一种可变体积合成柱及应用其的合成系统的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种可变体积合成柱及应用其的合成系统。


背景技术：

2.dna合成技术中，合成的判断片段常常有不同的表述方法，比如寡核苷酸、pcr引物、接头、探针、短链引物和长链引物等，而在实验室中，dna合成一般通过dna合成仪、dna合成柱等设备工具完成，dna合成过程简述如下:
3.第一步，将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸进行反应，从而脱去其5
′‑
羟基的保护基团dmt，能够获得游离的5
′‑
羟基。
4.第二步，合成dna的原料，使用亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，其3
′
端被活化，5
′‑
羟基仍然被dmt保护，从而与溶液中游离的5
′‑
羟基发生缩合反应。
5.第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5
′‑
羟基没有参加反应，则用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在后续环节根据实验需要来选择纯化方式分离掉。
6.第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变，成为更稳定的磷酸三酯。
7.目前现有的合成柱由柱体和固相载体组成，柱管为内径逐渐窄缩的管件，而柱管的内腔中固定有固相载体。其缺点在于：1、固定的固相载体将内腔一分为二，合成腔的体积固定，dna合成的第二步加入dna原料时，如果单步循环的dna原料和活化剂的总量管道超过和柱剩余体积的加合值，则会排到废液管道，因此需要多步耦合来实现，大大增加dna合成的时间；2，单步循环dna原料加入到合成柱内时，如果反应不充分，需要增加带帽反应，同时，原料会经过出口直接进入到废液收集管道，既浪费了昂贵的原料和试剂又得不到较好的产品质量；3、柱管内壁都采用倾斜设计，装配位内径上大、下小，在烧结时也会收缩，批间差比较大，导致装配时，对柱管积压程度也不一样，从而导致产品松紧度、均一性不一样，产品质量不稳定。


技术实现要素：

8.为解决上述问题，本发明提供了一种可变体积合成柱及应用其的合成系统。
9.根据本发明的一个方面，提供了一种可变体积合成柱，包括一个中空的柱体，所述柱体的上方安装有一个固定座、一个上端盖和一个中空连接柱，所述中空连接柱的底端伸入到所述柱体的内部并且连接有一个活塞，所述柱体的下端安装有一个下堵头；其中，所述活塞被一条竖直的第一通孔贯穿，所述下堵头一条竖直的第二通孔贯穿，所述上端盖与所述活塞之间形成液压腔，所述下堵头的下端设置有一个底部出口。
10.在一些实施方式中，所述固定座固定安装在所述柱体上，所述上端盖可拆卸地安装在所述固定座上，所述中空连接柱安装在所述上端盖上。由此，描述了固定座、上端盖和中空连接柱等安装的具体方式。
11.在一些实施方式中，所述固定座和所述上端盖均为中空的凸型结构。由此，描述了固定座和上端盖的具体结构。
12.在一些实施方式中，所述活塞的下端安装有一个上筛板，所述下堵头的上端安装有一个下筛板，所述上筛板和所述下筛板之间形成合成腔。由此，进一步描述了合成柱的具体结构。
13.在一些实施方式中，所述柱体的底部安装在一个底座上，所述底座上设置有一个出口通道，并且所述出口通道与所述底部出口连通。由此，通过底座能够对柱体进行稳定放置。
14.在一些实施方式中，所述固定座与所述底座之间通过支撑柱相连接。由此，通过设置支撑柱能够提高合成柱结构的稳固性。
15.在一些实施方式中，所述固定座的外侧设置有一个第一进出口和一个第二进出口，所述第一进出口和所述第二进出口均与所述液压腔相连通。由此，通过第一进出口和第二进出口能够将液压油通入到液压腔的内以用于调整液压。
16.在一些实施方式中，所述柱体与所述固定座之间、所述固定座与所述上端盖之间、所述上端盖与所述中空连接柱之间、所述中空连接柱与所述活塞之间、所述活塞与所述柱体之间以及所述下堵头与所述柱体之间均设置有密封圈。由此，通过在设置各垫圈能够对合成柱进行适当的密封。
