新隐丹参酮在制备预防或治疗心血管疾病的药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药研究领域，具体涉及一种新隐丹参酮在制备预防或治疗心血管疾病的药物中的应用。


背景技术：

2.视黄醇类受体(retinoid x receptor,rxr)属于非类固醇受体类受配体调控的转录因子，均在核内启动信号传导并影响基因转录，此类受体位于核内，多以同源或异源二聚体的形式与dna或其它蛋白质结合，配体入核与受体结合后，激活受体调节基因转录。rxr分为α、β和γ三种亚型，其中以rxrα最为重要，广泛分布在生物体肝脏、肾脏、脾脏、胎盘和表皮细胞中。rxrα在调控大量核激素信号途径中扮演着重要的角色，参与代谢、生长、发育、分化、死亡和免疫等几乎所有的生理过程的调节。rxrα受体的表达或活性的异常降低，已证实与多种疾病的发病机制密切相关，是导致多种疾病的重要因素，例如已被证实的肿瘤、心血管疾病、糖尿病、痴呆等均与rxrα受体密切相关，针对核受体开发的药物也因而被广泛用于这些疾病的治疗(可参考如下文献：维甲类x受体rxrα蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义，周艳红等；中国专利文献200510025826.4元宝草提取物用于调控rxrα受体靶点的应用)。因此，rxrα受体激动剂成为极具潜力的治疗药物，引起了众多学者的关注。
3.心血管疾病(cvd)是世界范围的头号健康杀手，根据who估计，cvd已成为全球的头号致死因素，每年死于心血管疾病的人数多于任何其它疾病/事故。who估计在2012年有1750万人死于心血管疾病，占全球死亡总数的31％，其中740万人死于冠心病，670万人死于中风。特别是在1600万由非传染性疾病导致的七十岁以下死亡中，有高达37％由心血管疾病造成。心脑血管疾病是我国城市第一大致死因素。
4.目前，心血管疾病主要依靠药物治疗，患者普遍习惯于相关慢病管理流程。心血管疾病用药主要包括以下几类：心脏病治疗用药、降血脂药、作用于肾素-血管紧张素系统药物、钙通道阻滞剂、周围血管扩张药、β-阻滞剂、血管保护剂、利尿剂、抗药血压药。其中心脏病治疗用药、降血脂药、作用于肾素-血管紧张素系统的药物、钙通道阻滞剂是心血管用药的主要类别。目前几类心血管用药的几个主要类别中存在各种副作用，使它们的有效性受到损害。例如降血脂药，他汀类不可以长期服用，长期服用会发生胃出血的可能，以及肝脏损伤；肾素-血管紧张素系统的药物主要用于高血压类心脏病；钙通道阻滞剂引起心率增快、头痛、下肢水肿等，在必要的时候还是要考虑是否要进行停用药物或更换别的药物进行替代。心脏疾病用药，如前列地尔，前列地尔可能会出现休克为最严重反应，但偶见。对于循环系统，有时发现胸闷、面红、心悸、头晕或血压下降，一旦出现，停药即消失；心衰患者可能加重心衰症状；其次偶有alt、ast上升等肝功能异常等。其中也不乏一些中药在治疗心血管疾病中崭露头角，例如丹参酮ⅱa磺酸钠注射液，目前临床可用于冠心病、心绞痛、心肌梗死，也可用于室性早搏，疗效确切。但是丹参酮ⅱa磺酸钠注射液不稳定，易发生沉淀，药物在体内代谢快，需要频繁给药，药理机制待明确等，大大限制了该药的临床应用。心衰(心力衰竭)是所有心血管疾病的终末阶段，是心脏疾病进展至严重阶段而引起的一种复杂的临
床综合征，相比于其他心血管疾病，具有患者病死率高、生活质量差、治疗难度大的特点，心衰患者不仅表现为心肌细胞损伤，还表现为心室重构以及心功能降低等症状。目前的药物大多存在用药量高、需要频繁长期用药或者疗效差的问题。因此，需要开发新型的治疗心血管疾病，尤其是治疗心梗后心衰的药物。
5.新隐丹参酮，系统命名为5,6,7,8-四氢-3-羟基-2-[(1r)-2-羟基-1-甲基乙基]-8,8-二甲基-1,4-菲二酮，分子式为c
19h22
o4，分子量为314.38，具有如下结构式：
[0006][0007]
目前，关于新隐丹参酮用于治疗心血管疾病尚无报道。


技术实现要素：

[0008]
为此，本发明要解决的技术问题是现有技术中无新隐丹参酮用于制备治疗心血管疾病的药物的问题，从而提供新隐丹参酮在制备治疗心血管疾病的药物中的应用，其具有用药量低、疗效好的特点。
