一种促进小鼠肌肉损伤修复的饲料及用途的制作方法

1.本发明涉及一种促进肌肉损伤修复的饲料及用途，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。


背景技术：

2.骨骼肌是人体最大的运动器官，约占身体质量的40%。其在人类生命的身体活动中起着关键的作用，如运动能力、能量稳态和呼吸作用等。除此之外，在动物生产中，肌肉发育是影响猪肉品质的主要因素，其直接影响胴体瘦肉率以及猪肉的营养品质和感官品质。骨骼肌由多核肌纤维组成，多核肌纤维是通过肌肉干细胞的活化、增值、分化和融合形成的，涉及一系列反应和转录因子调控。
3.肌肉损伤后，骨骼肌具有很强的再生和修复受损肌肉的能力。骨骼肌损伤再生过程中，静止的肌肉干细胞被激活，以修复受伤的肌肉和维持肌肉稳态。骨骼肌损伤修复过程受到多种因素以及转录因子的调节，但目前关于营养活性物质调控肌肉损伤再生的研究报道甚少。共轭亚油酸（cla）是一种主要从反刍动物脂肪和牛奶产品中发现的天然活性物质，是亚油酸的所有立体和位置异构体混合物的总称，具有诱导脂肪细胞凋亡、促进能量代谢及激活炎症信号通路等生理功能。然而，目前未见关于cla对肌肉损伤修复的相关研究。因此，探究cla在调控骨骼肌损伤修复过程中的功能具有重要的意义。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种促进小鼠肌肉损伤修复的饲料及用途。
5.一种促进肌肉损伤修复的饲料，普通日粮饲料中添加有质量百分比1% cla，其中t10, c12-cla : c9, t11-cla=1:1, 纯度80%。
6.所述普通日粮采用c57bl/6j小鼠维持饲料，其蛋白质含量22.8%，脂肪含量13.8%，碳水化合物含量63.4%，总热量3656 kcal/kg。
7.一种小鼠肌内损伤模型的构建方法，向约12周龄c57bl/6j雄性小鼠腹腔内注射200 ml的1%戊巴比妥钠麻醉后，向小鼠左右腿胫骨前肌（ta）组织中分别注射50 ml的10 mm心脏毒素（ctx）和0.9%的生理盐水，在损伤的当天饲喂普通日粮以及1% cla添加量的普通日粮。
8.所述的构建方法，所有组小鼠连续饲喂7d。
9.本发明的有益效果：1% cla的日粮饲料能够促进小鼠骨骼肌损伤再生，是研究营养活性物质调控肌肉损伤再生强有力的动物模型，开拓了目前关于营养活性物质调控肌肉损伤再生的新方法，可广泛用于开展相关研究。
附图说明
10.图1是流程图；图中： cc
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ctx 普通日粮，ca
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ctx 1% cla。
11.图2是1%cla添加日粮对小鼠体重的影响结果；图中：cc
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ctx 普通日粮，ca
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ctx 1% cla。
12.图3 是1%cla添加日粮对小鼠组织重量的影响结果；图中：cc
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ctx 普通日粮，ca
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ctx 1% cla。
13.图4 是1%cla添加日粮对小鼠运动时间的影响结果；图中：cc
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ctx 普通日粮，ca
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ctx 1% cla。
14.图5 是1%cla添加日粮对小鼠运动距离的影响结果；图中：cc
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ctx 普通日粮，ca
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ctx 1% cla。
15.图6 是1%cla添加日粮对小鼠运动最大速度的影响结果；图中：cc
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ctx 普通日粮，ca
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ctx 1% cla。
16.图7 是1%cla添加日粮对小鼠胫骨前肌组织形态的影响结果；图中：cc
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ctx 普通日粮，ca
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ctx 1% cla。
17.图8 是1%cla添加日粮对小鼠胫骨前肌组织损伤再生面积的影响结果；图中：cc
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ctx 普通日粮，ca
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ctx 1% cla。
18.图9 是1%cla添加日粮对小鼠胫骨前肌组织肌肉再生及炎症相关基因mrna表达水平的影响结果；图中：cc
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ctx 普通日粮，ca
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ctx 1% cla。
具体实施方式
19.下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
20.（一）、小鼠肌内损伤模型的构建：向约12周龄c57bl/6j雄性小鼠腹腔内注射约200ml的1%戊巴比妥钠麻醉后，向小鼠左右腿胫骨前肌（ta）组织中分别注射50ml的10mm心脏毒素（ctx）和0.9%的生理盐水，在损伤的当天饲喂普通日粮以及1% cla（t10, c12-cla : c9, t11-cla=1:1, 纯度为80%）添加量的普通日粮，模式过程见图1。
