剂用量如表4所示。
[0109]
表4测试用药剂
[0110][0111]
测试表4中的药剂对温室黄瓜角斑病的防治效果，种植后的黄瓜按常规生产管理。
[0112]
具体步骤包括：使用背负式喷雾剂，使用表4的杀菌剂样品药液分别对各个区块的作物进行喷雾，空白对照组使用等量清水喷雾。分别于施药前1天、施药后7天调查发病情况，具体试验方法按照《农药田间药效试验准则》进行。按照公式计算防治效果，具体结果如表5所示。
[0113]
黄瓜角斑病以病斑占叶面积比例大小，分6级记录：
[0114]
0级：无病斑；
[0115]
1级：病斑面积占整个叶面积的1％-20％以下；
[0116]
2级：病斑面积占整个叶面积的21％-40％；
[0117]
3级：病斑面积占整个叶面积的41％-60％；
[0118]
4级：病斑面积占整个叶面积的61％-80％；
[0119]
5级：病斑面积占整个叶面积的81％-100％。
[0120]
根据调查数据，计算各处理的病情指数和防治效果。
[0121][0122][0123]
表5各处理对黄瓜角斑病的防效
[0124][0125][0126]
由表5可以看出，壳寡糖-铜对黄瓜角斑病的防效偏低，未超过60％；6-羧基壳寡糖-铜及30％琥胶肥酸铜在用量分别为10g/亩、200g/亩时防效相当，均达到70％以上；6-羧基壳寡糖-铜在用量较低的情况下产生了较高的防效，除了与其铜含量较高外，也可能与6-羧基壳寡糖对植物细胞的免疫激活产生的协同增效作用有关。
[0127]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。