一种用于监测肿瘤相关免疫微环境的流式细胞术试剂盒及监测方法与流程

1.本发明涉及流式细胞术领域，具体讲，涉及一种用于监测肿瘤相关免疫微环境的流式细胞术试剂盒及监测方法。


背景技术：

2.肿瘤微环境(tumor microenvironment，tme)由定植于正常组织的肿瘤细胞，基质细胞、免疫细胞及其分泌因子、血管内皮细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ecm)等组分共同构成，在肿瘤的进展、免疫逃逸和耐药机制中发挥重要作用。起初这些由肿瘤细胞招募和激活的免疫细胞及相关基质成分，可以形成抑瘤性炎性微环境阻碍肿瘤发生发展。经过持续性肿瘤抗原刺激和免疫激活反应，微环境中相关效应细胞处于耗竭状态，导致无法发挥正常功能，从而产生免疫抑制性微环境促进肿瘤的发生发展。近些年的研究显示，靶向tme的免疫治疗可以激发或恢复免疫系统固有的抑瘤能力，重塑免疫微环境，并产生抗瘤性应答，因此监测肿瘤患者个体化的tme特征，可用于调整优化免疫治疗策略。
3.免疫过程包括免疫清除、免疫平衡和免疫逃逸三个阶段，在免疫清除阶段，先天性免疫和适应性免疫共同作用，快速将肿瘤细胞消灭，如果肿瘤细胞变异不能被有效识别，则可能进入平衡阶段，带瘤生存，如果在持续的免疫压力下，肿瘤细胞变异不再被适应性免疫识别、对免疫效应机制不敏感，或诱导肿瘤微环境为免疫抑制状态，则肿瘤细胞进入逃逸阶段，肿瘤的生长不再被免疫系统所阻断，导致免疫耐受。
4.免疫过程涉及的免疫细胞包括固有免疫的吞噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞等，适应性免疫细胞包括t细胞和b细胞，每类细胞又分为不同的亚群，分别执行不同的功能。固有免疫与适应性免疫、t细胞与b细胞通过协同作用，激活与抑制的平衡调节，抑制性受体的表达等机制共同参与肿瘤清除与发展的免疫过程。
5.流式细胞术(flow cytometry，fcm)是直接对标记了荧光信号的单细胞进行检测，实现高速细胞定量分析和分选的技术。主要优点是测量速度快，可多参数检测，综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术，既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。目前在临床医学领域里有着广泛的应用，可用于血液肿瘤的免疫分型和免疫学研究等。从1980年1激光2色流式问世，到2000年3激光13色流式问世，流式技术的快速发展极大的推动了临床免疫学监测的应用及发展，2017年全光谱流式的问世，一跃将三激光流式的检测通道从传统流式的13个提高到38个，可实现一管25色以上监测，大大提高了检测信息量，提高了诊断精度和免疫学检测的深度。
6.由于肿瘤相关的免疫微环境涉及的免疫细胞和各细胞亚群众多，抑制性受体众多，传统流式检测通道较少、抗体价格昂贵、可用商品化荧光素不足等原因，以往的检测除了检测深度不够，很难将目的细胞全部检测到，检测广度和深度不足，则很难筛选出对特定肿瘤发生发展影响明确的细胞进行检测与监测，更不能据此及时的个体化调整临床治疗策略。
7.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

8.本发明第一发明目的在于提供一种用于监测肿瘤相关免疫微环境的流式细胞术试剂盒。
9.本发明第二发明目的在于提供该试剂盒的使用方法。
10.本发明的第三发明目的在于提供一种肿瘤相关免疫微环境的监测方法。
11.为了实现本发明的发明目的，采用的技术方案为：
12.本发明提出一种用于监测肿瘤相关免疫微环境的流式细胞术试剂盒，所述试剂盒中含有分别标记有不同荧光素的抗体，所述抗体包括用于监测免疫抑制相关的抗体、用于t亚群分类的抗体和用于监测免疫活化的抗体；