17.根据本发明的一个方面，提供了一种上述可变体积合成柱的合成系统，其包括一条进口主管道、一条第一管道、一条第二管道、一条出口主管道、一条第四管道和一条第五管道；其中，所述进口主管道的其中一端与所述中空连接柱相连接，另一端分别与所述第一管道和所述第二管道相连接；所述出口主管道与所述底部出口相连接；所述第四管道和所述第五管道的其中一端均与所述液压腔相连通，另一端均连通一个油箱相连通。
18.在一些实施方式中，所述第一管道上设置有第一泵，所述第二管道上设置有第二泵。由此，通过第一泵和第二泵能够分别为第一管道和第二管道提供动力。
19.在一些实施方式中，所述第一泵和所述第二泵均为蠕动泵。由此，设置了第一泵和第二泵的种类。
20.在一些实施方式中，所述出口主管道上设置有第一阀门。由此，通过第一阀门能够对出口主管道进行开合控制。
21.在一些实施方式中，所述第四管道上设置有第三泵以及压力传感器。由此，通过第三泵和压力传感器能够对第四管道中的液压油的流动进行控制和检测。
22.在一些实施方式中，所述第五管道上设置有第二阀门。由此，通过设置第二阀门能够对出口主管道进行开合控制。
23.在一些实施方式中，所述第二管道与一个两位四通电动阀的c端相连接，所述出口主管道与所述两位四通电动阀的a端相连接；其中，所述两位四通电动阀的d端与一根第六管道相连接，b端与一根第三管道相连接。由此，设置两位四通电动阀能够通过转换其位置配合各步骤更加方便地进行合成工作。
24.在一些实施方式中，所述第三管道上设置有紫外传感器、ph值传感器以及电导温度传感器。由此，通过设置紫外传感器、ph值传感器以及电导温度传感器等能够对通过第三管道的流体的各参数进行检测。
25.本发明中的一种可变体积合成柱及应用其的合成系统能够使单步循环的单体和活化剂的总量不小于管道和柱剩余体积的加合值，可以使单步循环通过一步耦合实现，从而降低了合成的时间，提高合成效率，并且保证了合成产品的质量的稳定性。
附图说明
26.图1为本发明一实施方式的一种可变体积合成柱的结构示意图；
27.图2为图1所示可变体积合成柱的剖视图；
28.图3为一种应用了图1所示可变体积合成柱应的合成系统的实施例的示意图；
29.图4为另一种应用了图1所示可变体积合成柱的合成系统的实施例的示意图。
30.图中：柱体1，固定座2，上端盖3，中空连接柱4，活塞5，上筛板6，第一通孔7，下堵头8，第二通孔9，下筛板10，底部出口11，底座12，出口通道13，第一进出口14，第二进出口15，支撑柱16，密封圈17，合成腔18，液压腔19，进口主管道21，31，第一管道22，32，第二管道23，33，第一泵24，34，第二泵25，35，出口主管道26，36，第一阀门27，37，第四管道28，38，第五管道29，39，第三泵210，310，油箱211，311，压力传感器212，312，第二阀门213，313，第六管道314，第三管道315，紫外传感器316，ph值传感器317，电导温度传感器318，两位四通电动阀319。
具体实施方式
31.本发明的实施方式中，单体为修饰后的3'-o-可逆的保护基团的脱氧核糖核苷三磷酸即亚磷酰胺保护核苷酸单体，或者亚磷酰胺保护脱氧核苷酸单体。
32.固相载体一般为可控微孔玻璃珠(cpg)，其上连接有活性基团被保护的核苷酸。
33.不同的试剂包括：
34.三氯乙酸，其用于脱去其5
′‑
羟基的保护基团dmt，获得游离的5
′‑
羟基；
35.活化剂例，如四氮唑混合，其能使单体的3
′
端被活化，5
′‑
羟基仍然被dmt保护；
36.氧化碘，亚磷酰形式能够通过其转变为更稳定的磷酸三酯；
37.氨水，用于切下连接在cpg上的引物。
38.下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
39.图1示意性地显示了根据本发明的一种实施方式的一种可变体积合成柱的结构，图2显示了图1中的可变体积合成柱的剖视结构。如图1-2所示，该合成柱包括一个柱体1，柱体1内部为中空的，其中装填固相载体(附图中未示出)。柱体1的上方安装有一个固定座2、一个上端盖3和一个中空连接柱4，而固定座2、上端盖3和中空连接柱4能够共同对柱体1的上端口进行密封。
