一种测定尿液中草甘膦、草铵膦和亚硝酸盐的系统和方法与流程

1.本发明属于尿液毒物检测，具体涉及一种离子交换色谱柱切换法同时测定尿液中的草甘膦、草铵膦和亚硝酸盐的系统和方法。


背景技术：

2.草甘膦（glyphosate）、草铵膦（glufosinate）、亚硝酸盐常被用于农药、消毒剂等各个方面，除了对环境产生一定的影响外，还会对人体产生一些影响。亚硝酸盐会使人体组织缺氧，严重时会使人窒息而亡。草甘膦和草铵膦为有机磷类除草剂，具有低毒、高效、范围广的特点，但是进入人体后会使人产生消化道、呼吸道、心尿管系统及神经系统等多脏器损伤的现象，严重时会使人死亡。
3.目前常用来检测这些毒物的方法有：分光光度法、液质-气质联用法（lc-gc）、镉柱法等。而由于草甘膦、草铵膦极性较强、易溶于水，缺少发光基团和荧光基团，所以用液质测定大多需要复杂的衍生化手段。
4.草甘膦、草铵膦和亚硝酸盐在水里均为离子化合物，都能用离子色谱进行分离检测。而在唾液、尿液、血液等生物检材当中，尿液是最具有价值的。但是目前的lc、lc-ms、gc、gc-ms对尿液进行检测都需要进行前处理，需要将尿液中的蛋白质等大分子进行沉淀，将目标物分离进行检测。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明的目的在于提供一种离子交换色谱柱切换联用法同时直接测定尿液中不同浓度的草甘膦、草铵膦和亚硝酸盐的系统；本发明的第二目的在于提供一种上述系统的检测方法。
6.技术方案：本发明的一种测定尿液中草甘膦、草铵膦和亚硝酸盐的系统，包括用于高浓度检测的一维检测单元和用于低浓度检测的二维检测单元，所述一维检测单元和二维检测单元之间设有切换待测液体的第三六通阀；所述一维检测单元包括第一六通阀，所述第一六通阀上设有用于收集待测液体的定量环，所述第一六通阀的一端依次连接有第一保护柱、第一分析柱、第一抑制器和第一检测器；所述第一检测器与第三六通阀的一端连接；所述二维检测单元包括第二六通阀，所述第二六通阀上设有用于富集待测液体的富集柱，所述第二六通阀的一端与第三六通阀连接，所述第二六通阀的另一端依次连接有第二保护柱、第二分析柱、第二抑制器和第二检测器。
7.进一步的，所述第一保护柱和第一分析柱采用ion pac ag19色谱柱；所述第二保护柱和第二分析柱采用ion pac ag11色谱柱。
8.进一步的，所述富集柱采用uatc-lp12富集柱。
9.进一步的，所述一维检测单元和二维检测单元还连接有用于通入淋洗液的第一泵和第二泵。
10.本发明还保护所述的测定尿液中草甘膦、草铵膦和亚硝酸盐的系统的检测方法，
包括以下步骤：步骤一、在空白尿液中添加0.1~100 mg/l的目标离子分别对一维检测单元和二维检测单元进行检出限、定量限、线性和回收率的评价，确定一维检测单元和二维检测单元的检测浓度分界点；步骤二、通过自动进样器将待测液体装载在定量环中；步骤三、当待测液体中目标离子的浓度高于浓度分界点时，在洗脱液流动相作用下待测液体进入第一保护柱和第一分析柱进行洗脱分离；分离后的液体依次进入第一抑制器和第一检测器进行检测；步骤四、当待测液体中目标离子的浓度低于浓度分界点时，切换第三六通阀将定量环中的待测液流入到富集柱中进行目标离子的富集；步骤五、富集柱中待测液体进入第二保护柱和第二分析柱进行洗脱分离，分离后的液体依次进入第二抑制器和第二检测器进行检测；其中，目标离子为草甘膦、草铵膦或亚硝酸盐。
11.进一步的，所述步骤一中，检测浓度分界点为10mg/l。
12.进一步的，所述步骤一中，一维检测单元中草甘膦、草铵膦、亚硝酸盐的检出限分别为：0.396 mg/l、5.88 mg/l、0.97 mg/l；定量限分别为1.32 mg/l、19.6 mg/l、3.25 mg/l；二维检测单元中草甘膦、草铵膦、亚硝酸盐的检出限分别为：0.05 mg/l、0.02 mg/l、0.03 mg/l；定量限分别为：0.19 mg/l、0.06 mg/l、0.11mg/l。
