能耐受高浓度壳寡糖的马克斯克鲁维酵母基因工程菌及其制备方法和应用与流程

1.本技术属于生物工程技术领域，具体涉及能耐受高浓度壳寡糖的马克斯克鲁 维酵母基因工程菌及其制备方法和应用。


背景技术：

2.壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用 得到的，是天然中仅次于纤维素的第二丰富的多糖，在食品、医药、环保领域有 广泛的应用。但壳聚糖具有分子量大、水溶性差的特点，大大限制了其应用。壳 寡糖(chitooligosaccharides，cos)是由2-10个氨基葡萄糖通过β-1，4糖苷键连 接而成的低分子量多糖，结构式如下：
[0003][0004]
cos是壳聚糖的降解产物，它不但保留了壳聚糖的某些功能特性，还具有 更高的水溶性等特点使其具有应用价值。cos具有抗菌、抗氧化、抗血管生成、 抗肿瘤、抗炎和益生元等特性。随着壳寡糖应用领域的不断扩展，寻求稳定、高 效的壳寡糖绿色生物合成方法成为了当前亟待解决的关键问题。
[0005]
当前，壳寡糖的制备方法主要包括物理法、化学法和酶解法三大类。采用物 理、化学法对制备特定分子量壳寡糖可控性差，并且易对环境造成污染。近年来， 酶解法因反应条件温和、副产物含量低，产物得率高等优势，是制备壳寡糖产业 研究开发的研究热点。有研究报道，发现通过芽孢杆菌产生的几丁质酶能够水解 几丁质形成低分子量的壳寡糖产物。而来自解淀粉芽孢杆菌来源的内切型壳聚糖 酶降解产物中高聚合度的壳寡糖(dp 5-10)所占比例达到56.17％。park等人开 发一种生产不同聚合度壳寡糖的有效体系，利用芽孢杆菌sp.p21来源的壳聚糖 酶最终获得的壳寡糖聚合度分布在dp 3-7。综上所述，利用生物酶技术降解壳聚 糖是目前壳寡糖制备的主要途径。然而目前通过壳聚糖酶来生产壳寡糖过程中仍 存在缺乏高活力专一性酶、酶制剂成本高、转化效率低、精制工艺难等问题。而 采用全细胞高效催化策略生产壳寡糖不仅简化了生产工艺流程，同时无需酶的提 取和纯化，减少了酶活损失，有望大幅降低生产成本。然而在使用该方法时仍面 临壳聚糖酶活力低、产物的抑菌性使得全细胞催化效率低。因此，建立稳定、耐 受壳寡糖的全细胞催化合成壳寡糖生产工艺，具有巨大的应用价值和工业化潜 力。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术中存在的问题，本发明要解决的技术问题是提供一株能耐受高 浓度壳寡糖的马克斯克鲁维酵母基因工程菌，满足制备壳寡糖的使用需求。本申 请所要解决
的另一技术问题是提供上述马克斯克鲁维酵母基因工程菌的制备方 法。本技术还要解决的技术问题是提供马克斯克鲁维酵母基因工程菌的应用。
[0007]
为解决上述技术问题，本技术采用的技术方案为：
[0008]
一株能耐受高浓度壳寡糖的马克斯克鲁维酵母基因工程菌，在所述的马克斯 克鲁维酵母菌中克隆有壳聚糖酶基因chia；所述的壳聚糖酶基因的核苷酸序列 如seq id no.1所示。
[0009]
在所述的壳聚糖酶基因chia的n端融合了菊粉酶基因的信号肽；所述的菊 粉酶基因的信号肽序列如seq id no.2所示。
[0010]
所述的马克斯克鲁维酵母菌能耐受不低于50g/l壳寡糖。
[0011]
所述的能耐受高浓度壳寡糖的马克斯克鲁维酵母基因工程菌的构建方法，包 括如下步骤：
[0012]
1)以4％-6％浓度的壳寡糖为筛选压力，对马克斯克鲁维酵母菌株进行连续 培养传代，获得具有耐受高浓度壳寡糖的优势菌株；
[0013]
2)将融合了菊粉酶基因信号肽的壳聚糖酶基因spinu-chia连接到马克斯克 鲁维酵母表达质粒prsg上，得到重组质粒prsg-spinu-chia；将重组质粒利用 peg-醋酸锂转化法转化至马克斯克鲁维酵母km35，即得到重组马克斯克鲁维酵 母菌。
[0014]
步骤1)中，在筛选培养时，壳寡糖浓度分别为40g/l、50g/l和60g/l3 个阶段驯化培养，第一阶段驯化在第20天完成，将收获的最后一批培养种群进 行稀释涂布，以进行克隆选择和表型测试；从平板上随机挑选10个菌落，选择 其中生长速率最快的优势菌株进行下一轮驯化；经过三轮驯化后，最终获得具有 耐受高浓度壳寡糖的优势菌株。
[0015]
步骤2)中，具体的构建过程如下：
[0016]
(1)分别以马克斯克鲁维酵母km35基因组为模板，利用引物spinu-f和 spinu-r扩增seq id no.2所示的菊粉酶基因信号肽的核苷酸序列；分别以 puc57-chia质粒为模板利用引物chia-f和chia-r扩增seq d no.1所示的不 含原始信号肽的壳聚糖酶基因核苷酸序列；各引物序列如下：
[0017]
spinu-f：5
’‑
aaagatacaaaaatggtcgacatgaagttagcatactccctcttgc-3’；
[0018]
spinu-r：5
’‑
cttttggtctttatttagcccggcagccttgtaattgatcactgaagca-3’；