13.所述用于监测免疫抑制相关的抗体包括：抗2b4抗体、抗btla抗体、抗cd160抗体、抗lag-3抗体、抗vista抗体、抗cd95抗体、抗ctla4抗体、抗pd-1抗体、抗tigit抗体和抗tim3抗体；
14.所述用于t亚群分类的抗体包括：抗ccr6抗体、抗cd127抗体、抗cd183抗体、抗cd25抗体、抗cd28抗体、抗cd3抗体、抗cd4抗体、抗cd45ra抗体、抗cd62l抗体、抗cd8抗体、抗eomes抗体、抗t-bet抗体、抗tcrab抗体和抗tcrrd抗体；
15.所述用于监测免疫活化的抗体包括：抗cd38抗体、抗cd39抗体、抗cd69抗体、抗cd80抗体、抗cd86抗体和抗hla-dr抗体。
16.可选的，所述抗2b4抗体连接有荧光素rb730、所述抗btla抗体连接有荧光素rr664、所述抗cd160抗体连接有荧光素rr600、所述抗lag-3抗体连接有荧光素rv496、所述抗vista抗体连接有荧光素rb780、所述抗cd95抗体连接有荧光素rv520、所述抗ctla4抗体连接有荧光素rr778、所述抗pd-1抗体连接有荧光素rv805、所述抗tigit抗体连接有荧光素rv444、所述抗tim3抗体连接有荧光素rb515、所述抗ccr6抗体连接有荧光素rr678、所述抗cd127抗体连接有荧光素rb667、所述抗cd183抗体连接有荧光素rr705、所述抗cd25抗体连接有荧光素rv480、所述抗cd28抗体连接有荧光素rv734、所述抗cd3抗体连接有荧光素rv780、所述抗cd4抗体连接有荧光素rv624、所述抗cd45ra抗体连接有荧光素rv526、所述抗cd62l抗体连接有荧光素rb697、所述抗cd8抗体连接有荧光素rv650、所述抗eomes抗体连接有荧光素rv681、所述抗t-bet抗体连接有荧光素rv656、所述抗tcrab抗体连接有荧光素rb608、所述抗tcrrd抗体连接有荧光素rb574、所述抗cd38抗体连接有荧光素rb670、所述抗cd39抗体连接有荧光素rb710、所述抗cd69抗体连接有荧光素rv600、所述抗cd80抗体连接有荧光素rb713、所述抗cd86抗体连接有荧光素rv540、所述抗hla-dr抗体连接有荧光素rv645。
17.可选的，每种所述抗体分别包装，所述抗体的浓度为80～120μg/ml，优选100μg/ml。
18.可选的，每种所述抗体的包装体积为0.5ml；每个待测样本使用每种所述抗体的体积为5μl。
19.可选的，抗cd95抗体、抗ctla4抗体、抗pd-1抗体、抗tigit抗体、抗体tim3抗体、抗2b4抗体、抗btla抗体、抗cd160抗体、抗lag-3抗体、抗vista抗体、抗ccr6抗体、抗cd127抗
体、抗cd183抗体、抗cd25抗体、抗cd28抗体、抗cd3抗体、抗cd4抗体、抗cd45ra抗体、抗cd62l抗体、抗cd8抗体、抗tcrab抗体、抗tcrrd抗体、抗cd38抗体、抗cd39抗体、抗cd69抗体、抗cd80抗体、抗cd86抗体和抗hla-dr抗体为胞膜抗体，抗eomes抗体和抗t-bet抗体为胞浆抗体。
20.本发明涉及该试剂盒的使用方法，至少包括以下步骤：
21.(1)取2个流式管，标记为样本管和对照管；
22.(2)在样本管中先加入brilliant stain buffer，然后加入连接有荧光素的胞膜抗体；所述胞膜抗体包括抗cd95抗体、抗ctla4抗体、抗pd-1抗体、抗tigit抗体、抗体tim3抗体、抗2b4抗体、抗btla抗体、抗cd160抗体、抗lag-3抗体、抗vista抗体、抗ccr6抗体、抗cd127抗体、抗cd183抗体、抗cd25抗体、抗cd28抗体、抗cd3抗体、抗cd4抗体、抗cd45ra抗体、抗cd62l抗体、抗cd8抗体、抗tcrab抗体、抗tcrrd抗体、抗cd38抗体、抗cd39抗体、抗cd69抗体、抗cd80抗体、抗cd86抗体和抗hla-dr抗体；
