骨组织工程学的复合支架的制作方法

1.本发明涉及骨组织工程学的复合支架。
背景技术：
：：2.骨性关节炎及剥脱性骨软骨炎是一类由于软骨或软骨下骨退变或病变所导致，其临床表现为疼痛、残疾及关节僵硬，骨性关节炎患者的骨软骨组织的破坏无法进行有效地自我修复。3.组织工程学支架被认为可通过细胞与支架间的相互作用及相关信号分子以实现缺损组织修复重建。现今，多种技术可以实现对细胞外基质(ecm)的仿生，并为细胞黏附、增殖及成骨分化提供合适的3d网状微结构。现有的骨组织工程学的复合支架存在的主要问题之一是各层界面的结合强度不足，增加了各界面之间剥离的风险。技术实现要素：4.本发明的主要目的在于提供一种界面结合力强的骨组织工程学的复合支架。5.为了实现上述目的，本发明提供一种骨组织工程的复合支架，包括pcl支架和于pcl支架上经静电纺丝形成的pcl-明胶支架。6.在本发明的一些实施例中，pcl-明胶支架表面覆盖有负载了bmp-2的明胶薄层。7.在本发明的一些实施例中，所述的明胶薄层通过等离子表面改性覆盖在所述的pcl-明胶支架。8.在本发明的一些实施例中，所述的明胶经过硅烷偶联剂进行交联。9.在本发明的一些实施例中，pcl-明胶支架由含有pcl和明胶的混合纺丝溶液在pcl支架表面经过静电纺丝得到。10.在本发明的一些实施例中，所述的pcl：明胶的重量比为8:2。11.在本发明的一些实施例中，所述的混合纺丝溶液中还含有gptms。12.在本发明的一些实施例中，所述的gptms占混合纺丝溶液重量的20％。13.在本发明的一些实施例中，所述的pcl支架经pda修饰。14.在本发明的一些实施例中，所述的pcl支架由fdm工艺打印。15.本发明的pcl支架用于模拟松质骨结构，而pcl-明胶支架则用于模拟软骨下骨结构，pcl支架与pcl-明胶支架之间的界面结合强度显著提高。通过相应的理化性能检测及力学分析，结果表明本发明的复合支架具有更加优异的性能。体内外实验结果表明本发明的复合支架有利于骨软骨缺损的同期修复，并具有潜在的临床应用价值。附图说明16.图1为pc支架(a-c)、pcd支架(d-f)的fe-sem微观图像。(垂直方向(a，b，d，e)，横断面(c和f))。17.图2为多层支架的fe-sem微观图像。pcd支架上的pcl-明胶静电纺丝(a，b)，多层(dopa-hcl，mw189.64g/mol)，(3-缩水甘油三酯丙基)三甲氧基硅烷(gptms，mw236.34sg/mol)，氢氧化钠(mw40g/mol)和2,2,2-三氟乙醇(tfe，mw100.04g/mol)购自rhawn有限公司(上海，中国)。骨形态发生蛋白-2(bmp-2)购自peprotech有限公司(新泽西，美国)。明胶(mw40-50kda)，异丙醇(99.99％，mw60.10g/mol)，乙醇(mw46.07)，戊二醛(25％mw100.12gr/mol)，三羟甲基氨基甲烷(mw＝121.14g/mol)，磷酸盐缓冲液(pbs，tablet，ph7.2-7.4)，氯化钠(nacl，mw58.44g/mol)，氯化钾(kcl，mw74.55g/mol)，碳酸氢钠(nahco3，mw84.01g/mol)，二水氯化钙(cacl2·2h2o，mw147.01g/mol)，六水氯化镁(mgcl2·6h2o，mw203.30g/mol)，一碱式磷酸钠(nah2po4·h2o，mw137.99g/mol)和对硝基苯磷酸盐(p-npp，片剂)购自sigma-aldrich有限公司(密苏里州，美国)。盐酸(hcl，37％，mw36.46g/mol)购自sinopharm有限公司(上海，中国)。dmem培养基和胎牛血清(fbs)和青霉素-链霉素溶液购自gibco-brl生命科技有限公司(纽约，美国)。碱性磷酸酶活性检测试剂盒购自beyotime生物技术有限公司(上海，中国)。bca(二喹啉甲酸)蛋白检测试剂盒购自thermofisher科技有限公司(马塞诸塞州，美国)。oc蛋白酶联免疫检测试剂盒购自sino生物科技有限公司(北京，中国)。利用去离子水配置相关溶液。所有试剂无需进一步纯化，即可直接使用。33.2-2-制备单层3d打印支架34.本技术中利用simplify3d软件(4.0.1版本)进行支架建模，并利用型号为horiz500的fdm-3d打印机制备pcl支架。利用200μm尺寸的喷嘴将熔融的单纤维打印成网格状形态，填充速率设定为0.14mm/s。打印机床的温度设定为20℃，喷嘴的温度设定为115℃。设定的打印角度为0°和90°，以层厚为0.2mm打印pcl支架。