13.进一步的，所述步骤三中，采用10~40 mmol/l的koh溶液进行梯度洗脱，koh溶液的流速为1.0ml/min，柱温为30℃。
14.进一步的，所述步骤四中，第三六通阀切换草铵膦、亚硝酸盐、草甘膦的时间分别为9.7~11.4 min、15~15.9 min、26.4~29 min。
15.进一步的，所述步骤五中，采用23 mmol/l的koh溶液进行等度洗脱，koh溶液的流速为1.0ml/min，柱温为30℃。
16.本发明的测试原理为，利用一维检测单元将尿液中的目标离子和其他杂质离子进行分离，检测尿液中较高浓度的草甘膦、草铵膦和亚硝酸盐；其次当尿液中目标物含量过低时可以通过富集柱进行目标离子的富集，再通过二维检测单元同时检测尿液中低含量的草甘膦、草铵膦、亚硝酸盐；通过离子交换柱切换联用法实现了尿液中不同浓度的草甘膦、草铵膦、亚硝酸盐的同时、快速、准确检测。
17.其中，一维检测单元的色谱柱采用ion pac ag19，二维检测单元的色谱柱采用ion pac ag11，这是因为草甘膦、草铵膦、亚硝酸盐和尿液中的其他杂质能够在ion pac ag19、ion pac ag11上完全分离，并且分离度和峰形较好；三种目标物与尿液中的氯离子、硫酸根离子、尿素等杂质首先在ion pac ag19分离柱上进行预分离，检测较高浓度的目标物；随后，三种目标物进入二维检测单元，经过富集柱富集后在ion pac ag11分离柱上进行再一次分离，检测较低浓度的目标物。
18.有益效果：与现有技术相比，本发明的具有如下显著优点：本发明与现有的气质联用、液质联用方法相比，该离子色谱法无需尿液的蛋白沉淀衍生化等复杂的前处理，可以直接进样，并且能够同时测定草甘膦、草铵膦和亚硝酸盐等三种强极性毒物，方法具有快速、操作简单、灵敏度高的优点；同时，本发明还可以高效测定不同浓度的草甘膦、草铵膦和亚
硝酸盐，目标离子的检测浓度区间在0.1~100mg/l。
附图说明
19.图1为本发明系统进样过程示意图；图2为本发明系统一维离子交换的示意图；图3为本发明系统二维离子富集的示意图；图4为本发明系统二维离子交换的示意图；图5为尿液的第一维离子交换色谱图；图6为尿液的第二维离子交换色谱图。
具体实施方式
20.下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
21.参见图1-4的一种测定尿液中草甘膦、草铵膦和亚硝酸盐的系统，包括用于高浓度检测的一维检测单元和用于低浓度检测的二维检测单元；一维检测单元和二维检测单元之间设有切换待测液体的第三六通阀4；其中，一维检测单元包括第一六通阀3、定量环6、第一保护柱7、第一分析柱8、第一抑制器9和第一检测器10；定量环6设置在第一六通阀3上，一维检测单元的一侧设有第一泵1，第一泵1外接洗脱液；第一六通阀3依次与第一保护柱7、第一分析柱8、第一抑制器9和第一检测器10连接；自动进样器16与第一六通阀3连接；二维检测单元包括第二六通阀5、富集柱11、第二保护柱12、第二分析柱13、第二抑制器14和第二检测器15；富集柱11设置在第二六通阀5上，第二六通阀5的一侧连接第二泵2，第二泵2外接洗脱液，第二六通阀5的一端与第三六通阀4连接，第二六通阀5的另一端依次连接有第二保护柱12、第二分析柱13、第二抑制器14和第二检测器15。
22.第一保护柱7和第一分析柱8采用ion pac ag19色谱柱；所述第二保护柱12和第二分析柱13采用ion pac ag11色谱柱；富集柱11采用uatc-lp12富集柱；第一抑制器9为aers 500；第二抑制器14为aers 500 mm；第一检测器10和第二检测器15为抑制性电导检测器。
