一种基于二维液相色谱-紫外衍生法同时测定生物基质中5种氨基酸类神经递质的方法与流程

1.本发明涉及一种动物生物基质中氨基酸类神经递质的检测方法，具体涉及一种柱前衍生结合紫外检测的二维液相色谱系统，同时检测生物样本中天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、牛磺酸和γ-氨基丁酸五种氨基酸的方法，属于分析技术领域。


背景技术：

2.目前，对于氨基酸的研究已比较广泛，侧重点往往是针对人体内的常见氨基酸，对于动物氨基酸类神经递质的研究并不广泛。普遍认为氨基酸类神经递质包括兴奋性氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)和抑制性氨基酸(甘氨酸、牛磺酸和γ
-ꢀ
氨基丁酸)(m,p.；q,l.；acta,k.r.j.a.c.,review of recent advances in analyticaltechniques for the determination of neurotransmitters.2009,653(1),1-22.)。最初进行氨基酸测定是以茚三酮为显色剂进行柱后衍生并利用离子交换层析法测定的，但因其耗时又缺乏可重复性的缺点，逐渐发展为具备自动化的氨基酸分析仪，继而被发展较快、多用途的高效液相色谱和毛细管电泳技术所覆盖(m,p.；q,l.； acta,k.r.j.a.c.,review of recent advances in analytical techniques for thedetermination of neurotransmitters.2009,653(1),1-22.)。此外，柱前衍生的优势也逐渐弥补了柱后衍生的不足，在氨基酸的检测中，毛细管电泳仪耦合激光诱导荧光检测器和质谱检测器是分析氨基酸的主要趋势，其具备高分辨率和极少的样本量需求的优点，但在操作的难度和实验重复性方面还有待加强。气相色谱仪主要与电化学检测器和质谱检测器联用可用来分析氨基酸，但操作繁琐且分析时间长，因而发展空间较大。高效液相色谱仪多与紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器和质谱检测器等耦合，应用就较为广泛。电化学检测和质谱检测都有很高的灵敏度，但电化学检测不适合梯度洗脱，质谱检测因其价格昂贵在基层实验室里并不被普遍应用，相反紫外检测和荧光检测成本低、灵敏度好、容易操作且更易维护，从而被更多研究者应用，虽然氨基酸不具备生色团在紫外检测和荧光检测中需要进行衍生反应，但其在生物样品检测中的应用还在继续，前处理也会变得更简单。
3.随着仪器的普遍应用与发展，已由传统的一维高效液相色谱系为统转为多维液相色谱系统，自控力和专业应用性普遍增强。在现有技术中，二维液相色谱已经用于氨基酸和更多手性药物开发的手性和对映选择性分析，以及同时分析类似极性原子吸收光谱，如天冬氨酸、d-谷氨酸和天冬氨酸等的亲水性原子吸收光谱 (c,i.；t,a.；m,m.；t,i.；a,h.k.j.j.o.c.,development of an onlinetwo-dimensional high-performance liquid chromatographic system in combinationwith tandem mass spectrometric detection for enantiomeric analysis of free aminoacids in human physiological fluid.2018,1570,91-98.)。但是目前还没有研究发现可以同时检测5种氨基酸类神经递质。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种利用二维液相色谱法定性定量、快速分析、高效分离不同动物生物基质中5种氨基酸神经递质的方法，该方法克服了现有技术中一般方法难以分离多组分内源性物质以及受内源基质影响的缺陷。
