一种快速检测牡蛎疱疹病毒抗原的免疫荧光检测试纸条及应用的制作方法

1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种快速定性及定量检测牡蛎疱疹病毒(ostreidherpesvirus1 ,oshv-1)抗原的免疫荧光检测试纸条及其应用。


背景技术：

2.牡蛎疱疹病毒（oshv-1）， 隶属疱疹病毒目（herpesvirales），软体动物疱疹病毒科（malacoherpesviridae），宿主范围涉及我国多个养殖双壳贝类，包括牡蛎、扇贝及毛蚶等。牡蛎疱疹病毒感染养殖贝类群体后，可导致贝类群体大规模死亡。由于双壳贝类养殖模式属于开放水体养殖，养殖贝类发病后难以施药进行治疗，因此养殖过程中对病原的风险管控显得更为重要。为实现牡蛎疱疹病毒这一病原的定期监测任务，亟待开发一种快速、高效的检测方法。
3.目前对于oshv-1的检测，均基于对病毒核酸水平的检测，对从事检测操作人员业务水平要求较高；检测场所需配套相关设备、试剂储藏空间，并且需保持高度的清洁度以避免阳性样品污染。当下基于核酸检测技术处理周期较长，无法实现现场快速检测的目的。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题，本发明的主要目的在于提供一种快速检测牡蛎疱疹病毒（oshv-1）的抗原免疫荧光试纸条，该试纸条能够实现对牡蛎疱疹病毒的定性及定量检测，应用于养殖过程中oshv-1的定期监测，实现对这一病原的风险管控；另外，可为科研人员提供一种除核酸水平之外的病毒定量方法。
5.本发明还提供了上述抗原免疫荧光试纸条的应用。
6.本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：本发明提供了一种快速检测牡蛎疱疹病毒oshv-1抗原的免疫荧光试纸条，所述免疫荧光试纸条以如seq id no.1所示的orf104蛋白作为待检抗原分子；优化的，所述免疫荧光试纸条以如seq id no.2所示的肽段作为免疫原制备多克隆抗体。
7.本发明制备的免疫荧光试纸条具体包括pvc底板，底板上层依次叠放样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫；所述结合垫上设有荧光微球标记的epi多克隆抗体；检测垫由硝酸纤维素膜构成，喷印一条包被羊抗小鼠igg质控线c，以及一条包被epi多克隆抗体的检测线t。
8.上述epi多克隆抗体具体制备方法如下：（1）分别利用pgex-4-1及pet28a-sumo质粒重组表达epi蛋白，之后分别利用谷胱甘肽和ni 离子偶联琼脂糖树脂进行纯化；（2）取上述pgex-4-1重组表达的epi蛋白进行免疫小鼠；（3）利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化获得epi蛋白对应的小鼠多克隆抗体igg，利用pet28a-sumo重组表达epi蛋白作为待检抗原。
9.进一步的，步骤（2）中，所述免疫时每只小鼠的免疫剂量为200μg重组蛋白，免疫次
数7次。
10.进一步的，步骤（3）中，所述纯化后多克隆抗体的elisa效价为1:103~1:106。
11.本发明还提供了一种=免疫荧光试纸条的应用，用于快速定性定量检测牡蛎疱疹病毒，具体检测方法包括以下步骤：a.采集待检贝类外套膜样品，加入组织裂解液研磨或捣碎组织，得到待检溶液；b.将待检溶液滴入荧光免疫检测试纸条样品垫处，水平放置3~5min观察结果；c.采用手持式365nm左右波长紫外灯照射，进行快速定性检测；d.阴性样品组织裂解液梯度稀释epi标准品，绘制样品浓度与t/c比值间log直线回归标准曲线；测试待检样品t/c值，通过标准曲线计算样品中抗原含量，进行抗原定量检测。
12.进一步的，步骤（a）中，所述组织裂解液包括0.1m tris-hcl，0.5% tween20，1.5% tritonx-100，0.03% nan3。
13.进一步的，步骤（c）中，所述定性检测为：当检测垫质控线c和检测线t显现两荧光条带，表示待检样品中含有待检抗原；若仅质控线c显现一条荧光条带，表示待检样品中未检出待检抗原。