23.(3)在样本管和对照管中分别加入待测样本，孵育使抗体和细胞抗原结合；
24.(4)在样本管和对照管中分别加入红细胞裂解液，离心，清洗；
25.(5)在样本管和对照管中分别加入破膜剂1，孵育后清洗；
26.(6)在样本管和对照管中分别加入破膜剂2，孵育后清洗；
27.(7)在样本管中加入连接有荧光素的胞浆抗体，孵育；所述胞浆抗体包括抗eomes抗体和抗t-bet抗体；
28.(8)清洗，再匀混，上机检测。
29.可选的，所述使用方法中的操作均在室温条件下进行。
30.本发明还涉及一种肿瘤相关免疫微环境的监测方法，至少包括以下步骤：
31.(1)取2个流式管，标记为样本管和对照管；
32.(2)在样本管中先加入brilliant stain buffer，然后加入胞膜抗体；
33.(3)在样本管和对照管中分别加入待测样本，孵育；
34.(4)在样本管和对照管中分别加入红细胞裂解液，离心，清洗；
35.(5)在样本管和对照管中分别加入破膜剂1，孵育后清洗；
36.(6)在样本管和对照管中分别加入破膜剂2，孵育后清洗；
37.(7)在样本管中加入胞浆抗体，孵育；
38.(8)清洗，再匀混，上机检测；
39.(9)分析数据。
40.本发明至少具有以下有益的效果：
41.本发明试剂盒包括30个抗体，针对30个项目进行监测，包括cd4 t/cd8 t/初始t/效应t/中心记忆t/效应记忆t/干细胞记忆t/可挽救耗竭t/不可挽救耗竭t/treg/th1/th2/th17/abt/rdt/衰老t/t活化/treg活化/t抑制/与肿瘤进展相关的抑制性受体。结合全光谱流式细胞仪，可一管panel完成以上所有检测，方便快捷，省时省力，操作简单。
附图说明
42.图1为实施例2的流式细胞术的二维点图；
43.图2为实施例2的流式细胞术的二维点图；
44.图3为实施例2的流式细胞术的二维点图；
45.图4为实施例2的流式细胞术的二维点图；
46.图5为实施例2的流式细胞术的二维点图；
47.图6为实施例2的流式细胞术的二维点图；
48.图7为实施例2的流式细胞术的二维点图。
49.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本技术而不用于限制本发明的范围。
具体实施方式
50.下面通过实施例和对比例进一步说明本发明，这些实施例只是用于说明本发明，本发明不限于以下实施例。凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
51.本发明实施例提出一种用于监测肿瘤相关免疫微环境的流式细胞术试剂盒，应用全光谱流式细胞术，设计30色1管panel，共30个抗体，深度检测t细胞亚群、以及t细胞活化状态和部分抑制性受体的表达，监测肿瘤患者在不同时期，不同病程变化的免疫状态下，所有t细胞亚群及相关功能的表达，结合全光谱流式细胞仪，深度监测肿瘤患者免疫微环境中的t细胞亚群及功能。常规用于临床肿瘤患者的特定时间节点的监测，为及时调整临床免疫治疗方案，优化个体化方案设计以及免疫耐药等研究提供参考。
52.具体的，本发明实施例的流式细胞术试剂盒中含有分别标记有不同荧光素的抗体，抗体包括用于监测免疫抑制相关的抗体、用于t亚群分类的抗体和用于监测免疫活化的抗体，从而可系统性的监测免疫抑制和活化，同时对t亚群进行分类。
53.用于监测免疫抑制相关的抗体包括：抗2b4抗体、抗btla抗体、抗cd160抗体、抗lag-3抗体、抗vista抗体、抗cd95抗体、抗ctla4抗体、抗pd-1抗体、抗tigit抗体、抗tim3抗体。免疫抑制相关的抗体用于监测是否免疫功能受到抑制，导致病情不愈或进展。