最终，制备得到的支架在温度设定为36.0±0.5℃的烘箱(dhg-9050a)中进行干燥处理24小时。上述单层pcl支架简称为pc支架。将打印好的单层pc支架浸泡在盐酸多巴胺溶液之中(用10mmtris溶液配制浓度为2mg/ml的工作液)，并在室温条件下充分搅拌，所制备的pda修饰的单层pcl支架，简称为pcd支架。35.2-3-制备多层3d打印支架36.在底层pcd支架上覆盖一层经由静电纺丝技术制备的pcl-明胶层。按照8:2的比例向10％w/v的tfe溶液中加入pcl及明胶，制备混合溶液。待充分溶解之后，向上述聚合物溶液之中按20wt％的比例加入gptms并充分搅拌2小时。以上述混合溶液作为原材料，经由静电纺丝技术，按3ml/h的速率，在5kv的电压下进行打印，喷嘴与pcd支架之间的距离设定为13cm。所制备的所有样品均在36±0.5℃的环境中干燥并过夜。通过在支架的表面通过氧等离子改性技术覆盖一薄层明胶-bmp-2，以制备三层支架。支架在电压100w、压力0.76mbar的条件下暴露于氧气之中(0.9升/小时)90秒。45分钟之后，支架被浸没于明胶-bmp-2溶液中30分钟。最后，利用去离子水冲洗支架，并在36±0.5℃的环境中干燥过夜。明胶-bmp-2溶液中溶解有2％w/v明胶及1μg/ml的bmp-2。上述支架被简称为pcde支架。37.2-4-表征38.通过在支架表面喷涂一层薄金，并在电压3kv的条件下，利用fe-sem对支架的微结构进行扫描。支架孔径大小及纤维直径则通过软件对fe-sem扫描图像进行统计得到。39.支架的应力-应变曲线及抗压强度通过仪器的十字头，在设定速度为0.5mm/min、施压大小为100n的情况下检测得到。多层支架中界面之间的结合强度通过抗拉强度测试系统检测得到，位移设定为1mm/min。40.支架的亲水性通过在室温条件下利用座滴法进行检测(sl200ks，usa)。支架对pbs溶液的吸收能力的评估在将支架浸没在50mlpbs溶液(37±0.5℃)后进行。支架的干重计为w0，并记录支架在pbs中浸泡2小时、4小时、6小时及24小时后的湿重。并通过下述公式1对支架对pbs溶液的吸收能力进行计算。41.swellingratio(％)＝[w-w0/w0]×100ꢀꢀꢀ(1)[0042]支架的体外降解能力的检测则是将支架浸没于50mlpbs溶液(37±0.5℃)之中6周后，记录支架的初始重量，并在每周取出1个样本称重后并记录。利用下述公式2对支架的水生物降解能力进行计算。[0043]biodegradationratio(％)＝|[w-w0/w0]|×100ꢀꢀꢀ(2)[0044]而支架的酶生物降解能力则是将支架浸没于50mlpbs溶液(37±0.5℃)之中，并向其中加入4mg/ml的胰蛋白酶，为期6周。记录支架的初始重量，并在每周取出1个样本称重后并记录，并利用上述公式2对其酶生物降解能力进行评估。[0045]当支架在50ml10×sbf溶液(37±0.5℃)中浸泡12小时后，利用fe-sem对支架进行扫描，以证明在支架表面可发生羟基磷灰石矿化沉积而形成的层状结构，并利用atr-ftir技术及xrd技术对支架表面层状结构成分进行检测。xrd中x线的入射角度选择为2θ(10-80°)，选择cu-kα(λ1.5418a°)射线，并将检测结果与jcpds标准进行比对以确定晶体类型。[0046]2-5-细胞-支架间相互作用[0047]体外实验中利用骨髓间充质干细胞(rbmscs)。通过向无菌支架表面以104/ml的密度种植rbmscs，并利用含10％fbs、100u/ml青霉素-链霉素的dmem培养基，在37±0.5℃，5％co2的环境中进行培养3天，之后用pbs溶液冲洗3遍之后，利用戊二醛溶液进行固定，利用不同浓度的乙醇溶液进行梯度化脱水，在醋酸异戊酯:乙醇(1:1)中浸泡10分钟。细胞在支架表面的黏附情况通过fe-sem进行评估。[0048]在细胞与支架共培养1、3、5天后进行活死细胞染色，利用含24μm钙黄绿素和4.5μm碘化丙啶的pbs溶液在37±0.5℃、5％co2、95％湿度孵育30分钟之后，pbs溶液冲洗后，利用荧光显微镜评估细胞活性。rbmscs细胞与支架共培养1、3、5天之后，利用cck-8试剂盒对细胞的增殖情况进行评估。以5×104/ml的细胞密度将bmscs种植支架表面，并利用cck-8工作液(10％cck-8溶液，无血清dmem进行稀释)与细胞共同孵育4小时后，吸取反应液100ul加入96孔板之中，并在450nm检测吸光度。