治疗视网膜病变的组合物和方法与流程

治疗视网膜病变的组合物和方法
1.相关申请交叉引用
2.本技术要求于2019年5月28日提交的美国临时专利申请第62/853,179号的优先权，其全部内容通过引用并入本技术中。
技术领域
3.本发明涉及一种治疗视网膜病变的物质组合物。本发明的实施例涉及用于治疗早产儿视网膜病变(rop)的包括胰岛素和/或igf的纳米乳剂。


背景技术：

4.当分娩发生在怀孕37周之前时，被认为是早产(premature或preterm)。在子宫的最后几周对于健康的体重增加和各种重要器官的充分发育至关重要。
5.在人体中，视网膜在组织含氧量低的地方发育。从12至21孕龄时铺设血管前体细胞，为将来的血管发育提供支架。视网膜血管生成始于约孕龄16周，新血管从现有血管中萌出。发育中的视网膜的代谢需求超过了脉络膜循环提供的氧，导致“生理性缺氧”，从而刺激血管生成。
6.早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，rop)是一种发育性血管疾病，其特征是不完全血管化视网膜中视网膜血管的异常生长。rop主要发生在出生时体重1250克或未满28周孕龄的极低孕龄新生儿(extremely low gestational age neonates，elgans)，是儿童视力障碍和失明的最常见原因。
7.目前的治疗选择，包括激光光凝和玻璃体内注射血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)抗体，已被证明可用于严重的晚期rop。然而，激光光凝会破坏视网膜的主要部分，对幼年婴儿而言是一种困难且复杂的手术，而玻璃体内注射vegf抗体可能会造成影响其他器官的血管生长的全身性抑制。
8.因此，有必要且非常有利的是采用一种无上述限制的视网膜病变治疗方法。


技术实现要素：

9.根据本发明的一个方面，提供了一种包含胰岛素、二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10的药物组合物。
10.根据本发明的另一方面，提供了一种治疗早产儿视网膜病变的方法，所述方法包括向早产儿的眼睛施用包含胰岛素、二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10的药物组合物，从而治疗早产儿视网膜病变。
11.根据本发明的另一方面，提供一种预防或减轻早产儿视网膜病变严重程度的方法，所述方法包括向早产儿的眼睛施用包含胰岛素、二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10的药物组合物，从而预防或减轻早产儿视网膜病变严重程度。
12.根据本发明的另一个方面，提供了一种减少早产儿视网膜出血的方法，所述方法包括向早产儿的眼睛施用包含胰岛素、二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10的药物组合物，从
而减少早产儿视网膜出血。
13.根据本发明的另一方面，提供了一种减少经历视网膜病变的受试者的视网膜出血的方法，所述方法包括向受试者的眼睛施用包含胰岛素、二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10的药物组合物，从而减少受试者眼睛的视网膜出血。
14.根据本发明的另一方面，提供了一种减少经历视网膜病变的受试者的视网膜新生血管化的方法，所述方法包括向受试者的眼睛施用包含胰岛素、二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10的药物组合物，从而减少受试者眼睛中的视网膜新生血管化。
15.根据本发明的另一方面，提供了一种增加早产儿视网膜血管覆盖率的方法，所述方法包括向早产儿的眼睛施用包含胰岛素、二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10的药物组合物，从而增加早产儿的视网膜血管覆盖率(减少无血管视网膜区域)。
16.根据本发明的另一方面，提供了一种减轻早产儿视网膜炎症的方法，所述方法包括向早产儿的眼睛施用包含胰岛素、二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10的药物组合物，从而减轻早产儿的视网膜炎症。
