表达G2型猪流行性腹泻病毒S/S1的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒及其应用的制作方法

表达g2型猪流行性腹泻病毒s/s1的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒及其应用
技术领域
1.本发明涉及表达g2型猪流行性腹泻病毒s/s1的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒及其应用，属于兽用生物制品技术领域。


背景技术：

2.猪流行性腹泻(ped)是严重危害全球养猪业的烈性传染病。临床上能引起仔猪腹泻，呕吐，脱水和代谢性酸中毒等症状。其病原体猪流行性腹泻病毒(pedv)为单股正链rna 病毒，属于冠状病毒科阿尔法冠状病毒属(cov-α)。pedv可以感染所有年龄猪，10日龄内仔猪感染后发病率和死亡率都可达到100％。疫苗免疫是防控ped的有效方法，然而，现有 pedv商品化疫苗(包含灭活疫苗以及基于g1型毒株的弱毒疫苗)无法为2010年以来出现的新型pedv变异株(g2型)提供足够的交叉保护力。猪繁殖与呼吸综合征(prrs)同样给全球养猪业造成巨大经济损失。临床上主要引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统综合征。其病原体猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)为单股正链rna病毒，属于动脉炎病毒科(arteriviridae)。prrsv是目前已知变异最快的rna病毒之一，然而，现有商品化疫苗无法提供抵抗新型流行株的良好交叉保护。
3.纤突蛋白(spike,s)是pedv的主要跨膜蛋白。s蛋白一般可分为2个结构域：s1和 s2。s1(1-789氨基酸)为高突变区，可识别并与特异性受体结合。s2(790-1383氨基酸)为保守区，主要与细胞膜融合。s蛋白主要位于病毒表面，可与细胞上的受体结合，并通过膜融合的方式使病毒进入宿主细胞。同时，s蛋白含有至少四个中和表位，在刺激宿主产生中和抗体诱导保护性免疫应答中起重要作用。因此，s蛋白常作为ped基因工程疫苗研制的靶标抗原。
4.反向遗传操作技术已成为新型基因工程疫苗研制的重要方法。为减轻当前猪群多种病原疫苗免疫压力，利用prrsv反向遗传操作技术研制同时防控ped和prrs的基因工程活疫苗，实现“一针防两病”具有重要意义。但相关研究尚未有报道。


技术实现要素：

5.针对目前缺乏同时有效防控我国pedv和prrsv流行株的商品化疫苗问题，本发明提供两株重组表达g2型pedv流行株s或s1基因的prrsv嵌合病毒。这两株嵌合病毒接种猪体均可同时诱导pedv和prrsv的中和抗体，为研制国内外首个pedv重组prrsv基因工程活载体疫苗，实现“一针两防”，提供了疫苗候选株。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种重组载体，用于构建表达g2型猪流行性腹泻病毒s蛋白的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.一种重组载体，用于构建表达g2型猪流行性腹泻病毒s1蛋白的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.表达g2型猪流行性腹泻病毒s/s1基因的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，利用如权利要求1或2所述重组载体所拯救构建。
10.在本发明的一个方面，提供了重组表达g2型pedv流行株s或s1蛋白的hp-prrsv 嵌合病毒。这两株嵌合病毒不仅包含全长hp-prrsv天然弱毒株jstz1712-12的全基因序列，还包含g2型pedv流行株xj1904-34(genbank登录号：ol348059)的s或者s1基因。
11.在本发明的另一个方面，提供了构建重组表达g2型pedv流行株s或s1基因的 hp-prrsv嵌合病毒的方法。具体包括以hp-prrsv天然弱毒株感染性克隆rjstz1712-12 为活病毒载体，利用同源重组或者双酶切连接等方法在其orf1b和orf2a基因之间插入g2 型pedv流行株s或s1基因序列。构建拯救表达g2型pedv流行株s或s1蛋白的prrsv 嵌合病毒。
12.在本发明的另一个方面，提供了一种活病毒载体。具体为hp-prrsv天然弱毒株感染性克隆rjstz1712-12活病毒载体。包含hp-prrsv jstz1712-12分离株基因组全长cdna序列，该全长cdna序列的5’端加有巨细胞病毒真核启动子序列，3’端poly(a)尾下游加有丁肝炎病毒核酶序列以及牛生长激素多聚腺苷酸信号转录终止序列；上述活病毒载体是以 pacyc177低拷贝载体为框架，在pacyc177载体上插入四个单一限制性酶切位点paci, aflii,asci和noti，用于构建天然弱毒株jstz1712-12感染性克隆。
13.优选的，所述的方法包括如下步骤：
14.1)pedv-s和pedv-s1基因扩增；
