一种荧光适配体探针及其在microRNA/ctDNA核酸分子检测中的应用的制作方法

一种荧光适配体探针及其在microrna/ctdna核酸分子检测中的应用
技术领域
1.本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种用于检测microrna/ctdna核酸分子的荧光适配体探针。


背景技术：

2.循环游离核酸（包括循环肿瘤dna和microrna），已被证实密切相关许多生命过程，包括细胞增殖、分化、衰老和凋亡。因此，循环游离核酸可作为各种疾病（如癌症、神经退行性疾病、糖尿病和免疫系统病理学）的诊断和预后生物标志物。例如，mir-21与肿瘤的增殖、凋亡和侵袭有关，已被用作肿瘤治疗和诊断的生物标志物；持续上调的mir-155不仅导致持续的炎症反应，又可促进肿瘤的发生。而该类核酸物质在血液系统中的表达水平普遍很低。到目前为止，已经开发出检测 mirna 的技术，包括聚合酶链反应 (pcr)、微阵列分析和使用放射性标记探针的rna印迹分析。然而，由于mirna序列短，序列相似度高，表达水平低，mirna 的检测仍然面临挑战。开发简单、灵敏、特异的microrna和ctdna定量检测方法仍然是一个挑战。
3.对于mirna/ctdna的荧光传感，核酸适配体通常用于设计基于纳米荧光淬灭剂的荧光传感器。荧光团标记的核酸适配体通过静电或π-π相互作用吸附在纳米荧光淬灭剂上，导致荧光团的荧光猝灭（信号“关闭”）；在存在目标mirna/ctdna的情况下，由于双链寡核苷酸的形成，适体从纳米荧光淬灭剂中释放出来，从而允许荧光团的荧光恢复（信号“开启”）。但是，由于通常情况下设计的核酸适配体探针只标记一个荧光基团，所以其荧光强度较弱，不利于检测。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供了一种用于检测microrna/ctdna核酸分子的荧光适配体探针（dye-dsdna-aps），通过在microrna或ctdna的适配体上连接附加链dsdna，由于附加链dsdna可以嵌入大量荧光分子，从而增强适配体探针的荧光强度。
5.为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种荧光适配体探针，包括核酸适配体和附加链dsdna，所述附加链dsdna连接在核酸适配体的一端或两端；所述附加链dsdna的双链结构内嵌入有荧光分子。
6.进一步地，所述附加链dsdna为碱基数目在5-20之间的双链dna。
7.更进一步地，所述附加链dsdna为5
′‑3′
tctcagag、5
′‑3′
tctcagagcg或5
′‑3′
cctctcagag。
8.进一步地，所述荧光分子选自sybr green i、toto-1、yoyo-1或吖啶橙。
9.上述荧光适配体探针在microrna或ctdna检测中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。
10.进一步地，所述应用的具体方法为：将荧光适配体探针与纳米荧光猝灭剂组装后，加至含有待测microrna/ctdna的样品中，混合5-10 min后离心，通过分析上清液荧光强度，实现microrna/ctdna的高灵敏检测。
11.进一步地，所述纳米荧光猝灭剂选自氧化石墨烯、金纳米颗粒或金属有机框架材料。
12.本发明通过将microrna或ctdna的适配体连接上附加链dsdna，并将荧光分子（如sybr green i等）嵌入到该dsdna的双链结构中。所制备的荧光适配体探针（dye-dsdna-aps）可与荧光猝灭剂（如氧化石墨烯、金纳米颗粒和金属有机框架材料等）组装，作为microrna或ctdna的荧光传感器。首先，dye-dsdna-aps吸附于荧光猝灭剂表面，并发生荧光猝灭；在相应的microrna或ctdna存在下，dye-dsdna-aps中的适配体部分形成双链dna结构，导致dye-dsdna-aps从荧光猝灭剂表面释放，并使荧光复燃。该荧光信号变化过程，可用于microrna或ctdna的体外检测。结果显示，该方法中设计的dye-dsdna-aps荧光适配体探针具有较高的灵敏度，为体液中microrna或ctdna的高灵敏检测提供了新的方法。
13.本发明的有益效果在于：（1）本发明的microrna检测方法简单，且成本低。
14.（2）本发明的荧光适配体探针dye-dsdna-aps可标记不同发射波长的荧光分子，对多种microrna和/或ctdna进行检测。
15.（3）本发明的荧光适配体探针dye-dsdna-aps灵敏度较高，该探针的荧光强度取决于dsdna片段的长度和嵌入的荧光分子的数量。
附图说明
16.图1为本发明荧光适配体探针的检测原理图。
17.图2为本发明实施例1中sybr-dsdna-aps auncs@zif-8检测mir-21的原理。
18.图3 为实施例1中auncs和auncs@zif-8材料的扫描电镜图。其中：(a)为auncs，(b)为auncs@zif-8。
19.图4为实施例1中sybr-dsdna-aps auncs@zif-8用于检测mir-21的荧光光谱图（fi为荧光强度）。
20.图5为实施例1中sybr-dsdna-aps auncs@zif-8对mir-21的检测的线性关系。
21.图6为实施例1中 sybr-dsdna-aps auncs@zif-8对mir-21检测的选择性。
22.图7为实施例2中超声破碎后的zn2ph2da晶体和zn2ph2da-100材料的扫描电镜图。其中：c1为zn2ph2da晶体，c2为zn2ph2da-100材料。