14.本发明根据逐个oshv-1分子结构特征及分子表达量分析，优选了一个oshv-1类核衣壳蛋白orf104（seq id no.1）做为待检抗原分子，应用到oshv-1免疫荧光快速检测试纸条中。orf104做为类核衣壳蛋白，是病毒潜在的结构分子，在病毒感染期间表达量颇高。经抗原表位预测，优选一段抗原表位epi （seq id no.2）制备多克隆抗体。
15.与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：1、本发明操作步骤简单，检测速度快，结果即可定性观察又可定量测量，检测成本低。
16.2、本发明待检样品制备简单，只需配合组织裂解液破碎组织即可，无需繁琐的核酸抽提过程。
附图说明
17.图1为pgex-4-1重组表达的epi蛋白sds-page电泳图；图中，m为marker；1为epi纯化后蛋白；图2为pet28a-sumo重组表达的epi蛋白sds-page电泳图；图中，m为marker；1为epi纯化前蛋白；2为epi纯化后蛋白；图3为免疫荧光快速检测试纸条结构示意图；图中，1为底板，2为样品垫，3为结合垫，4为检测垫，5为吸水垫，6为检测线t，7为质控线c。
18.图4为的病毒抗原浓度检测的标准曲线图；图中，x轴为抗原浓度的对数值，y轴为t/c的对数值。
具体实施方式
19.下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
20.实施例1：制备oshv-1免疫荧光检测试纸条
1. epi蛋白的原核表达及纯化1）依据genbank公布的france 2013毒株序列（genbank：nc_005881.2），以puc57质粒为框架，由上海生工生物工程有限公司合成含oshv-1 epi基因（seq id no.3）的重组载体，并分别命名为puc57-epi；2）以上述合成重组载体puc57-epi为模板，分别扩增克隆epi片段至原核表达载体pgex-4t-1和pet28a-sumo，构建原核表达载体pgex-4t-1-epi和pet28a-epi；4）将原核表达载体pgex-4t-1-epi和pet28a-p25分别转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，获得表达菌株bl21
‑ꢀ
pgex-4t-1-epi和bl21-pet28a-epi；5）利用大肠杆菌原核表达系统分别表达纯化oshv-1 epi蛋白，具体步骤如下：将过夜培养重组菌按1:50体积比转接至新鲜lb培养基中，继续培养至细菌生长对数期od
600
= 0.4~0.6；加入终浓度为1.0 mmol/l的异丙基-β-d硫代半乳糖苷（iptg）作为诱导剂，37℃，220 r/min诱导表达12 h以上；4℃，5000g离心收获表达菌；将沉淀菌体按培养体积的1/15加入pbs缓冲液重悬，超声破碎后离心收集上清和沉淀；bl21
‑ꢀ
pgex-4t-1-epi菌株重组蛋白经谷胱甘肽偶联凝胶填料纯化收集，作为免疫原抗原；bl21-pet28a-epi菌株重组蛋白经ni离子偶联凝胶填料纯化收集，作为包被检测抗原，sds-page电泳图分别如图1、图2所示，-20℃保存备用。
21.2.epi多克隆抗体制备1）动物免疫小鼠通过背腹部皮下多点注射的方法免疫。首先，用弗氏完全佐剂与纯化epi蛋白等体积混合乳化，每只小鼠免疫剂量为200 μg蛋白；在首次免疫三周后分别用弗氏不完全佐剂与纯化的两蛋白等体混合乳化，利用相同剂量蛋白加强免疫6次，间隔周期二周；在最后一次免疫后7天，断尾采血，elisa检测血清效价，结果显示小鼠抗血清效价在1:103到1:107之间。
22.2）抗体血清大量采集及多克隆抗体纯化小鼠采用摘眼球法取血。4℃ 静置过夜，3000 g离心收集抗体血清；采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化多克隆抗体，elisa检测纯化后多克隆抗体效价，结果显示纯化后多克隆效价可达1:106左右，-80℃保存备用。