15.2)rjstz1712-12-s或rjstz1712-12-s1重组质粒的构建；
16.2-1：将pedv-s或pedv-s1片段插入rjstz1712-12-f3中间质粒；
17.2-2：将f3-s或f3-s1片段插入到rjstz1712-12全长质粒。
18.3)rjstz1712-12-s或rjstz1712-12-s1嵌合病毒拯救。
19.在本发明的另一个方面，嵌合病毒在制备新型基因工程疫苗中的应用。具体为，本发明提供了能同时抵抗我国pedv和prrsv流行株的新型基因工程活疫苗候选株。将上述构建拯救的两株嵌合病毒体外连续传代后用于接种猪体，均可同时诱导猪体产生抵抗pedv和prrsv的中和抗体，这两株嵌合病毒可用于制备新型pedv和prrsv的基因工程疫苗。
20.在本发明的另一方面，还涉及上述pedv和prrsv基因工程活疫苗在怀孕母猪免疫中的应用。上述嵌合病毒免疫母猪后诱导的pedv和prrsv中和抗体可通过母乳为新生仔猪提供抵抗pedv和prrsv流行株的感染。
21.有益效果：
22.本发明的显著特点包含：
23.1、以hp-prrsv天然弱毒株感染性克隆病毒为活疫苗载体，构建重组表达g2型pedv 流行株s或s1蛋白的嵌合病毒；
24.2、所构建的嵌合病毒有良好的体内外增殖效力，接种marc-145传代细胞均可引起细胞病变(cpe)，接种猪体可以出现特异性病毒血症；
25.3、所构建的嵌合病毒均具有良好的安全性，接种猪体后不引起发热(体外《40℃)，不影响增重，更不会引起仔猪死亡；
26.4、所构建的嵌合病毒可以诱导保护性免疫应答，接种猪均可同时诱导产生pedv和 prrsv的中和抗体；
27.5、所构建的嵌合病毒可用于研制同时抵抗pedv和prrsv流行株的新型基因工程疫
苗，减轻多种病原多次免疫压力，实现“一针防两病”，有利于我国ped和prrs疫情的防控。
附图说明
28.图1是本发明实施例1中rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1嵌合病毒基因组全长cdna 连接构建示意图；
29.图2是本发明实施例1中g2型pedv流行株xj1904-34的s和s1基因片段pcr扩增结果图；
30.图3是本发明实施例1中rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1重组质粒双酶切鉴定结果图；
31.图4是本发明实施例1中rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1感染性克隆病毒感染 marc-145细胞引起的细胞病变图；
32.图5是本发明实施例1中利用针对pedv的s蛋白单克隆抗体和针对prrsv的n蛋白单克隆抗体的间接免疫荧光检测法检测拯救的rjstz1712-12-s(a)和rjstz1712-12-s1(b)感染性克隆病毒结果图；
33.图6是本发明实施例1中利用荧光定量pcr方法检测rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1 感染性克隆病毒在marc-145细胞上的动态增殖结果图；
34.图7是本发明实施例1中rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1感染性克隆病毒感染marc-145细胞的噬斑结果图；
35.图8是本发明实施例2中rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1嵌合病毒接种猪体引起病毒血症结果图；
36.图9是本发明实施例2中rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1嵌合病毒接种猪体体温变化结果图；
37.图10是本发明实施例2中rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1嵌合病毒接种猪体体重变化结果图；
38.图11是本发明实施例2中rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1嵌合病毒接种猪血清体外中和g2型pedv流行株的病毒中和试验结果图；
39.图12是本发明实施例2中rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1嵌合病毒接种猪血清体外中和prrsv2流行株的病毒中和试验结果图。
40.核苷酸序列说明：
41.seq id no.1：重组载体rjstz1712-12-s的序列；
42.seq id no.2：重组载体rjstz1712-12-s1的序列；
43.seq id no.3：引物s/s1-kpni-fusion-f的序列；
44.seq id no.4：引物s-bcli-fusion-r的序列；
45.seq id no.5：引物s1-bcl1-fusion-r的序列。
具体实施方式
46.下列实施例中的常规实验方法，参见sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。
47.在本发明的实施例中，病毒有pedv的xj1904-34(genbank登录号：ol348059)和
