一种酮还原酶突变体的制作方法

：
1.本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种用于制备(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的酮还原酶突变体。


背景技术：

2.伊布替尼(ibrutinib)，又名依鲁替尼，是一种布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂的首创新药，2013年11月13日pharmacyclics公司宣布美国食品药品管理局批准其作为套细胞淋巴癌的单个治疗药物，适用于之前用其他手段治疗过的套细胞淋巴癌患者，2015年发现其可用于另一新适应症——egfr突变型的非小细胞肺癌。此外还有应用于多个适应症的临床研究包括i期临床的体瘤，ii期临床的多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病、边缘带淋巴瘤、移植物抗宿主病，后期临床的弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、胰腺癌等。作为未来的重磅炸弹药物，伊布替尼具有非常好的市场前景，预计高峰年份销售额将达到115～120亿美元。
3.(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶是合成伊布替尼的关键手性醇中间体。目前文献报道(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的制备方法主要有化学拆分法和生物转化法。
4.化学拆分法是将外消旋3-羟基哌啶在手性有机酸的作用下成盐析出得到(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的盐，然后游离、上保护基得到(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。该方法存在拆分收率低、操作繁琐及成本高昂的缺点。
5.2009年，文献organic letters vol.11，no.6，1245-1248报道了一种生物转化合成(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法。该方法利用磨碎的野生胡萝卡根为生物催化剂，将n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶酮还原得到(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，该方法存在生物催化剂大量获得困难及产物光学纯度不高等问题，反应效率太低、生产成本过高，难以产业化应用。
6.cn103789368b中公开了一种醇脱氢酶催化制备(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法，该方法虽然转化率(99％)和产物ee值都较高(》99.5％)，但是反应过程中底物浓度太低为1g/l，仅停留在实验室研究阶段，无法工业化放大应用。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于制备(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的酮还原酶突变体。
8.一方面，本发明提供的酮还原酶突变体的氨基酸序列是以seq id no.2所示的酮还原酶为参考序列发生突变的氨基酸序列，突变位点为第67位的天冬氨酸突变为甘氨酸，第91位的赖氨酸突变为甘氨酸，第113位的半胱氨酸突变为丙氨酸，第150位的谷氨酰胺突变为丙氨酸，第153位的苯丙氨酸突变为缬氨酸。
9.进一步，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示。
10.进一步，所述酮还原酶突变体的核苷酸序列如seq id no.3所示。
11.进一步，所述酮还原酶突变体来源于细长聚球藻(synechococcus elongatus)，野生型模板ncbi的登录号为aab82041.1。
12.更进一步，酮还原酶突变体表达于基因工程菌，优选大肠杆菌或酵母菌。
13.另一方面，本发明提供的酮还原酶突变体可以将n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶酮转化为(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，具体方案如下：
[0014][0015]
进一步，所述酮还原酶突变体为酮还原酶酶粉或含有该酮还原酶的全细胞或细胞破碎液，优选酮还原酶酶粉。
[0016]
进一步，所述酮还原酶酶粉浓度为1～10g/l。
[0017]
进一步，所述酮还原酶细胞浓度为5～50g/l。
[0018]
进一步，所述n-叔丁氧羰基-3-哌啶酮浓度为10～250g/l。
[0019]
进一步，该反应在辅酶和辅酶再生体系中进行。
[0020]
更进一步，辅酶因子选自nad

、nadh、nadp

和nadph的任意一种或它们的组合物，优选nadp

，辅酶浓度为0.001～1g/l。
[0021]
进一步，该反应在缓冲溶液中进行，其中缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，优选磷酸盐缓冲液，缓冲液的浓度为50～100mmol/l。
[0022]
进一步，该反应在ph＝5～8、温度为20～45℃下进行。
[0023]
本发明的有益效果在于，本发明公开的酮还原酶突变体能够将n-叔丁氧羰基-3-哌啶酮转化得到(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，1g酮还原酶能够催化50g底物，催化效能高，细胞成本低，具有重大的工业化应用价值。
附图说明
[0024]
无
具体实施方式
[0025]
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
[0026]
实施例1构建酮还原酶的定点饱和突变体库
[0027]
对seq id no.2(对应的核苷酸序列为seq id no.1)的酮还原酶通过计算机模拟结构，与底物进行对接，推测67位点、91位点、113位点、150位点、153位点与催化作用密切相关，对这些位点构建饱和突变体库，具体序列信息见表1。
[0028]
表1饱和突变的引物序列
[0029][0030][0031]
表1中带下划线的序列为突变位点，利用全质粒pcr扩增反应，扩增出带有突变基因的载体。接着利用dpni限制性内切酶对pcr产物进行重组质粒模板消化，再经过纯化之后，转化入大肠杆菌bl21(de3)感受态，之后将其涂布于含有50ug/l amp的lb平板上，在37℃的培养箱中倒置培养18小时长出单克隆。
[0032]
实施例2阳性克隆的高通量筛选
[0033]
对每个突变体随机挑选188个单克隆进行96孔板振荡培养，每个96孔板接种两个未突变的菌种为对照组(control)，共计10块96孔板。具体操作为：在无菌的96孔板中加入400ul的lb培养基，37℃培养约12小时，按照10％的接种量，转接于第二个96孔板中培养，继续培养3小时，加入终浓度为0.1mm的iptg诱导表达16小时，诱导温度25℃。培养结束后离心弃上清，冻存于-20℃冰箱中待用。
[0034]
按照表2配制转化体系，用排枪吸取300ul转入上述离心后的96孔板中，在40℃的恒温振荡器中，300rpm的转速下反应4小时(此为对照组转化约一半底物的反应时间)，70℃失活。最后对所有转化反应液进行tlc点板检测，选取转化率高于对照组的候选反应液，乙酸乙酯萃取后进行gc检测。
[0035]
表2筛选饱和突变体库的反应液体系
[0036]
原料浓度底物200g/l异丙醇30％nadp