5.为了实现上述技术目的，本发明首次针对极性相差较大的多组分内源化合物建立了检测l-谷氨酸、l-天冬氨酸、甘氨酸、牛磺酸和γ-氨基丁酸5种氨基酸类神经递质的衍生化检测方法，为寻求简便、快速、准确检测氨基酸方法提供依据。本发明提供了一种基于二维液相色谱-紫外衍生法同时测定生物基质中5种氨基酸类神经递质的方法，该方法是将生物样本进行柱前衍生预处理得到待测溶液，所述待测溶液通过二维液相色谱系统检测并定量分析天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、牛磺酸和γ-氨基丁酸5种氨基酸类神经递质目标物。
6.作为一个优选的技术方案，所述生物样本为猪血浆、羊血浆、大鼠血清、猪脑组织或大鼠脑组织。
7.作为一个优选的技术方案，猪血浆、羊血浆及大鼠血清的柱前衍生预处理方法为：将猪血浆、羊血浆或大鼠血清与乙腈/生理盐水混合物混合，在冷冻条件下，进行离心处理，取上层清液进行衍生处理，在上层清液中依次加入四硼酸钾溶液和nbd-f乙腈溶液，在55～65℃温度下振荡混匀8～12min，冷却后，在加入mili-q水，混匀得到待测溶液。
8.作为一个进一步优选的技术方案，猪血浆、羊血浆或大鼠血清与乙腈/生理盐水混合物的体积比为1:8～10。
9.作为一个进一步优选的技术方案，所述乙腈/生理盐水混合物由乙腈与生理盐水按体积比700～800:200～300组成。
10.作为一个进一步优选的技术方案，所述冷冻条件为温度小于5℃。
11.作为一个进一步优选的技术方案，所述离心的转速为14000～15000r/min，时间为8～12min。
12.本发明对于猪血浆、羊血浆或大鼠血清等血浆样本的预处理方法具体如下：分别取100μl猪血浆、羊血浆和大鼠血清用移液管移入2ml管中，然后添加1ml 乙腈生理盐水混合物(750:250，v/v)，在4℃冷冻离心机中旋转30s，以14500r/min 离心10min，取100μl的上清液进行衍生化，加入350μl 10mmol/l的四硼酸钾溶液(ph＝7.2～7.8)，加入50μl 10mmol/l的nbd-f乙腈溶液混合均匀后，置于 60℃恒温震荡仪中混匀10min，待其冷却后，加入0.5ml的mili-q水混匀，取 100μl进样。
13.作为一个进一步优选的技术方案，猪脑组织或大鼠脑组织的柱前衍生预处理的方法：将猪脑组织或大鼠脑组织与冷冻生理盐水进行均质处理，所得均质液与 pbs-乙腈混合液涡旋混合后，在冷冻条件下，进行离心处理，取上层清液进行衍生处理，在上层清液中依次加入四硼酸钾溶液和nbd-f乙腈溶液，在55～65℃温度下振荡混匀8～12min，冷却后，再加入mili-q水，混匀得到待测溶液。
14.作为一个进一步优选的技术方案，猪脑组织或大鼠脑组织与冷冻生理盐水的质量体积比为0.8～1.2g:0.4～0.6ml。
15.作为一个进一步优选的技术方案，所述pbs-乙腈混合液由ph＝7.4的pbs 与乙腈按体积比700～800:200～300组成；
16.作为一个进一步优选的技术方案，所述冷冻条件为温度小于5℃；
17.作为一个进一步优选的技术方案，所述离心的转速为14000～15000r/min，时间为8～12min。
18.本发明的猪脑组织和大鼠脑组织的预处理方法具体如下：分别称取猪脑组织和大鼠脑组织1g和0.5ml冷冻生理盐水(0.9％)于2ml离心管中，在组织匀浆机中均质1min，称取0.1g，加入pbs(ph＝7.4)-乙腈(750/250)，涡旋混合30 s后，将溶液在4℃冷冻离心机中以14500rpm离心10min，取100μl的上清液进行衍生化，加入350μl 10mmol/l的四硼酸钾溶液(ph＝7.2～7.8)，加入50μl 10mmol/l的nbd-f乙腈溶液混合均匀后，置于60℃恒温震荡仪中混匀10min，待其冷却后，加入0.5ml的mili-q水混匀，取100μl进样。
