用于治疗或预防呼吸道感染的亚单位疫苗的制作方法

1.本发明涉及稳定在融合前构象下的经修饰偏肺病毒(hmpv)f蛋白。本发明还涉及包括这些蛋白的用于预防和/或治疗人类受试者对抗呼吸道感染的免疫原性组合物(疫苗)。


背景技术：

2.人偏肺病毒(hmpv)是幼儿(0-4岁)、免疫功能低下患者和老年人急性呼吸道感染的主要原因，对这些类别的患者可能是致命的(schildgen等人2011.《临床微生物学评论(clinical microbiology reviews)》24(4):734
–
54)。尽管付出了大量努力，但目前还没有获得许可的疫苗或抗病毒药物来预防或治疗hmpv感染。在研究的几种疫苗接种策略中，含有病毒蛋白，尤其是hmpv f蛋白的亚单位疫苗是最有前景的(melero和mas.2015.《病毒研究(virus res.)》209:128-35)。
3.hmpv是副粘病毒科肺病毒属有包膜的单链rna病毒。hmpv基因组由对包含三种表面糖蛋白f、g和sh的九种蛋白进行编码的八种基因组成。对hmpv的保护主要通过中和针对融合(f)糖蛋白的抗体提供，所述融合蛋白在不同基因型之间高度保守，并且与其它副粘病毒共享相似性(参见van den hoogen等人2004.《新发传染病(emerging infectious diseases)》10(4):658
–
66；van den hoogen等人2002.《病毒学(virology)》295(1):119-32)。
4.副粘病毒f蛋白是一种i型整合膜蛋白，所述整合膜蛋白跨越一次膜并在其n端含有信号肽，所述信号肽将胞外结构域靶向到细胞外膜。在c端处，疏水性终止转移结构域(tm域)将蛋白质锚定在膜中，留下短的胞质尾部(参见图1)。
5.天然f蛋白合成为无活性前体，在信号肽切割之后指定为f0(yin等人2006.《自然(nature)》439(7072):38-44；yin等人2005.《美国国家科学院院刊(proc.nat.acad.sci.)》102(26):9288-93；russell等人1994.《病毒学》199(1):160-8)。为了变得有生物活性，f0被宿主蛋白酶处理，产生两条链，被称为f1和f2，所述两条链通过二硫键保持共价连接(schowalter等人2006.《病毒学杂志(journal of virology)》80(22):10931-41；biacchesi等人2006.《病毒学杂志》80(12):5798-806；yun等人2015.《科学报告(scientific reports)》5:15584)。三个f1-f2异源二聚体形成成熟的f蛋白，所述蛋白以亚稳态融合前构象并入到病毒体包膜中(battles等人2017.《自然通讯(nat.commun.)》8(1):1528)并且介导病毒体包膜和宿主细胞质膜的融合。在融合过程期间，f蛋白经历了从不稳定的融合前构象到稳定的融合后构象的不可逆重折叠(参见图2)。
6.在人血清中发现了特异性识别融合前hmpv f蛋白结构的中和抗体(wen等人20012.《自然结构与分子生物学(nat.struct.mol.biol.)》19:461
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463；ngwuta等人2015.《科学转化医学(science translational medicine)》7(309):309；rossey等人2018.《微生物学趋势(trends in microbiology)》26(3):209
–
19)，表明融合前f蛋白可能是有利的疫苗候选物(melero和mas 2015.《病毒研究》209:128-35)。与融合后f蛋白构象相比，融合前
的一个明显缺点是其不稳定性。先前尝试采用彻底的结构分析和计算机建模来生产稳定的融合前f蛋白。具体地，一组描述了高度稳定的融合前rsv f蛋白的设计，能够在大鼠中提供保护性应答(参见krarup等人2015.《自然通讯》6:8143)。另一组公开了hmpv f蛋白的稳定融合前形式的构建，其在用这些蛋白免疫的小鼠中引发中和抗体(参见wo2016/103238)。
7.对于hmpv、rsv和其它副粘病毒，确定了融合前和融合后构象下f蛋白的晶体结构(参见例如battles等人2017.《自然通讯》8(1):1528)。尽管具有一般结构相似性，但揭示了融合前hmpv f蛋白具有独特的结构特征，所述独特的结构特征赋予hmpv和rsv的f蛋白之间实质性的功能和免疫学差异。
8.尽管在理解hmpv f蛋白的作用机制、结构和免疫原性性质方面取得了重大进展，但市场上没有基于f蛋白的疫苗。因此，本发明的目的是提供新的经修饰的融合前hmpv f蛋白候选物，用于开发针对呼吸道感染的人疫苗。


技术实现要素：

9.本公开提供了能够引发中和抗体并防止hmpv感染的重组免疫原性人偏肺病毒(hmpv)f蛋白和其片段(本文中被称为hmpv f蛋白)。hmpv f蛋白的天然编码序列经过修饰以产生稳定的融合前构象。此类修饰是基于作为本发明的一部分包含的三维(3d)同源性模型设计的。本发明进一步包含产生重组免疫原性蛋白的方法和使用免疫原性蛋白预防和/或治疗人类hmpv感染的方法。
10.一方面，本公开提供了一种经修饰的hmpv f蛋白或其片段，所述f蛋白或其片段稳定在融合前构象下，所述f蛋白或其片段包括由f2结构域、异源肽接头和缺乏融合肽的f1结构域构成的单链多肽(fp)，其中所述接头定位于所述f2结构域与所述f1结构域之间并且含有一个或多个半胱氨酸残基，所述一个或多个半胱氨酸残基中的每个半胱氨酸残基与所述f1结构域中存在的半胱氨酸残基形成非天然二硫键。
11.在一个实施例中，所述单链f蛋白包括连接的f2结构域和f1结构域，使得f2的c端靠近f1的n端。f2与f1之间的蛋白酶切割位点可以被突变以消除蛋白质前体的切割。在一些实施例中，f1结构域可以是截短的f1结构域，例如使得其缺乏跨越seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的位置103-118处的与seq id no:3的天然f1结构域序列的残基1到16相对应的氨基酸残基的融合肽(fp)。因此，f1结构域可以包括与seq id no:1的残基119到539或seq id no:3的残基17到437相对应的片段。在一些实施例中，单链多肽可以包括f1结构域的与seq id no:1的残基119到490或seq id no:3的残基17到338相对应的片段，所述片段不含有锚跨膜(tm)结构域和在其c端处的胞质尾部。另外地，f1结构域和f2结构域可以通过含有例如包括至少一个半胱氨酸残基的五个残基的异源肽接头，优选地seq id no:4的接头连接。
12.在又一个实施例中，本发明的单链f蛋白具有稳定的融合前构象。一方面，融合前构象通过f1结构域与f2结构域之间蛋白酶切割的消除和f1游离n端的缺乏而稳定。赋予稳定性的另一个特征是存在至少一个另外的(包含非天然的)二硫键，所述至少一个另外的二硫键将hra结构域固定在通过三聚化形成的空腔内部(参见图3)。在一个实施例中，可以在插入f2和f1之间的异源肽接头的半胱氨酸残基与定位于f1结构域中的半胱氨酸残基之间形成非天然二硫键，优选地在其c端区域中并定位于所述空腔内。例如，可以在肽接头中的
半胱氨酸残基与seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的与seq id no:3的天然f1结构域序列的位置236相对应的位置338处的f1结构域中存在的非天然半胱氨酸残基之间形成非天然二硫键。在此类实施例中，单链f蛋白中存在的f1结构域(例如，缺乏seq id no:3的残基1-16的融合肽的截短的f1结构域)可包括如seq id no:3的序列中的a236c等突变(对应于seq id no:1中的a338c)。肽接头中的半胱氨酸残基可以例如紧邻f2结构域，例如可以是异源接头的n端处的第一个残基并且与f2结构域的c端相邻。例如，肽接头中的半胱氨酸残基可以存在于重组多肽中相当于seq id no:1的残基103的位置处。
13.在另外的实施例中，单链f蛋白可以包括补偿含单链的f三聚体的几何形状的改变的一种或多种另外的修饰。优选地，所述修饰是与seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的位置49、51、67、80、97、137、147、159、160、161、166、177、185、258、266、294、480和/或481相对应的位置处的取代。具体地，位置97处的天冬酰胺可以被谷氨酸(n97q)取代或位置185处的丙氨酸可以被脯氨酸(a185p)取代。因此，重组多肽可以包括包含seq id no:2的位置31、33、49、62和/或79处的一种或多种取代的f2结构域。重组多肽可以包括包含seq id no:3的位置35、45、57、58、59、64、75、83、156、164、192、378和/或379处的一种或多种取代的f1结构域(例如，缺乏seq id no:3的残基1-16的截断的f1结构域)。
14.此外，某种或某些突变可以补偿空腔填充的不足。具体地，空腔填充突变可以选自包括在seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的位置49、67、80、137、147、159、160、161、177和258处的氨基酸取代的列表。在一个实施例中，空腔填充突变包含seq id no:1中的t49m取代、i67l取代、i137w取代、a147v取代、a159v取代、t160f取代、a161m取代和/或i177l取代。因此，在一些实施例中，重组多肽可以包括包含seq id no:2的序列中的t31m或i49l取代的f2结构域。在其它实施例中，重组多肽可以包括(例如截短的)f1结构域，所述结构域包括seq id no:3中的选自i35w、a45v、a57v、t58f、a59m、i75l和/或f156i的一种或多种取代。
15.在另一个实施例中，重组单链f蛋白可以包括导致形成非天然氢键或盐桥的一种或多种取代。例如，此类取代包含seq id no:1中的e80n和s266d。因此，重组多肽可以包括包含seq id no:2的序列中的e62n取代的f2结构域。在其它实施例中，重组多肽可以包括包含seq id no:3中的取代s164d的(例如截短的)f1结构域。
16.在一些实施例中，重组单链f蛋白可以包括另外的半胱氨酸取代以产生另外的稳定二硫键。例如，取代e51c和k166c可以在f2结构域的β链的位置51处的半胱氨酸残基与seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的hra α4元件的位置166处的半胱氨酸之间形成非天然二硫键。这种修饰削弱了来自hra中的螺旋的e51与k138之间可能的盐桥。突变s266d向k138引入非天然盐桥，以补偿此螺旋的附接损失。另外地，将seq id no:1的邻近残基i480和l481取代为半胱氨酸允许跨三个原聚体引入三个二硫键以制备共价连接的三聚体蛋白质。因此，在一个实施例中，重组多肽可以包括包含seq id no:2的序列中的e33c取代的f2结构域。在其它实施例中，重组多肽可以包括包含seq id no:3中的取代k64c、s164d、i378c和/或l379c的(例如截短的)f1结构域。