yc2014(ku252649)分离株；prrsv的sd1612-1(mn119304)，jsyc2005-1(mt746146)和jstz1712-12(mk906026)分离株。细胞有bhk-21细胞系，vero细胞系和marc-145细胞系。
48.在本发明实施例中，质粒和菌株：pacyc177质粒购自优宝生物，rjstz1712-12-f3和 rjstz1712-12质粒(chen et al.,veterinary research,2021,52(1):74)保存于本实验室，trans1-t1 感受态细胞购自北京全式金生物有限公司。
49.在本发明实施例中，使用的其他试剂：rnase free h2o、胰酶细胞消化液(酚红)购自 solarbio公司；tripure reagent总rna提取试剂购自艾德莱生物公司；primescript1st strandcdna synthesis kit、2
×
primestar max dna polymearse购自takara公司；fastpureplasmid mini kit购自诺维赞生物科技有限公司；dmem培养基购自hyclone生物化学制品有限公司；胎牛血清购自sigma公司；dylight 594,goat anti-mouse igg(h l)secondaryantibody购自invitrogen；dna marker购自浙江博而金科技股份有限公司；2
×
biogold tag pluspcr mastermix购自浙江博而金科技股份有限公司；同源重组试剂盒cloneexpress multis onestep cloning kit购自vazyme公司；gel extraction kit购自北京康为世纪生物科技有限公司； dna限制性内切酶购自thermo fisher公司；t4 dna ligase、lipofectamine
tm
3000 transfection reagent购自invitrogen。
50.实施例1重组表达g2型pedv流行株s/s1蛋白的prrsv2嵌合病毒基因组全长cdna 克隆构建与拯救
51.1.1 pedv-s和pedv-s1基因扩增
52.为构建rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1重组质粒(图1)，首先根据我们实验室前期分离鉴定的g2型pedv野毒株xj1904-34基因组序列，使用primer 5.0设计s和s1基因的特异性扩增引物。详见表1。pcr反应体系详见表2。pcr反应程序详见表3。取pcr反应产物2μl，使用浓度为0.9％的琼脂糖凝胶进行电泳。如图2所示，获得pedv-s基因片段大小为4158bp，pedv-s1基因片段大小为2376bp。扩增产物均通过测序验证序列正确。
53.表1、扩增pedv的s和s1基因引物表
[0054][0055]
*特异性酶切位点由下划线标出。
[0056]
#
同源臂由斜体粗体标出。
[0057]
表2、扩增pedv的s和s1基因反应体系表
[0058] 名称体积模板xj1904-34cdna2μl引物s或s1引物对1μl试剂2
×
primestar max dna polymearse20μl
水rnase free h2o补至40μl
[0059]
表3、pedv的s和s1基因pcr扩增程序
[0060][0061]
1.2 rjstz1712-12-s或rjstz1712-12-s1重组质粒的构建
[0062]
1.2.1将pedv-s或pedv-s1片段插入rjstz1712-12-f3中间质粒
[0063]
用前期报道的相同方法(chen et al.,transboundary and emerging diseases,2020, 67:1820-1827)，bclⅰ和kpnⅰ对rjstz1712-12-f3中间载体质粒进行双酶切，获得 rjstz712-12-f3线性化载体片段。双酶切体系详见表4。反应条件：37℃水浴2h。
[0064]
表4、rjstz1712-12-f3-rfp质粒双酶切反应体系
[0065] 名称体积模板质粒rjstz712-12-f3质粒20μl内切酶bclⅰ2μl内切酶kpnⅰ2μl试剂10
×
cutsmart buffer4μl水rnase free h2o补至40μl
[0066]
利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收。使用同源重组的方法将pedv-s或s1基因连接到pjstz1712-12-f3线性化载体上。同源重组体系详见表5。
[0067]
表5同源重组体系
[0068][0069][0070]
将同源重组产物转化到trans1-t1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用检测引物进行菌液pcr检测。选取pcr阳性菌过夜增菌培养，提取质粒dna，使用ascⅰ和notⅰ进行双酶切鉴定，0.9％琼脂糖凝胶电泳，挑取酶切大小正确的重组质粒保留。
[0071]
按照上述方法，完成将pedv-s和pedv-s1插入到rjstz1712-12-f3中，获得 rjstz1712-12-f3-s或rjstz1712-12-f3-s1。