19.作为一个进一步优选的技术方案，所述衍生处理方法为：在所述上层清液中依次加入四硼酸钾溶液和nbd-f乙腈溶液，在55～65℃温度下振荡混匀8～12min，冷却后，在加入mili-q水，混匀。
20.作为一个进一步优选的技术方案，上层清液与四硼酸钾溶液的体积比为 1:3～4。
21.作为一个进一步优选的技术方案所述四硼酸钾溶液的浓度为8 mmol/l～12mmol/l，ph＝7.2～7.8。
22.作为一个进一步优选的技术方案，上层清液与nbd-f乙腈溶液的体积比为 1:0.4～0.6。
23.作为一个进一步优选的技术方案，所述nbd-f乙腈溶液的浓度为8 mmol/l～12mmol/l。
24.作为一个进一步优选的技术方案，上层清液与mili-q水的体积比为1:4～6。
25.本发明技术方案采用的是柱前衍生方法，由于衍生环境会随着柱填料的变化而变化，需对影响衍生化的ph、衍生化反应的时间和温度条件进行大量实验优化，选择合适的衍生条件可以得到较高的衍生产率和较短的衍生时间，获得最高的衍生收率和良好的峰形。
26.作为一个优选的技术方案，所述二维液相色谱系统检测检测条件为：一维色谱柱(萃取柱)：sncb 50mm*4.6mm*5μm柱；二维色谱柱(分析柱)：sbr3 200mm*4.6mm*5μm柱；进样体积：100～200μl；流速：0.8～1.2ml/min；柱温： 38～42℃；
27.流动相：
28.a泵：水相为0.02mol/l、ph＝6.8～6.9的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲液，有机相为甲醇-乙腈；水相和有机相体积比为2～3:1；
29.c泵:流动相由甲醇和0.02mol/l、ph＝6.8～6.9的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲溶液按体积比15～20:85～80组成；
30.a泵的梯度洗脱程序：从目标物转移到二维色谱柱时开始；1～5min，水相由 71vol％匀速降至55vol％；5～13min，水相保持55vol％；13～18min，水相匀速升至71vol％；
31.uv检测器472～482nm。
32.本发明技术方案针对现有的生物样品，建立的检测天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、牛磺酸和γ-氨基丁酸等氨基酸神经递质的检测方法，采用二维液相色谱仪作为分析仪器，通过简单的样品前处理，优化二维液相色谱条件，获得稳定的高效率目标物，关键在于解决内源化合物的定量分析问题。
33.相对现有技术，本发明技术方案带来的有益技术效果：
34.(1)本发明技术方案该方法具有进样体积大、分辨率高、峰形好且不受其他内源胺的影响等优点。
35.(2)本发明技术方案与普通高效液相色谱相比，具备在线除杂和在线富集的能力，可简化样品的前处理过程，实现目标物在二维系统中的完全转移，且在不同生物基质中未发现内源性物质干扰。
36.(3)本发明技术方案具有灵活性和可控性的特点，在进行目标物的截取、富集和转移的过程中，可通过具体情况，改变一维或二维流动相比例，或时间程序的截取时间与转移时间，适用于多组分的不同极性样品的分离，可为食品科学、神经科学和生物化学等科学研究提供基础。
附图说明
37.图1为氨基酸神经递质的一维色谱图和二维液相色谱图；(图a为经过萃取柱的图；图b红色为经过分析柱的图，蓝色为经过萃取柱和分析柱的合成图)。
38.图2为衍生反应温度、时间和ph优化图；(图a为时间10～70min，温度30～75℃条件下的衍生反应结果，其中a～e为30℃时的nbd-asp、nbd-glu、nbd-glu、 nbd-tau、nbd-gaba，f～j为45℃时的nbd-asp、nbd-glu、nbd-gly、nbd-tau， nbd-gaba，k～o为60℃时的nbd-asp、nbd-glu、nbd-gly、nbd-tau、nbd-gaba，p～t为75℃时的nbd-asp、nbd-glu、nbd-glu、nbd-tau、 nbd-gaba；图b为60℃下1～10min的衍生反应结果；图c为0.1mol/l硼酸钾溶液不同ph值的结果；图d为不同浓度值的硼酸钾溶液在ph＝7.5时的结果)。