17.在另一个实施例中，重组单链f蛋白可以包括有助于可溶性重组蛋白表达的修饰。例如，在seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的位置294(g294e)处可以存在用甘氨酸取代谷氨酸残基，这可以导致更高的蛋白表达产量。因此，在一个实施例中，重组多肽可以包括包含seq id no:3中的取代g192e的(例如截短的)f1结构域。
18.在一些实施例中，重组单链f蛋白可以包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种氨基酸取代和/或其它修饰的组合。
19.在一些实施例中，重组单链f蛋白可以包括三聚化辅助物，所谓的折叠子结构域，例如连接到重组f蛋白亚基的c端，其允许形成蛋白质三聚体。折叠子结构域可以源自t4噬菌体的纤维蛋白。本发明的重组hmpv f蛋白可以作为单三聚体或异源三聚体产生。
20.在一些实施例中，重组hmpv f蛋白可以包括与seq id no:5到9或24到28中的任一个的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。重组单链f蛋白可以包括f2结构域，所述结构域包括与seq id no:2的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。重组单链f蛋白可以包括f1结构域，所述结构域包括与seq id no:3的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，重组单链f蛋白可以包括截短的f1结构域，所述结构域包括与seq id no:3的氨基酸序列的残基17-437或17-388具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
21.本发明的重组hmpv蛋白具有免疫原性并且可以诱导识别天然hmpv f蛋白的中和抗体。本公开还包含重组hmpv蛋白的免疫原性片段和与seq id no:5到9或24到28中的任一个的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的免疫原性蛋白。
22.本公开还提供了对经修饰的hmpv f蛋白进行编码的分离的核酸分子、包括分离的核酸分子的载体、用于对经修饰的hmpv f蛋白进行重组表达的宿主细胞。
23.本公开还提供免疫原性组合物或疫苗，其包括本发明的重组hmpv f蛋白或对hmpv f蛋白进行编码的分离的dna分子或载体，其进一步包括药学上可接受的载体和/或赋形剂，与或不与佐剂一起使用。特别地，本公开提供了用于刺激受试者的免疫应答，特别是免疫应答的免疫原性组合物或疫苗，其可以中和hmpv病毒并防止hmpv感染。本公开进一步提供了免疫原性组合物或疫苗，其包括源自hmpv、rsv或piv3(副流感病毒3型)的另外抗原。本文所公开的免疫原性蛋白、分离的dna分子、载体和免疫原性组合物或疫苗适合用作药物，特别是用于预防和/或治疗性治疗病毒性呼吸道感染和相关疾病，尤其是由hmpv引起的感染和疾病。
24.本公开涵盖生产重组hmpv f蛋白或对hmpv f蛋白进行编码的分离的dna分子或免疫原性组合物(疫苗)的方法。还包含在受试者中产生免疫应答的方法，以及治疗、抑制或预防hmpv感染的方法。
25.在另外的方面，本发明提供了一种经免疫原性人偏肺病毒(hmpv)修饰的f蛋白或其片段，所述f蛋白或其片段通过相对于天然hmpv f蛋白序列的一种或多种氨基酸取代稳定在融合前构象下；其中所述经修饰的f蛋白或其片段包括在与seq id no:1的所述天然hmpv f蛋白序列的位置97相对应的位置处取代天冬酰胺残基的谷氨酰胺残基(n97q)。
26.在另外的方面，本发明提供了一种经免疫原性人偏肺病毒(hmpv)修饰的f蛋白或其片段，所述f蛋白或其片段通过相对于天然hmpv f蛋白序列的一种或多种氨基酸取代稳定在融合前构象下；其中所述经修饰的f蛋白或其片段包括在与seq id no:1的所述天然hmpv f蛋白序列的位置294相对应的位置处取代谷氨酸残基的甘氨酸残基(g294e)。
27.在另外的方面，本发明提供了一种经免疫原性人偏肺病毒(hmpv)修饰的f蛋白或
其片段，所述f蛋白或其片段通过相对于天然hmpv f蛋白序列的一种或多种氨基酸取代稳定在融合前构象下；其中所述经修饰的f蛋白或其片段包括在与seq id no:1的所述天然hmpv f蛋白序列的位置49、51、67、80、137、147、159、160、161、166、177、258、266、480和/或481相对应的位置处的一种或多种取代。
28.在另外的方面，本发明提供了一种经免疫原性人偏肺病毒(hmpv)修饰的f蛋白或其片段，所述f蛋白或其片段通过相对于天然hmpv f蛋白序列的两种或更多种氨基酸取代稳定在融合前构象下；其中所述经修饰的f蛋白或其片段包括相对于seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的取代e51c和k166c，并且其中经取代的半胱氨酸残基形成非天然二硫键。
29.在另外的方面，本发明提供了一种经免疫原性人偏肺病毒(hmpv)修饰的f蛋白或其片段，所述f蛋白或其片段通过相对于天然hmpv f蛋白序列的一种或多种氨基酸取代稳定在融合前构象下；其中所述经修饰的f蛋白或其片段包括相对于seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的选自由以下组成的组的一种或多种取代：t49m、e80n、i137w、a147v、a159v、t160f、a161m、i67l、i177l、f258i、s266d、i480c和/或l481c。
30.在另外的方面，本发明提供了一种经免疫原性人偏肺病毒(hmpv)修饰的f蛋白或其片段，所述f蛋白或其片段通过相对于天然hmpv f蛋白序列的三种或更多种氨基酸取代稳定在融合前构象下；其中所述经修饰的f蛋白或其片段包括相对于seq id no:1的所述天然hmpv f蛋白序列的至少所述取代t49m、a161m和i67l或i177l。
31.在另外的方面，本发明提供了一种经免疫原性人偏肺病毒(hmpv)修饰的f蛋白或其片段，所述f蛋白或其片段通过相对于天然hmpv f蛋白序列的三种或更多种氨基酸取代稳定在融合前构象下；其中所述经修饰的f蛋白或其片段包括相对于seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的以下取代组合之一：
32.n97q、r102g和g294e；
33.n97q、r102g、t160f、i177l和g294e；
34.n97q、r102g、t49m、i67l、a161m、e80n、f258i和g294e；
35.n97q、r102g、t49m、i67l、a161m、e51c、k166c、s266d、g294e、i480c和l481c；或者
36.n97q、r102g、t49m、a161m、i137w、a159v、a147v、i177l和g294e。
37.除非本文另有说明，本说明书中提及的所有氨基酸位置均对应于seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的氨基酸位置。此类突变在seq id no:2的f2结构域和seq id no:3的f1结构域中的对应位置可以直接由其推导出。seq id no:2的f2结构域对应于seq id no:1的残基19到102。seq id no:3的f1结构域对应于seq id no:1的残基103到539。
附图说明
38.图1示出了具有所指示结构域和重要基序的天然hmpv f蛋白的示意图。f0：蛋白质前体；f1、f2：f1和f2结构域；sp：信号肽；fp：融合肽；hra、hrb：七肽重复结构域a和b，tm：跨膜结构域；cyt：胞质尾部；s-s：二硫键。
39.图2示出了天然hmpv f蛋白的融合前和融合后构象的结构变化。(a)融合前f蛋白三聚体的带状图，其中hrb的c端与折叠子结构域进行三聚化，并且hra折叠到头部结构域上。(b)融合后f蛋白三聚体的带状图，其中hra形成长的平行三螺旋束，其与移位的hrb螺旋一起形成稳定的六螺旋束。
40.图3示出了具有所指示突变的经修饰的融合前hmpv f蛋白的三维结构(带状图)。
41.图4示出了通过se-hplc对重组hmpv f蛋白的分析。1-sf_a1_k-e294、2-sf_a1_k_l7、3-l7f_a1_4.2、4-l7f_a1_31、5-l7f_a1_23、6-l7f_a1_33。
42.图5示出了利用重组hmpv f蛋白的融合前或融合后特异性抗体获得的elisa数据：(a)sf_a1_k-e294；(b)sf_a1_k_l7；(c)l7f_a1_4.2；(d)l7f_a1_23；(e)l7f_a1_31；(f)l7f_a1_33；(g)l7f_a1_23.2。在所有图中，除(g)外，实线指示通过使用不同稀释度的抗融合前抗体mpe8 n113s获得的信号，并且虚线指示通过使用不同稀释度的抗融合后抗体mf1获得的信号.在(g)中：上线指示利用抗融合前抗体mpe8 n113s获得的信号，并且下线指示利用抗融合后抗体mf1获得的信号。
43.图6示出了用重组f蛋白与不同佐剂组合免疫的小鼠的血清igg滴度。(a和b)用2μg的sf_a1_k_l7免疫的小鼠；(c和d)用2μg的sf_a1_mfur免疫的小鼠。
44.图7示出了用addavax
tm
辅佐的重组f蛋白免疫的小鼠的血清igg倒数稀释滴度。虚线表示检测限。(a)igg
2a
倒数滴度稀释度。(b)igg1倒数滴度稀释度。
45.图8示出了用辅佐的重组f蛋白免疫的小鼠的血清igg倒数稀释滴度。虚线表示检测限。(a)igg
2a
倒数滴度稀释度。(b)igg1倒数滴度稀释度。
46.图9示出了针对sf_a1_k_l7蛋白与不同佐剂组合产生的小鼠血清中的中和抗体滴度(ic
50
，倒数稀释滴度)。
47.图10示出了小鼠血清中针对用(a)addavax
tm
或(b)辅佐的重组f蛋白产生的中和抗体滴度(ic
50
，倒数稀释滴度)。
48.图11示出了针对不同剂量的重组f蛋白产生的小鼠血清中的中和抗体滴度(ic
50
，倒数稀释滴度)。(a)用6μg f蛋白免疫的小鼠，(b)用2μg f蛋白免疫的小鼠，(c)用0.6μg f蛋白免疫的小鼠，(d)用0.2μg f蛋白免疫的小鼠和(e)用0.06μg f蛋白免疫的小鼠。
