一种快速检测食物中维生素B1的胶体金试纸的制作方法

一种快速检测食物中维生素b1的胶体金试纸
技术领域
1.本实用新型属于食品行业分析领域，具体涉及一种用于检测维生素b1的胶体金试纸。


背景技术：

2.维生素b1(vb1)又名硫胺素或抗神经炎素。其主要以盐酸硫胺和硝酸硫胺两种形式存在，化学名称分别为3-[(4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)甲基]-5-(2-羟基乙基)-4-甲基-噻唑盐酸盐和4-甲基-3-[(2甲基-4-氨基-5－嘧啶基)甲基]
‑ꢀ
5-(2-羟基乙基)噻唑；分子式分别为c
12h17
cln4os hcl和c
12h17
n5o4s，分子量 337.29。vb1是一种水溶性维生素，以辅酶形式参与糖的分解代谢过程，并具有维持心脏、神经及消化系统正常功能，以及促进发育的作用。vb1缺乏，会导致一些严重的疾病，例如：引起多种神经炎症，水肿，脚气病等，进而引起不适或者死亡。食物加工和烹调方法不当而导致vb1丢失过多、摄入严重不足而致vb1缺乏病的暴发常有报道，如2004年一种配方奶粉在以色列被强制召回，该奶粉引起3名婴儿死亡和 10名婴儿生病，因为奶粉中未添加维生素b1，导致婴儿大脑发育受损。根据中国第三次营养调查结果表明，与中国营养学会制定的标准相比较，我国人均vb1摄入量存在明显不足。vb1广泛存在于糙米、酵母、谷类、肝、肉类、豆类、vb1相关药品(vb1 片、复合vb1片，vb1口服液等)以及婴幼儿喂养阶段配方奶粉。因此，vb1的定性、定量分析在临床、食品等科学中有重要意义。
[0003]
现有技术检测vb1方法如下：硅钨酸重量法对于仪器要求不高，但操作麻烦、费时，紫外分光光度法操作简单，不需要标准品，但受仪器测定波长是否准确影响大。非水滴定法，电位滴定法虽然操作简单，准确性高，但因非水滴定法用到毒性试剂醋酸汞会产生污染；2017年开始施行的gb 5009.84—2016《食品国家安全标准食品中维生素b1的测定》已将gb/t 5009.84——2003《食品中硫胺素(维生素b1)的测定》、gb 541311—2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素b1的测定》、 gb/t7628—2008《谷物中维生素b1的测定》、gb/t9695.27—2008《肉与肉制品维生素b1含量测定》整合替代，增加高效液相色谱法为第一法，将荧光光度法作为第二法。其中荧光分光光度法，操作高操作复杂；高效液相色谱法(改良的反相高效液相色谱法、高效液相色谱-荧光检测法)因为仪器昂贵，前期处理复杂，运行成本高，分析时间长仍然无法实现操作简单，快速检测的需要。
[0004]
免疫胶体金技术(immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(haucl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、柠檬酸三钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
[0005]
基于胶体金的可视化检测为vb1定性定量分析提供了一个崭新的技术平台。胶体金粒子具有高电子密度的特性，当与胶体金颗粒结合的大分子在相应的配体处大量聚集时，会形成肉眼可见的红色或者粉红色斑点。胶体金试纸条将各种反应试剂以条带固定在试纸条上，样本溶液从试纸条的一端通过毛细管作用向另一端移动，样品中的待测物同层析材料上针对待测物的受体发生特异性反应。结合胶体金的待测样本被截留、聚集在层析材料的一定区域，通过目测可直观得到显色。本实用新型利用胶体金的原理，通过与bsa或ova偶联在的胶体金颗粒与硝酸纤维素(nitrocellulose filter， nc)膜上固定的单克隆鼠抗vb1抗体相互结合，开发快速检测vb1的胶体金。