17.根据本发明的另一方面，提供了一种降低早产儿视网膜氧化应激的方法，所述方法包括向早产儿的眼睛施用包含胰岛素、二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10的药物组合物，从而降低早产儿的视网膜氧化应激。
18.根据本发明的另一方面，提供了一种改善早产儿视网膜层发育的方法，所述方法包括向早产儿的眼睛施用包含胰岛素、二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10的药物组合物，从而改善早产儿的视网膜层发育。
19.根据本发明的另一方面，提供了一种减轻早产儿视力障碍(发生率或严重程度)的方法，所述方法包括向早产儿的眼睛施用包含胰岛素、二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10的药物组合物，从而减轻早产儿的视力障碍。
20.根据本发明的另一方面，提供了一种增加早产儿视野的方法，所述方法包括向早产儿的眼睛施用包含胰岛素、二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10的药物组合物，从而增加早产儿的视野。
21.根据本发明的另一方面，提供了一种制备用于视网膜病变局部治疗的药物组合物的方法，所述方法包括步骤：(a)在油相中生成包含二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10的水包油纳米乳剂；和(b)使用胺偶联反应将胰岛素或igf-1与纳米乳剂的纳米液滴结合。
22.除非另有定义，否则本技术中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然可以在本发明的实践或测试中使用与本技术描述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。如果发生冲突，以专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和示例仅为说明性的，并非限制性的。
附图说明
23.本发明在此仅以示例的方式参考附图描述。现在具体参考附图详细描述，在此强调，所示的细节是示例性的，仅仅是为了说明性地讨论本发明的优选实施例，并且呈现这些细节是为了提供被认为是对本发明的原理和概念方面最有用和最容易理解的描述。在这点上，除了对本发明的基本理解所必需的以外，没有试图更详细地示出本发明的结构细节，结
合附图的描述使本领域技术人员清楚本发明的几种形式如何可以在实践中实施。
24.附图中：
25.图1示意性地示出了本发明的组合物。
26.图2a-b是表示视网膜总出血量(图2a)和严重出血总量(图2b)的体内眼底镜检查结果的图。
27.图3a-c是常氧动物(图3a)、未治疗缺氧动物(图3b)和治疗动物(图3c)的体内眼底镜检查结果的图。
28.图4a-b是显示治疗对第14天和第18天新生血管形成的影响的图。
29.图5a-d显示胰岛素治疗组(图5a)、igf-1治疗组(图5b)、未治疗组(图5c)和正常(健康)动物(图5d)的p14的同工凝集素-b4染色。
30.图6a-b是显示胰岛素治疗组、igf-1治疗组、未治疗组和常氧组的无血管区的图。
31.图7a-d是显示胰岛素组(图7)、igf-1组(图7b)、未处理组(图7c)和常氧组(图7d)的p14的同工凝集素-b4染色的图像。标记roi(绿色)、血管覆盖区域(蓝色)、血管骨架(红色)和分支点(白色)。
32.图8是在特定时间点与所有反应组分(例如反应物(rh-胰岛素和dha)、中间体(dha-edc中间体)和所得产物(胰岛素-dha偶联物))的偶联反应的色谱图。
33.图9是从冻干乳剂(成品制剂)中提取的胰岛素-dha偶联物的色谱图。
34.图10是显示冻干乳剂(成品制剂)的成分的峰的色谱图。
35.图11a-c是说明使用wimretina软件自动分析h&e视网膜层厚度的结果(图11a)、在研究中进行的生物标志物pge2水平分析的结果、比较了不同的研究组(图11b)和在研究中进行的生物标志物8-iso-pgf2a水平分析的结果、比较了不同的研究组(图11c)的图。
36.图12-13是显示含有游离胰岛素、dha和辅酶q10的制剂的成分的峰的色谱图。
37.图14a-e和15a-e是本发明组合物的低温透射电子显微照片(tem)。
具体实施方式
38.本发明是一种可用于治疗视网膜病变的物质组合物。具体而言，本发明可用于通过局部施用包含胰岛素或igf的纳米乳剂来治疗rop。