[0049]rbmsc细胞的成骨行为通过alp活性检测试剂盒对alp活性进行评估。在细胞与支架共培养3天、7天、14天之后，利用ripa裂解液对细胞进行裂解，并2000rpm离心10min，加入p-npp溶液30分钟之后，在405nm情况下对吸光度进行检测。利用bca蛋白检测试剂盒对alp蛋白浓度进行检测。[0050]细胞与支架共培养3天、7天、14天之后，根据使用说明书利用oc酶联免疫试剂盒对其骨钙蛋白的浓度进行检测，通过标准品绘制oc蛋白标准曲线。对照组中不含支架样品。[0051]2-6-统计学分析[0052]上述结果均重复5次，并记录与excel2016软件之中。5次检测结果均以平均值±标准差的方式呈现并记录于excel2016软件之中。利用spss软件判断不同结果之间的差异是否具有统计学意义，p≤0.05时认为差异具有统计学意义。[0053]3-1-表面形态表征[0054]支架的微结构对于其理化性质、力学性质、生物学行为至关重要，甚至可以影响受损组织的再生重建。至今为止，3d打印支架可以实现对其几何学、微结构的精细化控制，其中包括有孔径大小、孔隙形状、孔隙率及内部连通性等等，以满足目标组织修复重建的需要。图1展示了经用fdm技术加工的、pda修饰的pcl多层支架的微观图像。图像中可见纤维相互垂直交织形成网状结构，上述网状微观结构是通过在机床上逐层打印熔融纤维丝结构而形成的。[0055]此外，微观图像中展现了支架内部存在有相互连通的孔隙结构，同时3d打印支架较好地还原了先前3d设计文件的尺寸，并未见明显收缩。图1(d，e)中可见经过pda修饰后的pcl支架，在这个过程中支架被先浸泡入含tris的酒精溶液之中，之后再加入盐酸多巴胺。24小时后，盐酸多巴胺由于其自聚合作用，而在支架的表面包覆形成薄层结构，充分覆盖了pcl光滑的表面。本技术之中pc支架作为pda附着的基材。[0056]聚合物支架的孔隙率是关乎细胞黏附、迁移、分化以及血管化的关键因素。孔隙率控制在50-60％可以在保证力学稳定性的前提下，为骨组织的修复重建提供合适的条件。其他可影响3d打印支架的参数包括有孔和纤维的大小、分布。pc支架和单层pcd支架的平均孔径大小分别为448.2±21.37μm和429±44.02μm，而pc支架中纤维的直径大小为355.8±22.76μm，经过pda修饰之中纤维直径增加到388.4±μm，结果可见图3。然而，上述孔隙大小及纤维直径之间的差异并不具有统计学意义，纤维直径的增加可归咎于pda在纤维表面的包覆。其他研究结果表明孔径大小在100-500μm能够给细胞及组织的生长、氧气供给、体外成骨表现、骨修复提供合适的条件。本技术中，fe-sem微观图像结果显示pc支架及单层pcd支架的孔隙均有利于干细胞增殖、分化及基因和蛋白的表达，最终实现骨软骨缺损的修复重建。[0057]3d打印支架可被用于促进松质骨的再生，而对于骨软骨缺损的修复重建，支架也应当能够做到同时模拟软骨下骨以及软骨。因此，本技术后续利用pcl-明胶纤维层模拟了软骨下骨，并同时起到了增加界面之间结合强度的作用。静电纺丝技术是一项常用于制备仿生细胞外基质的技术，该技术可以实现孔隙率超过90％。纳米或是微米级别的纤维有利于细胞浸润、增殖以及迁移。除此之外，以明胶作为基材的水凝胶，可形成亲水性的聚合物网络结构，且其主要构成与天然的软骨成分相类似，故可以用作模拟软骨层。根据相关研究，表面改性及负载大分子蛋白可有利于细胞的定向生长、增殖及分化。此外，通过气体等离子技术处理水凝胶是一项可提高水凝胶耐久性及稳定性的绝佳策略。因此，通过氧等离子技术直接将明胶ꢀ‑bmp-2水凝胶直接固定到基材表面。图2通过fe-sem图像成形了覆盖明胶-bmp-2水凝胶层前后静电纺丝层的微观形貌。微观图像可见形态均一且无异常珠状结构的纤维丝状物，其平均直径为2.27±0.46μm。而明胶-bmp-2水凝胶固定后，纤维直径增加到3.36±0.80μm，直径的增加有利于增加纤维之间的相互连通，并减少了支架内部的无效区域(详见图3)。在基材表面固定明胶-bmp-2水凝胶对纤维大小的均一性存在不利影响。此外，多层pcde的横断面图像可见纤维与3d打印支架形成了完全黏附(图2(d，e))。这个现象可能与纤维的化学组成结构密切相关。pcl层可用于模拟松质骨层，明胶层可用于模拟软骨层。[0058]3-2-化学表征[0059]利用ftir技术对原材料及支架均进行了检测，检测结果详见图4a。而支架合成的思路及过程详见图b。[0060]在pcl材料中，ch2基团伸缩振动所产生的峰可见2946cm-1和2865cm-1处被观察到。