一种快速鉴定植物叶绿体完整性的方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速鉴定植物叶绿体完整性的方法。


背景技术：

2.叶绿体是植物进行光合作用的主要场所，是植物特有的细胞器。它还参与脂肪酸、氨基酸、维生素和激素等重要物质的合成。此外，叶绿体在植物体内还具有其他很多重要的生理功能。因此，对于叶绿体的研究一直是生物学领域的热点。
3.如何从植物细胞中分离出来完整的叶绿体是很多研究者在实验中遇到的问题。常用的提取叶绿体的方法主要是percoll密度梯度离心法。该方法旨在通过密度梯度离心的方法将破损的叶绿体与完整的叶绿体进行分离。其原理是提取过程中破损的叶绿体由于内含物的泄露导致密度降低，从而在离心管中处于上层，而完整的叶绿体由于密度较大，从而处于离心管的中部。
4.密度梯度离心是分离完整叶绿体和破损叶绿体的常用方法，但是由于叶绿体中经常含有较多的淀粉，在离心的过程当中，破损的叶绿体由于含有淀粉导致密度增加也会在离心力的作用下沉入到中层完整叶绿体中。因而，“中层叶绿体”中有多少完整的叶绿体并不确定，有时大部分都是破损的叶绿体。如果盲目相信中层的叶绿体都是完整的叶绿体，有可能会造成严重的错误。
5.此外，人们还采用蛋白质凝胶电泳以及随后的染色或免疫印迹的方法，根据分离得到的叶绿体中有关蛋白的比例大概推断其完整性，但是该方法所耗时间较长(需要一天时间)，且不能准确和直观地反映出完整叶绿体所占比例。该方法与离心方法都不能直观、可视化地展示完整叶绿体的形态、大小以及所占的比例。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术的不足，开发一种快速鉴定植物叶绿体完整性的方法，以便人们更好地深入研究叶绿体的功能。本发明采用罗丹明b(rhodamine b)和尼罗红(nile red)等荧光染料，对percoll密度梯度离心分离后得到的叶绿体的膜进行染色，利用荧光显微镜进行观察，可以快速、清晰直观地显示出叶绿体的完整性以及叶绿体的大小、形态，从而确定密度梯度离心分离后得到的“中层叶绿体”中完整叶绿体所占比例。本发明使用罗丹明等染料染色，只需几分钟时间，便可用荧光显微镜观察。
7.为实现上述技术问题，本发明提供了一种快速鉴定植物叶绿体完整性的方法，所述方法包括如下步骤：
8.1)提取植物叶片叶绿体：将植物叶片剪碎放入破碎缓冲液gb中，然后进行破碎、过滤和离心收集得到总叶绿体；
9.2)分离叶绿体：通过密度梯度离心分离破碎的叶片细胞中的总叶绿体，得到上层破碎叶绿体和中层叶绿体；
10.3)离心收集与重悬：将需要鉴定的叶绿体组分进行转移，离心收集后重悬得到叶
绿体悬液；
11.4)叶绿体染色：将荧光染料加入到叶绿体悬液中，使叶绿体膜被染色；
12.5)叶绿体完整性分析：通过荧光显微镜观察荧光染料对叶绿体的染色情况，比较破损叶绿体与完整叶绿体的染色差异，观察叶绿体膜的完整性区分完整和破损的叶绿体。
13.在本发明的技术方案中，步骤1)中，植物细胞中叶绿体的提取方法为：将待提取叶绿体的植物材料剪碎放入破碎缓冲液gb中，然后进行破碎、过滤和离心收集得到叶绿体。
14.在本发明的技术方案中，所述植物为含有叶绿体的植物材料，优选的，所述植物选自烟草叶片、菠菜叶片、豌豆叶片、玉米叶片、拟南芥叶片中的一种。
15.在本发明的技术方案中，离心采用离心机进行，所述离心机在使用前，将离心机温度调到4℃进行预冷。
16.在本发明的技术方案中，步骤1)中，每1g植物材料加入14-20ml的缓冲液gb。
17.在本发明的技术方案中，步骤2)中，采用percoll密度梯度法分离破碎的植物细胞中的总叶绿体。
18.在本发明的技术方案中，步骤3)中，叶绿体悬液为将需要鉴定的叶绿体离心，弃上清，沉淀用缓冲液rb悬浮得到。
19.在本发明的技术方案中，所述步骤4)中，染色时间为2-10分钟。
20.在本发明的技术方案中，所述步骤4)中，所述荧光染料为罗丹明b或尼罗红。
21.在本发明的技术方案中，所述罗丹明b的使用浓度为0.1mg/l-10mg/l，优选为1mg/l；