54.用于监测免疫活化的抗体包括：抗cd38抗体、抗cd39抗体、抗cd69抗体、抗cd80抗体、抗cd86抗体、抗hla-dr抗体。其中，抗cd38抗体用于监测t系活化，抗cd39抗体用于监测t早期活化，抗hla-dr抗体用于监测t中期活化，抗cd25抗体用于监测t早期活化，抗cd69抗体、抗cd80抗体、抗cd86抗体都用于监测活化状态，这样可以比较全面的检测活化，用于观察机体遇到抗原刺激，t细胞活化是否正常，抗感染、抗肿瘤的功能是否正常。
55.用于t亚群分类的抗体包括：抗ccr6抗体、抗cd127抗体、抗cd183抗体、抗cd25抗体、抗cd28抗体、抗cd3抗体、抗cd4抗体、抗cd45ra抗体、抗cd62l抗体、抗cd8抗体、抗eomes抗体、抗t-bet抗体、抗tcrab抗体、抗tcrrd抗体；分类抗体是用于区分t细胞亚群用的，t细胞亚群与各抗体的功能具体如表1所示：
56.表1
57.58.[0059][0060]
本发明试剂盒的监测结果可采用冻干型人t/b/nk淋巴细胞国家参考品进行验证，验证结果为：准确率为100％。
[0061]
具体的，本发明实施例试剂盒中荧光素和抗体结合的对应关系如表2所示：
[0062]
表2
[0063]
[0064][0065]
本发明实施例根据抗体表达强弱配上相应强度的荧光素，这个panel是使用全光谱多色流式在实验中优化而成的，临床可直接使用，无需预实验，不会导致检测中因为抗体强度表达不合适所致的无法对t细胞亚群进行分类或者检测结果不准确。
[0066]
具体的，本发明实施例中每种抗体分别包装，抗体的浓度为80～120μg/ml，优选100μg/ml。每种抗体的包装体积为0.5ml；每个待测样本使用每种抗体的体积为5μl。抗体保存于添加有0.1wt％叠氮化钠的pbs缓冲溶液中。
[0067]
实验所需的其他试剂有：brilliant stain buffer(bd公司，购买链接为https://www.bdbiosciences.com/cn/solrsearch？text＝566349#)；破膜剂1、破膜剂2(intraprep permeabilization reagent，来源于贝克曼公司，购买链接为https://www.beckmancoulter.cn/bls_search/flowreagents/search/)；pbs；红细胞裂解液(lyse
tm lysing buffer，来源于bd pharm，购买链接为https://www.bdbiosciences.com/cn/applications/research/stem-cell-research/stem-cell-buffers-and-ancillary-reagents/lysing-buffer/p/555899)。
[0068]
本发明实施例试剂盒的具体使用方法为：
[0069]
一、试剂的准备：
[0070]
1、取2个流式管，标记为样本管和对照管；
[0071]
2、在样本管先加入brilliant stain buffer10ml于样本管中，再加入胞膜抗体5ml，充分混匀；
[0072]
3、在样本管和对照管中分别加入待测样本100ml，充分混匀，室温孵育15分钟使抗体和细胞抗原结合；
[0073]
3、再次混匀后，在样本管和对照管中分别加入红细胞裂解液4ml，室温裂解10分钟；
[0074]
4、离心1500转(1050rpm)5min，吸弃上清，充分混匀；
[0075]
5、在样本管和对照管中分别加入pbs 4ml，离心1500转(1050rpm)5min，吸弃上清，充分混匀；
[0076]
6、在样本管和对照管中分别加入破膜剂1 50～100μl，室温避光孵育10分钟，充分混匀；
[0077]
7、在样本管和对照管中分别加入pbs 4ml，离心1500转(1050rpm)，吸弃上清，混匀；
[0078]
8、在样本管和对照管中分别加入破膜剂2 50μl，同时用加样器轻轻吸混样本，室温避光孵育5分钟；
[0079]
9、在样本管中加入胞浆抗体，充分混匀，室温避光孵育15分钟使抗体和细胞抗原结合，混匀；