23.3. 荧光微球标记抗体的制备1）荧光微球的活化：选择一种稀土铕元素的荧光聚苯乙烯微球，直径300 nm，包含功能基团羧基；用0.1mmes (ph 6.0)稀释1 mg 荧光微球，涡旋混匀；随后加入(20-50) μl 50mg/ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc) 和(20-50) μl 50 mg/ml n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，旋转器上反应约30 min；edc和nhs均为0.05m mes缓冲液配置。
24.2）荧光微球活化后淬灭：高速离心约20 min收集活化后荧光微球；加入 1ml 0.25％甲醇（0 .1m mes缓冲液 配置)，涡旋重悬；重复一次。
25.3）多克隆抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入50 μg epi多克隆抗体，涡旋混匀，置于旋转器上反应约30 min；4）封闭：加入 500 μl 3% 牛血清白蛋白（0.04 m乙醇胺配制），超声3s，间歇3s，重复3次，超声完成后置于旋转器上继续封闭反应30min；5）复溶：高速离心收集封闭后荧光微球，加入500 μl 标记荧光微球复溶液（含
0.05％酪蛋白 (casein)、0.3％ 聚乙烯比咯烷酮 pvp、0.05％ 丙三醇、 0.05％ tween-20和、0.03％proclin 300、5％海藻糖、0.05％叠氮钠、0 .05m tris-hcl，ph 7 .8），同上超声助溶，重复3次。
26.4. 结合垫的制备将荧光微球标记多克隆抗体通过定量喷膜仪以4 μl /cm的量喷涂于玻璃纤维膜上，放入烘箱，50℃避光烘干。
27.5. 检测垫的制备用包被液（0.05m pbs（ph7.0-7.4），3% 海藻糖， 0.05% nan3）将epi蛋白多克隆抗体浓度调整至1.0 mg/ml，平行相同条件处理羊抗小鼠igg抗体。利用定量喷膜仪将epi多克隆抗体和羊抗小鼠igg抗体喷印于硝酸纤维素膜中央，形成检测线t和质控线c印迹，间隔5 mm；将检测膜烘干后，室温保存备用。
28.6.样品垫及吸水垫的制备用含0.01mol/ltris-hcl，0.2% tween 20（v/v）和 0 .1%（w/v）nan3的tbs（ph 7 .2）溶液浸泡玻璃纤维棉；烘干制得样品垫，加干燥剂室温密闭保存；选用吸水滤纸作为吸水垫。
29.7.检测试纸条的组装先将检测垫（下）和样品垫（上）依次粘贴于底板（支撑板）样品端，各层间重叠约2 mm，将检测膜粘贴于支撑板中央，最后，将吸水垫粘贴于检测膜的另一端，与检测膜重叠约2 mm。试纸条结构如图3所示：试纸条包括底板（支撑板）1和固定在底板上的样品垫2、结合垫3、检测垫4和吸水垫5，检测垫上设有羊抗小鼠igg抗体喷印的质控线7和epi多克隆抗体喷印的检测线6。
30.实施例2：利用试纸条快速检测oshv-1抗原1. oshv-1抗原快速定性检测1.1检测样品溶液的制备采集待检贝类外套膜组织，加入适量组织裂解液进行研磨破碎。
31.1.2 样品检测将待检测样品溶液滴入检测试纸条样品垫上，水平放置3~5 min观察结果。
32.1.3检测结果判定检测试纸条检测垫出现两条荧光条带（即检测线与质控线均显色），表示待检样品中含有oshv-1抗原；仅显现一条荧光条带（质控线）为阴性，表示待检样品未检测出oshv-1抗原；检测试纸条未显现任何条带表明检测操作不当或检测试纸条失效。
33.2. oshv-1抗原快速定量检测2.1 绘制标准曲线将epi重组蛋白用阴性样品组织裂解液稀释到九个浓度(0 ng/ml、2 ng/ml、4 ng/ ml、8 ng/ml、15 ng/ml、31 ng/ml、62 ng/ml，123 ng/ml)，取50 ul滴入试纸样品端，反应10min后放入荧光分析仪中进行检测。对浓度及t/c值取对数，之后进行线性拟合，拟合曲线如图4所示，r2》0.99。
34.2.2 精密度测定将稀释后epi重组蛋白重复测定10次，根据测定t/c值和拟合曲线计算测定浓度和
变异系数，由试纸条测定浓度变异系数cv(％)值≤10％。
35.2.3 待检样品浓度测定待检样品制备同定性检测过程，取50 ul待检样品滴入试纸条样品端，测定t/c比值，计算出样品浓度。