[0009]
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0010]
本发明还提供了新隐丹参酮在制备预防或治疗心血管疾病的药物中的应用。
[0011]
进一步地，所述心血管疾病选自冠心病、心绞痛、心肌梗死、心衰、室性早搏中的至少一种。
[0012]
本发明研究发现，相比于其他丹参成分来说，新隐丹参酮对于心衰，尤其是心梗后心衰具有显著提高的治疗效果。
[0013]
进一步地，所述新隐丹参酮作为rxrα受体激动剂。
[0014]
本发明还提供了新隐丹参酮具有如下任意一项或者多项应用，
[0015]
(1)所述新隐丹参酮在制备用于改善或者提高心功能的药物中的应用，优选地，所述药物用于抑制心梗后心衰导致的心功能降低或者提高心梗后心衰患者的心功能。
[0016]
(2)所述新隐丹参酮在制备用于保护心肌细胞和/或提高心肌细胞活力的药物中的应用。
[0017]
进一步地，新隐丹参酮作为唯一活性成分。
[0018]
进一步地，所述药物包括一种或者一种以上药学上可接受的辅料。
[0019]
进一步地，所述辅料选自稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、缓释剂、表面活性剂和吸收促进剂中的至少一种。
[0020]
进一步地，所述药物选自片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、贴膏剂、栓剂、气雾剂、软膏剂或注射剂。
[0021]
所述新隐丹参酮在760mmhg的压力下的沸点为505.3℃；所述化合物的酸度系数为4.50
±
1.00；所述化合物为棕褐色晶状体。所述化合物几乎不溶于水，易溶于有机溶剂。
[0022]
本发明的技术方案具有以下优点：
[0023]
1、本发明研究发现新隐丹参酮可作用于rxrα受体，对于rxrα受体具有良好的激动作用，可作为rxrα受体激动剂使用。
[0024]
2、本发明研究发现新隐丹参酮能够明显提高心梗后心衰小鼠模型的心功能，改善心梗后心衰小鼠的心脏病理状态。
[0025]
3、本发明研究发现新隐丹参酮能够明显提高对心肌细胞的保护作用，抑制心肌细胞损伤。
附图说明
[0026]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]
图1为spr实验测定的不同浓度的新隐丹参酮对心血管治疗靶点rxrα的影响结果示意图；
[0028]
图2为mst实验测定的不同浓度的新隐丹参酮对心血管治疗靶点rxrα的影响结果示意图；
[0029]
图3为新隐丹参酮对rxrα蛋白的western blot图；
[0030]
图4为新隐丹参酮对rxrα表达水平的影响结果示意图；
[0031]
图5为实验例3中各组心梗后心衰小鼠的心功能测试图像；
[0032]
图6为实验例3对各组心梗后心衰小鼠的心功能影响的测试结果示意图；
[0033]
图7为实验例3各组心梗后心衰小鼠的心脏形态的染色图。
具体实施方式
[0034]
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
[0035]
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
[0036]
实施例1新隐丹参酮与rxrα受体的结合
[0037]
本实施例运用了分子互作技术：表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,spr)和微量热涌动技术(microscale thermophoresis,mst)寻找新隐丹参酮的作用靶点。
[0038]
一、spr实验
[0039]
利用biacore t200分子互作分析系统，将rxrα蛋白(购自sigma，美国)通过氨基偶
联固定于cm5芯片(购自ge，美国)表面，样品分析物依次以不同浓度进样，进行结合分析。
[0040]
1、换芯片，换buffer(缓冲液)：打开软件，stop standby(停止待命)，换缓冲液(pbs-p 5％dmso，pbs-p(磷酸盐缓冲液，购自ge，美国)与dmso的体积比为95％：5％)，需要过滤)，换芯片，做prime(缓冲液冲洗整个流路系统，为下一步的实验做好准备)，冲管路。
