一种测量生物细胞电特性的光诱导电极扫描显微镜及方法与流程

1.本发明涉及生物细胞电特性测量领域，尤其涉及一种测量生物细胞电特性的光诱导电极扫描显微镜及方法。


背景技术：

2.研究生物细胞的电特性对人类疾病的防预与治疗有着至关重要的意义，测量生物细胞的电特性对疾病诊断、细胞再生康复以及高通量药物筛选等领域均可能带来重大突破。因此，生物细胞电特性检测技术的发展为我们在细胞水平研究生物体的生理和病理过程提供了有力工具。
3.目前，微电极阵列被广泛用于检测生物细胞的电特性，该检测技术直接在器件表面培养生物细胞，通过芯片上的引脚与外部信号采集设备相连，将信号采集出来。可以选用多种材料设计制备各种形状的电极，包括圆盘状、插指状、火山形和井状等，制备方法主要包括模板法、刻蚀法和自组装法等。这些传统电极的制备需要设计复杂的物理电极，物理电极的设计存在设计复杂、制作周期长、成本高等问题，且只能检测固定位置处细胞的电特性。而对生物细胞无接触、无损伤的光诱导电极目前可用于细胞操纵、分离或捕获粒子等，并未应用于生物细胞电特性测量领域。本发明提出一种测量生物细胞电特性的光诱导电极扫描显微镜，用光诱导电极取代传统的固定电极，避免了复杂的加工过程，极大地降低了成本，同时可以根据需要实时改变电极的位置和形状，以实现生物细胞电特性的灵活测量，还可以通过光图案的动态扫描或者位移平台对芯片进行x和y方向的移动实现光诱导电极扫描模式，从而进行细胞定位。


技术实现要素：

4.本发明技术解决问题：1)传统电极的制备存在复杂的电极制造问题，且样品制备难、成本高；2)传统电极的形状、位置固定，对生物细胞的电特性测量不够灵活，分辨率低，有测量死角；3)由于传统电极位置固定，无法通过测量细胞电特性的方式确定细胞的位置。本发明提供了一种测量生物细胞电特性的光诱导电极扫描显微镜及方法，使用光诱导电极代替传统的物理电极，避免了复杂的电极制造工艺，且电极连续(无测量死角)、分辨率高、效率高、成本低；进一步地，可以根据需要实时改变光诱导电极的形状和位置，以实现生物细胞电特性测量图案化、灵活化；进一步地，可以利用光图案的动态扫描或者位移平台对芯片进行x和y方向的移动实现光诱导电极扫描模式，从而在二维平面进行贴壁细胞定位；进一步地，对贴壁细胞上表面和悬浮细胞产生的电信号，可以通过扫描过程中的信号序列分析计算获得其空间位置，进而实现在三维空间上的细胞定位。进一步地，将光诱导电极应用于生物细胞电特性测量领域，突破了固定电极或电极阵列的局限性。
5.本发明提供的一种测量生物细胞电特性的光诱导电极扫描显微镜及方法，目的可通过以下的技术措施来实现：
6.一种测量生物细胞电特性的光诱导电极扫描显微镜，包括：位移平台(1)，投影装
置(2)，第一正透镜(3)，第二正透镜(4)，物镜(5)，光敏芯片(6)，光学显微镜(7)，ccd(8)，计算机(9)。
7.位移平台(1)，包括：微米位移台(粗调，25mm行程，分辨率0.1μm)和纳米位移台(细调，100μm行程，分辨率0.2nm)，用于对光敏芯片(6)进行三维调节，x和y方向用于水平调节光敏芯片位置，实现光诱导电极扫描模式，z方向用于竖直调节光敏芯片位置以调节成像焦距，使细胞成像于计算机(9)的显示器上。
8.投影装置(2)、第一正透镜(3)、第二正透镜(4)、物镜(5)，用于将设计好的光图案投影到光敏芯片(6)上，通过调节投影装置(2)、第一正透镜(3)和第二正透镜(4)之间的间距改变光图案尺寸。
9.光敏芯片(6)，光敏层的被照射区域产生光生载流子使电导率增加，从而在芯片上产生由光图案定义的光诱导电极。将培养皿环粘附于光敏芯片(6)上形成光敏芯片培养皿，提取心肌细胞并接种于培养皿中，进行电特性测量实验。
10.光学显微镜(7)、ccd(8)，用于获取光图案和细胞图像。
11.计算机(9)，用于实时观测光图案和细胞图像，同时作为外部采集设备进行细胞电信号的采集与处理。计算机(9)带有信号放大器和数据采集卡(24bits，200ks/s)。
12.所述的光敏芯片(6)，从上到下依次由本征氢化非晶硅光敏层(11)、n型掺杂氢化非晶硅层(12)，氧化铟锡导电层(13)和玻璃基底(14)组成。其中，本征氢化非晶硅光敏层(11)厚度为100nm