39.参照附图和附图说明可以更好地理解本发明的原理和操作。
40.在详细说明本发明的至少一个实施例之前，应当理解，本发明的应用不限于以下描述中阐述的细节或实施例中所示出的细节。本发明能够能够有其他实施例，或者能够以各种方式实施或执行。此外，应理解本技术中使用的措辞和术语仅用于描述目的，不应被视为限制。
41.虽然存在rop的治疗选择，但此类选择受限于给药复杂性、副作用和可能对眼睛组织造成的损伤。
42.本发明人假设，rop的有效治疗应防止出生后的毒性影响(例如，氧过量)，并提供缺失的宫内因子(胰岛素和胰岛素生长因子1)，其可以促进生理性脉管系统发育，同时最小化对这些因子的全身暴露。
43.在实施本发明的同时，本发明人配制的组合物能够促进生理性眼脉管系统发育，并降低眼内毒性，从而能够治疗视网膜疾病，例如视网膜病变。如以下实施例部分中进一步
描述的，本发明组合物可有效刺激健康血管生长，并预防和减少氧诱导的大鼠模型引起的视网膜出血和病理性血管生长(新生血管化)。
44.术语“促进生理血管发育”是指增加氧从视神经流向眼周的流量或通道。
45.术语“视网膜病变”是指任何可能导致视力损伤的视网膜损伤。这可能包括，例如，减缓或阻止生理性脉管系统生长的病理(血管闭塞或收缩阶段，例如rop的i期)和响应组织缺氧和缺血而形成的异常(反常)病理性血管。视网膜病变可能是辐射或头部创伤等外部因素所致，也可能是糖尿病或高血压等系统性疾病的表现。视网膜病变也可由血管炎症和药物(例如，糖尿病药物，如艾塞那肽、利拉鲁肽和普兰林肽)引起。
46.因此，根据本发明的一个方面，提供了一种包含治疗有效量的胰岛素和/或igf-1、二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10作为活性成分的物质组合物。
47.如本技术进一步描述的，胰岛素和/或igf-1促进生理血管发育，而dha减少炎症反应，辅酶q10减少氧化应激信号传导。
48.术语“治疗有效量”或“药学有效量”表示活性成分或包含该活性成分的组合物的剂量，其将提供指示该活性成分的治疗效果。
49.本发明药物组合物中各活性成分的剂量可取决于许多因素，包括所治疗的受试者、视网膜病变阶段(例如rop)和给药途径(局部或眼内)。
50.在rop的情况下，可通过躯体效应(例如血管密度和覆盖)、血管化程度和/或进展，或者视网膜层发育的质量来确定进展。
51.物质组合物可配制成油包水纳米乳剂，其具有包含二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10，并与胰岛素和/或胰岛素样生长因子(例如通过酰胺键)结合的纳米液滴。图1是本发明物质组合物的示意图，显示了与胰岛素或igf12结合并包含dha12和辅酶q10 14的纳米液滴。
52.下面的示例部分描述了一种制备本发明物质组合物的方法。
53.物质组合物可以以冻干状态储存，并用水或盐水复溶，例如用于使用或储存为备用药物组合物。
54.物质组合物可以是药物组合物的一部分，该药物组合物包含用于局部或眼内递送的载体。
55.本发明药物组合物的局部制剂可包括载体(如中链甘油三酯(mct))、长链甘油三酯油(如蓖麻油)、合成和半合成油(如矿物油)和不饱和脂肪酸(如油酸)。
56.本发明药物组合物的眼内制剂可制备成微乳剂和/或包含载体，例如脂质体、纳米球、胶束和纳米胶囊。
57.使用与活性成分(如螯合剂、表面活性剂和环糊精)形成包合物的赋形剂，可配制眼内制剂以缓释或延迟释放活性成分。
58.所述药物组合物还可包含：
59.(i)碳水化合物(作为稳定剂、润滑剂或冷冻剂)，包括但不限于单糖(例如葡萄糖、麦芽糖)、二糖(例如海藻糖)、低聚糖(糊精(例如麦芽糊精)、环糊精(例如羟丙基-β-环糊精(hpbcd))，多糖(例如右旋糖酐)。
60.(ii)乳化剂，包括但不限于天然来源的非离子表面活性剂(例如卵磷脂、蛋黄磷脂)和合成来源的非离子表面活性剂(例如泰洛沙泊(tyloxapol))和离子表面活性剂(例如
注射用水溶剂高达1ml
74.*含有约0.4mg/ml dha游离酸和约1.6mg/ml dha乙酯(相当于1.47mg/ml dha
75.游离酸)。
76.**氢氧化钠或盐酸用于调节ph值，不包含在总和中。
77.下表3描述了本发明组合物的眼内制剂。
78.表3-眼内制剂
[0079][0080]
为了增强本发明组合物的功效，开发了一种制备纳米乳剂的方法，该纳米乳剂具有包封(dha)和辅酶q10并与胰岛素或胰岛素样生长因子结合的纳米液滴。