22.所述尼罗红的使用浓度为1mg/l-100mg/l，优选为10mg/l。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
24.本发明采用罗丹明b和尼罗红等荧光染料对多种植物的叶绿体进行染色，植物叶绿体染色后，通过荧光显微镜观察，完整叶绿体的外膜轮廓清晰，荧光分布均匀，而破损的叶绿体的外膜轮廓模糊，荧光呈不连续的片段状或者聚集成点状，因此能够快速、直观地显示叶绿体的完整性，对叶绿体的研究具有重要意义。
附图说明
25.图1是本发明快速鉴定植物叶绿体完整性的方法的技术流程图。
26.图2是通过密度梯度离心分层分离叶绿体的照片图。
27.图3是通过自荧光和明场观察未进行染色烟草和菠菜叶片叶绿体的照片图。
28.图4是罗丹明b染烟草和菠菜叶片叶绿体后用荧光显微镜观察的图。
29.图5是罗丹明b染豌豆、玉米和拟南芥叶片叶绿体后用荧光显微镜观察的图。
30.图6是尼罗红染烟草和菠菜叶片叶绿体后用荧光显微镜观察的图。
31.图7是尼罗红染豌豆、玉米和拟南芥叶片叶绿体后用荧光显微镜观察的图。
32.图8是罗丹明b的分子结构式。
33.图9是尼罗红的分子结构式。
具体实施方式
34.下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
35.在下文中，将参考附图对本发明的具体实施例进行详细地描述，依照这些详细的描述，所属领域技术人员能够清楚地理解本发明，并能够实施本发明。在不违背本发明原理的情况下，各个不同的实施例中的特征可以进行组合以获得新的实施方式，或者替代某些实施例中的某些特征，获得其它优选的实施实施方式。
36.下述实施例中使用的罗丹明b(rhodamine b)，分子式：c
28h31
cln2o3，分子量：479.01，罗丹明b荧光染料的分子结构式如图8所示：本发明使用的罗丹明b还有其他中文别名，分别有：9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁氯化物，罗丹明610；玫瑰红b；蕊香红b；玫瑰精b；若丹明b；蓝光碱性蕊香红。
37.下述实施例中使用的尼罗红(nile red)：分子式：c
20h18
n2o2，分子量：318.37，尼罗红荧光染料的分子结构式如图9所示。
38.参阅图1，一种植物叶绿体提取与完整性鉴定方法的技术流程图，具体为，一种快速鉴定植物叶绿体完整性的方法，包括如下步骤：
39.1)提取叶绿体：将含有叶绿体的植物材料剪碎放入破碎缓冲液gb中，然后进行破碎、过滤和离心收集得到总叶绿体；
40.2)分离叶绿体：通过密度梯度离心分离破碎的叶片细胞中的总叶绿体，得到上层破碎叶绿体和中层叶绿体；
41.3)离心收集与重悬：将需要鉴定的叶绿体组分进行转移，离心收集后重悬得到叶绿体悬液；
42.4)叶绿体染色：将荧光染料加入到叶绿体悬液中，使叶绿体膜被染色；
43.5)叶绿体完整性分析：通过荧光显微镜观察荧光染料对叶绿体的染色情况，比较破损叶绿体与完整叶绿体的染色差异，观察叶绿体膜的完整性区分完整和破损的叶绿体。
44.实施例1
45.1)实验准备工作：配制叶片破碎缓冲液gb(50mm hepes/koh,ph7.5；0.33m sorbitol；1mm mgcl2；1mm mncl2；2mm edta,ph8.0；5mm na-ascorbate；0.1％bsa)、叶绿体重悬缓冲液rb(50mm hepes-koh,ph 7.9；0.33m sorbitol；0.8mm cacl2；5mm na-ascorbate)；打开离心机，将温度调到4℃进行预冷；洗净各类离心管、漏斗和尼龙网并吹干。
46.2)提取叶绿体：取5g烟草叶片，剪碎到100ml gb中，然后用榨汁机打碎，3次点动，每次5s。将所得溶液过滤到圆底的大离心管中，2000g离心2分钟，弃上清，加入适量的rb重悬沉淀。
47.3)分离叶绿体：将重悬叶绿体溶液小心地加到用gb配好的有密度梯度的percoll上(1ml 90％的percoll 2ml 40％的percoll，可以加1-2ml叶绿体悬浮液)，2000g离心10min，叶绿体分为两层，上层为破损的叶绿体，中层通常认为是完整的叶绿体。如图2所示，上、中层叶绿体处于不同的位置。