[0019]
chia-f：5
’‑
tgcttcagtgatcaattacaaggctgccgggctaaataaagaccaaaag-3’：
[0020]
chia-r：5
’ꢀ‑
taactaattacatgacccgggttacttaattacaaagttaccatattcgttac-3’；
[0021]
pcr扩增体系为：模板质粒puc57-chia或马克斯克鲁维酵母km35基因组： dna2μl，上游引物和下游引物：各2μl，primestar高保真酶：12.5μl，ddh2o： 6.5μl；
[0022]
pcr反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s；然后55℃退火30s， 72℃延伸1min，循环30次；
[0023]
分别回收pcr扩增产物spinu和chia基因片段，利用重叠pcr进行融合 成片段spinu-chia，重叠pcr扩增体系为：spinu和chia基因片段：各2μl， 上游引物和下游引物：各2μl，primestar高保真酶：12.5μl，ddh2o：4.5μl； 重叠pcr反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性30s；然后55℃退火1min， 72℃延伸2min，循环35次；
[0024]
融合后的dna片段spinu-chia与经过限制性内切酶sal i和sma i双酶切 后的质粒prgs，使用一步克隆法exnase ii作用下进行连接，转化产物分别转 化至大肠杆菌dh5α；
15000marker；泳道2：prgs-spinu-chia经sal i和sma i双酶切(目的 条带800bp)；
[0040]
图3是重组酵母发酵液上清sds-page蛋白胶图验证结果图；
[0041]
图4是重组酵母在发酵过程中壳寡糖的转化率结果图。
具体实施方式
[0042]
下面结合具体实施例对本技术做进一步的说明。
[0043]
以下实施例所使用的主要材料和试剂盒为：e.coli dh5a感受态(诺威赞公司 购买)，引物合成与dna测序(南京金斯瑞生物科技有限公司)，primestar高 保真酶(takara)，限制性内切酶sal i和sma i(takara)，dnamarker(takara)， 质粒提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，胶回收试剂盒(南京诺唯赞 生物科技有限公司)，一步克隆连接exnase ii试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限 公司)，prsg质粒为自主构建的马克斯克鲁维酵母表达质粒(构建流程如图2)。
[0044]
发酵液中壳寡糖检测方法：产物使用lc-1260系统测定，分离柱为alltechchrom prevail carbohydrate es5μ柱(4.6mm
×
250mm)，(santa clara，ca)。流 动相由乙腈和水组成，梯度洗脱条件为：0min，75％乙腈；7min，75％乙腈；8 min，65％乙腈；15min，65％乙腈；16min，75％乙腈；22min，75％乙腈。柱 温为40℃，流速为1ml/min。产物的定性以标品为对照；定量以几丁寡糖(dp 2～6)标准品不同浓度峰面积计算得出。
[0045]
菌株：本技术所使用的菌株为马克斯克鲁维酵母，是本技术人自主分离筛选 到的一株马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)，经鉴定与本领域的其他 马克斯克鲁维酵母相同，而马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)km35 通过实施例1的方法驯化获得，本领域技术人员可以采用其他马克斯克鲁维酵母 利用本技术的方法进行试验，可以获得目标效果。
[0046]
实施例1马克斯克鲁维酵母基因工程菌的构建
[0047]
马克斯克鲁维酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0048]
1)由于壳寡糖的抑菌性，为获得能够耐受壳寡糖产物的底盘，借助当实验 室驯化技术，以4％-6％浓度的壳寡糖为筛选压力，对k marxianus菌株进行连续 培养传代。如图1所示，它显示了在富含高浓度壳寡糖培养基(40g/l、50g/l 和60g/l)中，菌体生物量(od
600
)随着壳寡糖浓度升高而变化的情况，该过 程经历了3个阶段，共耗时58天。第一阶段驯化在第20天完成，将收获的最后 一批培养种群进行稀释涂布，以进行克隆选择和表型测试。从平板上随机挑选 10个菌落，选择其中生长速率最快的优势菌株进行下一轮驯化(图1)。最终经 过三轮驯化后，获得了具有耐受高浓度壳寡糖的优势菌株，命名为k.marxianuskm35。
[0049]