[0081]
因此，根据本发明的另一方面，提供了一种配制用于视网膜病变局部治疗的药物组合物的方法。该药物组合物通过在油相中生成包含二十二碳六烯酸(dha)和辅酶q10的水包油纳米乳剂，并使用胺偶联反应将胰岛素或igf-1与纳米乳剂的纳米液滴结合而制备。
[0082]
纳米乳剂生成后，可以使用(但不限于)柱层析、切向流过滤(tff)、透析对纳米液滴进行纯化或浓缩。可添加稳定剂，例如但不限于环糊精、糊精、单糖或二糖。
[0083]
然后将制剂冻干以储存，随后在使用前用盐水或水复溶。
[0084]
下面的示例部分提供了本制剂方法的更详细描述。
[0085]
如上文所述，本发明组合物可用于治疗视网膜病变，尤其是早产儿视网膜病变(rop)。
[0086]
因此，根据本发明的另一方面，提供了一种治疗有需要的受试者(例如早产儿)的视网膜病变的方法。该方法通过向有需要的受试者的眼睛施用本发明的药物组合物来实现的。这种给药可以是局部给药或眼内给药。
[0087]
本技术中使用的术语“有需要的受试者”指人或非人哺乳动物。任何年龄(例如婴儿(如足月或早产婴儿)、成人或老年)或性别的人或非人哺乳动物(猫、狗、牛、绵羊、猪、山羊和马)。人类受试者可以是胎龄为24周至33周的早产婴儿。受试者也可以是出生时体重在500克至1650克之间的低出生体重婴儿。
[0088]
本发明组合物的外用制剂(滴眼液)可在出生到六个月大的时间段内的任何时间段施用于早产儿，每日一次或数次，持续180天，剂量为10μl至100μl。本发明组合物的眼内制剂可在出生到六个月大的时间段内的任何时间段施用于早产儿，根据临床需要，每隔几周施用一次，持续180天，每次注射剂量为5-30微升。
[0089]
此处使用的术语“约”是指
±
10％。
[0090]
本发明的其它目的、优点和新颖特征对于本领域的普通技术人员来说，在研究以
下实施例时将变得显而易见，这些实施例并不是限制性的。
[0091]
实施例
[0092]
现在参考以下实施例，其与上述描述一起以非限制性方式说明本发明。
[0093]
实施例1
[0094]
纳米乳剂制剂
[0095]
以下实施例说明了本发明物质组合物的制备，该组合物配制为适于作为水包油纳米乳剂进行复溶的冻干粉末。
[0096]
下表4列出了该物质组合物制剂生产过程中使用的成分。
[0097]
表4-制剂成分
[0098][0099]1实施例1描述了含胰岛素制剂的某些生产工艺。
[0100]2工艺中除去。
[0101]3交联剂，用于胺偶联反应，随后除去。
[0102]
采用溶剂置换法制备了纳米微滴。将100mg coq10、50mg coq10、25mg泰洛沙泊和50mg mct溶于9ml丙酮中，将25mg类脂e 80(lipoid e 80)溶于1ml乙醇中。合并所得溶液，在室温下以900转/分钟混合30分钟，逐滴滴加至20ml 0.1％w/v的聚乙烯醇水溶液中，以900转/分钟继续搅拌15分钟。然后，使用实验室旋转蒸发器在室温和减压(50毫巴(mbar))条件下完全除去有机溶剂，并在用0.5m naoh将初始ph调节至7.4后对所得乳剂进行胺偶联反应。
[0103]
向所得乳剂中加入在0.5ml磷酸盐缓冲盐水(ph 7.2)中制备的1.3μmol edc，所得
混合物在室温下孵育15分钟，然后使用碳酸钠缓冲液将ph调节至8.3
±
0.2。向19.5ml乳剂中加入0.5ml 0.1mol/ml的rh-胰岛素磷酸盐缓冲盐水溶液(ph 7.2)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。然后，使用水作为洗脱剂，将反应混合物装载到重力流pd-10凝胶过滤柱(sephadex g-25)上，以从较小颗粒(例如edc，游离活性物质分子)中分离纳米液滴。使用实验室旋转蒸发器在减压(50毫巴(mbar))和37℃条件下从纳米液滴馏分中除去过量洗脱液(水)。然后，将乳剂与2-羟丙基-β-环糊精混合至最终浓度2％w/v，通过0.45μm pes(聚醚砜)膜过滤，分配至小瓶中并冷冻干燥。1ml复溶溶液中活性成分的含量为0.67urh-胰岛素、2mg dha和1mg coq10。
[0104]
实施例2
[0105]
研究1
[0106]
在大鼠氧诱导的视网膜病变模型上测试实施例1中描述的物质组合物的眼用制剂(elgn01由胰岛素dha和coq10组成)。
[0107]
程序
[0108]