49.图12示出了用2μg的用addavax辅佐的重组f蛋白免疫并且随后用野生型hmpv(通过rt-qpcr测量)攻击的小鼠肺中的病毒rna载量。a和b表示两个独立的实验。
50.图13示出了用addavax
tm
辅佐的重组f蛋白免疫并且随后用野生型hmpv(肺定植测定)攻击之后对小鼠的保护。(a)用6μg f蛋白免疫的小鼠，(b)用2μg f蛋白免疫的小鼠，(c)用0.6μg f蛋白免疫的小鼠，(d)用0.2μg f蛋白免疫的小鼠和(e)用0.06μg f蛋白免疫的小鼠。
具体实施方式
51.定义
52.佐剂
[0053]“佐剂”是指用于可能通过抗原呈递细胞的活化来特异性或非特异性增强抗原特异性免疫应答的任何物质。佐剂的实例包含油乳剂(例如，完全或不完全弗氏佐剂)、montanide不完全赛比克佐剂如isa51、基于角鲨烯的水包油乳液佐剂如(诺华公司(novartis ag))(ott g.等人1995.《药物生物技术(pharm biotechnol)》6:277-96)或addavax
tm
(invivogen公司)，单磷酰脂a(mpl)(cluff cw.2010.《实验医学与生物学进展(adv exp med biol)》667:111-23)，铝盐佐剂(明矾)(如wo 2013/083726中所描述的)、聚
阳离子聚合物，尤其是聚阳离子肽，尤其是聚精氨酸或含有至少两个lysleulys基序的肽，尤其是klklllllklk、含有非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(cpg)的免疫刺激性寡脱氧核苷酸(odn)，例如cpg 1018(dynavax)，在所定义的碱基上下文中(例如，如wo 96/02555中所描述的)或基于肌苷和胞苷的odn(例如，如wo 01/93903中所描述的)，或含有脱氧肌苷和/或脱氧尿苷残基的脱氧核酸(如wo 01/93905和wo 02/095027中所描述的)，尤其是基于寡核苷酸(didc)
13
的佐剂(瓦尔内娃公司(valneva se))(如wo 04/084938和olafsdottir等人2009.《斯堪的纳维亚免疫学杂志(scand j immunol.)》69(3):194-202中所描述的)、神经活性化合物，尤其是人类生长激素(在wo 01/24822中描述)、趋化因子(例如，防御素1或2、rantes、mip1-α、mip-2、白介素-8或细胞因子(例如，白介素-1β、-2、-6、-10或-12；干扰素-γ；肿瘤坏死因子-α；或粒细胞-单核细胞-集落刺激因子)、胞壁酰二肽(mdp)变体、细菌毒素的无毒变体，qs-21(抗遗传公司(antigenics inc.))，quill a，n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰-l-丙氨酸-2-[1,2-二棕榈酰基-s-丙三基-3-(羟基磷酰氧基)]乙酰胺(mtp-pe)以及sarkar等人2019.《疫苗专家评论(expert rev vaccines)》:18(5):505-521中描述的其它，以及组合物，例如佐剂系统，如af03、as01、as03和as04(giudice等人2018.《免疫病理学研讨会(seminars in immunology)》39:14-21)。通过tlr3、tlr4、tlr7、tlr8和tlr9受体转导免疫信号的佐剂促进th1偏向免疫，而通过tlr2/tlr1、tlr2/tlr6和tlr5的信号传导促进th2偏向免疫。例如，cpg odn、polyic和mpl等佐剂主要诱导th1应答，明矾是th2应答的强诱导剂，而addavax
tm
和可以诱导混合的th1和th2应答。佐剂可以与抗原一起施用或可以单独施用，通过与抗原相同的途径或通过与抗原不同的途径。单个佐剂分子可以具有佐剂和抗原性质两者。
[0054]
氨基酸取代
[0055]
氨基酸取代是指用不同的氨基酸或没有氨基酸(即缺失)替换多肽中的一个氨基酸。如本文所用，保守取代是不改变蛋白质的基本结构和功能的那些取代，例如当施用于受试者时蛋白质诱导免疫应答的能力。
[0056]
以下六组被视为是彼此的保守取代：
[0057]
1)丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；
[0058]
2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；
[0059]
3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(g)；
[0060]
4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；
[0061]
5)亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、蛋氨酸(m)、缬氨酸(v)；以及
[0062]
6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)。
[0063]
非保守取代是那些降低经修饰的hmpv蛋白的功能活性，使得在具有施用于受试者时诱导免疫应答的能力的取代。
[0064]
抗体
[0065]
抗体是特异性结合并识别抗原的多肽或蛋白质，如hmpv f蛋白或mpv f蛋白的抗原片段。术语“抗体”以最广泛的含义在本文使用并且涵盖各种抗体结构，包含(但不限于)：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要其展现出所希望的抗原结合活性即可。抗体的非限制性实例包含，例如，保持对抗原的结合亲和力的本领域已知的完整免疫球蛋白以及其变体和片段。抗体片段的实例包含但不限于fv、fab、
fab'、fab'-sh、f(ab')2；双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段包含通过修饰整个抗体产生的或使用重组dna方法从头合成的抗原结合片段(参见例如，kontermann和dubel(编辑)《抗体工程(antibody engineering)》,第1-2卷,第2版,施普林格出版社(springer press),2010)。
[0066]
本发明已经使用了以下抗体：mpe8抗体是与存在于融合前而非融合后构象中的hmpv f蛋白的表面上的表位特异性结合的单克隆抗体(参见corti等人2013.《自然》,501:439-443)。mpe8抗体的重链和轻链可变区的序列分别以登录号agu13651.1和agu13652.1保藏在genbank中。mf1抗体识别融合后hmpv f蛋白的6hb结构域，如rodriguez,2015(《病毒学方法杂志(j virol methods)》224:1-8)中所描述的。williams等人,2007(《病毒学杂志(j virology)》81(15):8315-24)中描述的ds7抗体与融合前和融合后hmpv f蛋白构象两者结合。
[0067]
空腔填充突变(或取代)
[0068]
空腔填充突变是填充hmpv f蛋白的蛋白质核心内的空腔的氨基酸取代。空腔本质上是折叠蛋白内的空隙，其中不存在氨基酸或氨基酸侧链。在若干个实施例中，引入空腔填充氨基酸取代以填充融合前构象中存在的hmpv f蛋白胞外结构域核心中的空腔。
[0069]
折叠子结构域
[0070]
折叠子结构域是天然形成三聚体结构的氨基酸序列，并且也可被称为三聚化辅助结构域。在一些实例中，折叠子结构域可以包含在所公开的重组蛋白的氨基酸序列中，使得抗原将形成三聚体。在一个实例中，折叠子结构域是t4噬菌体源性折叠子结构域，包含如例如gyipeaprdgqayvrkdgewvllstf(seq id no:10)所示的氨基酸序列。折叠子结构域可以例如从纯化的蛋白质切割，例如通过掺入与折叠子结构域相邻的凝血酶切割位点。
[0071]
糖基化位点
[0072]
糖基化位点是多肽如蛋白质的表面上的氨基酸序列，其容纳聚糖的附接。n-连接的糖基化位点是nx(s/t)的三联体序列，其中n是天冬酰胺，x是除脯氨酸之外的任何残基，并且(s/t)是丝氨酸或苏氨酸残基。聚糖是多糖或寡糖。聚糖也可以用于指糖缀合物的碳水化合物部分，如糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖。
[0073]
异源
[0074]
术语“异源”是指源自不同的基因来源。与蛋白质或病毒异源的氨基酸序列源自不同于其中其存在或表达的蛋白质或病毒的来源。在一个具体的非限制性实例中，存在于两个结构域之间的重组多肽中的异源肽接头是指不天然存在于这两个结构域之间的野生型多肽中的肽序列，例如肽接头是连接重组多肽中的两个结构域的人工序列。
[0075]
同源
[0076]
同源蛋白质具有类似的结构和功能，例如来自两个或更多个物种或病毒菌株的在两个或更多个物种或病毒菌株中具有类似的结构和功能的蛋白质。同源蛋白质共享类似的蛋白质折叠特性，并且可以被视为结构同源物。同源蛋白质通常共享高度的序列保守性，如至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％，至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列保守性，以及高度的序列同一性，如至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
[0077]
hmpv f蛋白
[0078]
hmpv f(融合)蛋白是促进病毒和细胞膜的融合的包膜糖蛋白。在自然界中，hmpv f蛋白被合成为大约540个氨基酸长的单个多肽前体，其包含n端信号肽(大约前18个残基)，所述信号肽指导定位到内质网，在所述内质网信号肽被切割掉。剩余的多肽，指定为f0，构成f蛋白单体(原聚体)，其在seq id no:1的天然f蛋白序列中位置102与103之间的蛋白酶切割位点处被加工，产生两个二硫键连接的片段，f1和f2。f2片段源自f前体的n端部分，并且包含大约seq id no:1的残基19-102。这些片段中的较大的片段f1包含f前体的c端部分(大约seq id no:1的残基103-539)，包含细胞外/腔内区域(残基103-490)、跨膜结构域(残基491-513)和c端的细胞质结构域(残基514-539)。hmpv f蛋白的胞外部分是f胞外结构域，其包含f2结构域(大约是hmpv f蛋白的位置19-102)和f1胞外结构域(大约是hmpv f蛋白的位置103-490)。三个f2-f1原聚体在成熟的f蛋白三聚体中寡聚化，其采用亚稳定的融合前构象，在与靶细胞膜接触时触发经历到融合后构象的构象变化。这种构象变化暴露了定位于f1结构域的n端的疏水序列(被称为融合肽(fp))，所述疏水序列与宿主细胞膜缔合并促进病毒的膜或受感染细胞与靶细胞膜的融合。三个hmpv f胞外结构域可以形成三个hmpv f原聚体的蛋白质复合物。本发明涉及经修饰的hmpv f蛋白或其片段，即包括一种或多种非天然氨基酸突变的重组多肽，所述突变相对于野生型、天然或天然存在的hmpv f蛋白序列稳定了融合前构象。