[0080]
10、在样本管和对照管中分别加入pbs 4ml，离心1500转(1050rpm)，弃上清；
[0081]
11、在样本管和对照管中分别加适量pbs后再混匀，300目滤网过滤，待上机检测。
[0082]
二、上机检测：
[0083]
将制备得到的样本管和对照管，直接用cytek全光谱流式细胞仪检测，用仪器自带分析系统进行数据分析。
[0084]
经过监测待测样本的目的细胞占有核细胞的百分比，跟参考值进行比较，看检测的细胞亚群比例与参考值相比增高还是降低，从而可对肿瘤患者的免疫状态进行评估。
[0085]
三、结果输出。
[0086]
本发明实施例还涉及一种肿瘤相关免疫微环境的监测方法，至少包括以下步骤：
[0087]
1、取2个流式管，标记为样本管和对照管；
[0088]
2、在样本管先加入brilliant stain buffer10ml于样本管中，再加入胞膜抗体5ml，充分混匀；
[0089]
3、在样本管和对照管中分别加入待测样本100ml，充分混匀，室温孵育15分钟使抗体和细胞抗原结合；
[0090]
3、再次混匀后，在样本管和对照管中分别加入红细胞裂解液4ml，室温裂解10分钟；
[0091]
4、离心1500转(1050rpm)5min，吸弃上清，充分混匀；
[0092]
5、在样本管和对照管中分别加入pbs 4ml，离心1500转(1050rpm)5min，吸弃上清，充分混匀；
[0093]
6、在样本管和对照管中分别加入破膜剂1 50～100μl，室温避光孵育10分钟，充分混匀；
[0094]
7、在样本管和对照管中分别加入pbs 4ml，离心1500转(1050rpm)，吸弃上清，混
匀；
[0095]
8、在样本管和对照管中分别加入破膜剂2 50μl，同时用加样器轻轻吸混样本，室温避光孵育5分钟；
[0096]
9、在样本管中加入胞浆抗体，充分混匀，室温避光孵育15分钟使抗体和细胞抗原结合，混匀；
[0097]
10、在样本管和对照管中分别加入pbs 4ml，离心1500转(1050rpm)，弃上清；
[0098]
11、在样本管和对照管中分别加适量pbs后再混匀，300目滤网过滤，待上机检测。
[0099]
12、分析数据：采用仪器自带软件进行数据分析，将得到的各目的细胞占有核细胞的百分比数据，跟正常人或者该待测者初诊时的数据(即参考值)进行比较，看检测的细胞亚群比例与参考值相比增高还是降低，从而可对肿瘤患者的免疫状态进行评估；
[0100]
具体的，参考值的测定，是指一个地区的健康人群中，规定若干条规格标准，在总体中抽样进行调查测定，将测定结果经统计学处理求出平均值(x)和标准差(s)，通常将x定位参考值，将x
±
2s定为参考范围。
[0101]
实施例1
[0102]
一种用于监测肿瘤相关免疫微环境的流式细胞术试剂盒，其具体组成如表3所示。
[0103]
表3
[0104]
[0105][0106]
实施例2
[0107]
以待测者的外周血样本为待测样本，该采用实施例1的试剂盒进行检测，得到流式细胞术的二维点图如图1～图7所示(所圈门的含义如表5所示)。采用仪器自带软件进行数据分析，自动生成如表4所示的表格，将各目的细胞占有核细胞的百分比，跟参考值进行比较，看检测的细胞亚群比例与参考值相比增高还是降低，从而可对该待测者的免疫状态进行评估。
[0108]
该待测者的试验结果如表4所示。
[0109]
表4
[0110]
[0111]
[0112][0113]
表5
[0114]
[0115]
[0116][0117]
本技术虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本技术构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本技术的保护范围应当以本技术权利要求所界定的范围为准。