将一组大鼠，包括一窝18只幼仔，分为两组：a组-elgn01组(9只)，b组-未治疗(9只，在氧气室中未治疗)。将一只母鼠，3只幼仔，置于常氧条件下作为附加对照。
[0109]
在第5-14天或第18天(根据牺牲日)开始治疗，首先通过注射器(局部，不损伤眼部)在眼睑下给药，然后睁眼后滴眼药水。
[0110]
氧疗方案如下：生命的第0-14天，24小时高氧(50％)循环，然后24小时低氧(12％)循环。
[0111]
第1组研究于出生后第14(p14)天结束，第2组研究于出生后第18(p18)天结束，第17天由眼科医生进行眼底检查评估，然后对样本进行组织学和免疫组织学评估。
[0112]
结果
[0113]
体内基础检查结果
[0114]
在治疗组中，总共观察到12例视网膜出血，而未治疗组动物为22例(elgn01治疗显著性p＝0.04)。
[0115]
表5-眼底检查体内结果-每组视网膜出血
[0116][0117]
数据为平均值
±
sd；p《1，(*)p《0.05，(**)p《0.01。
[0118]
治疗组和未治疗组的视网膜总损伤和严重出血总量如图2a-b所示。
[0119]
图3a-c是常氧、缺氧(治疗和未治疗)的视网膜图。正常动物的视网膜血管完整，无出血或消融。未经治疗的缺氧动物出现视网膜出血(箭头)。给药动物显示损伤减少。
[0120]
新生血管区
[0121]
对新生血管形成的影响如图4a-b所示。新生血管形成(nv)在p18时较高，对应于人类疾病ii期末。p14对应于疾病i期结束(进展阶段)。在这两个时间点，治疗组的nv显著低于未治疗动物。在p14，elgn01治疗组显示0％新生血管形成，而未治疗组为0.09％(t检测比较
p＝0.07)。在p18，与未治疗组相比，elgn01治疗组显示的新生血管平均减少40％(elgn01治疗1.35％，未治疗1.89％，t检测比较p＝0.07，治疗效果28％)。
[0122]
视网膜层
[0123]
将石蜡包埋的全眼切片，用苏木精和伊红染色。在一张载玻片上收集了来自不同位置的四个切片。使用带10倍物镜的光学显微镜(某些位置为4倍物镜)对h&e染色进行成像。
[0124]
来自未经治疗的oir组的代表性染色显示视网膜层解体，oir损伤导致神经节细胞层增厚。每组共可获得8个样本-4个切片/只眼，每个治疗组2只眼(来自不同动物)。
[0125]
为了评估视网膜层的完整性，将去识别的h&e染色图像上传到wimsis软件图像中。对每个视网膜进行掩蔽分析，识别并测量每个视网膜层的大小-rgcl-视网膜神经节细胞层、ipl-内网状层、inl-内核层、opl-外网状层、onl-外核层、rpe-视网膜色素上皮、cho-脉络膜。图11a显示了视网膜层的平均厚度。
[0126]
表6-视网膜层的平均厚度[px]
[0127][0128]
实施例3
[0129]
研究2
[0130]
在大鼠氧诱导的视网膜病变模型上测试基于实施例1(elgn01由胰岛素dha和coq10组成，elgn02由igf-01及其类似物组成)中描述的物质组合物的眼用制剂。
[0131]
程序
[0132]
将两组大鼠，每组包括18只幼仔，分为三个治疗组：a组elgn01(12只)，b组elgn02(12只)，c组未治疗(12只)。d组为正常对照组。
[0133]
在第5天开始治疗，对动物进行给药治疗直至第14天或第18天(根据牺牲日)，首先通过注射器(局部，不损伤眼部)在眼睑下给药，然后睁眼后滴眼药水。
[0134]
氧疗方案如下：前4天内，进行8次间歇性低氧事件，在30分钟内3次降至12％，其余时间50％高氧。生命的第5-14天，24小时高氧(50％)循环，然后24小时缺氧(12％)。
[0135]
第1组的研究在生命第14天结束，第17天由眼科医生进行眼底检查评估，然后对样本进行组织学和免疫组织学评估。
[0136]
结果
[0137]
同工凝集素染色
[0138]
样品采用平板安装，视网膜用同工凝集素ib4染色。由独立专家使用isolectin染色视网膜的图像手动量化无血管区域(avas)。
[0139]
图5a-d显示了胰岛素和igf治疗组、未治疗组和常氧组的染色。在胰岛素和igf-1治疗组(图5a-b)中，观察到具有完整中央血管的最小无血管区。在未治疗组中(图5c)，观察到大的无血管区(箭头)。在常氧组(图5d)中，观察到血管完全覆盖。
[0140]
图6a-b是表示ava的图。在p14，两个治疗组的ava均比对照组降低50％(无血管面