而在1721cm-1，1294cm-1，and1238cm-1处所观察到的峰值则分别是由于c＝o、c-c和c-o-c的伸缩振动所产生的。对于pda，可见3200-3500cm-1处因o-h基团和n-h基团伸缩振动而产生的峰值。n-h基团伸缩振动而产生的吸收峰可在1603cm-1处被观察到。酰胺基中的n-h基团以及c-o基团伸缩振动所产生的峰值可分别在1511和1119cm-1处被观察到。酚基中c-o-h基团伸缩振动所产生的特征峰可在1344cm-1和1285cm-1被观察到。明胶中特征峰可在3200-3600cm-1被观察到，提示了n-h基团和o-h基团的伸缩振动。在1633和1525cm-1处出现的峰值是由于酰胺基1和2中的c＝o和n-h基团伸缩振动所导致的。除此之外，在1230cm-1处出现的峰值与酰胺基3中c-n和n-h的伸缩振动有关。对于gptms，在2944和2812cm-1处出现的峰值与甲氧基中的ch3基团的伸缩振动有关。不仅如此，脱氧水及丙基链中的ch2基团的伸缩振动所出现的峰值可在1195和1081cm-1处被观察。gptms中的环氧树脂所产生的峰值位于1254，910，859和436cm-1。[0061]pc支架的特征峰与纯pcl原材料的特征峰具有较好的相似性，表明了本技术所使用的加工工艺并不会对pcl原材料的化学组成产生不良影响。本技术中，在碱性介质中经过pda自发的自氧化反应从而在pcl支架表面形成薄层覆膜。盐酸多巴胺在碱性介质中经由自氧化而形成了多巴胺醌，之后在胺基脱去质子及后续的迈克尔反应，进一步形成了多巴胺铬。最后，在5，6-二羟基吲哚中邻醌与邻儿茶酚的相互作用终止而形成了pda。nielsen等学者提出pda的聚合过程增强了结合力，包括氢结合、双齿螯合、配位以及单齿和桥接双齿结合的混合物，以便与底物相互作用。pcd支架的光谱中可见与pda相关的峰值，提示了pda在pcl基体表面的包覆，而pcd支架上可见c＝o、c-o、c-c相关峰值强度下降，而在1630cm-1处产生的峰值与pda芳香环及nh基团的伸缩振动有关。这种现象可能是由于pcl的羰基与pda的胺基之间的化学作用。[0062]在多层pcde支架中，gptms交联的电纺丝明胶分别在1160950cm-1处产生的峰值与si-o-si基团和si-oh基团有关。本技术中，明胶的氨基与gptms中的环氧环相互作用，该环终止了环氧基的开环反应。这种现象发生后，gptms化学结构中的三甲氧基发生水化反应，在酸催化作用下最终形成硅醇基团在最后一步，si-o-si键之间共价键的形成，导致了硅醇基团的缩合反应并相互交联形成了明胶。在本技术中，软骨模拟层经氧等离子体表面处理后被固定化在pcde支架上。氧等离子体处理影响了软骨模拟层的表面的官能团，通过用自由基或电离物质轰击化学基团，导致碳自由基和不稳定的氢过氧化物的产生。过氧化物之间发生相互作用从而形成了含氧官能团，包括羰基、羧酸、羟基等。因此，疏水的ch基团相关峰强度因ch键断裂而降低，富氧表面中所含的氧官能团(c＝o)所对应的峰值增强，光谱中2946cm-1附近的峰值强度降低和1721cm-1附近的峰值强度亦证实了上述观点。此外，纤维表面的活性自由基与明胶之间迅速形成相互作用，改善了最表层在支架表面的固定情况。固定化溶液的甲基和静电纺丝层的羟基共价耦合以及富氧表面与明胶基溶液的氢键结合是可能的，光谱中3300cm-1处所出现的峰值(与羟基相关)亦证实了上述观点。[0063]3-3-力学性能[0064]一系列的参数，包括孔隙率、孔径大小、孔的形状以及内部相互交流及化学特性等均会对支架的力学性能、稳定性、完整性造成影响。为了细胞在支架上的黏附、迁移、增殖及血管化的同时，也需要保证支架能够承载外力作用，故需要在孔隙率与力学性能之间寻找平衡点。因此，支架的应力-应变曲线、抗压强度、弹性模量以及界面之间的结合能力均需要被测量，结果详见图5。相较于其他支架样本，pcde支架的应力-应变曲线显著高于其他样本，故在pcde支架发生断裂之前，其能够吸收的能量也与其坚韧强度相互匹配。与pc支架相比，pcd支架的抗压强度以及弹性模量分别是pc支架的1.07倍与1.06倍，然而，pcd支架与pc支架在上述指标上的差异不具有统计学意义。[0065]尽管pcl本身就是一种具有高强度的聚合材料，但是本技术中单层pcd支架的强度的改善与支架表面纳米级别的pda、更小孔径大小、更粗的纤维更相关。在相类似的研究中，pda修饰可以增强支架的耐久度和稳定性。