40.其中，固定座2为中空的凸型结构，其通过螺纹与柱体1固定连接；上端盖3也为中空的凸型结构，其可拆卸地安装在固定座2上，并且通过螺纹与固定座2进行连接；中空连接柱4安装在上端盖3上，其下端穿过上端盖3和固定座2，伸入到柱体1的内部。
41.中空连接柱4的下端连接有一个活塞5，活塞5具有凸型结构，其能够沿着柱体1的内壁进行上下滑动。其中，活塞5的下端则固定安装有一个上筛板6，并且活塞5上设置有一条竖直的第一通孔7，而第一通孔7贯穿活塞5的上端和下端，并且与中空连接柱4相连通。
42.柱体1的下端固定安装有一个下堵头8，下堵头8与柱体1内壁通过螺纹固定连接。
而在下堵头8的上端还固定安装有一个下筛板10，下筛板10位于柱体1的内部，并且在下堵头8的下端设置有一个底部出口11。其中，下堵头8上还设置有一条竖直第二通孔9，第二通孔9贯穿堵头8的上端和下端，并且与底部出口11相连通。
43.柱体1的底部安装在一个底座12上，并且在底座12上设置有一个出口通道13，并且出口通道13与一个底部出口11连通。
44.柱体1的内腔，具体为上筛板6与下筛板10之间的中空部位称为合成腔18。
45.固定座2的外侧设置有第一进出口14和第二进出口15，其分别连通上端盖3与活塞5之间的柱体1部分腔体，这部分腔体称为液压腔19。
46.固定座2与底座12之间还通过支撑柱16连接，以防止固定座2发生位置移动。
47.此外，在柱体1与固定座2之间、固定座2与上端盖3之间、上端盖3与中空连接柱4之间、中空连接柱4与活塞5之间、活塞5与柱体1的内壁之间以及下堵头8与柱体1内壁之间均设置有密封圈17，以保证各个部件之间的气密性。
48.图3显示了其中一种应用了图1中的可变体积合成柱的合成系统的实施例的结构。如图3所示，在该合成系统中，合成柱的中空连接柱4的上端与一条进口主管道21的其中一端相连接，而进口主管道21的另一端分别与一条第一管道22和一条第二管道23的出口端相连接。其中，第一管道22用于输送不同的单体，并且第一管道上设置有第一泵24；第二管道23输送不同的试剂，第二管道上设置有第二泵25；而第一泵24和第二泵25均为蠕动泵。
49.合成柱的底部出口11与一条出口主管道26的进口端相连接，出口主管道26用于输送废液、回收液以及合成物，并且在出口主管道26上设置有第一阀门27。
50.合成柱的第一进出口14通过一条第四管道28连通一个油箱211，而第四管道28上设置有第三泵210以及压力传感器212。其中，第三泵210采用柱塞泵，而压力传感器212的信号输出端连接第三泵210的信号采集端。
51.合成柱的第二进出口15通过一条第五管道29同样连接油箱211，而第五管道29上设置有第二阀门213。其中，第一阀门27和第二阀门213均采用两位两通电磁阀，用于控制流路的流通或截止。
52.使用该合成系统合成dna的过程如下所述。
53.第一步，加入三氯乙酸。
54.关闭第一阀门27，打开第二阀门213，开启第二泵25，将三氯乙酸通过第二管道23经过进口主管道21进入到合成柱的合成腔18内。随着三氯乙酸的加入，此时活塞5上移，液压油则通过第四管道28进入到油箱211中。当预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸充分反应后，脱去其5
′‑
羟基的保护基团dmt，获得游离的5
′‑
羟基。
55.然后，关闭第二泵25和第二阀门213，并打开第一阀门27和第三泵210，则液压油会会经过第四管道28进入到合成柱的液压腔19内，此时活塞5下移，则反应后的试剂通过出口主管道26排出并收集。
56.第二步，合成dna的原料。
57.关闭第一阀门27，打开第二阀门213，开启第二泵25和第一泵24，将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑分别通过第一管道22和第二管道23经过进口主管道21进入到合成柱的合成腔18内。而亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合得到核苷亚磷酸活化中间体，其3
′
端被活化，5
′‑
羟基仍然被dmt保护，与固相载体上游离的5
′‑
羟基发生缩
合反应，其中可以通过设置第二泵25，第一泵24不同的流量来实现活化剂和单体的设定比例。