[0041]
2、手动偶联蛋白
[0042]
(1)样品蛋白准备：采用ph为4.0的醋酸钠配置rxrα受体蛋白母液(10μg/ml，400μl)待用。
[0043]
(2)芯片活化：利用3、4通道，3通道为参比通道，4通道为样品通道。分别取100μledc(二氯乙烷)和100μlnhs(n-羟基琥珀酰亚胺)混合，开新循环，选择3、4通道，5μl/min，进样420s。
[0044]
(3)联蛋白：选择4通道，5μl/min，蛋白进样偶联数次，使偶联量达到14000ru。
[0045]
(4)用乙醇胺封闭：开新循环，选择3、4通道，5μl/min，封闭7min。封闭后响应值会有稍微降低。
[0046]
3、溶液矫正：因为分析物溶剂为dmso，所以需要进行溶液矫正。用pbs-p(磷酸盐缓冲液)配置含有体积百分数为4.5％和5.8％的dmso溶液，选择3通道，30μl/min，分别进样30s。通常响应值为-600～960，若不匹配，通过计算需要往pbs-p 5％dmso中补充pbs-p或者dmso(1％dmso响应值为120)。
[0047]
4、分析物准备：分别采用弥罗松酚、新隐丹参酮、丹参醌c、英卡西林为分析物，将各分析物用纯dmso配置成10mm的母液，根据实验需要分别用pbs-p 5％dmso的缓冲液梯度稀释分析物，稀释成10个浓度梯度。
[0048]
5、电脑编程程序：进样参数设置为30μl/min，结合时间120s，解离时间120s，再生：1mm naoh 15s。样品依次流过fc3-fc4。
[0049]
6、数据处理：样品与蛋白亲和力通过拟合结合曲线获得，用kd(m)表示。
[0050]
二、mst实验
[0051]
弥罗松酚的spr试验出现假阳性结果，又通过mst实验检测其与新新隐丹参酮的kd值。
[0052]
微量热涌动试剂盒(购自诺坦普科技(北京)有限公司)并参考试剂盒说明书的规定标记蛋白，具体为：将100μl(10μm)的rxrα受体蛋白溶液加入标记缓冲液预处理的a柱，离心后加入100μl标记缓冲液和6μl染料，室温避光孵育30min，得到标记蛋白。再将206μl标记蛋白加入b柱，分别以300、600、600μl磷酸盐缓冲液(ph值＝7.4)分次冲洗，收集至4支ep管，测管中蛋白浓度及红外光强度，选取蛋白浓度最大的ep管进行后续实验。小分子溶液配置：第1管将母液(50mm)稀释至50μm，第2至16管加入10μldmso，再由1管倍比稀释。每管加入10μl标记蛋白，得到小分子浓度25μm至0.7629nm的系列样品。
[0053]
结合实验：样品以毛细管吸入，插入微量热泳动仪中，并由nt control v.2.1.33软件进行分析微量热泳动仪结果，得到kd值。
[0054]
三、实验结果
[0055]
表1 kd结果
[0056] spr实验kd值/(m)mst实验kd值/(m)弥罗松酚(f-1)7.59
×
10-6
10-4
新隐丹参酮(neo)5.762
×
10-5
2.5
×
10-5
丹参醌c(dskc)1.199
×
10-4
—英卡西林(e-1)2.79
×
10-4
—
[0057]
结果见上表和图1和2和上表所示，相比于其他rxrα受体激活剂，本发明的新隐丹参酮与rxrα受体具有更好的结合力。弥罗松酚的spr试验出现假阳性结果，又通过mst实验验证其kd值低于新隐丹参酮。
[0058]
实施例2新隐丹参酮对rxrα受体的激活作用
[0059]
1、实验方法
[0060]
h9c2心肌细胞以8
×
103个/孔，接种于96孔板中。待细胞生长至80％时，使用课题组建立的稳定的缺氧缺糖(8h)/复氧复糖(12h)细胞模型，具体操作如下：采用缺氧小室和厌氧袋来制造缺氧环境，无糖dmem作为缺糖的条件来建立缺氧缺糖模型。h9c2心肌细胞以8
×
103个/孔接种到96孔板中，培养到实验所需的密度，弃去原有培养液，用pbs清洗2次，加入无糖dmem，放入缺氧小室内，并加入厌氧袋，盖上缺氧小室的盒盖，放入培养箱进行缺氧缺糖造模，时间分别为8小时模拟心肌缺血过程，然后拿出来，去掉无糖dmem，加入完全培养基，实现复氧复糖，复氧复糖时间为12h，模拟再灌注的过程。在缺氧缺糖造模步骤加入100μl含有2μmol/l的新隐丹参酮的earle’s液，放置于缺氧小盒里面培养8h，在复氧复糖步骤，加入100μl含有2μmol/l的新隐丹参酮的培养基，放置于培养箱正常培养12h。结束后提取细胞蛋白进行免疫印迹(western blot)分析。使用rxrα的抑制剂hx531(1μm)作为阴性对照。