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1000nm，n型掺杂氢化非晶硅层(12)厚度为20nm
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100nm，氧化铟锡导电层厚度为20nm
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200nm。氧化铟锡导电层用于纵向收集载流子并向外部电路传输，同时可以减少光学反射。氢化非晶硅对光极其敏感，在光照条件下电阻变小，利用有光照处导通和无光照处截止的特性获得光诱导电极，且氢化非晶硅具有高光暗电导比(≥103)和高吸收率，因此选用氢化非晶硅作为光敏材料。光敏材料由本征氢化非晶硅光敏层(11)和n型掺杂氢化非晶硅层(12)两部分组成。本征氢化非晶硅光敏层(11)是光生载流子的产生区，只有本征氢化非晶硅光敏层(11)具有光电转化作用；n型掺杂氢化非晶硅层(12)是为了降低本征氢化非晶硅光敏层(11)和氧化铟锡导电层(13)之间的接触电阻。
13.进一步地，投影装置(2)将设计好的光图案投影，依次经过第一正透镜(3)、第二正透镜(4)的汇聚、物镜(5)的缩放照射到光敏芯片(6)上。
14.进一步地，所述的投影装置(2)，也可以用以下方法实现：1)两光束激光干涉产生的微米或纳米条纹扫描，2)激光振镜控制光点扫描，或3)空间光调制器结合光敏芯片成像扫描。
15.取1
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3天新生大鼠3只，提取心肌细胞并接种于培养皿中，进行以下电特性检测实验。
16.一种测量生物细胞电特性的光诱导电极扫描显微方法，使用如上任一所述的显微镜，具体操作步骤包括如下：
17.提取1
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3天新生大鼠的心肌细胞，培养在光敏芯片(6)培养皿中。投影装置(2)将设计好的光图案进行投影，经过第一正透镜(3)、第二正透镜(4)的汇聚、物镜(5)的缩放照射到光敏芯片(6)上。光敏芯片(6)的被照射区域产生光生载流子使电导率增加，从而在芯片上产生由光图案定义的光诱导电极。通过调整投影装置(2)、第一正透镜(3)和第二正透镜(4)之间的距离调节光图案尺寸。同时利用光学显微镜(7)、ccd(8)和计算机(9)对细胞和光
图案进行实时观测。调节光图案的投影位置，或移动位移平台(1)使光图案照射于待测细胞下方。将导线一端连接光敏芯片(6)的氧化铟锡导电层(13)作为测量电极，另一端接外部采集设备计算机(9)，参考电极置于细胞上方。观察计算机(9)采集软件的示数，实时检测细胞的电特性，从而实现了利用光诱导电极测量生物细胞的电特性。
18.光诱导电极扫描显微镜扫描模式的两种实现方式。方法一，光图案的动态扫描：利用投影装置(2)使光图案进行移动，使线条图案从芯片的左端移动到右端进行x方向扫描，从芯片的上端移动到下端进行y方向扫描。方法二，利用位移平台(1)精细调节光敏芯片(6)的水平位置实现光诱导电极在x和y方向的连续扫描。光诱导电极扫描的同时观察计算机(9)采集软件的示数，在x方向扫描过程中，当出现最强的周期性电压信号时记录坐标x1，在进行y方向扫描过程中，当出现最强的周期性电压信号时记录坐标y1，此时(x1，y1)即为细胞位置，实现了利用光诱导电极扫描模式在二维平面上进行细胞定位。
19.进一步地，被测细胞也可以是其他兴奋细胞，或细胞膜电位，以及细胞膜电位/离子通道的变化。
20.进一步地，对贴壁细胞上表面和悬浮细胞产生的电信号，可以通过扫描过程中的信号序列分析计算获得其空间位置，进而实现在三维空间上的心肌细胞定位。
21.本发明通过制作光诱导电极扫描显微镜，使用光诱导电极代替传统的固定电极，实现对生物细胞电特性的灵活测量和细胞定位。具有以下优点：
22.1)电极制备简单、效率高、成本低，避免了复杂的物理电极制造工艺。
23.2)可以根据需要实时连续调整电极的位置和形状，从而产生动态光诱导电极，以实现生物细胞电特性的高分辨率灵活测量。