39.图3为生物样品中空白样品图；(红色为猪空白样品、蓝色为大鼠空白样品、黑色为羊空白样品)。
具体实施方式
40.以下结合具体实施例来对本发明作进一步说明，但本发明所要求保护的范围并不局限于具体实施例。
41.实施例1
42.一种二维液相色谱-紫外衍生法在血液和脑组织中同时测定5种氨基酸类神经递质方法：
43.1、目标物：l-谷氨酸、l-天冬氨酸、甘氨酸、牛磺酸和γ-氨基丁酸。
44.2、试验试剂：超纯水为milli-q超纯水体系；乙腈和甲醇为色谱纯；氨水、磷酸、四硼酸钾、nbd-f、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠为分析级溶剂。
45.3、标准溶液：l-谷氨酸、l-天冬氨酸、甘氨酸、牛磺酸和γ-氨基丁酸标准储备液：分别精确称取标准品，将l-谷氨酸和l-天冬氨酸均配制成10mmol/l 储备液，将甘氨酸、牛磺酸和γ-氨基丁酸均配制成100mmol/l储备液，于-80℃保存，保质期3个月。
46.4、标准工作液：在生物基质的定量分析中，用mile-q水作为替代基质，将标准储备液和使用标准加入法加入生物基质的标准工作液稀释至所需浓度来制备混合标准工作溶液，于-20℃保存，保质期1个月。
47.5、仪器和材料：二维液相色谱系统由anax(中国长沙)的flc-2420柱状烘箱、spd-20a紫外检测器、一个高压梯度色谱lc-20at泵(a泵)和二个高压lc-20at泵(泵b和泵c)组
成，并配备有600-μl进样回路的sil-20a自动进样器、cbm-20a系统控制器和labsolutionslc workstation ver.5single lc 工作站，日本岛津公司。
48.电子天平(atx224岛津制作所)；5452小型台式离心机(德国eppendorf 公司)；vortex dancerⅲ迷你涡旋混合器(莱普特科学仪器有限公司)；kq-100e 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。ph测定仪，梅特勒-托利多：s210 ph计，上海梅特勒-托利多仪器有限公司。
49.6、方法：
50.6.1、样品前处理：针对标准品的前处理过程，对标准储备液用水稀释所需浓度即可。
51.6.2、衍生反应条件：研究反应介质ph、衍生化反应的时间和温度，以及衍生反应的最佳配比。需选用过量浓度的nbd-f以使衍生反应进行完全，以免对氨基酸衍生程度产生影响，此外衍生化效率对ph值敏感，即使ph值变化很小，衍生化产物的峰面积也会发生明显的变化，四硼酸钾ph值7.0，7.5，8.0，8.5， 9.0，9.5的四硼酸钾缓冲液配制5种氨基酸混合液。对以上条件分别进行衍生和色谱分析。衍生时间与温度相互影响，温度越高反应时间越短，在30、45、60、 75℃下分别进行10、20、30、40、50、60、70min的摸索，根据所得各氨基酸的响应情况，对60℃进一步缩短衍生时间(1～10min)进行探索。研究了不同衍生化条件对峰面积的影响，衍生条件优化结果见图1。
52.6.3、仪器检测：
53.以下作为本台二维液相色谱的参考条件，可具不同试验环境、不同液相仪器和不同样品进行调整。
54.一维色谱柱(萃取柱)：sncb 50mm*4.6mm*5μm柱；
55.二维色谱柱(分析柱)：sbr3 200mm*4.6mm*5μm柱；
56.进样体积：100μl；
57.流速：1ml/min；
58.流动相：
59.a泵：水相0.02m磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲液(ph＝6.8～6.9)，有机相甲醇-乙腈(3:1，v/v)；