相反，多层pcde支架相比于pc支架和pcd支架表现出了更为显著的抗压强度，其抗压强度分别提供了1.87倍和1.74倍，单层支架的抗形变和耐久性均明显低于多层支架。而上述支架的力学强度与天然软骨组织(0.24-1mpa)以及软骨下骨(30-50mpa)相近。材料的弹性模量会在骨组织再生过程之中产生应力遮挡效应，为了解决上述问题，多层pcde支架的抗压弹性模量分别是pc支架的1.80倍和是单层pcd支架的1.72倍。多层pcde支架较高的力学稳定性是影响细胞形态、细胞活性以及组织重建的因素。多层支架存在的主要问题之一是各层的界面结合强度不足，增加了各界面之间剥离的风险。图5(d)中呈现了支架各界面之间的结合强度。在本技术中，本技术评估了经过静电纺丝加工后的3d支架在经过等离子改性技术处理前后的支架界面间的结合强度。结果表明明胶-bmp-2凝胶层固定之后并不会对松质骨界面和软骨下骨界面之间的结合强度造成不良影响。本技术中的支架可在获得适当的体内生物力学稳定性的情况下，支架内部界面之间的结合强度要高出约250倍。因此，本技术中的多层复合支架更有利于骨软骨缺损的再生重建。[0066]3-4-吸收能力和生物降解能力[0067]支架与水分子之间的相互作用受到了支架本身的微结构和化学成分的影响，好的亲水性以及内部相互连通的孔隙结构有利于水的充分吸收，而支架与水分子间的相互作用又影响了组织的再生过程。因此，由于水-支架相互作用的改善，支架内部毛细血管的充分形成更加有利于促进细胞功能改善，体液流动和营养转移增加，ecm分泌，最终形成新的组织。此外，体液流动不畅，导致了细胞营养不良和缺乏足够的血管形成，最终导致了组织修复重建不良。先前发表的研究结果提示这种结构的亲水性，特别是表面亲水性，会导致层粘连蛋白等蛋白质的黏附。因此，富含蛋白质的表面可为细胞在支架表面的黏附中提供位点，促进细胞黏附、增殖和分化，这在损伤的再生中具有重要意义。[0068]通过座滴法测量接触角来评估支架的亲水性，其结果详见图6(a-c)。pc支架、单层pcd支架以及多层pcde支架的水接触角分别为86.41±1.05、52.63±1.48和84.02±0.67°。因此，pcd支架的水接触角减少，是由于pda修饰后对pcl支架的非亲水性的改善所造成的。在其他研究之中可以发现经由pda修饰的pla或pcl支架，其亲水性发生了显著地提升。毋庸置疑的是，pda中的羟基及胺基基团可解释上述现象。此外，多层结构的接触角的增加可能是由于gptms作为明胶的改性剂的疏水性而导致的。此外，由于参与gptms相互作用，明胶之中亲水官能团(胺基和羟基)数量减少可能是多层支架亲水性轻微降低的另一个可能原因。然而，gptms的其他好处，包括生物活性或成骨性能，足以抵消其所带来的不良影响。[0069]支架的吸水能力检测结果详见为图6(d)。不同支架显示出不同程度的吸水倾向，这些倾向与不同支架本身的亲水性相符合。结果显示，各不同支架均表现出时间依赖性行为，随着实验时间的增加，直至24小时时，各种支架材料的吸水量逐渐增加。因此，所有支架在最初2小时内都表现出较高的吸水率(12-28％)。24小时后，pc支架、单层pcd支架和多层pcde支架的吸水量分别为20.78±3.53％、33.67±3.67％、25.20±1.05％。尽管pcl和gptms本身均具有疏水性，但是支架本身较好的比表面积，且3d打印支架界面之间所存在的相互连接的管状孔隙都可以显著增加支架吸收pbs的能力。其他研究单向孔隙结构的成果亦提出了上述观点。因此，这种微观结构可以通过促进体液交换来增加水分的吸收。这一现象更佳有利于细胞营养和促进损伤组织的修复重建。由得到的结果可以得出，经由纳米级的pda修饰之后pc支架的吸水能力显著提升增加，因此在不同的测试时间点上的吸水情况均显著高于与其他组。这一现象与表面修饰的pda中所富含亲水性官能团，包括儿茶酚胺和羟基，其可与水分子之间形成氢键。由于支架的化学组分中含有gptms，故与单层支架相比，多层支架的吸水能力有所降低。而gptms本身无细胞毒性且对于促成骨分化的能力的改善以及增加了明胶内部交联从而提高了水凝胶的稳定性，其对于亲水性的不良影响微乎其微。因此，相比于pc支架，pcde支架亲水性的增加与pda、明胶中富含的亲水性基团密切相关。与pc支架相比，经过氧等离子体处过后的pcde支架因其表面可实现氧官能团的富集及其亲水性的改善作用也不容忽视。简而言之，无论是单层支架还是多层支架均具有较好的亲水性，而pcde支架所具有的最佳亲水性决定了其在临床应用中优越性。[0070]支架的可降解性和其降解产物的生物相容性是组织工程领域的一个重要参数。