48.4)离心收集与重悬：小心吸取中层叶绿体到新的离心管中，再加入2ml rb，混匀，500g离心2分钟，弃上清，加入适量rb重悬叶绿体得到叶绿体悬液。
49.5)叶绿体染色：先将罗丹明b或尼罗红用rb配置成100倍母液，采用终浓度为0.1mg/ml的罗丹明b(溶剂为rb)进行染色，染色时加入叶绿体悬液，染色时间为5min，离心后，将上清吸出，加入rb重悬，用显微镜观察。
50.6)叶绿体完整性观察：采用荧光显微镜观察叶绿体的染色情况。不染色直接观察无法区分破损和完整的叶绿体。
51.实施例2
52.本实施例叶绿体提取与完整性鉴定方法与实施例1步骤相同，不同的是步骤2)中，叶片为菠菜叶片。
53.实施例3
54.本实施例叶绿体提取与完整性鉴定方法与实施例1步骤相同，不同的是步骤2)中，叶片为豌豆叶片。
55.实施例4
56.本实施例叶绿体提取与完整性鉴定方法与实施例1步骤相同，不同的是步骤2)中，叶片为玉米叶片。
57.实施例5
58.本实施例叶绿体提取与完整性鉴定方法与实施例1步骤相同，不同的是步骤2)中，叶片为拟南芥叶片。
59.实施例6
60.本实施例叶绿体提取与完整性鉴定方法与实施例1步骤相同，不同的是步骤5)中，染料为终浓度为10mg/l尼罗红(溶剂为rb)。
61.实施例7
62.本实施例叶绿体提取与完整性鉴定方法与实施例1步骤相同，不同的是步骤2)中叶片为菠菜叶片，步骤5)中染料为终浓度为10mg/l尼罗红(溶剂为rb)。
63.实施例8
64.本实施例叶绿体提取与完整性鉴定方法与实施例1步骤相同，不同的是步骤2)中叶片为豌豆叶片，步骤5)中染料为终浓度为10mg/l尼罗红(溶剂为rb)。
65.实施例9
66.本实施例叶绿体提取与完整性鉴定方法与实施例1步骤相同，不同的是步骤2)中叶片为玉米叶片，步骤5)中染料为终浓度为10mg/l尼罗红(溶剂为rb)。
67.实施例10
68.本实施例叶绿体提取与完整性鉴定方法与实施例1步骤相同，不同的是步骤5)中叶片为拟南芥叶片，步骤5)中染料为终浓度为10mg/l尼罗红(溶剂为rb)。
69.结果分析：
70.植物叶绿体染色后，通过荧光显微镜观察结果如图4、5、6、7所示：完整叶绿体的外膜轮廓清晰，荧光分布均匀；而破损的叶绿体的外膜轮廓模糊，荧光呈不连续的片段状或者聚集成点状。
71.以烟草叶片、菠菜叶片、豌豆叶片、玉米叶片、拟南芥叶片提取叶绿体，然后通过密度梯度离心分层分离叶绿体的照片类似，如图2所示是实施例1通过密度梯度离心分层分离叶绿体的照片图。上层的叶绿体通常被认为都是破损的，中层的叶绿体通常被认为都是完整的。
72.首先通过自荧光和明场观察未进行染色烟草和菠菜叶片叶绿体叶绿体，如图3所示，可以看出完整和破损的叶绿体难以区分。
73.如图4所示，通过罗丹明b染色烟草和菠菜叶片叶绿体后，由于罗丹明b可以与叶绿体膜结合，通过荧光显微镜观察可以看出完整叶绿体的外膜轮廓清晰，荧光分布均匀，而破损的叶绿体的外膜轮廓模糊，荧光呈不连续的片段状或者聚集成点状。因此，通过罗丹明b染色可以很直接地观察到所提取的叶绿体的完整程度，辨别叶绿体的完整性。
74.如图5所示，通过将密度梯度离心分离的中层豌豆、玉米和拟南芥叶片叶绿体进行罗丹明b染色后，在荧光显微镜观察可以看出通过罗丹明b染色，可以发现豌豆和玉米的叶绿体中有部分是破损的，拟南芥的叶绿体大部分是破损的。
75.如图6所示，通过尼罗红染色烟草和菠菜叶片叶绿体后在荧光显微镜观察的可以看出，使用尼罗红也可以将叶绿体膜染色，并能够明显的区分完整与破损的叶绿体。完整叶绿体的外膜轮廓清晰，荧光分布均匀，而破损的叶绿体的外膜轮廓模糊，荧光呈不连续的片段状或者聚集成点状。因此，通过尼罗红染色可以很直接地观察到所提取的叶绿体的完整程度，辨别叶绿体的完整性。
76.如图7所示，通过尼罗红染色豌豆、玉米和拟南芥叶片叶绿体后在荧光显微镜观察可以看出，豌豆和玉米的叶绿体中有部分是破损的，拟南芥的叶绿体大部分是破损的。
77.上述实施例只为说明本发明的技术构思和特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
78.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。