检测16型和18型HPV的LAMP引物组合、反应体系和方法与流程

检测16型和18型hpv的lamp引物组合、反应体系和方法
技术领域
1.本发明属于病毒分子生物学领域，具体涉及一种检测16型和18型hpv的lamp引物组合、反应体系和方法。


背景技术：

2.宫颈癌是全球女性癌症死亡的第二大原因。长期持续性感染高危基因型人乳头瘤病毒 (hpv)是宫颈癌前病变后续发展的关键因素。hpv包含一组小型异质性的、无包膜衣壳包裹的dsdna病毒，可感染粘膜及皮肤上皮细胞。目前被认为是导致严重宫颈发育不良和宫颈癌发展的高危型hpv基因型有hpv16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59和68，而将hpv 26、53、66、73和82定义为中危型，其中hpv16和hpv18是最具致癌性的基因型，分别约占全球宫颈癌病例的55.2％和14.2％。
3.宫颈癌筛查传统上基于常规液基细胞学检测(巴氏染色)诊断。因为液基细胞学检测严重依赖于形态学标准，被认为是高度主观的方法，所以液基细胞学筛查在各级医院显示出不同程度的敏感性(30-87％)。如今，hpv dna的核酸检测被认为是检测鉴定hpv病毒的金标准。因为在99.7％的宫颈癌研究病例中检测到病毒基因组，并且比传统的液基细胞学筛查检测具有更高的敏感性。hpv基因分型技术，例如hybrid capture 2(hc2)、cervista、amplicor 和聚合酶链反应(pcr)，虽然它们的方法各不相同，但它们的缺点是既耗时又需要昂贵的仪器设备。因此，开发一种简单、快速且具有成本效益的方法来早期检测hpv dna非常重要。
4.环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是一种用于等温扩增核苷酸目标的越来越受欢迎的替代方法。lamp反应基于bst dna聚合酶在60℃到70℃温度范围内的等温条件下进行的链置换扩增，这需要一组四(或六)种不同的引物与靶基因上的六 (或八)个不同区域结合，才能进行检测。lamp引物组由两个外部引物(正向外部引物f3 和反向外部引物b3)、两个内部引物(正向内部引物fip和反向内部引物bip)和最终两个环引物(环正向引物lf和环向后引物lb)，这样设计可进一步缩短扩增时间。因此，可以使用至少一组四个引物，它们严格识别目标序列上的六个不同区域，范围在180bp到200bp之间，确保高特异性。lamp方法在阳性样品检测中可以产生大量扩增产物，可以通过琼脂糖凝胶电泳或通过目测颜色变化来检测。lamp反应可以在30～60分钟内完成，使得任何实验室都只需要简单且廉价的仪器(例如水浴或金属浴)即可进行核酸检测。lamp的主要优点是：设备最少，高灵敏度和检测时间快速(少于60分钟)。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种快速检测16型和18型hpv的lamp引物组合、反应体系和方法。
6.本发明所采取的技术方案是：
7.本发明的第一方面，提供一种lamp检测引物组，包括hpv16和/或hpv18的引物组；
8.所述hpv16的引物组的核酸序列如下所示：
9.外引物：
10.f3：tgtaaccttttgttgcaagtgt(seqidno.1)；
11.b3：agcatcccctgtttttttttcca(seqidno.2)；
12.内引物：
13.fip：cagatggggcacacaattccta-caaagcacacacgtagaca(seqidno.3)；
14.bip：accataatctaccatggctg-aaccatccattacatcccgtacc(seqidno.4)；
15.环引物：
16.lf：gtgcccattaacaggtcttcc(seqidno.5)；
17.lb：caggtaccaatggggaagag(seqidno.6)；
18.所述hpv18的引物组的核酸序列如下所示：
19.外引物：
20.f3：agcgactcagaggaagaaaac(seqidno.7)；
21.b3：gccattgttgcttactgctg(seqidno.8)；
22.内引物：
23.fip：tctggcttcacacttacttcacata-gttaatcatcaacatttaccag(seqidno.9)；
24.bip：gctagtagtagaaagctcagcag-accacggacacacaaagg(seqidno.10)；
25.环引物：
26.lf：ttgtgtgacgttgtggttcggc(seqidno.11)；
27.lb：ttcgagcattccagcagctgtt(seqidno.12)。
28.在本发明的一些实施方式中，所述外引物、内引物、环引物在反应体系中的摩尔比为1：(1～2)：1。
29.在本发明的一些优选实施方式中，所述外引物、内引物、环引物在反应体系中的摩尔比为1:2:1。
30.本发明的第二方面，提供一种试剂盒，其特征在于，包括本发明第一方面所述的lamp检测引物组。
31.在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包含buffer、dna聚合酶、指示剂。
32.在本发明的一些实施方式中，所述buffer包含：180～220mmtris-clph8.6～9.0、90～110mmkcl、70～90mmmgso4、90～110mm(nh4)2so4、0.9～1.1％tween20、7～9m甜菜碱、12～16mmdntps。
33.在本发明的一些实施方式中，所述buffer包含：200mmtris-clph8.8、100mmkcl、80mmmgso4、100mm(nh4)2so4、1％tween20、8m甜菜碱、14mmdntps。
34.在本发明的一些实施方式中，所述dna聚合酶为bstdna聚合酶。
35.在本发明的一些实施方式中，所述指示剂为荧光染料。