23.尿液中草甘膦、草铵膦、亚硝酸盐的离子色谱法分析检测步骤如下：步骤一、将待测尿液进行稀释除去大颗粒固体进样：取待测尿液1ml加入15ml试管中，加入19ml去离子水稀释，以7830 r/min的速度离心10min后，取上清液放入超滤管中。超滤管再以7830r/min的速度离心10min后，取上清液过0.22μm尼龙滤膜除去固体颗粒，直接进样；进样过程具体参见图1，实线表示连通的状态，虚线表示断开的状态，自动进样器16将待测尿液通过第一六通阀3输送到定量环6中，使待测尿液进入一维检测单元；步骤二、参见图2，自动进样器16的进样端断开，第一泵1将洗脱液送入定量环6中，随后混合的待测液体进入第一保护柱7和第一分析柱8，将目标离子和杂质离子进行分离；淋洗液为10~40 mol/l 的koh溶液梯度淋洗，具体为：0~5 min，10 mmol/l；5~25 min，10~40 mmol/l；25~27 min，40 mmol/l；27.1~30 min，10 mmol/l；温度为30℃，流速为1 ml/min；然后分离后的液体经过第一抑制器9和第一检测器10进行检测，检测后经过第三六通阀排出；参见图5，a表示尿液和b表示尿液加标，通过抑制电导检测；得到的峰中：1表示亚硝酸根；2表示草铵膦；3表示草甘膦，说明可以实现目标离子的检测；步骤三、当待测物浓度较低，即小于10 mg/l时，一维检测单元无法准确检测时，参
见图3，经过一维检测单元预处理的待测尿液在第三六通阀的切换下可以进入二维检测单元的富集柱11，其中根据各目标物质的分离时间，控制草铵膦、亚硝酸盐、草铵膦的阀切换时间分别为：9.7~11.4 min、15~15.9 min、26.4~29 min；在富集柱11中完成对低浓度的目标物质的富集；步骤四、参见图4，此时断开富集柱11的进料端，同时第二泵2将洗脱液送入富集柱11中，随后混合的待测尿液进入第二保护柱12和第二分析柱13,进行洗脱分离，淋洗液为23 mmol的koh溶液等度淋洗，柱温为30℃，流速为1ml/min，然后分离后的液体经过第二抑制器14和第二检测器15进行检测，参见图6，a表示尿液和b表示尿液加标，通过抑制电导检测；得到的峰中：1表示草铵膦；2表示亚硝酸根；3表示草甘膦，说明可以实现低浓度的目标离子的检测；步骤五、通过在空白尿液中添加0.1~100 mg/l的目标离子对建立起的二维离子交换柱切换法进行了检出限、定量限、线性和回收率的评价。通过分别对草甘膦、草铵膦和亚硝酸盐峰面积和溶液浓度建立线性回归方程，每个浓度峰面积分别取六次计算平均值，计算得到一维检测单元中草甘膦、草铵膦和亚硝酸盐的分别在10~100 mg/l、10~100 mg/l、10~100 mg/l有良好的线性关系，线性相关系数（r2）分别为0.9999、0.9992、0.9992，检出限分别为0.40、5.88、0.97 mg/l（s/n=3），定量限分别为1.32、19.6、3.25 mg/l（s/n=10）。二维检测单元中草甘膦、草铵膦和亚硝酸盐的分别在0.1~10 mg/l、0.1~10 mg/l、0.1~10 mg/l有良好的线性关系，线性相关系数（r2）分别为0.9996、0.9993、0.9993，检出限分别为0.05、0.02、0.03 mg/l（s/n=3），定量限分别为0.19、0.06、0.11 mg/l（s/n=10）。本发明的检测方法中，需要确定一维检测单元和二维检测单元的检测浓度分界点，由于确定柱切换时间的范围时使用2 mg/l 的标准样品，当柱切换时间确定后发现当样品浓度增加到一定值时，从第一维到第二维的回收效率反而降低，即当浓度大于10 mg/l时，回收效率降低，故选择10 mg/l 为二维检测浓度的最高值，在这个条件下测定第二维的标准曲线，当目标离子浓度为0.1~10 mg/l时线性相关性r2均＞0.999；测定第一维的线性曲线，当浓度为10~100 mg/l时，线性相关性r2均＞0.999，故第一维的测定范围是10~100 mg/l。