技术实现要素：

[0006]
本实用新型提供了一种快速检测食物中维生素b1的胶体金试纸，其具有方便快捷、操作简单、结果准确等优点。
[0007]
本实用新型的技术方案如下所示：
[0008]
一种快速检测食品中维生素b1的胶体金试纸，包括支撑垫1，硝酸纤维素膜2，偶合物垫片3，吸水垫4和样品垫7；所述硝酸纤维素膜2位于所述支撑垫1上，所述硝酸纤维素膜2一端上方连接吸水垫4，另一端上方连接偶合物垫片3，所述偶合物垫片另一端上方连接样品垫，其特征在于，所述硝酸纤维素膜2中间设置包被有vb1抗体的检测线6，检测线6两边分别平行设有控制线5，所述偶合物垫片3涂布金标记的维生素b1抗体以及控制线偶合物。
[0009]
进一步地，所述样品垫7的方上设有固定垫片8。所述固定垫片8可选单面胶。
[0010]
进一步地，所述控制线5包被有抗dnp抗体，所述控制线偶合物为dnp-bsa标记的胶体金，其中bsa是指牛血清白蛋白。
[0011]
进一步地，本实用新型包括一包裹所述胶体金试纸的外壳9，分别设有露出样品垫7、检测线6和两条控制线5的窗口。所述外壳优选塑料外壳。
[0012]
本实用新型所述的快速检测食物中维生素b1的胶体金试纸，采用双向侧流免疫反应原理，通过双抗体夹心法制备而成。检验时样本中的vb1的与偶合垫上的 bsa-vb1胶体金偶合物同时在硝基纤维素膜上层析流动，当样本中的vb1与 bsa-vb1胶体金偶合物层析至硝基纤维素膜上的检测区(vb1检测线)时，与预先包被在硝基纤维素膜上的vb1抗体发生反应从而被固定在硝基纤维素膜的检测线上。检测线上的复合物越多，条带上的光密度值就越高。同时，在检测过程中，控制线偶合物也会随样本在硝基纤维素膜上层析，当层析至硝基纤维素膜的控制线时， dnp-bsa胶体金会与预先包被在硝基纤维素膜上的抗dnp抗体发生反应从而被固定在控制线上。由于胶体金为红色，因而固定在硝基纤维素膜控制线上的抗dnp中的 dnp-bsa胶体金免疫复合物将显示红色。当样本中不含vb1时，则只显示两条控制线。当样本含vb1时，检测线就会清晰的显示出来。进一步地，待反应结束后，可利用胶体金读卡仪(广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司)进行浓度检测，显示结果。
附图说明
[0013]
图1是本实用新型所述一种快速检测食物中维生素b1的胶体金试纸的结构示意图。
[0014]
其中，1:支撑垫，2：硝酸纤维素膜，3：偶合物垫片，4:吸水垫，5:控制线，6：检测线，
7:样品垫，8:固定垫片。
[0015]
图2是本实用新型所述一种快速检测食物中维生素b1的胶体金试纸的另一种实施方式的结构示意图。
[0016]
其中，7:样品垫，6:检测线，5:控制线，9：外壳。
具体实施方式
[0017]
以下结合附图对本实用新型所述快速检测vb1的胶体金试纸或试纸盒进行详细说明，不能理解为是对本实用新型的限制。以下实施例中所使用的材料和试剂除特别说明外，均为普通市售。本实用新型适用于：谷物、米、肝、肉类、豆类、水果、蔬菜、vb1药品(vb1片、复合vb1片，vb1口服液等)婴幼儿配方奶粉等等中的vb1 定性定量检测。
[0018]
【实施例1】检测样品的制备
[0019]
检测样品的制备：
[0020]
1、固体粉末样品(如奶粉或胶囊类药粉)的制备
[0021]
奶粉(或胶囊类药粉)每1g加50ml温水冲泡至完全溶解，用0.01mol/lpbs (ph7.4)缓冲液按体积比1:1稀释,如有混浊用4层滤纸进行过滤，取4ml置于5ml 离心管中，5000r/min离心5min，取100μl上清液在制备好的试纸上检测，10min后直接观察c、t线显线情况。
[0022]
2、鲜奶样品的制备
[0023]
用0.01mol/l pbs(ph7.4)缓冲液按体积比1:1稀释,如有混浊用4层滤纸进行过滤，取4ml置于5ml离心管中，5000r/min离心5min，取200μl上清液在制备好的试纸上检测，10min后直接观察c、t线显线情况。
[0024]
3、新鲜水果、蔬菜、豆类：取500g左右，用粉碎机将样品粉碎后，过20目筛，制得均匀性一致的匀浆或粉末，即为匀浆或固体试样，立即测定或者于冰箱中冷藏保存。
[0025]
称取1g(精确到0.01g)匀浆或固体试样置于5ml离心管中，加入4ml 0.01mol/l pbs(ph7.4)溶液，涡旋仪涡动5min，5000r/min离心5min，取100μl上清液在制备好的试纸上检测，10min后直接观察c、t线显线情况。
[0026]
4、新鲜肝、肉类：取250g肝或肉类，用匀浆机或者粉碎机将样品匀质后，制得均匀性一致的匀浆，即为匀浆试样，取匀浆试样3g置于100ml三角瓶中6ml乙酸乙酯后再恒温振荡器中振荡混合30min，5000r/min离心10min，吸取6ml上层液体,放入旋转蒸发仪中45℃蒸干，剩余物用1.5ml异辛烷和氯仿(v：v 2/3)溶解，加入1ml 0.01 mol/l pbs(ph7.4)溶液振荡10min，5000r/min离心10min，吸取100μl上清液在制备好的试纸上检测，10min后直接观察c、t线显线情况。
[0027]
5、其他含水量较低的固体样品，如含水量在15％左右的谷物(米)，取100g左右样品，用粉碎机将样品粉碎后，过20目筛，制得均匀性一致的粉末，即为固体试样，立即测定或者于冰箱中冷藏保存。