23.图8为实施例3中sybr-dsdna-aps’ zn2ph2da-100用于检测mir-155的荧光光谱图（fi为荧光强度）。
24.图9为实施例3中sybr-dsdna-aps’ zn2ph2da-100对mir-155的线性关系。
25.图10为实施例3中sybr-dsdna-aps’ zn2ph2da-100对血清中mir-155的线性关系。
具体实施方式
26.本发明通过设计荧光适配体探针dye-dsdna-aps，与荧光猝灭剂组装后可作为microrna或ctdna的高灵敏度的荧光传感器。
36.8 ml h2o 在 25℃下混合。在温和搅拌（500 rpm）下将溶液加热到 70℃ 24 h，然后冷却到室温。使用透析袋（3000 da 分子量截止）纯化，并在4℃下储存以供以后使用。
33.②ꢀ
auncs@zif-8 的制备auncs@zif-8的制备：取5.6 mg的zn（no3）2·
6h2o 溶于 80 μl的 h2o 溶液，加入 1.0 ml 的金纳米簇水溶液，然后将 ph 调至 5.0，离心水洗得金纳米簇沉淀。将沉淀分散于 1.0 ml 甲醇中，与 zn（no3）2·
6h2o（25 mm，7.5 ml）和 2-甲基咪唑（25 mm，7.5 ml）的甲醇溶液混合，室温静置 12 小时，离心收集得 auncs@zif-8，用甲醇洗涤数次，保存于甲醇溶液。
34.图3（a和b）为auncs纳米粒子和auncs@zif-8材料的透射电镜图，由电镜图可知auncs成功包裹在了zif-8中。
35.2. mir-21荧光适配体探针在auncs@zif-8上的组装将标记荧光分子sybr green i的mir-21适配体（sybr-dsdna-aps）（50 nm）（dsdna：5
′‑3′
: tctcagag；5
′‑3′
: ctctgaga）与auncs@zif-8在1 ml磷酸缓冲液中混合，15 min后形成sybr-dsdna-aps与auncs@zif-8形成的复合物（sybr-dsdna-aps auncs@zif-8）。
36.（二）mir-21的荧光检测取sybr-dsdna-aps auncs@zif-8的分散液(0.2 mg
·
ml-1
)，加入含mir-21的血清样品中，5 min后通过荧光法检测上清液荧光强度。
37.图4为检测mir-21的荧光光谱图观察到探针sybr-dsdna-aps在524 nm处的荧光强度随mir-21浓度从5 pm到100 pm增加，而auncs@zif-8-2在647 nm处的荧光强度变化不明显；由图5可知，sybr-dsdna-aps auncs@zif-8对mir-21的检测具有较好的线性关系。
38.（三）检测方法的选择性将sybr-dsdna-aps auncs@zif-8分散于磷酸缓冲液中（0.2 mg
·
ml-1
），然后加入mir-21、r1（5
′‑3′
: uagcucuucagacuggaguuga, seq id no.1）r2（5
′‑3′
: uagcaaaucaggcugaugaaga, seq id no.2）、牛血清白蛋白（bsa）、谷胱甘肽（gsh）、三磷酸腺苷（atp）、三磷酸尿苷（utp）、三磷酸鸟苷 （gtp）和三磷酸胞苷（ctp）等分子，按上述方法进行荧光检测。由图6可知，sybr-dsdna-aps auncs@zif-8对mir-21具有专一性。
39.实施例2mir-155的荧光检测（一）荧光传感材料的制备：1．zn2ph2da晶体的合成。
40.将dtba（0.1mmol）、phen（0.2mmol）和znac
·
2h2o（0.2mmol）混合分散于20ml乙醇中。然后向混合物中添加120 μlnaoh溶液（0.7 m），并将其转移到聚四氟乙烯高压釜中200℃下加热24小时，用乙醇和水分别洗涤三次，离心收集沉淀。
41.2.zn2ph2da-100的制备。
42.将dtba（0.1 mmol）、phen（0.2 mmol）、znac
·
2h2o（0.2 mmol）和naoh（0.1 mmol）分散于20 ml乙醇中。然后将混合物在聚四氟乙烯高压釜中100℃下加热10小时。用乙醇洗涤三次，离心收集沉淀。
43.图7（c1和c2）为超声破碎后的zn2ph2da晶体和zn2ph2da-100材料的扫描电镜图。
44.3. mir-155荧光适配体探针在zn2ph2da-100上的组装
将标记荧光分子sybr green i的mir-155适配体（sybr-dsdna-aps’）（20 nm）（dsdna：5
′‑3′
: tctcagag；5
′‑3′
: ctctgaga）与zn2ph2da-100（0.05 mg
·
ml-1
）在磷酸缓冲液中混合，5 min后形成sybr-dsdna-aps’与zn2ph2da-100形成的复合物（sybr-dsdna-aps’ zn2ph2da-100）。
45.（二）mir-155的荧光检测取sybr-dsdna-aps’ zn2ph2da-100的分散液，加入含mir-155的血清样品中，5 min后通过荧光法检测上清液荧光强度。
46.图8为检测mir-155的荧光光谱图，sybr-dsdna-ap’探针在524 nm处的荧光强度随mir-155浓度的增加而恢复。而zn2ph2da-100在366 nm处的荧光强度大致保持不变；由图9可知，sybr-dsdna-aps’ zn2ph2da-100对mir-155的检测具有较好的线性关系；图10为血清中检测mir-155的线性关系。