0.2g/lph7.0磷酸钾buffer100mm
[0037]
实施例3阳性候选突变体的测序
[0038]
在每个饱和突变体文库中，选取转化率最高(大于wt)，且gc检测中手性纯度》
99.5％(ee》99.0％)的突变体进行测序，根据序列比对发现突变体分别为d67g，l91g，c113a，q150a，f153v。表3为测序获得的序列突变信息。将其命名为mu01-mu05。
[0039]
表3测序后的密码子和氨基酸突变信息
[0040]
namesitesamplecodonmutationmu01d671b6gat-》ggtd67gmu02l912c2ctg-》gggl91gmu03c1131e6tgc-》gctc113amu04q1501f7caa-》gccq150amu05f1532d9ttc-》gtcf153v
[0041]
实施例4组合突变体的构建
[0042]
在d67g突变体的基础上，构建五个位点的组合突变体，即seq id no.4所示氨基酸序列，将其命名为mu06。对mu06和未突变的wt同时接种5ml含氨苄青霉素的lb试管培养基，37℃培养12小时，按1％接种量转接活化培养物至100ml含氨苄青霉素的2yt液体培养基中，37℃培养od至0.6～0.8，加入iptg(终浓度0.1mm)于25℃诱导培养16小时，离心收集菌体。按照表4的体系进行反应，在40℃的恒温振荡器中，300rpm的转速下反应3小时，tlc检测结果：mu06在3小时内即可转化完底物，而wt对照组只反应了不到一半，将mu06反应液用乙酸乙酯萃取后，送gc检测，结果手性纯度为99.8％。
[0043]
表4比较突变体催化效果的反应液体系
[0044]
原料浓度底物200g/l异丙醇30％nadp

0.2g/l细胞20g/lph7.0磷酸钾buffer100mm
[0045]
实施例5酮还原酶mu06突变体细胞/酶粉的制备
[0046]
将mu06突变体接种至5ml含氨苄青霉素的lb试管培养基中活化培养(37℃培养12小时)，按1％接种量转接活化培养物至400ml含氨苄青霉素的2yt液体培养基中，37℃培养od至0.6～0.8，加入iptg(终浓度0.1mm)于25℃诱导培养16小时。离心收集菌体得到酮还原酶mu06突变体细胞。用40ml磷酸盐缓冲液(10mm，ph 7.5)重悬20g菌体后，于均质机中均质破碎，离心收集上清，-20℃预冻后真空冷冻干燥48小时后碾碎，即得酮还原酶mu06突变体的酶粉。
[0047]
实施例6克级(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的制备
[0048]
向1l圆底烧瓶中加入0.5l事先配好的ph 7.0的100mmol/l的磷酸盐缓冲液、3.0g酮还原酶mu06酶粉和0.004g nadp，搅拌均匀后，加入64g n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶酮和0.3l异丙醇，30℃搅拌5小时，过滤，滤液用甲苯萃取，减压浓缩甲苯得到71g淡黄色液体；粗品加入0.5kg正己烷，在0～50℃搅拌析出白色固体，过滤、真空烘干得产品59.2g，纯度99.8％，光学纯度99.8％，收率92.5％。
[0049]
实施例7公斤级(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的制备
[0050]
向20l带夹套的玻璃反应釜中加入10l事先配好的ph 7.0的90mmol/l的磷酸盐缓
冲液、0.1kg酮还原酶酶粉和0.09g nadp，搅拌均匀后，加入4kg n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶酮和6l异丙醇，30℃搅拌6小时，过滤，滤液用甲苯萃取，减压浓缩得到4kg淡黄色液体；粗品加入20kg正己烷，在0～50℃搅拌析出白色固体，过滤、真空烘干得产品3.81kg，纯度99.9％，光学纯度99.7％，收率95％。