[0079]
hmpv f0多肽
[0080]
f0多肽是切割信号肽之后剩余的hmpv f蛋白的前体，其由f2结构域和f1结构域组成，包含f1胞外结构域、跨膜结构域和胞质尾部。天然f0多肽在分离f1和f2的蛋白酶切割位点(大约在seq id no:1的位置102与103之间)处被加工，产生f1和f2多肽片段(结构域)。
[0081]
hmpv f1结构域
[0082]
hmpv f1结构域是hmpv f蛋白的氨基酸序列的一部分。如本文所用，“f1结构域”是指天然f1序列和包含修饰(例如氨基酸取代、插入或缺失)的f1序列。天然f1结构域(seq id no:3)包含天然hmpv f蛋白的大约残基103-539，并且包含(从n端到c端)细胞外/腔内区域(seq id no:1的残基103-490)、跨膜结构域(seq id no:1的残基491-513)和c端处的胞质结构域(seq id no:1的残基514-539)。若干个实施例包含从天然f1序列修饰的f1结构域，例如缺乏融合肽的f1结构域(例如seq id no:1的残基103-118)。在一些实施例中，f1结构域是f1胞外结构域，即缺乏跨膜和胞质结构域，例如f1结构域对应于seq id no:1的残基103到490或119到490。在另外的实施例中，f1结构域包含一种或多种氨基酸取代，其使重组单链f蛋白(含有f1结构域)在融合前构象下稳定。
[0083]
hmpv f2结构域
[0084]
hmpv f2结构域是hmpv f蛋白的氨基酸序列的一部分。如本文所用，“f2结构域”是指天然f2多肽和包含来自天然序列的修饰(例如氨基酸取代)(例如被设计成使重组f蛋白(包含经修饰的f2多肽)在hmpv f蛋白融合前构象下稳定的修饰)的f2多肽。天然f2结构域(seq id no:2)包含大约seq id no:1的残基19-102。在天然成熟的hmpv f蛋白中，f2结构域通过两个二硫键连接到f1结构域。
[0085]
hmpv融合肽(fp)
[0086]
hmpv融合肽是hmpv f蛋白的氨基酸序列的一部分。融合肽可以是seq id no:1的
残基103-118，即seq id no:3的f1结构域的n端残基1到16。
[0087]
hmpv f蛋白融合前构象
[0088]
hmpv f蛋白融合前构象是hmpv f蛋白在触发导致hmpv f蛋白转变为融合后构象的融合事件之前并且在分泌系统中加工成成熟的hmpv f蛋白之后采用的结构构象。融合前构象下的示例性hmpv f蛋白的三维结构在本文和例如wo 2016/103238中进行讨论。hmpv f蛋白的融合前构象在整体结构上与其它副粘病毒(如rsv)的f蛋白的融合前构象类似，但有一些显著差异。在若干个实施例中，稳定在融合前构象下的重组hmpv f蛋白与对融合前但不是融合后构象下的hmpv f蛋白的三聚体形式特异的抗体(如mpe8抗体，参见wo2016/103238)特异性结合。
[0089]
单链hmpv f蛋白
[0090]
本发明的单链hmpv f蛋白是重组hmpv f蛋白胞外结构域(本文也用作单链多肽)，其表达为包含(经修饰的)hmpv f1结构域和(经修饰的)hmpv f2结构域的单个多肽链。单链hmpv f蛋白通常可以三聚化以形成三聚hmpv f蛋白亚基，优选地与三聚化辅助结构域例如折叠子融合。在一些实施例中，重组单链hmpv f多肽在f1结构域与f2结构域之间不包含蛋白酶切割位点，并且当在细胞中产生时不被切割成单独的f1结构域和f2结构域多肽。在一个实施例中，f1结构域和f2结构域与异源肽接头连接以产生单链构建体。
[0091]
免疫应答
[0092]
免疫应答是免疫系统的细胞，如b细胞、t细胞或单核细胞对刺激的应答。在一个实施例中，所述应答对特定抗原具有特异性(“抗原特异性应答”)。在一个实施例中，免疫应答是t细胞应答，如cd4 应答或cd8 应答。在另一个实施例中，应答是b细胞应答，并且导致产生特异性抗体。“引发免疫应答”是指用佐剂对受试者进行预治疗以增加对随后施用的免疫原性剂的期望免疫应答。“增强免疫应答”是指佐剂和免疫原性剂的共同施用，其中与在不存在佐剂的情况下向受试者施用免疫原性剂相比，佐剂增加了对免疫原性剂的期望免疫应答。
[0093]
免疫原
[0094]
免疫原是可以在动物中刺激抗体产生或t细胞应答的化合物、组合物或物质，包含注射或吸收到动物中的组合物。免疫原与具有特定体液或细胞免疫的产物反应，包含由如公开的重组hmpv f蛋白等异源抗原诱导的那些产物。免疫原可以包含一个或多个表位。在一些实施例中，免疫原可以是重组hmpv f蛋白或其免疫原性片段、包含重组hmpv f蛋白或其免疫原性片段的蛋白质纳米颗粒或病毒样颗粒、或对重组hmpv f蛋白或其免疫原性片段进行编码的核酸或载体，所述免疫原能够在哺乳动物(如用病原体感染或有用病原体感染的风险的哺乳动物)中诱导免疫应答。向受试者施用免疫原可能导致针对所关注病原体的保护性免疫和/或主动免疫。
[0095]
免疫原性组合物
[0096]
免疫原性组合物是包括免疫原的组合物，所述免疫原诱导针对抗原的可测量的ctl应答，或诱导针对抗原的可测量的b细胞应答(如抗体的产生)，所述抗原包含在免疫原上或由包含在免疫原中的核酸分子编码。在一个实例中，免疫原性组合物是包含所公开的重组hmpv f蛋白或其免疫原性片段的组合物，其在施用于受试者时诱导针对hmpv病毒的可测量ctl应答，或诱导针对hmpv f蛋白的可测量b细胞应答(如抗体的产生)。免疫原性组合
物可以包含对免疫原性蛋白进行编码的分离的核酸，所述分离的核酸可以用于表达免疫原性蛋白并且因此引发针对此蛋白质的免疫应答。因此，在另一个实例中，免疫原性组合物是包含对所公开的重组hmpv f蛋白或其免疫原性片段进行编码的核酸分子的组合物，其在施用于受试者时诱导针对hmpv病毒的可测量ctl应答，或诱导针对hmpv f多肽的可测量b细胞应答(如抗体的产生)。对于体内使用，免疫原性组合物将通常包含药学上可接受的载体中的免疫原性多肽或对免疫原性多肽进行编码的核酸分子，并且还可以包含其它试剂，如佐剂。任何特定的多肽，如所公开的重组hmpv f蛋白或对蛋白进行编码的核酸，都可以通过本领域公认的测定容易地测试其诱导ctl或b细胞应答的能力。
[0097]
分离的
[0098]“分离的”生物组分已与其它生物组分，如其中天然存在组分的其它生物组分，如其它染色体和染色体外dna、rna和蛋白质基本上分离或纯化。已“分离”的蛋白质、肽和核酸包含通过标准纯化方法纯化的蛋白质。所述术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的蛋白质或肽以及化学合成的蛋白质、肽和核酸分子。分离的不需要绝对纯度，并且可以包含至少50％分离如至少75％、80％、90％、95％、98％、99％或甚至99.9％分离的蛋白质、肽或核酸分子。稳定在融合前构象下的本文所公开的经修饰的hmpv f蛋白与融合后构象下的hmpv f蛋白分离，例如与融合后构象下的hmpv f蛋白至少80％分离、至少90％、95％、98％、99％或甚至99.9％分离。
[0099]
接头
[0100]
接头是可以用于将两个分子连接成一个连续的分子，例如连接单个多肽中的两个结构域的双功能分子。优选地，接头是肽接头。接头可以具有任何合适的长度，例如1到20、1到15、1到10、1到5个或更少的氨基酸残基。接头可以包括例如丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和/或缬氨酸残基或由其组成。优选地，接头可以包括至少一个半胱氨酸残基。
[0101]
天然(native或natural)蛋白质、序列或二硫键
[0102]
天然(native或natural)(本文可互换使用)多肽、序列、残基或二硫键是未经修饰的多肽、序列、残基或二硫键，例如未通过选择性突变将抗原的抗原性集中到靶表位，或将二硫键引入到天然蛋白质中不存在的蛋白质。天然蛋白质、残基或序列也被称为野生型蛋白质、残基或序列。非天然(non-native或non-natural)二硫键是不存在于天然蛋白质中的二硫键，例如由于通过基因工程将一个或多个半胱氨酸残基引入到蛋白质中而在蛋白质中形成的二硫键。同样，结构域中的非天然半胱氨酸残基是在野生型、天然序列中的所述位置处不存在的半胱氨酸残基。
[0103]
中和抗体
[0104]
中和抗体通过与感染原上的特异性抗原结合来降低感染原的感染滴度。在一些实例中，感染原是病毒。在一些实例中，对hmpv f蛋白特异的抗体中和hmpv的感染滴度。在一些实施例中，中和抗体结合并抑制相关抗原的功能，如共享抗原的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性抗原表面的抗原。对于来自病原体如病毒的抗原，抗体可以结合并抑制来自病原体的多于一类和/或亚类的抗原的功能。例如，对于hmpv，抗体可以结合并抑制抗原的功能，如来自多于一组的hmpv f蛋白。在一个实施例中，针对hmpv的广泛中和抗体与针对hmpv的其它抗体的不同之处在于所述中和抗体中和循环中的多种类型的hmpv的高百分比。
[0105]
药学上可接受的载体
[0106]
药学上可接受的载体用于调配用于临床施用的免疫原性hmpv f蛋白。e.w.martin,马克出版公司(mack publishing co.),easton,pa,第19版,1995的《雷明顿氏药物科学(remington's pharmaceutical sciences)》描述了适用于所公开的免疫原的药物递送的组合物和调配物。通常，载体的性质将取决于所采用的特定施用模式。例如，肠胃外调配物通常包括可注射流体，其包含药学和生理学可接受的流体，如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为媒剂。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包含例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体之外，要施用的药物组合物可以含有少量无毒的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如，乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。在特定实施例中，适合于向受试者施用的载体可以是无菌的、和/或悬浮的或以其它方式包含在单位剂型中，所述单位剂型含有一个或多个测量剂量的适合于诱导期望的抗mpv免疫应答的组合物。所述载体也可能伴随着用于其治疗目的的药物。单位剂型可以是，例如，包含无菌内容物的密封小瓶或用于注射到受试者中的注射器，或冻干以用于随后的溶解和施用，或者呈固体或受控释放剂量。