2)将融合了菊粉酶基因信号肽的壳聚糖酶基因spinu-chia连接到马克斯克 鲁维酵母表达质粒prsg上，得到重组质粒prsg-spinu-chia将重组质粒利用 peg-醋酸锂转化法转化至马克斯克鲁维酵母km35，即得到重组马克斯克鲁维酵 母菌(图2)。具体的构建方法如下：
[0050]
(1)分别以马克斯克鲁维酵母km35基因组为模板，利用引物spinu-f和 spinu-r扩增seq id no.2所示的菊粉酶基因信号肽的核苷酸序列；分别以 puc57-chia质粒为模板利用引物chia-f和chia-r扩增seq id no.1所示的不 含原始信号肽的壳聚糖酶基因核苷酸
序列；各引物序列如下：
[0051]
spinu-f：5
’‑
aaagatacaaaaatggtcgacatgaagttagcatactccctcttgc-3’：
[0052]
spinu-r：5
’‑
cttttggtctttatttagcccggcagccttgtaattgatcactgaagca-3’：
[0053]
chia-f：5
’‑
tgcttcagtgatcaattacaaggctgccgggctaaataaagaccaaaag-3’：
[0054]
chia-r：5
’ꢀ‑
taactaattacatgacccgggttacttaattacaaagttaccatattcgttac-3’；
[0055]
pcr扩增体系为：模板质粒puc57-chia或马克斯克鲁维酵母km35基因组： dna2μl，引物spinu-f和引物spinu-r(引物chia-f或引物chia-r)：各2μl， primestar高保真酶：12.5μl，ddh2o：6.5μl。
[0056]
pcr反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s；然后55℃退火30s， 72℃延伸1min，循环30次。
[0057]
分别回收pcr扩增产物spinu和chia基因片段，利用重叠pcr进行融合 成片段spinu-chia，重叠pcr扩增体系为：spinu和chia基因片段：各2μl， 引物spinu-f和chia-r：各2μl，primestar高保真酶：12.5μl，ddh2o：4.5 μl；重叠pcr反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性30s；然后55℃退火 1min，72℃延伸2min，循环35次。
[0058]
融合后的dna片段spinu-chia与经过限制性内切酶sal i和sma i双酶切 后的质粒prgs，使用一步克隆法exnase ii作用下进行连接，转化产物分别转 化至大肠杆菌dh5α。从氨苄青霉素抗性平板分别挑取转化子转接于5ml含有 25μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，在37℃、200rpm条件下过夜培养， 经质粒提取后经限制性内切酶sal i和sma i双酶切质粒，重组质粒 prgs-spinu-chia构建成功的结果如图2所示，则为阳性克隆菌株。
[0059]
(2)将验证成功的重组质粒prgs-spinu-chia转化至马克斯克鲁维酵母 km35，涂布于含50μg/ml g418抗性的固体培养基上，37℃培养12-16小时得 到初步阳性克隆；经抗性培养基筛选得到酵母转化子转接液体培养后，使用酵母 质粒提取试剂盒进行质粒双酶切验证，根据电泳结果判断，含有800bp片段的 质粒对应的菌株，即为含有壳聚糖酶酶基因的重组马克斯克鲁维酵母菌km35。
[0060]
实施例2全细胞催化合成壳寡糖
[0061]
利用实施例1制备的基因工程菌株全细胞催化合成壳寡糖的步骤如下：
[0062]
1)将构建成功的重组马克斯克鲁维酵母km35在30～37℃条件下进行活化， 将菌株接到ypd培养基中，30～37℃、100～250rpm培养10-16h至od
600
大于 4.0。
[0063]
2)将培养好的种子液以2-10％的接种量接种于含有壳聚糖底物的发酵培养 基，在30～37℃、100～250rpm条件下进行好氧培养60h。其中，发酵培养基包 含如下组分：葡萄糖1～50g/l，酵母粉1～5g/l，蛋白胨1～10g/l，kh2po
4 1～10 g/l，mgso40.3 1～10g/l，吐温-80 0.1～0.5％，其余为水，ph 5.0。
[0064]
3)利用7.5l发酵罐放大，在以原料50g/l壳寡糖为底物进行催化发酵， 发酵结束后，通过测定重组菌株发酵液中壳聚糖酶活性、壳寡糖的含量和聚合度， 结果如图3和图4所示，最终获得37g/l的壳寡糖，壳寡糖分子量低于2000da， 产物的主要聚合度为dp2-dp5，产量分别占4％、16％、30％、50％，壳寡糖转 化率达到74％，此外酶活测定结果表明重组菌株的壳聚糖酶实现了胞外分泌表 达，体积酶活达到2300u/ml。利用该工艺可实现胞外合成特定聚合度的壳寡糖 新发酵工艺。