积百分比为：elgn01治疗：2.77％，elgn02治疗：3.15％，未治疗：6.13％)。常氧组占无血管面积的1.4％。使用t检测比较治疗组与未治疗动物时，相比于未治疗动物，elgn01治疗组存在统计学显著差异(p＝0.01)。相比于未治疗动物，elgn02治疗组也存在统计学显著差异(p＝0.03)。
[0141]
以掩蔽的方式分析每个视网膜的血管密度(％，通过将血管的像素数量除以感兴趣区域的像素总数计算得出)、血管总面积、分支点数量(其中两个或更多节段汇集)、节段数量(单个血管节段的数量)和平均节段长度。
[0142]
在p14，两个治疗组在许多方面上均优于未治疗动物；与未治疗组相比，elgn01治疗组的血管密度(％)显著更高(p＝0.051)，elgn02治疗组的血管密度(％)也显著更高(p＝0.032)，表明视网膜血管生长和发育更好，无血管区域更少。与未治疗组相比，治疗组也显示更大的血管面积-elgn01治疗组(p＝0.073)和elgn02治疗组(p＝0.014)。此外，与未治疗动物相比，治疗a-elgn01的平均节段长度显著更长(p＝0.037)，表明血管具有更好的连续性。
[0143]
表7-p14时视网膜血管的量
[0144][0145]
数据为平均值
±
sd；通过t检测，与对照未治疗组相比，p《1，(*)p《0.05，(**)p《0.01。n＝5个每组。
[0146]
图7a-d是每个治疗组的p14的同工凝集素-b4染色图。标记roi(绿色)、血管覆盖区域(蓝色)、血管骨架(红色)和分支点(白色)。
[0147]
如下文表8所示，在p18，elgn01治疗组的血管密度(％)显著高于未治疗组(p＝0.007)。elgn02治疗组显示无显著趋势。血管密度％反映了与非血管化区域相比发生血管化的视网膜数量。无新生血管形成的血管密度较高表明视网膜血管生长发育较好，无血管区域较少。与未治疗组相比，治疗组的血管面积更大。与未治疗组(p＝0.02)相比，elgn01治疗组显示更多的分支点。此外，与未治疗组(p＝0.04)相比，elgn01治疗组显示更多的血管。
[0148]
表8-p18时视网膜血管的量
[0149]
[0150]
数据为平均值
±
sd；通过t检测，与对照未治疗组相比，p《1，(*)p《0.05，(**)p《0.01。n＝5个每组。
[0151]
生物标志物活性
[0152]
在p14和p18，采集眼睛，进行匀浆和离心，以比较不同研究组组织中不同生物标志物的水平。样品包括每组4只不同的大鼠，对每3个样品进行测试。将内容物归一化至每个样品中的蛋白总浓度。分析的生物标志物为8-异前列腺素(8-isoprostane)或8-异pgf2α(8-isopgf2α)，这是一种通常研究的生物标志物，在氧化应激和脂质过氧化过程中大量生成，是一种可靠且经证实的氧化应激生物标志物(beharry，2017年)。此外，还测量了pge2-一种对内皮细胞具有双重相反作用的炎症过程的生物标志物(图11b)。通过不同的受体介导血管收缩和血管舒张。pge2是cox-2亚型的主要代谢产物，被细胞因子和生长因子激活，高度参与血管生成(beharry，2017年)。
[0153]
结果显示，与未治疗组相比，在p14和p18，8-异pgf2α(8-isopgf2α)水平降低，表明对动物模型产生的氧化应激损伤具有预防作用(图11c)。该作用见于疾病的第一和第二阶段(p14和p18)。在p14，所有组的pge2水平均高于常氧组，在p18，治疗组显示降低，其中未治疗组显示显著升高，这与病理的炎症阶段相关(图11b)。
[0154]
实施例4
[0155]
研究3
[0156]
将眼用制剂(包含胰岛素、dha和coq10(在实施例1中描述的)的elgn01)施用于新生大鼠，以测定施用后眼睛中的胰岛素浓度。
[0157]
程序
[0158]
将两组大鼠，每组包括18只幼仔，分为两个治疗组：a组-elgn01常氧组(18只)，b组-elgn01低氧组(18只)。在常氧条件下将包括2只幼仔的一组大鼠作为对照。
[0159]
通过使用注射器(局部)在眼睑下方施用组合物(含0.0067个胰岛素单位的10g/l剂量)，在第5天开始治疗，持续4天。给药后30、60、120分钟处死大鼠(每t，n＝3)。对全眼进行匀浆，并通过elisa(elisa)进行评估。
[0160]
结果
[0161]
下表9所示结果表明，给药后2小时内，8-16％的胰岛素被吸收到眼组织中。
[0162]
表9-每个时间点的平均值(
±
sdv)
[0163]
时间胰岛素浓度(pmol/l)305.52
±
2.05604.66
±