[0107]
多肽
[0108]
多肽是任何氨基酸链，无论长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。“多肽”适用于氨基酸聚合物，包含天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然氨基酸，例如对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物。“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物并入多肽中的氨基酸或氨基酸模拟物。多肽具有氨基端(n端)末端和羧基端(c端)末端。“多肽”与肽或蛋白质可互换使用，并且在本文中用于指氨基酸残基的聚合物。在许多情况下，一种或多种多肽可以折叠成特定的三维结构，包含表面暴露的氨基酸残基和非表面暴露的氨基酸残基。在一些情况下，蛋白质可以包含一起折叠成功能单元的多个多肽。例如，细胞表面上的成熟hmpv f蛋白包含三个f2/f1异源二聚体，所述异源二聚体三聚化为多聚体蛋白。“表面暴露的氨基酸残基”是在蛋白质的表面具有一定程度暴露，例如使得当蛋白质在溶液中时其可以接触溶剂的那些氨基酸。相比之下，非表面暴露的氨基酸是在蛋白质的表面上没有暴露，使得当蛋白质在溶液中时其不接触溶液的那些氨基酸残基。在一些实例中，非表面暴露的氨基酸残基是蛋白质核心的一部分。
[0109]
重组多肽或蛋白质
[0110]
重组多肽(或蛋白质)是一种具有非天然存在的序列或具有通过人工组合两个以其它方式分开的序列区段而制成的序列的多肽(或蛋白质)。这种人工组合可以通过化学合成来实现，或者更常见的是通过对分离的氨基酸残基区段进行人工操作，例如通过基因工程技术来实现。在若干个实施例中，重组单链多肽由已引入到宿主细胞如细菌或真核细胞中的异源(例如重组)核酸编码。例如，可以将核酸引入到具有能够表达由引入的核酸编码的蛋白质的信号的表达载体上，或者可以将核酸整合到宿主细胞染色体中。
[0111]
序列同一性：序列同一性通常以同一性百分比来测量：百分比越高，两个序列越相同。当使用标准方法比对时，多肽的同源物、直向同源物或变体将具有相对高度的序列同一性。
[0112]
用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。各种程序和比对算法在以下中描述：smith和waterman(《高等应用数学(adv.appl.math.)》2:482,1981)；needleman和wunsch《分子生物学杂志(mol.biol.)》48:443,1970；pearson和lipman(《美国国家科学院院刊》85:2444,1988)；higgins和sharp,《基因(gene)》,73:237-44,1988)；higgins和sharp(cabios5:151-3,1989)；corpet等人(《核酸研究(nuc.acids res.)》16:10881-90,1988)；huang等人(《生物科学中的计算机应用程序(computer appls in the biosciences)》8:155-65,1992)；pearson等人(《分子生物学方法(meth.mol.bio.)》24:307-31,1994)和altschul等人(《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》215:403-10,1990)，呈现了对序列比对方法和同源性计算的详细考虑。一旦经过比对，就通过对在两个序列中存在相同的核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行计数来确定匹配数。序列同一性百分比是通过将匹配数除以经鉴定序列中示出的序列长度或除以铰接长度(如来自经鉴定序列中示出的序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后通过将结果值乘以100来确定。优选地，在序列的全长上确定百分比序列同一性。例如，当与具有1554个氨基酸的测试序列比对时，具有1166个匹配的肽序列与测试序列有75.0％的同一性(1166
÷
1554*100＝75.0)。百分比序列同一性值取整为最接近的十分之一。例如，75.11、75.12、75.13和75.14向下取整为75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19向上取整为75.2。长度值将始终是整数。
[0113]
ncbi基本局部比对搜索工具(blast)(altschul等人1990.《分子生物学(mol.biol.)》215:403)可从若干个来源获得，包含国家生物技术信息中心(马里兰州贝塞斯达的ncbi(ncbi,bethesda,md))和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。在互联网上的ncbi网站上可获得如何使用此程序确定序列同一性的说明。blast和blast 2.0算法还在altschul等人(《核酸研究》25:3389-3402,1977)中进行了描述。用于执行blast分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information)(ncbi.nlm.nih.gov)公开获得。blastn程序(对于核苷酸序列)使用字长(w)为11、比对(b)为50、期望值(e)为10、m＝5、n＝-4以及对两条链的比较作为默认值。blastp程序(对于氨基酸序列)使用字长(w)为3，期望值(e)为10作为默认值，并且使用blosum62评分矩阵(参见henikoff和henikoff.1992.《美国国家科学院院刊》89:10915-10919)。
[0114]
多肽的同源物和变体的特征通常在于拥有至少约75％，例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，计数超过参考序列的至少50、100、150、250、500个氨基酸残基，超过参考序列的全长或超过与所关注参考氨基酸序列的全长比对。当通过这种方法评估时，与参考序列具有甚至更大相似性的蛋白质将显示增加的百分比同一性，如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性。为了对核酸序列进行序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，指定子序列坐标(如有必要)，并且指定序列算法程序参数。使用默认程序参数。
[0115]
有用的算法的一个实例是pileup。pileup使用了feng和doolittle的渐进比对方法的简化(《分子进化(mol.evol.)》35:351-360,1987)。使用的方法类似于由higgins和sharp所描述的方法(cabios 5:151-153,1989)。使用pileup，将参考序列与其它测试序列进行比较，以确定使用以下参数的百分比序列同一性关系：默认间隙权重(3.00)、默认间隙
长度权重(0.10)和加权末端间隙。pileup可以从gcg序列分析软件包中获得，例如7.0版(devereaux等人1984.《核酸研究》12:387-395)。
[0116]
如本文所用，提及“至少80％同一性”是指与指定的参考序列例如与参考序列的至少50、100、150、250、500个氨基酸残基或与序列的全长“至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性”。如本文所用，提及“至少90％同一性”是指与指定的参考序列例如与参考序列的至少50、100、150、250、500个氨基酸残基或与序列的全长“至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性”。
[0117]
治疗有效量
[0118]
治疗有效量是足以预防、治疗(包含预防)、减少和/或改善病症或疾病的症状和/或潜在原因例如预防、抑制和/或治疗hmpv感染的药剂，如所公开的免疫原或免疫原性组合物的量。在一些实施例中，治疗有效量足以减轻或消除疾病的症状，如hmpv感染。例如，这可以是抑制或预防病毒复制或可测量地改变病毒感染的外在症状所需的量。通常，此量足以可测量地抑制病毒复制或感染性。在一个实例中，期望的应答是抑制、减少或预防hmpv感染。为了使所述方法有效，不需要完全消除、减少或预防感染。例如，与合适的对照相比，施用治疗有效量的药剂可以将感染(如通过细胞感染或通过感染受试者的数量或百分比来测量)降低期望的量，例如降低至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少100％(消除或预防可检测的hmpv感染)。
[0119]
应当理解，为了获得针对病原体的保护性免疫应答可能需要多次施用免疫原性组合物。因此，治疗有效量涵盖与先前或随后施用组合有助于获得保护性免疫应答的部分剂量。例如，治疗有效量的药剂可以在治疗过程(如初免-加强疫苗接种治疗)期间以单一剂量或以若干个剂量施用，例如每天施用。然而，治疗有效量可以取决于所治疗的受试者、所治疗病状的严重性和类型以及施用方式。药剂的单位剂型可以以治疗量或以治疗量的倍数包装，例如，包装在具有无菌组件的小瓶(例如，具有可刺破的盖子)或注射器中。
[0120]
疫苗
[0121]
疫苗是在受试者中引发预防性或治疗性免疫应答的药物组合物。在一些情况下，免疫应答是保护性免疫应答。通常，疫苗引发对病原体(例如病毒病原体)的抗原或对与病理状况相关的细胞成分的抗原特异性免疫应答。疫苗可以包含多核苷酸(如对所公开的抗原进行编码的核酸)、肽或多肽(如所公开的抗原)、病毒、细胞或一种或多种细胞成分。在一个具体的非限制性实例中，与对照相比，疫苗降低了与hmpv感染相关的症状的严重性和/或降低了病毒载量。在另一个非限制性实例中，与对照相比，疫苗减少了hmpv感染。
[0122]
同源性建模
[0123]
一方面，本公开提供一种稳定在融合前构象下的新型经修饰的hmpv f蛋白。本公开还提供了一种用于基于晶体结构和同源性建模产生稳定的融合前f蛋白的方法。为了分析使修饰稳定的结构基础，使用了一系列可用的hmpv融合蛋白和同源融合蛋白的结构。其中融合前hmpv f蛋白胞外结构域(pdb:5wb0)和融合后hmpv f蛋白胞外结构域(pdb:5l1x)的晶体结构模型，融合前rsv f蛋白胞外结构域(pdb:4dab)和融合后rsv f蛋白胞外结构域(pdb:3rrr)的晶体结构模型。基于pdb:2ibl、1ox3和1avy中的结构数据，通过使用折叠子结
构域的所谓三聚化辅助结构域被建模成同源性模型。
[0124]