合适的支架应该为细胞附着和功能提供基质。因此，快速可降解或不可降解的结构无法达到最终目的。微结构(孔径大小、孔的形状、内部连通性、表面形貌和结晶度等)、化学组成(亲水性、玻璃化温度、分子质量等)、环境条件(ph值、温度、压力等)及添加成分(酸性、碱性、单体、溶剂等)影响了材料的降解速度。图7分别为pbs和pbs-胰酶培养液浸泡6周后的不同类型支架的fe-sem显微照片。[0071]正如图7所示，在含酶的pbs溶液之中，随着生物降解的发生，3d打印支架出现了更多的额外的孔隙，同时随着纤维的崩解，导致了支架的整体性发生了破坏。此外，孔隙和纤维的排列发生破坏。cai等学者认为酶生物降解支架在含酶pbs溶液中的降解过程与体内降解过程相类似，故在人体内具有更好的应用前景。[0072]图8(a，b)显示了支架在6周内的生物降解速率。通过降解曲线可知支架以一个相对恒定的速率发生降解。而可知的是，支架在pbs溶液及含酶pbs溶液之中降解小于40％，反映了支架仍可以维持一定的稳定性。在骨组织修复重建的过程之中，2周后即可见骨痂出现，4-7周可见骨痂全面形成。此外，桥接骨痂及骨膜会参与到骨组织的修复重建过程之中，而新生骨组织的塑形过程在2个月内即开始了。另外，细胞的增殖和生长需要2个月，纤维软骨在4个月后形成，6个月后软骨得到完全修复，其所合成分泌的细胞外基质逐渐被吸收。这要求支架的降解速率应当与机体内细胞黏附、增殖、血管化及新生骨组织形成的速率相互匹配。[0073]多种因素可以对支架的耐久度造成影响。通常情况下，支架内部连通孔隙结构对于支架的降解过程提供了众多的结合位点，有利于体液的交换，降低了其机械强度。然而，支架内部管状微结构是影响3d打印支架耐久度的影响因素之一。另外一项研究体现了规律管状孔隙结构可以保证支架的完整性，以防止存在随机分布的孔隙结果支架突然崩解现象的出现。[0074]支架的化学组成可以对其生物降解速率造成影响。而亲水性材料的生物降解速率显著高于非亲水材料的生物降解速率。构成骨样层及软骨下骨样层的化学组成通常是pcl材料。而pcl材料本身是一种半结晶、半疏水性质的聚合物。相关研究报道pcl内植物的水生物降解性较低。此外，含pcl的支架由于其特性，其可以较为长久的维持其支架的稳定性及整体性。因此，晶体相成分可以有效抵抗快速崩解。然而，与体外环境相比，材料在体内生物降解时所产生的酸性降解产物可以进一步增加支架质量损失率。随着材料的亲水性和吸水能力的增加，材料的生物降解速率亦会随着增加。[0075]在本技术之中，单层pcd支架由于存在pda修饰，故亲水性的增加导致了pcd支架的生物降解速率显著高于pc支架。这是由于pda中富含亲水基团从而导致了pcd支架与水分子相互作用的倾向显著增加。[0076]因此，支架与水分子之间的相互作用越强，其越有可能对材料中的水解基团造成破坏。对pda体内生物降解的研究表明，在细胞吞噬作用下，可在人体内产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，进而导致微生物、自由基和氧的产生。上述因素均将在8周内对pda的生物降解造成影响。其他相关研究表明pda在体外的降解依赖于水解机制。本技术先前关于pda纳米微球的研究证明pda在体外4周内的崩解是由于-nh基团的破坏及c＝c、c＝o的破坏。此外，-coh基团的破坏也在pda的降解过程中可以被观察到。[0077]相比之下，多层支架的生物降解速度要慢于单层支架，这与gptms在软骨下骨和软骨样层中的疏水性以及交联后聚合物(明胶)的亲水官能基团密度的降低导致生物降解下降，从而延长了支架的耐久度。含明胶-gptms的材料其在体外的水解也遵循水生物降解机制。当纳米纤维大小小于300微米时，将随着纤维方向逐渐发生生物崩解。在支架的第二层和第三层的生物降解过程中，随着si-o-si和si-oh键被破坏，导致了硅离子基团、氨基酸和金属离子的释出。明胶中的亲水性官能团，包括胺基和羟基，为快速水解和生物降解提供了活性位点。[0078]尽管如此，pcde支架相比pc支架显示出更高的质量损失率。这种现象可能是由于含有明胶的最上层的存在。明胶中的胺基和羟基可以通过增强亲水性来提高生物降解率。另一个可能的原因是等离子体改性产生的含氧官能团可以通过进一步增加亲水性来增加生物降解的速率。[0079]3-5-生物活性[0080]羟基磷灰石生物矿化沉积是骨组织修复重建过程之中的关键所在，本技术将支架浸泡于10×sbf溶液中12个小时，并通过fe-sem对支架表面羟基磷灰石矿化沉积情况进行扫描评估详见(图9)，ftir光谱和xrd光谱详见(图10)。