58.随着单体与活化剂四氮唑的加入，此时活塞5上移，液压油通过第四管道28进入到油箱211。而当反应充分后，关闭第一泵24、第二泵25和第二阀门213，打开第一阀门27和第三泵210，则液压油会经过第四管道28进入到合成柱的液压腔19内，此时活塞5下移回到最初位置，反应后的试剂可以通过出口主管道26排出并收集。
59.第三步，加入氧化碘。
60.关闭第一阀门27，打开第二阀门213，开启第二泵25，将氧化碘通过第二管道23经过进口主管道21进入到合成柱的合成腔18内。随着氧化碘的加入，此时活塞5上移，液压油通过第四管道28进入到油箱211，则氧化碘可以将第二步中的亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
61.然后，关闭第二泵25和第二阀门213，并打开第一阀门27和第三泵210，则液压油会经过第四管道28进入到合成柱的液压腔19内，此时活塞5下移，反应后的试剂通过出口主管道26排出并收集。
62.经过以上三个步骤，一个脱氧核苷酸则会被连接到固相载体的引物上，再用三氯乙酸脱去它的5
′‑
羟基上的保护基团dmt。重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基均被接上去。
63.第四步，通入高温氨水。
64.关闭第一阀门27，打开第二阀门213，开启第二泵25，将高温氨水通过第二管道23经过进口主管道21进入到合成柱的合成腔18内，随着高温氨水的加入，此时活塞5上移，液压油通过第四管道28进入到油箱211，则高温氨水与固相载体上的引物充分反应，可以将连接在固相载体上的引物切下来。
65.然后关闭第二泵25和第二阀门213，打开第一阀门27和第三泵210，则液压油会经过第四管道28进入到合成柱的液压腔19内，此时活塞5下移，反应后的试剂通过出口主管道26排出收集，同时收集合成产物。
66.图4显示了另一种应用了图1中的可变体积合成柱的合成系统的另一种实施例的结构。如图4所示，在该合成系统中，合成柱的中空连接柱4的上端与一条进口主管道31的其中一端相连接，而进口主管道31的另一端分别与一条第一管道32和一条第二管道33的出口端相连接。其中，第一管道32用于输送不同的单体，并且第一管道上设置有第一泵34；第二管道33输送不同的试剂，第二管道上设置有第二泵35；而第一泵34和第二泵35均为蠕动泵。
67.第二管道33的进口端与一个两位四通电动阀319的c端相连接，而两位四通电动阀的d端连接与一根第六管道314出口端相连接，并且第六管道314的进口端分别连接装有不同试剂的试剂瓶；
68.合成柱的底部出口11与一条出口主管道36的进口端相连接，出口主管道36用于输送废液、回收液以及合成物，并且在出口主管道36上设置有第一阀门37。
69.出口主管道36的出口端还与两位四通电动阀319的a端相连接，而两位四通电动阀319的b端与一根第三管道315的进口端相连接，并且第三管道315的出口端连接多个不同的收集瓶。
70.其中，两位四通电动阀319的第一位置为a端和b端连通，c端和d端连通；第二位置
为a端和c端连通，b端和d端连通。
71.此外，第三管道315上还设置有紫外传感器316、ph值传感器317以及电导温度传感器318，可用于通过第三管道315的流体的各参数进行检测。
72.合成柱的第一进出口14通过一条第四管道38连通一个油箱311，而第四管道38上设置有第三泵310以及压力传感器312。其中，第三泵310采用柱塞泵，而压力传感器312的信号输出端连接第三泵310的信号采集端。
73.合成柱的第二进出口15通过一条第五管道39同样连接油箱311，而第五管道39上设置有第二阀门313。其中，第一阀门37和第二阀门313均采用两位两通电磁阀，用于控制流路的流通或截止。
74.使用该合成系统合成dna的过程如下所述。
75.第一步，加入三氯乙酸。
76.将两位四通电动阀319调到第一位置，即c端和d端连通，a端和b端连通，关闭第一阀门37，打开第二阀门313，开启第二泵35，将三氯乙酸通过第六管道314和第二管道33经过进口主管道31进入到合成柱的合成腔18内。随着三氯乙酸的加入，此时活塞5上移，液压油则通过第四管道38进入到油箱311中。