60.c泵:c泵的流动相为甲醇和0.02mol/l磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲溶液 (ph＝6.8～6.9)(15:85，v/v)；
61.液相洗脱条件：
62.表1 l-谷氨酸、l-天冬氨酸、甘氨酸、牛磺酸和γ-氨基丁酸在flc系统运行时间程序
[0063][0064]
a泵的梯度洗脱程序：梯度分析在目标转移到二维柱后开始。1～5min，水相由71％匀速降至55％；5～13min，水相保持55％；13～18min，水相匀速升至71％。
[0065]
高效液相色谱参数：流速1ml/min；柱温40℃；进样量100μl；uv检测器 480nm。
[0066]
7、二维液相色谱系统建立原理：
[0067]
二维液相色谱系统，采用萃取柱与分析柱间的传递方式，首先，生物样品从自动取样器进入仪器流路系统，再经屏障/管道进入萃取柱，以达到对样品进行初步分离的目的；再使萃取柱与分析柱连接，将样品由萃取柱转移到分析柱，转移完成后，萃取柱返回mc流路，目标成分可在分析柱中实现进一步分离，并进行紫外检测。整个二维系统通过flc的智能流量控制系统(trs)连接。
[0068]
实施例2
[0069]
血液和脑组织样品的定量分析
[0070]
1、目标物同实施例1
[0071]
2、试验试剂同实施例1
[0072]
3、标准溶液同实施例1
[0073]
4、标准工作液同实施例1
[0074]
5、仪器和材料同实施例1
[0075]
6、生物样品前处理方法
[0076]
6.1、血浆及血清样品前处理：分别取100μl猪血浆、羊血浆和大鼠血清用移液管移入2ml管中，然后添加1ml乙腈生理盐水混合物(750:250，v/v)。在4℃冷冻离心机中旋转30s，以14500r/min离心10min。取100μl的上清液进行衍生化。
[0077]
6.2、脑组织样品前处理：分别称取猪、大鼠脑组织1g和0.5ml冷冻生理盐水(0.9％)于2ml离心管中，在组织匀浆机中均质1min，称取0.1g，加入pbs (ph＝7.4)-乙腈(750/250)。涡旋混合30s后，将溶液在4℃冷冻离心机中以 14500rpm离心10min。取100μl的上清液进行衍生化。
[0078]
7、仪器检测方法同实施例1
[0079]
对于内源性化合物，其体内基质中存在浓度未知的靶点，计算了实际校准曲线和替代校准曲线的空白浓度，验证了平行性，表明水作为替代基质是成功的。在生物样品中分别加入低、中、高浓度的l-天冬氨酸、l-谷氨酸、甘氨酸、牛磺酸和γ-氨基丁酸，证明了稀释效果。结果表明，反算样品的准确度在实际浓度范围内。
[0080]
本实施例中，大鼠血清、猪血浆及羊血浆中的l-天冬氨酸、l-谷氨酸、甘氨酸、牛磺酸和γ-氨基丁酸在≥100ng/ml浓度范围内均有着良好的线性关系；该方法最小定量限的信噪比＞10；最小检出限的信噪比＞3。
[0081]
本实施例中，猪血浆中添加低浓度时，l-天冬氨酸、l-谷氨酸、甘氨酸、牛磺酸和γ-氨基丁酸的rsd％(日内)分别为9.19、8.93、4.06、4.99、14.85，rsd％ (日间)分别为14.43、12.46、6.18、8.81、12.11；猪血浆中添加中浓度时，l
-ꢀ
天冬氨酸、l-谷氨酸、甘氨酸、牛磺酸和γ-氨基丁酸的rsd％(日内)分别为 1.85、1.47、2.24、2.69、9.12，rsd％(日间)分别为7.72、6.86、4.51、2.64、 2.96；猪血浆中添加高浓度时，l-天冬氨酸、l-谷氨酸、甘氨酸、牛磺酸和γ-氨基丁酸的rsd％(日内)分别为2.39、2.24、1.70、1.94、5.33，rsd％(日间) 分别为5.47、4.35、2.56、2.42、3.33；
[0082]
本实施例中，替代基质标准曲线的线性关系、检测线和定量限如下：
[0083]