本技术中，10×sbf溶液被用于支架生物活性的评估，与常规sbf溶液相比，新配方的10×sbf溶液可以提高羟基磷灰石在支架表面矿化沉积的速度。本技术中本技术利用nah2po4·h2o代替k2hpo4·3h2o以及改变hco3-和cl-的浓度，结果如表1所示。[0081]表1:10×sbf溶液、常规sbf溶液和人血浆的离子浓度比较[0082][0083][0084]fe-sem微观图像证实支架在10×sbf溶液中浸泡12小时后，可见羟基磷灰石在支架表面形成了颗粒状矿化结晶。之后随着矿化沉积程度的增加，整个支架的表面将形成层状矿化沉积结构。因此，类纳米样矿化颗粒均匀地覆盖在单侧pcd支架及多层pcde支架的表面。然而，在pc支架的表面仅能见到少量羟基磷灰石矿化结晶(图9(a-f))。[0085]通过在复合支架的化学组成中应用pda和gptms，所得到的结果证实了pda和gptms改善了支架的生物活性。其他研究表明，羟基磷灰石样层在含pda的支架上可发生偶极相互作用和离子传导作用。利用pda对pc支架进行表面修饰，复合支架表面所带的负电荷和儿茶酚胺可进一步影响羟基磷灰石的矿化沉积。电荷排斥终止于金属离子在10×sbf溶液中的吸收，从而降低整个系统的能量。pcd支架浸泡在10×sbf溶液中导致pda所含的羟基中h 的释放。因此，活化的表面和成核位点产生，可用于在hco3-和hpo42-在支架表面的转移，并刺激钙离子在支架表面的沉积。单层pcd支架的高亲水性在促进羟基磷灰石在支架表面的矿化沉积中起着决定性作用。在含有gptms的明胶的第二层和第三层中，硅醇基团可促进钙磷酸盐层的成核和并降低了系统所消耗的能量。因此，硅烷醇基团与10×sbf溶液中的离子通过静电相互作用，可促进类羟基磷灰石层的形成。此外，由羟基和羧酸基团产生的表面负电荷为钙离子的吸附提供合适的底物。钙离子在pcde支架表面的沉积，破坏了10×sbf溶液中的离子平衡，改变了表面电荷。这一现象伴随着羧基中h 的释放以及磷酸盐被硅酸钙吸附在支架表面。这种相互作用的结果是形成磷酸八钙。最后，支架在浸泡溶液后不同离子沉积在其表面后，进一步形成羟基磷灰石矿化沉积。值得注意的是，明胶和等离子体改性所提高的支架的亲水性可以促进10×sbf溶液的吸收和羟基磷灰石矿化沉积。羟基磷灰石形成示意图如图9(b)所示。考虑到支架表面羟基磷灰石的形成有利于支架与周围组织的结合并可能对缺损组织的修复重建产生促进作用。[0086]支架表面矿化沉积结构atr-ftir光谱(详见图10(a))可见与羟基磷灰石相关的化学键的存在，3100-3500cm-1处的宽峰及1610cm-1处的峰值与矿化沉积结构中的o-h和水分子的伸缩振动有关。582cm-1处的峰值与磷酸盐中的p-o的振动收缩密切相关。此外，因c-o振动收缩所产生的峰值可在819cm-1处被观察到。另一项研究证明，材料在10×sbf溶液中浸泡后的矿化沉积所形成羟基磷灰石与生理状态下形成的羟基磷灰石成分十分接近。而因羟基磷灰石中的碳酸盐基团的伸缩振动而产生的峰值可在1410-1455cm-1处被观察到。[0087]羟基磷灰石的xrd谱图(图10(b))证实了支架表面羟基磷灰石的矿化沉积。在2θ角(10-25°)处观察到一个由聚合物非晶相所引起的宽峰。然而，羟基磷灰石层在支架表面上的沉积导致非晶峰的强度的减少，而新出现高峰出现在2θ角的27.27，31.55，39.65，45.62，和49.53°，上述角度分别对应着(210)、(211)、(310)、(222)和(213)晶体。晶体峰值强度的提升表明pda和gptms在羟基磷灰石生物矿化过程中起协同促进作用。[0088]3-6-细胞-支架间的相互作用[0089]在支架植入人体或是动物体内之前进行体外细胞实验是十分必要的。rbmscs细胞在单层支架和多层支架共培养3天后在pc支架、pcd支架、pcde支架表面的黏附、增殖、分化、活性等情况的fe-sem微观图像详见图11(a-c)。结果表明，该支架为细胞的黏附提供了合适的条件，反映了本技术中的支架的多孔微结构有利于氧合、体液交换和血管生成。此外，支架生物相容性对细胞行为及其功能起着决定性作用。相关结果表明，经pda表面修饰后的pc支架，细胞可在支架表面充分延展。改善细胞在支架表面黏附情况的一个可能原因是pda有利于防止蛋白发生变性。此外，pda中的儿茶酚胺和羟基官能团可以通过与整合素发生相互作用，从而促进了细胞黏附。此外，必须考虑pda可以通过结合血清中纤维连接蛋白，从而为细胞黏附提供结合位点。