[0072]
1.2.2将f3-s或f3-s1片段插入到rjstz1712-12全长质粒
[0073]
用ascⅰ和notⅰ对rjstz1712-12(chen et al.,veterinary research,2021,52(1):74)和 rjstz1712-12-f3-s或rjstz1712-12-f3-s1进行双酶切，获得pjstz1712-12-f1 f2线性化载体和片段f3-s以及f3-s1。rjstz1712-12，rjstz1712-12-f3-s和rjstz1712-12-f3-s1双酶切体系详见表6。反应条件：37℃水浴2h。
[0074]
表6、重组质粒双酶切体系
[0075][0076]
利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收。胶回收的 rjstz1712-12-f1 f2线性化载体和片段f3-s或f3-s1按摩尔比为1:8,以t4dna连接酶连接，转化trans1-t1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用检测引物进行菌液pcr 检测。选取pcr阳性菌过夜增菌培养，提取质粒dna，然后，通过pacⅰ aflⅱ、aflⅱ ascⅰ和ascⅰ hf-notⅰ等内切酶组合对rjstz1712-12，rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1嵌合质粒进行双酶切鉴定，0.8％琼脂糖凝胶电泳。双酶切鉴定结果如图3所示，插入s基因后,f3-s片段的大小为7719bp，f3-s1的大小为5937bp。
[0077]
按照上述方法，完成rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1重组质粒的构建。这两个重组质粒序列详见seq id no.1和seq id no.2。
[0078]
1.3rjstz1712-12-s或rjstz1712-12-s1嵌合病毒拯救
[0079]
预先使用含10％fbs的dmem培养基将bhk-21细胞按2.5
×
105细胞/孔的密度接种于 24孔细胞培养板，置于37℃,5％co2的培养箱培养至细胞密度达到80％左右。按照 lipofectamine
tm
3000transfection reagent说明进行细胞转染，具体操作如下：
[0080]
首先在一个ep管中配置质粒预混液：感染性克隆质粒500ng,p3000 1μl,dmem 25μl；在另一个ep管中配置lip3000预混液：lip3000 1.5μl,dmem 25μl；最后将上述两步获得的预混液混合，室温静置15min,加入待转染的细胞。
[0081]
预先使用含10％fbs的dmem培养基将marc-145细胞按2
×
105细胞/孔的密度接种于 12孔细胞培养板，置于37℃,5％co2的培养箱培养，至细胞密度达到80％左右，换用含2％ fbs的dmem培养基。
[0082]
细胞转染后36-48h,将整个培养板冻于－80℃,反复冻融两次后取全部细胞悬液，10, 000
×
g离心1min。取全部上清加入marc-145细胞，继续培养，每天观察细胞情况。如图4所示，拯救病毒接种marc-145后72h后可见细胞出现皱缩、聚集、脱落等cpe现象，阴性对照组细胞无明显cpe产生。rjstz1712-12-s或rjstz1712-12-s1嵌合病毒与亲本毒株(rjstz1712-12)cpe特征基本一致。如图5所示，取第3代拯救病毒接种marc-145,48hpi 后使用pedv抗s2蛋白单抗anti-s2和prrsv抗n蛋白单抗ic9c8作为一抗进行ifa检测，可见pedv-s蛋白特异性绿色荧光，由于缺乏s1特异性单抗，未检测到s1特异性荧光信号，但两株重组病毒的prrsv-n蛋白均出现特异性红色荧光，阴性对照组无荧光产生，再次证实两株嵌合病毒均拯救成活。
[0083]
1.4 rjstz1712-12-s和s1与亲本毒rjstz1712-12的增值特性比对
[0084]
预先使用含10％fbs的dmem培养基将marc-145细胞按1
×
105细胞/孔的密度接种于 24孔细胞培养板，置于37℃,5％co2的培养箱培养，至细胞密度达到80％左右，换用含2％ fbs的dmem培养基。
[0085]
取rjstz1712-12、rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1第3代病毒液各200tcid
50
接种到24孔板的marc-145细胞上。取2hpi、24hpi、48hpi、72hpi和96hpi共五个时间点进行多步生长曲线测定。多步生长曲线测定结果如图6所示，rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1 的生长曲线与亲本毒rjstz1712-12无明显差异。
[0086]
1.5 rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1噬斑实验
[0087]