0.921204.80
±
1.15
[0164]
实施例5
[0165]
纳米乳剂制剂
[0166]
以下实施例示出了制备本发明物质组合物的替代方法。
[0167]
本发明公开了在配制过程中胰岛素直接与油状纳米液滴的一锅结合。通过使用交联试剂n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)在水性介质中将胰岛素一步偶联至dha羧基进行偶联。
[0168]
制备胰岛素-dha结合物的方法采用以下一般步骤：
[0169]-使用溶剂置换法形成纳米液滴；
[0170]-通过形成活性o-酰基异脲dha-edc酯，用edc活化dha羧基；
[0171]-通过与胰岛素的伯胺基形成酰胺键，胰岛素与dha羧基结合，同时释放出edc副产物，即可溶性n-未取代尿素。
[0172]
通过30,000-100,000mwco膜进行超滤，从edc副产物中纯化反应混合物。
[0173]
材料和方法
[0174]
制备有机相-将347mg dha游离酸、75mg泰洛沙泊和75mg类脂e 80(lipoid e 80)溶于25ml乙醇中。将混合物通过21g针逐滴滴加到100ml双层去离子水中，在室温下以350rpm连续混合。将所得乳剂再混合10分钟，然后使用实验室旋转蒸发器(40
±
2℃，50毫巴(mbar))在减压下完全除去有机溶剂。
[0175]
在用0.1n hcl将ph初步调节至4.5后，对所得乳剂进行胺偶联反应。
[0176]
27mmol溶解于1ml水中的edc加入到所得乳剂中，混合物在室温下温育40分钟，直至dha-edc中间体酯的形成完成。
[0177]
将反应混合物的ph调节至6.2，加入溶于50毫升水中的0.45mmol胰岛素(ph 7.2)。反应在一小时内完成，偶联期间保持ph 6.3-6.4。通过高效液相色谱法(dionex ultimate 3000)监测反应，在图8中给出了反应混合物在第30分钟的方法条件和色谱图。
[0178]
反应完成后，混合物用双层去离子水以1:2稀释，并使用蠕动泵通过100,000mwco hydrosart超滤盒(sartorius)转移。
[0179]
150ml所得滞留物中胰岛素偶联物的含量为0.037mmol，按胰岛素含量计算的产率为82％。
[0180]
乳剂的渗透压为301mosm/kg。
[0181]
偶联反应混合物的色谱图见图8，组分和条件见下表10。
[0182]
表10
[0183][0184]
制造了另一种物质组合物，该组合物配制成适于复溶成水包油纳米乳剂的冻干粉末。下表11列出了制备过程中使用的组分。
[0185]
表11
[0186][0187]1工艺中除去。
[0188]2交联剂，用于胺偶联反应，随后除去。
[0189]
配制过程包括制备两种单独的乳剂：第一种乳剂将辅酶q10掺入dha纳米液滴中，第二种乳剂包括与dha纳米液滴偶联的胰岛素。乳剂通过置换法分别制备，并在纯化步骤之前合并。
[0190]
乳剂1
[0191]
将300mg辅酶q10、525mg dha乙酯、125mg泰洛沙泊和125mg类脂e 80(lipoid e 80)溶于15ml丙酮和50ml乙醇的混合物中。将混合物通过21g针逐滴滴加到250ml 0.1％pva水溶液中，在室温下以350rpm下连续混合。将所得乳剂再混合10分钟，然后使用实验室旋转蒸发器(40
±
2℃，50毫巴(mbar))在减压下完全除去有机溶剂。
[0192]
乳剂2
[0193]
将125mg dha游离酸、25mg泰洛沙泊和25mg类脂e 80(lipoid e 80)溶于12ml乙醇中。将混合物通过21g针逐滴滴加到50ml双层去离子水中，在室温下以350rpm连续混合。将所得乳剂再混合10分钟，然后使用实验室旋转蒸发器(40
±
2℃，50毫巴(mbar))在减压下完全除去有机溶剂。
[0194]
在用0.1n hcl将ph初步调节至4.5后，对所得乳剂进行胺偶联反应。
[0195]
0.11mmol溶解于1ml水中的edc加入到所得乳剂中，混合物在室温下温育1.25小时，直至dha-edc中间体酯的形成完成。
[0196]
将反应混合物的ph调节至6.2。加入溶于18毫升水中的0.15mmol胰岛素(ph 4.2)。反应在一小时内完成，偶联期间保持ph 6.2-6.4。通过高效液相色谱法(dionex ultimate 3000)监测反应，在图8中给出了反应混合物的方法条件和典型色谱图。
[0197]