[0028]
称取1g(精确到0.01g)固体试样置于5ml离心管中，加入4ml 0.01mol/lpbs (ph7.4)溶液，涡旋仪涡动5min，5000r/min离心5min，取100μl上清液在制备好的试纸上检测，10min后直接观察c、t线显线情况。
[0029]
【实施例2】制备快速检测vb1的胶体金试纸
[0030]
制备如图1所示的胶体金试纸结构，包括支撑垫1，位于所述支撑垫上的硝酸纤维
素膜2，所述硝酸纤维素膜2的一端上方层叠连接吸水垫4，另一端上方层叠连接偶合物垫片3，所述偶合物垫片远离硝酸纤维素膜2的一端上方层叠连接样品垫7，所述样品垫的另一端上方粘接固定垫8；所述固定垫选用单面胶，所述硝酸纤维素膜2 中间部位的检测线6包被有单克隆鼠抗vb1抗体，检测线两边分别设有控制线5，所述偶合物垫片3上涂有金标记的bsa-vb1以及控制线偶合物，所述控制线5包被有抗dnp抗体，所述控制线偶合物为dnp-bsa标记的胶体金。其中，硝酸纤维素膜2在胶体金试纸中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；检测线6是将单克隆鼠抗vb1抗体使用包被缓冲液[(碳酸缓冲液cbs，ph9.6 0.1mol/l):称取 0.75gna2co3，1.466g nahco3用蒸馏水定容到500ml。]稀释到0.2-0.5mg/ml，优选0.2 mg/ml的浓度，取1ul/cm划线于所述硝酸纤维素膜2上，干燥，即得；控制线5是将抗dnp抗体使用3％甲醇、0.1％吐温-20的0.01mol/l pbs(ph7.4)缓冲液稀释到0.2-0.5mg/ml，优选0.2mg/ml的浓度，取1ul/cm划线于所述硝酸纤维素膜2上，干燥，即得。
[0031]
所述偶合物垫片3的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液(包含0.1％bsa、5％蔗糖、0.5％peg20000、0.1％吐温-20的 0.01mol/l pbs(ph7.4)缓冲液)中浸泡5分钟后取出，干燥后，用biodot包膜仪器将金标记的bsa-vb1以及控制线偶合物涂布在偶合物垫片3上，涂布量是1ul/mm，干燥，即得。优选地，所述偶合物垫片3的预封闭缓冲液包含0.8％的酪蛋白，4％的牛血清白蛋白，0.007％的硼酸，0.1％的peg。
[0032]
所述样品垫7可对液态样品起到初步过滤作用。将样品垫用141封闭液(质量分数为0.2％-0.4％的bsa、0.01mol/l pbs(ph7.4)缓冲液)浸泡5分钟后，37℃干燥4.5h，即得。优选地，所述141封闭液包含：质量分数为0.4％的bsa、0.01mol/ l pbs(ph7.4)缓冲液，将上述各组成部件按图1所示结构粘贴在支撑垫1上，获得快速检测vb1的胶体金试纸。
[0033]
【实施例3】用本实用新型所述胶体金试纸快速检测vb1
[0034]
取本实用新型优选的一种快速检测vb1的胶体金试纸，如图1所示述胶体金试纸包括支撑垫片1，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜2，所述硝酸纤维素膜的一端上方层叠连接吸水垫4，另一端上方层叠连接偶合物垫片3，所述偶合物垫片远离硝酸纤维素膜2的一端上方层叠连接样品垫7，所述样品垫另一端的上方粘接固定垫片8，所述固定垫片选用单面胶，所述硝酸纤维素膜2中间部位检测线6包被有单克隆鼠抗vb1抗体，检测线两边分别设有控制线5，所述偶合物垫片3上涂布有金标记的bsa-vb1以及控制线偶合物。优选地，所述控制线5包被有抗dnp抗体，所述控制线偶合物为dnp-bsa标记的胶体金。按以下步骤进行检测：1)吸取待测样品，如低温保存样本需恢复至室温。2)将待测样品加入样品垫7上，反应10min。3) 直接观察或者，将所述胶体金试纸置于胶体金读卡仪(广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司)中判定结果。
[0035]
【实施例4】用本实用新型所述胶体金试纸盒快速检测vb1
[0036]
取本实用新型另一种快速检测vb1的胶体金试纸盒，如图2所示，所述胶体金试纸盒包括支撑垫片1，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜2，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫4，另一端连接偶合物垫片3，所述偶合物垫片连接样品垫7，所述样品垫另一端部上方粘接固定垫片8，所述固定垫片选用单面胶，所述硝酸纤维素膜2中间部位检测线6包被有单克隆鼠抗vb1抗体，检测线两边分别设有控制线 5，所述偶合物垫片3上涂布有金标记的bsa-vb1以及控制线偶合物。优选地，所述控制线5包被有抗dnp抗体，所述控制线偶合物为
dnp-bsa标记的胶体金。所述胶体金试纸还包括一外壳9，所述外壳包裹所述试纸，露出样品垫7、硝酸纤维素膜2上的检测线6和两条控制线5。按以下步骤进行检测：1)采集的待测vb1 样本，如低温保存样本需恢复至室温。2)将待测样品加入样品垫7上，反应10min。 3)直接观察或者，将所述胶体金试纸置于胶体金读卡仪(广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司)中判定结果。