天然成熟的hmpv f蛋白由通过两个二硫键共价连接的两个多肽f2和f1构成。成熟过程包含胰蛋白酶样蛋白酶对f0前体的一次切割，导致f1结构域的游离n端产生融合肽fp，所述融合肽与靶细胞膜相互作用并触发构象变化。切割后，f1的c端部分重新定位到内部三聚体空腔的疏水区域。这可能会增强亚稳态融合前状态的稳定性，直到触发事件开始重新折叠成融合后构象异构体(参见图2)。在融合前构象下，含有hra的区域弯曲并与头部结构域结合，而在融合后构象下，所述区域是长突出螺旋的一部分。融合前到融合后的转变包含将f1亚基的七肽重复a(hra)序列重折叠成一个长α-螺旋，以及将定位于hra的n端的融合肽(fp)插入在其尖端，进入细胞膜。这种重折叠促进hra和hrb序列组装成稳定的六螺旋束，从而驱动膜融合。
[0125]
单链f蛋白
[0126]
单链f蛋白的建模旨在获得稳定的融合前构象，并且同时保持与天然hmpv f蛋白的最大结构相似性(参见图3)。假设缺失f1与f2之间的切割位点将稳定融合前构象异构体。消除一个切割步骤也有利于重组蛋白的生产过程。胰蛋白酶样识别基序rqsr跨越seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的位置99到102，并且切割在位置102处位(r102)的第二个精氨酸之后立即发生。切割消除可以通过切割位点中的至少一种突变来实现，优选地通过取代位置102处的精氨酸来实现。特别地，r102可以被甘氨酸或其它合适的氨基酸残基取代。特别地，在本发明的一个实施例中，通过用甘氨酸(r102g)取代位置102处的精氨酸来消除胰蛋白酶切割位点。
[0127]
为了实现单链f胞外结构域与天然融合前hmpv f蛋白的3d结构相似性，设计了f1结构域与f2结构域之间的环。在一个实施例中，通过插入异源肽接头来构建环。在优选的实施例中，针对抗原的稳定性、抗体结合质量和产量优化接头的大小和组成。在一个实施例中，接头的长度可以介于2与10个氨基酸残基之间，优选地介于2与5个残基之间，更优选地介于3与5个残基之间，甚至更优选地4或5个残基，最优选地5个残基。在另一个实施例中，接头可以插入在seq id no:1的位置95到102处的氨基酸残基之间，优选位置102处，最优选地位置102处的甘氨酸残基之间。
[0128]
在一些实施例中，接头可以由一种或多种半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和/或丝氨酸残基构成。类似物可以包括一个、二个或三个丙氨酸残基、一个或两个缬氨酸残基和一个或两个甘氨酸残基。例如，丙氨酸可以处于接头的位置1、2、3、4和/或5处；甘氨酸可以处于接头的位置2、3和/或4处；并且缬氨酸优选地可以处于接头的位置3和/或5处。表1中提供了接头的一些非限制性实例以及f2和f1的另外修饰。
[0129]
在优选的实施例中，接头包括至少一个(例如一个)半胱氨酸残基。半胱氨酸可以处于接头的对应于seq id no:1的位置103和105的任何位置处，优选地处于位置1或3处。更优选地，半胱氨酸处于接头的对应于seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的位置103的位置1处(即接头的n端处，优选地与f2结构域相邻)。甚至更优选地，接头是cgaga、cgagv、cgaav、agcga、caaav、caafv或cgaga。在最优选的实施例中，接头是cgaga(seq id no:4)。
[0130]
表1a.连接f2和f1结构域的单链接头的变体实例。indel操作会导致融合肽的缺失，并且具有胞外结构域序列净缩短的效果。用匹配数字标记的半胱氨酸，如c(1)或c(2)，在f1结构域与f2结构域之间形成二硫键。用质数('c)标记的半胱氨酸定位于相邻的原聚体
上。
[0131][0132]
[0133][0134]
表1b.以一般模式呈现的连接f2和f1结构域的单链接头的实例。用匹配数字标记的半胱氨酸，如c(1)或c(2)，在f1结构域与f2结构域之间形成二硫键。用质数('c)标记的半胱氨酸定位于相邻的原聚体上。
[0135][0136]
在一些实施例中，单链f蛋白的融合前构象可以通过引入至少一个非天然的原聚体内或原聚体间二硫键而共价稳定。例如，可以在定位于f2结构域与f1结构域之间的异源肽接头的半胱氨酸残基与f1结构域的半胱氨酸残基之间引入非天然二硫键。第一半胱氨酸残基可以处于所述接头的与seq id no:1的位置103相对应的任何位置，例如位置1、2、3或4处，优选地位置1处。可替代地，可以在seq id no:1的位置96或101或102处将第一半胱氨酸残基引入f2结构域中。在最优选的实施例中，位置103处的半胱氨酸与seq id no:1的天然hmpv f序列的位置338处的丙氨酸的半胱氨酸取代形成非天然二硫键。这种s-s键可以通过在疏水三聚体空腔内固定f2与f1之间的环来稳定单链f蛋白的融合前构象。此类环固定模拟了天然hmpv蛋白中的f1的内化切割n端的定位效应。在一些实施例中，单链hmpv f蛋白可以包括另外的半胱氨酸取代，所述半胱氨酸取代可以引入非天然原聚体间二硫键，例如通过共价连接来稳定蛋白质三聚体。
[0137]
在又一个实施例中，单链hmpv f蛋白在seq id no:3的f1结构域的n端处缺乏氨基酸残基1到16，涵盖融合肽fp的全部或部分序列。优选地，单链hmpv f蛋白在seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的位置103-118处缺乏氨基酸残基。fp的缺失进一步稳定了单链hmpv f蛋白的融合前构象。
[0138]
在一些实施例中，单链hmpv f蛋白可以包括一种或多种另外的修饰。一方面，另外的修饰可以补偿单链hmpv f蛋白几何形状的改变。另一方面，另外的修饰可以进一步稳定
融合前构象。另外的修饰可以包括一种或多种氨基酸取代、插入和/或缺失。在修饰中，保守取代可能是但不一定是优选的。以下取代组被视为是保守的：
[0139]
1)丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；
[0140]
2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；
[0141]
3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(g)；
[0142]
4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；
[0143]
5)亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、蛋氨酸(m)、缬氨酸(v)；以及
[0144]
6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)。
[0145]
在一个实施例中，稳定单链hmpv f蛋白的另外修饰是用谷氨酰胺残基取代seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的位置97(n97q)处的天冬酰胺残基。
[0146]
在另一个实施例中，单链f胞外结构域的另外修饰可以包括一种或多种空腔填充取代，包含但不限于位置49、67、137、159、147、160、161和/或177处的相对于seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的取代。具体地，空腔填充取代可以选自但不限于t49m取代、i67l取代、i137w取代、a147v取代、a159v取代、t160f取代、a161m取代或i177l取代。另外地，两种或更多种空腔填充取代的组合是可能的。在一个特定实施例中，所述组合包括t160f和i177l取代。在另一个特定实施例中，所述组合包括t49m、i67l和a161m取代。在又特定实施例中，所述组合包括t49m、a161m、i137w、a147v、a159v和i177l取代。
[0147]
通过空腔填充加固hra α3。在天然和经切割的f蛋白中，f1的n端部分在融合前构象(“加载弹簧”)中带有含有hra的结构域，这是融合后热力学更稳定的f蛋白中的长延伸螺旋，但折叠成若干个不同的小螺旋，甚至带有β发夹元件。此元件的另外接触可以允许蛋白质稳定在融合前构象下。为了填充hra α3下方的空腔，在位置t49m和a161m处用填充空间的脂肪族残基甲硫氨酸替换两个小残基，以形成互补对堆积在一起并加强此定位于表面的螺旋的脂肪族固定。battles等人于2017年报道了hmpv f融合前胞外结构域在位置161处发生突变，导致不表达f蛋白亚基(a161f)或亚基与mpe8抗体(a161l)反应不良(参见battles等人2017.《自然通讯》8(1):1528)。
[0148]
hra α4通过二硫键共价连接。hra α4延伸到f蛋白的尖端，并且位于融合前结构中hra α3之后的β发夹元件的c端。所有这些元件都参与了融合后构象中长α-螺旋元件的转化，其中包含在病毒融合过程中从头部结构域朝宿主细胞膜的运动。此处在hra α4螺旋元件(k166c)到由f2部分(e51c)提供的长β链之间引入二硫桥。这种变化修饰了两个带电残基，所述带电残基参与了极性网络，包含与hra α3的接触。引入了另外的修饰s266d，以允许通过这种二硫键形成突变部分地重建盐桥网络中的干扰。
[0149]
通过引入色氨酸使hra α2-α3硬化。hraα2-α3在融合前的hmpv f蛋白上形成弯曲的亚结构(同时在融合后构象下是长螺旋的一部分)。此弯曲的硬化将阻碍向融合后构象的转变。对于这种弯曲，可以观察到类似折叠的亚结构，其中hmpv f蛋白i137是类似物位置中的色氨酸，并且提供更密集排列的亚结构，例如在与肝素(pdb:3dy0，链a的w271)结合的切割蛋白c抑制剂的n端部分的晶体结构中。基于同源性建模和分子模拟，引入了另外两个突变a147v和a159v以在此亚结构中提供额外的空间填充，以迫使色氨酸侧链进入在蛋白c抑制剂结构中观察到的朝向，从而允许另外稳定色氨酸侧链酰胺与s149(蛋白c抑制剂中的天冬酰胺)极性接触。此外，a147和a159的类似物位置提供了具有空间填充侧链的残基。
[0150]
在一些实施例中，单链hmpv f蛋白可以包括一种或多种另外的稳定取代，例如导致形成非天然氢键、变体核心堆积或盐桥的取代。具体地，经修饰的单链hmpv f蛋白可以包括e80n、f258i和/或g294e取代。e80n取代可以建立到d224'(表示相邻原聚体的质数)的原聚体间h键并减少与d209的排斥。另一方面，e80n取代增强了单链hmpv f蛋白的重组表达。有助于提高重组蛋白产量的另一种修饰是g294e取代。
[0151]