77.当三氯乙酸加入达到一定的量时，将两位四通电动阀319调到第二位置即c端和a端连通，d端和b端连通，同时关闭第二阀门313，打开第一阀门37，此时的三氯乙酸通过第二泵35沿着第二管道33、进口主管道31、合成柱的合成腔18以及出口主管道36循环流动。当预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸充分反应后，脱去其5
′‑
羟基的保护基团dmt，获得游离的5
′‑
羟基。
78.然后，关闭第二泵35，再将两位四通电动阀319调到第一位置，打开第三泵310，则液压油会会经过第四管道38进入到合成柱的液压腔19内，此时活塞5下移，则反应后的试剂通过出口主管道36和第三管道315排出并收集。
79.第二步，合成dna的原料。
80.关闭第一阀门37，打开第二阀门313，开启第二泵35和第一泵34，将两位四通电动阀319调到第一位置，再将亚磷酰胺保护核苷酸单体通过第一管道32、将活化剂四氮唑通过第六管道314和第二管道33，再经过进口主管道31进入到合成柱的合成腔18内。而亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合得到核苷亚磷酸活化中间体，其3
′
端被活化，5
′‑
羟基仍然被dmt保护，与固相载体上游离的5
′‑
羟基发生缩合反应，其中可以通过设置第二泵35，第一泵34不同的流量来实现活化剂和单体的设定比例。
81.随着单体与活化剂四氮唑的加入，此时活塞5上移，液压油通过第四管道38进入到油箱311。当达到一定量时，关闭第一泵34和第二阀门313，将两位四通电动阀319调到第二位置，打开第一阀门37，则核苷亚磷酸活化中间体沿着第二管道33、进口主管道31、合成柱的合成腔18以及出口主管道36循环流动。
82.而当反应充分后，关闭第二泵35，打开第三泵310，则液压油会经过第四管道38进入到合成柱的液压腔19内，此时活塞5下移回到最初位置，反应后的试剂可以通过出口主管道36和第三管道315排出并收集。
83.第三步，加入氧化碘。
84.打开第二阀门313，开启第二泵35，将两位四通电动阀319调到第一位置，再将氧化
碘通过第六管道314和第二管道33并经过进口主管道31进入到合成柱的合成腔18内。随着氧化碘的加入，此时活塞5上移，液压油通过第四管道38进入到油箱311。当达到一定量时，将两位四通电动阀319调到第二位置，同时关闭第二阀门313，打开第一阀门37，此时氧化碘通过第二泵35沿着第二管道33、进口主管道31、合成柱的合成腔18以及出口主管道36循环流动，而氧化碘可以将第二步中的亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
85.而当反应充分后，关闭第二泵35，将两位四通电动阀319调到第一位置，再打开第三泵310，则液压油会经过第四管道38进入到合成柱的液压腔19内，此时活塞5下移，反应后的试剂通过出口主管道36和第三管道315排出并收集。
86.经过以上三个步骤，一个脱氧核苷酸则会被连接到固相载体的引物上，再用三氯乙酸脱去它的5
′‑
羟基上的保护基团dmt。重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基均被接上去。
87.第四步，通入高温氨水。
88.将两位四通电动阀319调到第一位置，关闭第一阀门37，打开第二阀门313，开启第二泵35，将高温氨水通过第六管道314和第二管道33并经过进口主管道31进入到合成柱的合成腔18内，随着高温氨水的加入，此时活塞5上移，液压油通过第四管道38进入到油箱311，当达到一定的量时，将两位四通电动阀319调到第二位置，同时关闭第二阀门313，打开第一阀门37，此时高温氨水通过第二泵35沿着第二管道33、进口主管道31、合成柱的合成腔18以及出口主管道36循环流动。则高温氨水与固相载体上的引物充分反应，可以将连接在固相载体上的引物切下来。
89.然后关闭第二泵35，将两位四通电动阀319调到第一位置，打开第三泵310，则液压油会经过第四管道38进入到合成柱的液压腔19内，此时活塞5下移，反应后的试剂通过出口主管道36和第三管道315排出并收集，同时收集合成产物。
90.以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。