反应完成后，混合物与乳剂#1混合，然后用0.1％pva水溶液(渗透压《5mosm/kg)以1:2稀释，并使用蠕动泵通过30,000mwco hydrosart超滤盒(sartorius)转移，滞留物的最终体积为250ml(偶联的胰岛素的理论含量为0.06mol/ml)。
[0198]
4g溶解于8ml水中的hpbcd加入到80ml的乳剂中，将体积调节至100ml。
[0199]
通过0.22μm pes膜过滤乳剂，装入4ml玻璃小瓶中(每瓶0.5ml)并冻干。成品的渗
透压为376mosm/kg。
[0200]
每瓶胰岛素偶联物的理论含量为0.024μmol/瓶，观察到的含量为0.017μmol/瓶；偶联的胰岛素的产率为72％。
[0201]
液体散装和干燥成品的z-平均尺寸分别为119.9nm(多分散性指数0.137)和243nm(多分散性指数0.342)。
[0202]
通过rp-hplc监测偶联的胰岛素以及冻干粉的dha和辅酶q10的含量。冻干成品的色谱图如图10所示。下表12提供了用于检测冻干制剂的色谱条件。
[0203]
表12
[0204][0205][0206]
在图14a-e和15a-e中示出了如实施例5所述生产的制剂的典型的低温透射电子显微照片(tem)。
[0207]
实施例6
[0208]
胃肠道制剂
[0209]
生产了一种用于局部治疗早产儿肠吸收不良的口服乳剂。该制剂含有三种活性成分：rh-胰岛素、dha和辅酶q10。在复溶制剂中，胰岛素以游离蛋白形式存在，dha和辅酶q10偶联到油滴中。
[0210]
制剂过程包括以下一般步骤：
[0211]-使用溶剂置换法形成dha和辅酶q10乳剂；
[0212]-添加rh-胰岛素和冷冻剂；
[0213]-过滤和冷冻干燥。
[0214]
材料和方法
[0215]
将513mg辅酶q10、898mg dha乙酯、175mg泰洛沙泊和175mg类脂e 80(lipoid e 80)溶于80ml乙醇中。将混合物通过21g针逐滴滴加到350ml 0.1％pva水溶液中，在室温下以350rpm下连续混合。将所得乳剂再混合10分钟，然后使用实验室旋转蒸发器(40
±
2℃，50毫巴(mbar))在减压下完全除去有机溶剂。
[0216]
将1ml胰岛素水溶液(2.7mg/ml，ph 8.5)与14ml含有28.6mg/ml hpbcd和343mg/ml麦芽糊精的冷冻剂溶液混合。将所得溶液加入连续混合的乳剂中并混合20分钟。
[0217]
通过0.22um pes膜过滤乳剂，装入到4ml玻璃小瓶中(装入体积为0.5ml/小瓶)并
冻干。成品的渗透压为358mosm/kg。每瓶含0.65iu rh-胰岛素、0.9mg dha和0.5mg辅酶q10。
[0218]
下表13列出了制剂成分。冻干产品的色谱图见图12和13。
[0219]
表13
[0220]
成分每1ml复溶产品的量重组人胰岛素(rh-胰岛素)1.3iu(0.045mg)顺-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(dha)1.9mg辅酶q10(coq10)1.1mg泰洛沙泊0.4mg类脂e 80(lipoid e 80)0.4mg聚乙烯醇(pva)0.8mg羟丙基-β-环糊精(hpbcd)6.7mg麦芽糊精80.0mg氢氧化钠*-盐酸*-注射用水高达1ml
[0221]
*氢氧化钠或盐酸用于调节ph值，不包含在总和中。
[0222]
应当理解，为了清楚起见，在单独实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何适当的子组合提供。
[0223]
虽然已经结合本发明的具体实施例描述了本发明，但很显然，对于本领域技术人员来说，许多替代、修改和变化方案将是显而易见的。因此，本发明旨在包含落入所附权利要求书的精神和广泛范围内的所有这些替代、修改和变化。本技术说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用全部并入本技术说明书中，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地通过引用并入本技术说明书中的程度相同。另外，本技术中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认该参考文献可作为本发明的现有技术。
[0224]
另外，本技术的任何一个或多个优先权文件在此通过引用全部并入本技术。