36.在本发明的一些实施方式中，所述荧光染料优选为sybrgreen。
37.本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述引物组或本发明第二方面所述试剂盒在检测hpv16和/或hpv18中的应用。
38.本发明的第四方面，提供一种检测hpv16和/或hpv18的方法，包含以下步骤：
39.s1：提取待测样品的dna；
40.s2：使用本发明第一方面所述引物组或本发明第二方面所述试剂盒扩增样品dna；
41.s3：根据指示剂的指示情况判断结果；
42.该方法不用于疾病的诊断。
43.在本发明的一些实施方式中，所述扩增条件为55～65℃反应20～30min。
44.在本发明的一些实施方式中，所述扩增条件为60℃反应25min。
45.在本发明的一些实施方式中，所述扩增的反应体系为：2.5μl buffer、10pmol f3、10pmolb3、20pmol fip、20pmol bip、10pmol lf、10pmol、lb、8u bst dna聚合酶、1μl模板样本 dna、1x sybr green、加ddh2o至25μl。
46.本发明的有益效果是：
47.本发明提供的引物组合、反应体系和方法用于hpv16和hpv18的核酸检测，采用sybrgreen染料进行荧光pcr仪器检测和可视化的染色显色检测，在55℃～65℃条件下均可实现靶基因的有效扩增及检测，不需变温，不需复杂仪器；并且能快速获得检测结果，30min内即可完成反应，特异性为100％，检测灵敏度为10～100copies/ml。操作简单、快速、灵敏，对硬件要求低，成本较低，有利于技术制备成试剂盒用于广泛推广，为hpv16和hpv18的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有重要意义。
附图说明
48.图1为检测hpv16和hpv18的荧光曲线结果。
49.图2为检测hpv16和hpv18的可视化结果。
50.图3为hpv16的检测灵敏度实验结果。
51.图4为hpv18的检测灵敏度实验结果。
52.图5为hpv16的检测特异性实验结果。
53.图6为hpv18的检测特异性实验结果。
具体实施方式
54.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
55.实施例1lamp检测hpv16和18的引物设计、反应体系以及检测方法
56.1、选取hpv16和hpv18的保守序列设计相应的lamp引物，包括两条外引物(f3、 b3)和两条内引物(fip、bip)，及对应的环引物对lf和lb。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并经hplc纯化。其中引物信息见表1。
57.表1引物信息
[0058][0059][0060]
f3是有与靶基因f3c区互补的f3区的引物。
[0061]
b3是有与靶基因b3c区互的b3区的引物。
[0062]
fip是在3端有与靶序列的f2c区互补的f2区并且在5端有与靶基因的f1c区相同的序列的引物。
[0063]
bip是在3'端有与靶序列b2c区互补的b2区并且在5端有与靶基因blc区相同的序列的引物。
[0064]
lf是与靶基因loopf区互补的lf区的引物。
[0065]
lb是有与靶基因loopb区互补的lb区的引物。
[0066]
2、一种反应体系，包括检测hpv16和hpv18的引物组，具体包括以下组分，反应体系见表2：
[0067]
表2反应体系
[0068][0069][0070]
上述10x buffer包括以下组分：
[0071][0072]
3、一种试剂盒，包含上述反应体系，进行hpv16和18的检测。
[0073]
实施例2一种lamp检测hpv16和18的方法
[0074]
在该实施例中，利用lamp来检测hpv16和18的方法，包括以下步骤：
[0075]
(1)采用基因组dna提取试剂盒提取待测样品的dna；
[0076]
(2)将待测样品的dna加入到反应体系中，放置于荧光pcr仪上，设置60℃1分钟，共25个循环进行lamp反应；
[0077]
(3)荧光pcr仪收集荧光信号；
[0078]
(4)将反应产物用1μl sybr green，可进行可视化观察结果。
[0079]
结果见图1荧光信号结果和图2的可视化结果。结果表明16型和18型hpv的lamp 引物组合和反应体系能检测16型和18型hpv阳性样品。
[0080]
实施例3灵敏度检测
[0081]
使用人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸(hpv dna)标准品(广州邦德盛生物技术有限公司) 作为实验阳性样本，hpv16的浓度平均数为1.36e 06，hpv18的浓度平均数为2.13e 06。用去离子水或者te buffer稀释到106、105、104、103、102、101拷贝/μl作为标准品，分别用1、2、3、4、5和6指代。将不同浓度的标准品进行lamp检测，反应体系和反应条件同实施例1，结果见图3和图4，结果表明hpv16和18型的检测灵敏度均为10～100拷贝之间。
[0082]
实施例4特异性检测
[0083]
选取临床已用荧光探针pcr法确定hpv感染亚型的dna样本，包括16、18、31、 33、52型阳性样本，采用基因组dna提取试剂盒提取待测样品的dna，各取待测20ng 待测样品的dna(约3000拷贝人基因组dna)作为模板，进行lamp检测，反应体系和反应条件同实施例1。结果见图5和图6。
[0084]
结果表明，hpv16和18型的阴性dna及非hpv16和18型的阳性dna标本均无阳性结果，hpv16和18型的阳性dna均显示为阳性结果，说明本发明实施例1的引物组特异性很强。
[0085]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。