24.3)光诱导电极扫描模式利用光图案的动态扫描或者位移平台在水平方向对光敏芯片的精细调节，实现在二维平面上的贴壁细胞定位。
25.4)对贴壁细胞上表面和悬浮细胞产生的电信号，可以通过扫描过程中的信号序列分析计算获得其空间位置，进而实现在三维空间上的细胞定位。
26.5)将光诱导电极应用于生物细胞电特性测量领域，突破了固定电极或电极阵列的局限性。
附图说明
27.图1为本发明的光诱导电极扫描显微镜结构示意图；
28.其中：1为位移平台，2为投影装置，3为第一正透镜，4为第二正透镜，5为物镜，6为光敏芯片，7为光学显微镜，8为ccd，9为计算机；
29.图2为光敏芯片结构示意图；
30.其中：11为本征氢化非晶硅光敏层，12为n型掺杂氢化非晶硅层，13为氧化铟锡导电层，14为玻璃基底；
31.图3为光诱导电极扫描示意图；
32.图4为通过光图案的动态扫描实现光诱导电极扫描模式获得的生物细胞电特性实验图；
33.图5为通过位移平台的移动实现光诱导电极扫描模式获得的生物细胞电特性实验图。
具体实施方式
34.下面结合附图对本发明做进一步说明。
35.如图1所示，本发明的光诱导电极扫描显微镜，包括位移平台1、投影装置2、第一正透镜3、第二正透镜4、物镜5、光敏芯片6、光学显微镜7、ccd8、计算机9。光敏芯片6安装于所述位移平台1上。投影装置2将设计好的光图案投影，依次经过第一正透镜3、第二正透镜4的汇聚、物镜5的缩放照射到光敏芯片6上。通过调整投影装置2、第一正透镜3和第二正透镜4之间的距离调节光图案的尺寸。光敏芯片6的被照射区域电导率增大，产生由光图案定义的光诱导电极，避免了传统电极复杂的制备过程，且电极的形状和位置灵活可变。利用光学显微镜7、ccd8和计算机9观察细胞和光图案，根据细胞位置调节光图案，使光诱导电极位于待测细胞下方，同时计算机9将作为外部采集设备采集生物细胞的电特性。光学显微镜7和ccd8，用于获取光图案和细胞图像。计算机9带有信号放大器和数据采集卡(24bits，200ks/s)，用于实时观测光图案和细胞图像，同时作为外部采集设备进行细胞电信号的采集与处理。
36.将导线一端连接光敏芯片6的氧化铟锡导电层13作为测量电极，另一端接外部采集设备计算机9，选择银丝作为参考电极，将其置于细胞上方并与外部采集设备计算机9相连。
37.位移平台1，包括：微米位移台(粗调，25mm行程，分辨率0.1μm)和纳米位移台(细调，100μm行程，分辨率0.2nm)，用于对光敏芯片6进行三维调节，x和y方向用于水平调节光敏芯片位置，实现光诱导电极扫描模式，z方向用于竖直调节光敏芯片位置以调节成像焦距，使细胞清晰成像于计算机9的显示器上。
38.本发明提供两种光诱导电极扫描模式：第一种，利用投影装置2投影动态光图案进行直接扫描模式；第二种，利用位移平台1精细调节光敏芯片6的水平位置实现光诱导电极的间接扫描模式。如图2所示，光敏芯片6从上到下依次由本征氢化非晶硅光敏层11，n型掺杂氢化非晶硅层12，氧化铟锡导电层13和玻璃基底14组成。其中，本征氢化非晶硅光敏层11的厚度为400nm，n型掺杂氢化非晶硅层12的厚度为50nm，氧化铟锡导电层13的厚度为120nm。仅本征氢化非晶硅光敏层11具有光电转化作用，被照射区域产生光生载流子使电导率增加，从而在芯片上产生由光图案定义的光诱导电极。n型掺杂氢化非晶硅层12用于降低本征氢化非晶硅光敏层11和氧化铟锡导电层13之间的接触电阻，使二者更好的耦合。
39.如图3所示，投影装置2将竖直线条图案投射到光敏芯片6上，沿x方向移动图案或者在x方向移动位移平台使竖直线条图案从芯片的左端移动到右端，同时观察计算机9采集软件的示数，当出现最强的周期性的电压信号时，此时的光线条图案位于细胞位置处，记录此刻的坐标，即x1。投影装置2将水平线条图案投射到光敏芯片6上，沿y方向移动图案或在y方向移动位移平台使水平线条图案从芯片的上端移动到下端，当计算机9采集软件出现最强的周期性的电压信号时，记录此刻的坐标，即y1。此时，(x1，y1)即为细胞的位置，利用光诱导电极扫描显微镜实现了二维平面上的细胞电特性测量和定位。
40.如图4所示，通过光图案的动态扫描，连续改变光图案的投影位置，实现光诱导电极扫描模式，利用计算机9采集电压信号。当光图案投射于细胞下方时，计算机9采集软件出现如图的周期性电压信号。