l-天冬氨酸：y＝165.26x 2712.8，1.0000，20-5000nmol/l，lod 15nmol/l， loq 20nmol/l；l-谷氨酸：y＝197.29x 1817.2，0.9999，30-5000nmol/l。lod 20nmol/l，loq 30nmol/l；甘氨酸：y＝278.76x 20571，0.9999，1-5000nmol/l， lod 0.5nmol/l，loq 1nmol/l；牛磺酸：y＝253.8x 4285.3，0.9999，50-5000， lod 30nmol/l，loq 50nmol/l；γ-氨基丁酸：y＝169.86x 8217.8，0.9992， 50-10000nmol/l，lod 30nmol/l，loq 50nmol/l。以上结果可作为本次研究的检测线和定量限。
[0084]
本实施例中，猪血浆、羊血浆、大鼠血清标准曲线的线性关系分别如下：
[0085]
猪血浆：l-天冬氨酸：y＝161.38x 8181.6，0.9994，20-5000；l-谷氨酸：y ＝192.06x 26555，0.9994，30-5000；甘氨酸：y＝264.09x 70391，0.9996，1-5000；牛磺酸：y＝241.81x 63822，0.9989，50-5000；γ-氨基丁酸：y＝170.87x 25364， 0.9992，50-10000；
[0086]
羊血浆：l-天冬氨酸：y＝186.22x 7421.9，0.9998，20-5000；l-谷氨酸：y ＝209.54x 84191，0.9902，30-5000；甘氨酸：y＝274.48x 92387，0.9996，1-5000；牛磺酸：y＝268.01x 33140，0.9993，50-5000；γ-氨基丁酸：y＝208.2x 27061， 0.9992，50-10000；
[0087]
大鼠血清：l-天冬氨酸：y＝171.39x 9327.9，0.9994，20-5000；l-谷氨酸： y＝199.38x 54913，0.9954，30-5000；甘氨酸：y＝266.88x 49856，0.9971， 1-5000；牛磺酸：y＝265.83x 101295，0.9985，50-5000；γ-氨基丁酸：y＝188.25x
ꢀ-
7076.5，0.9995，50-10000；
[0088]
本实施例中，替代基质标准曲线，猪、大鼠脑组织标准曲线的线性关系分别如下：
[0089]
替代基质：l-天冬氨酸：y＝203.83x 5291.9，0.9998，20-5000；l-谷氨酸： y＝234.55x 3648.7，0.9998，30-5000；甘氨酸：y＝302.64x 35787，0.9998， 1-5000；牛磺酸：y＝278.38x 12835，0.9998，50-5000；γ-氨基丁酸：y＝220.78x 4421.8，0.9999，50-10000；
[0090]
猪：l-天冬氨酸：y＝236.09x 31464，0.9992，20-5000；l-谷氨酸：y＝259.26x 30605，0.9995，30-5000；甘氨酸：y＝298.46x 95618，0.9994；1-5000；牛磺酸：y＝272.58x 42510，0.9994；50-5000；γ-氨基丁酸：y＝231.52x 21144， 0.9998，50-10000；
[0091]
大鼠：l-天冬氨酸：y＝232.3x 18666，0.9998，20-5000；l-谷氨酸：y＝ 260.56x 18824，0.9996，30-5000；甘氨酸：y＝317.84x 56241，0.9999，1-5000；牛磺酸：y＝296.5x 36367，0.9994，50-5000；γ-氨基丁酸：y＝236.38x 16471， 0.9998，50-10000；
[0092]
本实施例中，生物基质标准工作曲线同替代基质曲线相比具备相似的斜率和平行性，满足水作为替代基质的基本条件。
[0093]
表2猪、羊、大鼠生物基质与替代基质的浓度比较(平行性)
[0094]
asp：天冬氨酸；glu：谷氨酸；gly：甘氨酸；tau：牛磺酸；gaba：γ-氨基丁酸
[0095]
[0096]