预先使用含10％fbs的dmem培养基将marc-145细胞按3
×
105细胞/孔的密度接种于6 孔细胞培养板，置于37℃,5％co2的培养箱培养，至细胞密度达到80％左右，换用含2％fbs 的dmem培养基。第二天观察细胞密度，直至细胞达到致密状态时进行下一步。
[0088]
将rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1第3代病毒原液做10倍倍比稀释，稀释梯度为
ꢀ‑
2～-4。将单层细胞的培养液弃去，加入600ul倍比稀释后的病毒液，感染1.5h，每20min 摇晃一次。1.5h后弃去病毒液,用pbs轻柔清洗1到2次,配置0.7％低熔点琼脂糖培养液(30ml 培养基配方:15ml dmem 600ul fbs 300ul青链霉素 最后倒入15ml1.4％低熔点琼脂液)，待冷却至37度左右，直接覆盖单层细胞。然后将6孔板倒置培养，四天后观察。空斑形成后，使用4％多聚甲醛覆盖培养基，固定过夜后进行结晶紫染色1h。染色完成后用水冲洗，观察。噬斑实验结果如图所示7所示，rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1的噬斑大小和形状与原毒相似。
[0089]
实施例2嵌合病毒rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1仔猪接种试验及其安全性和免疫效力评价
[0090]
2.1动物接种实验分组
[0091]
3周龄的仔猪分为3组，5头猪接种rjstz1712-12-s，5头猪接种rjstz1712-12-s1，3头猪作为阴性对照。实验组仔猪分别鼻内和肌内接种2ml 10
5.0
tcid
50
/ml rjstz1712-12-s和 rjstz1712-12-s1(第3代)。3只阴性组仔猪注射2ml dmem。具体如表7所示：
[0092]
表7动物实验分组
[0093][0094]
2.2动物实验prrsv特异性病毒血症监测
[0095]
接种rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1后，每周采集血清样本1～2次用于病毒载量测定。具体通过颈下前腔静脉采血，每次每只猪采血3ml。将采集的血清提取总rna，然后反转录为cdna，再用实时荧光定量(rt-pcr)法分析病毒血症动态。实时荧光定量法的具体反应体系和反应程序如下：
[0096]
rt-pcr的体系：probe 0.4μl、primer 0.5μl、rtaq 10μl和血清cdna 1μl，最后用
rnasefree h2o补至20μl。
[0097]
rt-pcr反应程序为：95℃30s热启动。95℃5s，60℃1min，40个循环。
[0098]
根据上述方法，完成对接种后仔猪体内的病毒载量检测，结果如图8所示，rjstz1712-12-s 和rjstz1712-12-s1成功在仔猪体内复制。
[0099]
2.3动物实验仔猪体温及体重测量
[0100]
在接种后每天对仔猪进行体温测量，用3个肛温温度计分别用于rjstz1712-12-s组、 rjstz1712-12-s1组和阴性对照组仔猪的直肠温度进行测量。体温测量结果如图9所示， rjstz1712-12-s组和rjstz1712-12-s1组仔猪体温与阴性对照组相似，未出现发热(《40℃)。每周称量体重并做临床症状每日评估。体重测量结果如图10所示，rjstz1712-12-s组和 rjstz1712-12-s1组仔猪的体重与阴性对照组相似，无明显差异。初步显示其具有较好安全性。
[0101]
2.4体外血清中和实验
[0102]
预先使用含10％fbs的dmem培养基将vero细胞按4
×
104细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板，置于37℃,5％co2的培养箱培养，至细胞密度达到80％左右。
[0103]
将采集的rjstz1712-12-s组、rjstz1712-12-s1组和阴性对照组仔猪血清用dmem按1：8、 1：16、1：32、1：64稀释。分别加入新96孔板中，然后在每个孔内加入100个tcid
50 yc2014 病毒。置于37℃,5％co2的培养箱培养1.5h。然后将对应的血清病毒混合液加入接种有vero 的96孔板的对应孔中。再置于37℃,5％co2的培养箱培养1.5h，使病毒吸附。随后用pbs洗去未吸附的病毒颗粒，加入含2％fbs的dmem培养基。四天后观察结果。prrsv的血清中和实验同样按照上述方法进行。
[0104]
中和实验结果如图11和图12所示，与阳性孔相比，接种rjstz1712-12-s和rjstz1712-12-s1 后，猪血清能够中和g2型pedv毒株，也能中和2型prrsv病毒，细胞没有病变出现。具体中和实验结果见表8。
[0105]
表8中和抗体产生总体情况
[0106]
[0107]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明技术方案而作的举例，并非对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明要求的保护范围之内。