在一些实施例中，用邻近残基i480和l481取代半胱氨酸残基允许以共价环的形式跨三个原聚体引入三个二硫键。共价连接的三聚体应该比折叠三聚化颗粒更稳定。官能环的形成要求所有三个二硫键形成，或者在多个环的情况下，每个原聚体之间形成至少一个二硫键。环到折叠子结构域的距离很短，并且折叠附接位置针对更刚性的几何形状进行优化。
[0152]
在优选实施例中，以下取代组合如下：
[0153]
n97q、r102g和g294e(l7f_a1_23)(例如存在于seq id no:5中)
[0154]
n97q、r102g、t160f、i177l和g294e(sf_a1_k_l7)(例如存在于seq id no:6中)；
[0155]
n97q、r102g、t49m、i67l、a161m、e80n、f258i和g294e(l7f_a1_31)(例如存在于seq id no:7中)；
[0156]
n97q、r102g、t49m、i67l、a161m、e51c、k166c、s266d、g294e、i480c和l481c(l7f_a1_33)(例如存在于seq id no:8中)，以及
[0157]
n97q、r102g、t49m、a161m、i137w、a159v、a147v、i177l和g294e(l7f_a1_4.2)(例如存在于seq id no:9中)。
[0158]
蛋白质三聚体
[0159]
在一些实施例中，本发明的经修饰的单链hmpv f蛋白与天然hmpv f蛋白的不同之处在于其不具有跨膜结构域和胞质尾部。然而，在一些实施例中，经修饰的单链hmpv f蛋白可以形成单三聚体或异源三聚体。为了形成三聚体，三聚化辅助结构域，所谓的折叠子，可以插入f胞外结构域的c端部分中。将保留可溶性状态的三聚化辅助物添加到亚基胞外结构域的c端支持稳定的三聚体和可溶性蛋白质三聚体的形成。
[0160]
在一个实施例中，折叠子结构域可以源自t4噬菌体的纤维蛋白并且包括seq id no:10的序列。在另一个实施例中，纤维蛋白折叠子可以通过插入一个或多个n-糖基化位点(基序nxt/s，其中“x”除脯氨酸之外的任何氨基酸残基)来修饰，这可以帮助隐藏hmpv非特异性表位。经修饰的折叠子结构域序列的一些非限制性实例如下：
[0161]
折叠子
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
gyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl
ꢀꢀꢀꢀ
(seq id no:10)
[0162]
折叠子-glyc-1 gyipeaprngtayvrkdgewvllstfl
ꢀꢀꢀꢀ
(seq id no:29)
[0163]
折叠子-glyc-2 gyipeaprdgqayvrkngtwvllstfl
ꢀꢀꢀꢀ
(seq id no:30)
[0164]
折叠子-glyc-3 gyipeaprdgqayvrkdgnwtllstfl
ꢀꢀꢀꢀ
(seq id no:31)
[0165]
折叠子-glyc-4 gyipeaprngtayvrkngtwvllstfl
ꢀꢀꢀꢀ
(seq id no:32)
[0166]
折叠子-glyc-5 gyipeaprngtayvrkdgnwtllstfl
ꢀꢀꢀꢀ
(seq id no:33)。
[0167]
可替代地，折叠子结构域可以具有来自gcn4亮氨酸拉链的结构元素(harbury等人1993.《科学(science)》262:1401)或允许围绕c3轴附接的自组装纳米颗粒单体(例如铁蛋白和卢马辛合成酶)。
[0168]
在另一个实施例中，折叠子结构域附接到f蛋白的c端，替换其跨膜结构域和胞质
结构域。折叠子的n端处的甘氨酸残基可以直接或通过各种长度的肽接头附接到f1结构域，所述肽接头可以包含至少一个蛋白酶位点。较长的接头允许对折叠子结构域的运动断开偶联，但不太能有效地支持将hrb区域(茎)的螺旋保持在定义的位置处。螺旋可以通过横向位移和三聚化辅助结构域弯曲成偏离颗粒的主c3轴的角度进行运动。较短的接头允许折叠子结构域的更刚性附接，其中对茎结构域的三个螺旋具有更强的固定作用。
[0169]
具体地，折叠子结构域可以通过插入在seq id no:1的天然hmpv f蛋白序列的s482之后的丙氨酸残基附接。这允许将s482保持为c端螺旋帽并重现折叠界面的局部几何形状。此类几何形状可以通过经由短接头(例如被称为“vsl”或“vsa”的短接头，分别由序列ilsa(seq id no:34)和ccsa(seq id no:35)组成)的折叠附接来实现。其中的丙氨酸(a483)与晶体结构pdb:1avy中的酪氨酸的n-2位置处的丙氨酸(对应于seq id no:10中的位置2)处于类似的位置，并在结构模型中显示与酪氨酸侧链类似的接触。另外地，短接头“vsl”或“vsa”可以与其它突变例如紧邻接头的氨基酸取代组合使用。例如，接头“vsa”与取代c480和c481的组合允许通过跨三个原聚体形成二硫环而共价连接三个原聚体。在这种几何形状中，二硫环的半胱氨酸残基在空间上保持接近，并且因此支持形成增加原聚体三聚体的整体稳定性的完全闭合的环。刚性较小的折叠子附接的实例保留了seq id no:1的残基483-485(具有二硫环的ilssae或ccssae)。形成超过一个半胱氨酸环的经修饰的折叠子接头的一些实例如下所示：
[0170]
480-cckqtneccknleravsa-496(seq id no:36)
[0171]
480-ccrelkeccknlenavsa-496(seq id no:37)
[0172]
480-ccrelkdccknlenavsa-496(seq id no:38)
[0173]
480-ccrelkdccknleravsa-496(seq id no:39)
[0174]
480-ccrelkdcckqlnkavsa-496(seq id no:40)
[0175]
480-ccrelkecckqlnkavsa-496(seq id no:41)
[0176]
短接头的其它非限制性实例是：gg、sg、gs、ggg、gga、ggs、sgg、ssg、sgs、sga、gga、ssa和sggs。此类接头可以与切割位点组合使用，例如通过替换a496引入。切割位点优选地是表2中公开的凝血酶切割位点、tev-切割位点(烟草蚀刻病毒蛋白酶)或xa-切割位点(因子xa)。
[0177]
表2
[0178]
描述切割基序seq id no凝血酶切割位点lvpr-gsseq id no:42tev-切割位点enlyfq-gseq id no:43因子xa切割位点iegr-seq id no:44
[0179]
在一些实施例中，为了更容易纯化重组蛋白，单链多肽可以包括现有技术中已知的任何纯化标签序列。有助于纯化的多肽的实例包含但不限于his-标签、myc-标签、s-肽标签、mbp标签、gst标签、flag标签、硫氧还蛋白标签、gfp标签、bccp、钙调素标签、链霉亲和素标签、hsv表位标签、v5表位标签和cbp标签。本发明的蛋白质优选地包括分别具有seq id no:11和seq id no:12的序列的his标签和/或链霉亲和素标签。
[0180]
可以应用的组合的非限制性实例表3中示出，其可以允许形成具有两个二硫环的平行三螺旋束。三聚化可能发生在含有480-495个残基的序列部分，但可以通过折叠子结构
域的存在来促进。半胱氨酸环的可用性允许形成二硫键，从而在三个原聚体之间进行共价连接。之后，三聚化辅助功能变得过时并且可以切除文件夹，其中优点是可以避免来自异源序列(以及例如非hmpv)的免疫原性副作用。
[0181]
表3
[0182][0183]
在一些实施例中，重组hmpv f蛋白可以包括与seq id no:5到9或24到28中的任一个的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，例如其中百分比序列同一性是在参考序列的全长范围内确定的。重组单链hmpv f蛋白可以包括f2结构域，所述结构域包括与seq id no:2的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。重组单链f蛋白可以包括f1结构域，所述结构域包括与seq id no:3的氨基酸序列，优选地至少相对于seq id no:3的残基17-437或17-388具有至少85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
[0184]
编码核酸和载体
[0185]
本技术提供了对本发明的重组hmpv蛋白进行编码的分离的核酸分子。核酸可以编码例如多肽，所述多肽包括例如a)hmpv f蛋白的(经修饰的)f1结构域；b)hmpv f蛋白的(经修饰的)f2结构域，c)定位于f1结构域与f2结构域之间的异源肽接头；d)三聚化辅助结构域；以及任选地e)纯化标签，其中f1结构域和f2结构域通过在接头中的半胱氨酸与f1结构域中的半胱氨酸之间引入的至少一个非天然二硫键共价连接。编码本发明的蛋白质的核酸可以包括seq id no:19到23的序列或由所述序列组成。
[0186]
本技术还包含对与seq id no:5到9或24到28中的任一个的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的蛋白质进行编码的分离的核酸分子。本技术还包含与seq id no:19到23的序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的分离的核酸分子，例如其中百分比序列同一性是在参考序列的全长范围内确定的。
[0187]
本技术还提供包括用于表达本发明的重组蛋白的分离的核酸分子的载体。本发明还提供了被设计成辅助表达和提供分离的多肽的表达系统。本技术还提供了用于表达本发明的重组hmpv f蛋白的宿主细胞。宿主细胞可以是原核生物。原核生物可以是例如大肠杆菌。宿主细胞可以是真核细胞。
[0188]
免疫原性组合物和调配物
[0189]
本发明的重组单链hmpv f蛋白具有免疫原性并且可以诱导识别天然hmpv f蛋白的中和抗体。本公开还包含重组hmpv蛋白的免疫原性片段和与seq id no:5到9或24到28中
的蛋白质具有至少85％序列同一性的免疫原性蛋白。
[0190]
本公开还提供免疫原性组合物或疫苗，其包括本发明的重组hmpv f蛋白或对hmpv f蛋白进行编码的分离的dna分子或载体，包括本领域已知的可接受的载体和/或赋形剂或稳定剂(通常参见remington,2005.《药学科学与实践(the science and practice of pharmacy)》,利平科特
·
威廉斯
·
威尔金斯出版公司(lippincott,williams and wilkins))。免疫原性组合物是当注射或以其它方式引入免疫原性组合物时在哺乳动物宿主中引发免疫应答的任何材料组合物。免疫应答可以是体液的、细胞的或两者。加强效应是指在哺乳动物宿主随后暴露于相同免疫原性组合物时，对免疫原性组合物的免疫应答增加。体液应答导致哺乳动物宿主在暴露于免疫原性组合物时产生抗体。