其中，与其他试验组相比，多层pcde支架显示细胞通过板足和丝状伪足紧密地黏附在支架表面。明胶化学组分中的亲水官能团，如胺基、羟基和羧酸，可促进细胞迁移。此外，氧等离子体处理改善了支架表面的亲水性，从而改善了细胞黏附和迁移。此外，修饰后的支架表面可为整合素受体提供结合位点，从而促进了细胞扩散。此外，bmp-2可进一步改善了细胞黏附，这源于通过与细胞表面受体结合改善细胞与支架之间的相互作用。[0090]因此，该支架具有良好的生物相容性，因为在培养1天后，细胞在支架表面分布均匀。在这里，一簇细胞逐渐形成，以增加培养时间，这是细胞软骨形成的最初迹象。据推测，营养丰富的介质，缺乏压力，良好的细胞呼吸可以影响这一现象。然而，共培养5天之后活细胞的密度降低，根据cck-8的结果，实验组中支架上的细胞增殖情况与对照组并无显著差异，而3天后，各个实验组支架上的细胞增殖情况显著增加。而在5天之后，各个实验组支架上的细胞增殖情况反而下降了，但是整体细胞的生存率仍超过了80％，其他相关研究也得到了相类似的结果。在所有测试时间点上，各组测量结果之间存在显著差异。然而，单层pcd支架的细胞-支架相互作用较pc支架相比明显改善，由此证实了pda对细胞生长的支持作用。bmscs与多层pcde支架共培养时，其在24小时时细胞的数量并没有出现显著增加，而活细胞的数量随着培养时间的延长而显著增加。一个可能的原因可能是由于添加了gptms，支架与水分子相互作用的亲和力降低。因此，支架亲水性的降低导致最初1天内细胞增殖无显著增加。此外，已知gptms所释放si离子可以延缓细胞生长和增殖。然而，在与多层pcde支架共培养3天后，与其他组相比，多层pcde支架显示出最高的细胞存活率和细胞增殖。这可能与在支架与整合素之间发生的相互作用有关。因此。细胞行为发生改变，从而促进了细胞增殖。[0091]当有适当的刺激时，rbmscs具有向成骨细胞或软骨细胞分化的潜能。为骨软骨再生的体外研究奠定了良好的基础。据此，本技术评估了不同类型的支架对alp和成骨相关基因表达的作用，如图13(a，b)所示。alp是在成骨过程中表达的主要标志物。本技术结果显示，bmscs与支架共培养3天后，alp活性水平较低，但随着培养时间的延长，alp活性显著提高。然而，共培养14天后，alp的表达反而下降，但活性仍明显高于对照组。因此，无论是单层pcd还是多层pcde支架，alp的活性水平都高于pc支架。由于alp在ecm形成和成熟过程中表达，而生物活性因子的存在可以促进alp的活性。因此，pda和gptms及其协同作用影响了细胞分化，提高了alp的活性。其他相关研究也证实了pda和gptms具有促进成骨分化的潜力。此外，在gptms的化学结构中含有si离子，虽然si离子的释放抑制了细胞增殖及alp的活性。[0092]oc蛋白是一种非胶原蛋白，是成骨的主要生物标志物。其与新骨形成密切相关。因此，本技术测定了oc蛋白的表达水平。本技术中，所有试验组中(pcd支架、pcde支架)oc蛋白表达水平显著高于对照组的oc蛋白表达水平。本技术中，在共培养7天后，单层pcd支架中oc蛋白测量值高于多层pcde支架，尽管测量的浓度之间的差异并不具有统计学意义。但共培养14天后，多层pcde支架在oc蛋白表达显著高于单层pcd支架。这种现象可能是由pcde支架中si离子释放所引起的。此外，骨诱导信号蛋白bmp-2在改善支架促成骨能力找那个的作用也不应被忽视。另一项研究表明，随着纳米纤维支架中的bmp-2释放，新骨形成显著增加。[0093]根据体外实验结果，本技术可以认为多层pcde支架可以改善细胞行为和促进成骨相关蛋白的表达，充分模拟骨软骨外基质，有利于骨缺损部位的修复重建。[0094]本技术结合3d打印技术、静电纺丝技术和低温氧等离子体表面改性层固定技术，成功构建了负载了bmp-2的多层pcl-pda-明胶复合支架。通过检测复合支架的抗压强度、界面结合强度、亲水性、吸收能力、水解和酶生物降解能力以及生物活性，证明了多层复合支架适合同时促进骨软骨缺损的修复重建。bmscs在支架上的的黏附情况、增殖情况等结果均证实了本技术中的多层复合支架具有较好的生物相容性。同时，alp活性和oc蛋白的表达也反映了支架在组织修复重建过程中的促成骨能力。因此，本技术提出了一种可用于骨软骨缺损一体化修复重建的多层复合支架。[0095]本发明中的实施例仅用于对本发明进行说明，并不构成对权利要求范围的限制，本领域内技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护范围内。当前第1页12当前第1页12