21.（二）、共轭亚油酸添加对小鼠肌肉损伤再生后体重及组织重量的影响1、共轭亚油酸对小鼠肌肉损伤再生后体重的影响小鼠肌肉损伤再生7天后，称取小鼠体重，进行比较，结果见图2。
22.2、共轭亚油酸对小鼠肌肉损伤再生后组织重量的影响小鼠肌肉损伤再生7天后，处死小鼠，取出四种肌肉组织：胫骨前肌、腓肠肌、趾长伸肌、比目鱼肌；三种脂肪组织：棕色脂肪、皮下脂肪、附睾脂肪；五种内脏：心、肝、脾、肺、肾，称取重量，进行比较，结果见图3。
23.结果为：共轭亚油酸对小鼠肌肉损伤再生后体重无显著影响，显著提高腓肠肌重量并降低皮下脂肪重量，而对其他组织无显著影响。
24.（三）、共轭亚油酸添加对小鼠运动能力的影响
小鼠肌肉损伤再生7天后，先对其进行三天的跑步机运动适应：1）第一天跑步机运动速度5 米/分钟，运动10分钟；2）第二天跑步机运动速度7 米/分钟，运动10分钟；3）第三天跑步机运动速度10 米/分钟，运动10分钟；随后第四天对其进行运动能力测定：倾斜角度为5
°
，先10 米/分钟，运动10分钟，之后每5分钟速度增加2米/分钟，直至小鼠力竭，记录运动时间（秒）、距离（米）及最大速度（米/分钟），结果见图4-6。
25.结果为：共轭亚油酸添显著提高小鼠损伤再生后的运动时间、距离及速度。
26.（四）、共轭亚油酸添加对小鼠损伤再生后胫骨前肌组织形态及损伤再生面积的影响1、共轭亚油酸对小鼠胫骨前肌损伤再生后组织形态的影响小鼠肌肉损伤再生7天后，处死小鼠，取出胫骨前肌，加入2ml左右固定液进行固定，随后进行石蜡切片及he染色，结果见图7。
27.石蜡切片具体步骤如下：1）取材：新鲜组织用固定液固定24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内；2）脱水浸蜡：将脱水盒放进脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75%酒精4h，85%酒精2h，90%酒精2h，95%酒精1h，无水乙醇i 30min，无水乙醇ii 30min，醇苯5-10min，二甲苯i 5-10min，二甲苯ii 5-10min，65
°
融化石蜡i 1h，65
°
融化石蜡ii 1h，65
°
融化石蜡iii 1h；3）包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20
°
冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块；4）切片：将修整好的蜡块，放入-20℃冻台冷却，再将冷却的蜡块置于石蜡切片机切片，厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃ 温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃ 烘箱内烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
28.he染色具体步骤如下：1）石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯
ⅰꢀ
20min-二甲苯
ⅱꢀ
20min-无水乙醇
ⅰꢀ
5min-无水乙醇
ⅱꢀ
5min-75%酒精5min，自来水洗；2）苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗；3）伊红染色：切片依次入85%、95%的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min；4）脱水封片：切片依次放入无水乙醇i 5min
ꢀ‑
无水乙醇ii 5min-无水乙醇ⅲ5min
ꢀ‑
二甲ⅰ5min
‑ꢀ
二甲苯ⅱ5min透明，中性树胶封片；5）显微镜镜检，图像采集分析。
29.2、共轭亚油酸对小鼠胫骨前肌损伤再生后再生面积的影响之后用imagej软件对切片面积中的已再生面积以及未再生面积进行统计，结果见图8。
30.结果为：共轭亚油酸显著促进小鼠肌肉损伤再生，切片中肌肉已再生面积显著增
加，未再生面积显著降低。
31.（五）、共轭亚油酸添加对小鼠损伤再生后肌肉再生及炎症相关基因mrna表达水平的影响1、总rna的提取取小鼠肌肉损伤再生7天的胫骨前肌，用trizol法提取总rna。步骤如下：1） 取胫骨前肌组织，加入500μl trizol试剂，剪碎组织，匀浆机匀浆2次，30s，室温静置15min。
32.2） 加入100μl三氯甲烷，漩涡振荡15s，室温孵育10 min；3） 4℃，12000 rpm离心10 min，；4） 溶液分为三层，小心吸取上清液，转移到新的depc处理过的离心管中，加入等体积室温异丙醇，颠倒混匀，静置10 min；5） 4℃，12000 rpm离心10 min，在管底壁可见白色rna沉淀；6） 倒掉上清，加入75%预冷的乙醇500μl，把rna沉淀悬浮洗涤；7） 4℃，12000 rpm离心5 min；8） 重复步骤6及7一次；9） 倒掉上清，用移液枪小心吸去管底剩余的乙醇，敞开离心管，室温干燥沉淀20 min；10） 用20μl rnase-free水溶解rna，用枪头轻轻的吹吸溶解rna；11） 以rnase-free 水为对照，用分光光度计测定rna的浓度和纯度。
33.2、反转录测定总rna浓度，对纯度和完整性符合要求的样品进行反转录，反转录体系如下表1：30
ꢀº
c 10min，42
ꢀº
c 60 min，70
ꢀº
c15min，反应结束后加入80μl rnase free水，将cdna放置-20
ꢀº
c备用。
34.3、q-pcrqpcr采用applied biosystems steponeplus
™
real-time pcr系统，使用sybr green master mix(罗氏，印第安纳波利斯，美国), 反应体系如下表2： 。
35.采用2-ddct
法分析基因表达的相对变化，结果为：q-pcr结果表明，与对照组（cc）相比，共轭亚油酸添加组（ca）的小鼠肌肉再生相关基因表达量（myod、myog、emyhc）显著下降，炎症相关基因表达量（il-6、tnf-a）显著下降（图9）。
36.最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发
明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。