[0061]
2、实验结果
[0062]
结果如图3和4，western blot结果显示，h9c2心肌细胞经过缺氧缺糖/复氧复糖细胞损伤模型后，导致rxrα表达下调(model组)，但是给予新隐丹参酮处理后(ncts组)，rxrα的表达上调，联合使用抑制剂(ncts hx531组)效应消失。结果可以说明新隐丹参酮可以作用于rxrα靶点，并且促进其表达，而发挥药效。
[0063]
实施例3新隐丹参酮提高心梗后心衰小鼠的心功能
[0064]
1、实验方法
[0065]
icr雄性小鼠50只，25-28g，适应性饲养一周，随机分为假手术(sham)组、模型(model)组、新隐丹参酮低剂量(neolowdose)组、新隐丹参酮高剂量(neohighdose)组、阳性对照组，对于模型组、新隐丹参酮低剂量组、新隐丹参酮高剂量组和阳性对照组形冠状动脉左前降支结扎术，建立小鼠心梗后心衰模型。具体步骤如下：小鼠逐只称重后，腹腔注射0.5％(质量百分数)戊巴比妥钠麻醉(0.08ml/10g)，鼠板背位固定，手术区备皮，消毒。用22g静脉留置针经口行气管插管，小动物呼吸机辅助呼吸，参数设定为呼吸频率100次/分、潮气量2ml、呼吸比1：1。于左胸前第3、4肋间开胸，暴露心脏，7-0线自左心耳下1mm处结扎冠状动脉左前降支，结扎后5-0线逐层关胸缝合、脱离呼吸机。假手术组小鼠手术线穿线打活结，其他步骤与上述相同。术后放在电热毯上待其苏醒后放回笼中。
[0066]
与术后第二天开始按照体重给药，见表2所示，连续给药7天，每天给药一次，假手术组与模型组给予相同体积的蒸馏水。
[0067]
表2给药方案
[0068]
分组动物数量药物剂量给药方式假手术组10蒸馏水0.16μl/只/天灌胃
模型组10蒸馏水0.16μl/只/天灌胃新隐丹参酮低剂量阻10新隐丹参酮0.16μl、2.1mg/kg/天灌胃新隐丹参酮高剂量阻10新隐丹参酮0.16μl、8.4mg/kg/天灌胃阳性对照组10曲美他嗪0.16μl、10mg/kg/天灌胃
[0069]
注：新隐丹参酮低剂量组和高剂量组的药物为新隐丹参酮溶解于含质量浓度为0.5％的cmc-na的蒸馏水中，得到药物溶液，阳性对照组的药物为曲美他嗪溶解于含质量浓度为0.5％的cmc-na的蒸馏水中，得到药物溶液。
[0070]
2、测试方法
[0071]
(1)治疗7天后，对各组小鼠进行心脏超声检测，测试小鼠的心功能。
[0072]
(2)上述小鼠心脏超声结束后，后处死获取小鼠的心脏。沿结扎点横切心脏，用4％预冷多聚甲醛固定心脏组织横切面(1.2mm厚)，石蜡包埋，按照常规方法进行苏木精-伊红染色和马松染色。
[0073]
3、实验结果
[0074]
(1)心功能测试结果
[0075]
表3心功能测试结果
[0076][0077]
结果见上表和图5和6所示，与假手术组相比，模型组ef和fs分别下降83.64％和88.78％(p《0.001,p《0.001)。此外，lvid；d和lvid；s分别增加49.68％和109.48％(p《0.001,p《0.001)，表明模型组有严重的功能损害。低剂量和高剂量组的新隐丹参酮组中的ef分别比模型组增加了258.4％，124.17％(p《0.001,p《0.001和p《0.001)，fs具有同样的改变。
[0078]
(2)心脏形态
[0079]
masson三色染色是胶原纤维染色的权威和经典技术。如图7所示，masson染色的结果表明，在模型组中，大量的胶原蛋白沉积在小鼠心肌梗死区域中，而在新隐丹参酮低高剂量组中仅沉积少量的胶原蛋白。另外，h&e染色显示假手术组的心肌结构排列良好。在模型组中可以观察到灰白色的疤痕病变广泛分布在心肌坏死区域，并伴有炎性细胞浸润，并且细胞变得松散。与模型组相比，用新隐丹参酮治疗后，上述病理状态明显改善。
[0080]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。