41.如图5所示，通过位移平台的移动，即通过移动位移平台在x方向改变竖直线条图
案的投影位置，在y方向改变水平线条图案的投影位置，实现光诱导电极扫描模式，利用计算机9采集电压信号。当光图案投射于细胞下方时，计算机9采集软件出现如图的周期性电压信号。
42.下面再对本发明方法进行详细说明。
43.实施例1：
44.取1
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3天新生大鼠3只，提取心室，加入ⅱ型胶原酶消化心肌组织，分离细胞。第二天经过过滤、离心、弃上清，沉淀中加入含10％fbs的dmem高糖培养基，吹打成心肌细胞悬液，接种于培养皿中。将培养皿置于37℃、5％co2的培养箱中培养1.5
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2小时进行差速贴壁，此时心肌细胞存在于上清液中。收集上清液，加入含有抑制非心肌细胞增殖的终浓度为0.1mmol/l的brdu的培养基，将心肌细胞悬浮液接种于光敏芯片6培养皿中，继续培养24小时后换液，换为不含brdu的培养基培养。培养12小时细胞基本贴壁，少数贴壁的单个细胞出现自发性搏动，搏动频率较慢，有的每分钟仅数次。
45.按图1方式连接各个元件或装置，设计光图案。投影装置2将设计好的光图案进行投影，光图案经过第一正透镜3、第二正透镜4的汇聚和物镜5的缩放后照射到光敏芯片6上。通过调整第一正透镜3、第二正透镜4、物镜5和光敏芯片6的位置调节光图案的尺寸。本征氢化非晶硅光敏层11的被照射区域产生光生载流子使电导率增加，从而在芯片上产生由光图案定义的光诱导电极。利用光学显微镜7、ccd8和计算机9观察光图案和细胞位置，将光图案投影于细胞位置处。利用计算机9的采集软件采集细胞的电压信号，实现了光诱导电极扫描显微镜的生物细胞电特性测量。
46.实施例2：
47.将心肌细胞接种于光敏芯片6培养皿中，按图1方式连接各个元件或装置。
48.光诱导电极扫描模式一：如图3上所示，设计一系列竖直线条图案，通过控制竖直线条图案依次从光敏芯片6的左端移动到右端，实现了光诱导电极x方向扫描模式。光诱导电极扫描的同时观察计算机9采集软件的实时信号，当出现最强的周期性的电压信号时，通过计算机9观察光图案和贴壁心肌细胞，此时的光图案位于细胞位置处，记录此刻的坐标x1(x1＝232.5μm)。如图3下所示，设计一系列水平线条图案，通过控制水平线条图案依次从光敏芯片6的上端移动到下端，实现了光诱导电极y方向扫描模式。光诱导电极扫描的同时观察计算机9采集软件的实时信号，当出现最强的周期性的电压信号时，通过计算机9观察光图案和细胞，此时的光图案位于细胞位置处，记录此刻的光图案坐标，即y1(y1＝344.1μm)。(x1＝232.5μm，y1＝344.1μm)即为细胞的位置。通过光图案的动态扫描实现光诱导电极扫描模式获得的细胞电特性实验图如图4所示，完成了光诱导电极扫描显微镜在二维平面上的贴壁心肌细胞电特性测量和定位。
49.光诱导电极扫描模式二：如图3上所示，设计一条竖直线条图案，在x方向调节位移平台1使竖直线条图案沿此方向进行移动，实现了光诱导电极x方向扫描模式。诱导电极扫描的同时观察计算机9采集软件的实时信号，当出现最强的周期性的电压信号时，通过计算机9观察贴壁心肌细胞和光图案，此时的光图案位于细胞位置处，记录此刻的坐标，即x1(x1＝232.5μm)。如图三下所示，设计一条水平线条图案，在y方向调节位移平台1使一条水平线条图案沿此方向进行移动，当出现最强的周期性的电压信号时，记录此刻的坐标，即y1(y1＝344.1μm)。(x1＝232.5μm，y1＝344.1μm)即为细胞的位置。通过位移平台的移动实现光诱导
电极扫描模式获得的心肌细胞电特性实验图如图5所示，完成了光诱导电极扫描显微镜在二维平面上的贴壁心肌细胞电特性测量和定位。
50.上述描述的实施例并非限定本发明，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做各种更改和等同替换，因此本发明的保护范围视权利要求范围所界定。