[0191]
免疫原性组合物或疫苗可以进一步包括佐剂。佐剂可以基于施用方法进行选择，并且可以包含矿物油基佐剂，如弗氏完全和不完全佐剂，montanide不完全赛比克佐剂，如isa，水包油乳液佐剂，如ribi佐剂系统，水包油乳液佐剂，如(诺华公司)或addavax
tm
(invivogen公司)(ott g.等人1995.《药物生物技术(pharm biotechnol)》6:277-96)，单磷酰脂a(mpl)(cluff cw.2010.《实验医学与生物学进展(adv exp med biol)》667:111-23)，铝盐佐剂(明矾)(例如，如wo 2013/083726中所描述的)、含有胞壁酰二肽的句法佐剂调配物(mdp)、聚阳离子聚合物，尤其是聚阳离子肽，尤其是聚精氨酸或含有至少两个lysleulys基序的肽，尤其是klklllllklk、含有非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(cpg)的免疫刺激性寡脱氧核苷酸(odn)，例如cpg 1018(dynavax)，在所定义的碱基上下文中(例如，如wo 96/02555中所描述的)或基于肌苷和胞苷的odn(例如，如wo 01/93903中所描述的)，或含有脱氧肌苷和/或脱氧尿苷残基的脱氧核酸(如wo 01/93905和wo 02/095027中所描述的)，尤其是寡核苷酸(didc)
13
(如wo 01/93903和wo 01/93905中所描述的)、(瓦尔内娃公司)(如wo 04/084938和olafsdottir等人2009.《斯堪的纳维亚免疫学杂志》69(3):194-202)、神经活性化合物，尤其是人类生长激素(描述于wo 01/24822中)以及sarkar i.等人2019中描述的那些(《疫苗专家评论(expert rev vaccine)》:18(5):505-521)或其组合，如giudice gd等人2018(《免疫病理学研讨会》39:14
–
21)中描述的af03、as01、as03和as04。一些组合根据例如在wo 01/93905、wo 02/32451、wo 01/54720、wo 01/93903、wo 02/13857、wo 02/095027和wo 03/047602中描述的组合。在一个优选的实施例中，佐剂是氢氧化铝或铝盐，其诱导强抗体和th2偏向的免疫应答。在另一个优选的实施例中，佐剂是诱导混合th1/th2应答的佐剂或佐剂组合物，如或addavax
tm
、mpl/明矾和
[0192]
本公开还提供了包括本发明的重组hmpv f蛋白的药物组合物，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。药物组合物可以进一步包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。药学上可接受的载体和/或赋形剂可以包含缓冲剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂和增溶剂(参见《雷明顿氏药物科学》,e.w.martin,宾夕法尼亚州伊斯顿市麦克出版公司,第15版,1975)。
[0193]
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在施用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。载体、赋形剂或稳定剂可以进一步包括缓冲剂。赋形剂的实例包含但不限于碳水化合物(如单糖和二糖)、糖类(如蔗糖、甘露醇和山梨糖醇)、磷酸盐、柠檬酸盐、抗氧化剂(如抗坏血酸和蛋氨酸)、防腐剂(如苯酚、丁醇、苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯、儿茶酚、十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲铵、间苯二酚、环己醇、3-戊醇、苯扎氯铵、苄索氯铵和间甲酚)、低分子量
多肽、蛋白质(如血清白蛋白或免疫球蛋白)、亲水聚合物氨基酸、螯合剂(如edta)、成盐反离子、金属络合物(如锌蛋白络合物)和非离子表面活性剂(如tween
tm
和聚乙二醇)。
[0194]
本发明的免疫原性组合物在包含人类的哺乳动物宿主中引发免疫应答。免疫应答可以是细胞依赖性应答或抗体依赖性应答或两者。这些免疫原性组合物可用作疫苗并且可以提供针对hmpv感染的保护性应答。
[0195]
本公开还提供了免疫原性组合物或疫苗，其包括源自至少一种不同感染性病毒，尤其是引起呼吸道感染的病毒，如hmpv、rsv(呼吸道合胞病毒)、piv3(副流感病毒3型)、流感病毒或冠状病毒(如sars-cov、sars-cov-2、mers等)的一种或多种另外抗原。优选地，另外的抗原是rsv f蛋白、piv3 f蛋白、流感血凝素或冠状病毒s-蛋白。
[0196]
本文所公开的免疫原性重组蛋白、分离的dna或rna分子、载体和免疫原性组合物或疫苗适合用作药物，特别是用于预防和/或治疗性治疗病毒性呼吸道感染和相关疾病，尤其是由hmpv引起的感染和疾病。
[0197]
本公开涵盖生产重组hmpv f蛋白或对hmpv f蛋白进行编码的分离的核酸(dna或rna)分子或免疫原性组合物(疫苗)的方法。还包含在受试者中产生免疫应答的方法和治疗、抑制或预防呼吸道感染，尤其是由hmpv引起的呼吸道感染的方法。
[0198]
现在将仅参考以下非限制性实施例通过实例的方式来描述本发明。
[0199]
实例
[0200]
实例1：经修饰的f蛋白的设计
[0201]
结构模型
[0202]
基于源自融合前rsv f(pdb:4jhw和4mmv，还有4mmu、4mms)、融合前piv-5f(pdb:5gip)、融合前hmpv f(pdb:5wb0)和融合后hmpv f(pdb:5l1x)蛋白的可用晶体结构的同源性模型(表示融合过程不同过渡阶段的模型)，在稳定的融合前构象下设计了突变的hmpv f蛋白。折叠子结构域改编自模型pdb:2ibl。模型构建和结构分析使用开源版本的pymol结构编辑器包(薛定谔公司(schrodinger llc)，https://github.com/schrodinger/pymol-open-source)进行。利用namd建模包(phillips等人2005《计算化学杂志(j comput chem.)》26(16):1781-802)和charmm36力场(mckerell等人1998.《物理化学杂志b(j phys chem b.)》102(18):3586-3616)或gromacs(berendsen等人1995.《计算机物理学通讯(comp.phys.comm.)》91:43-56；hess等人2008,《化学理论与计算杂志(j.chem theory comput.)》4,435-447；www.gromacs.org)/opls-aa(jorgensen wl，耶鲁大学)对模型进行了改进。候选模型通常在nvt、npt模拟序列中真空弛豫后应用的协议中进行改进，总共13ns，其中应用三个对称退火周期(改编自anishkin等人2010.《蛋白质(proteins.)》78(4):932
–
949)然后是自由采样和能量最小化。
[0203]
实例2：重组f蛋白的生产
[0204]
菌株
[0205]
天然hmpv f蛋白可以选自由seq id no:1、13到18或其变体的序列表示的任何hmpv株和任何血清型。在某些示例性实施例中，hmpv f蛋白源自由seq id no:1表示的菌株nl/1/00、血清型a1和由seq id no:14表示的菌株can97-83、血清型a2。
[0206]
表达载体
[0207]
用于克隆的质粒pvvs 1371含有：
[0208]-来自鸡β-珠蛋白基因座的hs4绝缘子序列，
[0209]-两个cmv启动子，
[0210]-两个嵌合内含子，处于cmv启动子的下游，由来自人β-珠蛋白基因的第一个内含子的5'-供体位点和来自免疫球蛋白基因重链可变区的内含子的支链和3'-受体位点构成。供体位点和受体位点的序列以及支链点位点被改编成匹配用于剪接的共有序列。内含子定位于cdna插入物的上游，以防止利用cdna序列内的可能隐藏的5'-供体剪接位点，
[0211]-牛生长激素聚腺苷酸化信号序列(bgh a)，
[0212]-来自tn5的新霉素磷酸转移酶基因在sv40增强子和早期启动子区域的调控下，
[0213]-疱疹病毒的胸苷激酶基因的hsv tk聚腺苷酸化信号定位于新霉素磷酸转移酶基因的下游，
[0214]-细菌启动子调控下的卡那霉素抗性基因，以及
[0215]-复制的puc起点。
[0216]
野生型f蛋白的编码序列是从hmpv菌株nl/1/00、亚系a1中分离出来的，并且针对在cho细胞中的表达进行了密码子优化。将野生型和经修饰的f蛋白的编码序列克隆到pvvs1371质粒中，用于在cho细胞中进行瞬时或稳定的蛋白质表达。
[0217]
简言之，使用限制位点sali和paci将编码序列克隆在嵌合内含子与pvvs1371载体的bgh a聚腺苷酸化位点之间。在琼脂糖凝胶上纯化之前，载体和合成的编码序列(合成通过geneart完成)用sali和paci消化。将片段与t4 dna连接酶连接，并且连接产物用于转化最大效率dh5α感受态细胞。通过序列分析测试所选克隆的设计突变。
[0218]
在cho细胞中表达
[0219]
蛋白质表达基于使用stx可扩展转染系统装置并遵循供应商的实验建议对cho细胞进行瞬时转染。简言之，在电穿孔之前，将cho细胞沉淀，悬浮在电穿孔缓冲液中并且与对应的表达质粒dna混合。将细胞-dna混合物转移到盒式处理组合件中并加载到stx可扩展转染系统上。使用预加载在装置中的“cho”方案对细胞进行电穿孔，并且立即转移到培养瓶中，并在37℃下用8％co2温育30到40分钟。恢复期后，将细胞以高密度重悬于ex-cell acf cho培养基(西格玛奥德里奇公司(sigma aldrich))中。电穿孔后细胞培养在37℃下用8％co2和轨道振荡进行。
[0220]
生产动力学由以下组成：将培养温度降低到32℃并每天用分批补料培养基喂养经转染细胞，所述培养基专为在cho细胞中瞬时表达蛋白质而开发(cho cd efficientfeed
tm a(赛默飞世尔科技公司(thermofischer scientific))，用酵母酸盐、葡萄糖和glutamax补充)。培养约7到14天后，检查细胞活力并在细胞澄清后收获条件培养基，这对应于以最大速度离心10分钟的两次运行。澄清的产品通过0.22μm无菌膜过滤并在蛋白质纯化前储存在-80℃。
[0221]
通过细胞内免疫染色进行蛋白质检测
[0222]
在转染后第7天，将细胞在pbs中洗涤一次，并在室温下在4％多聚甲醛中固定10分钟。固定细胞在室温下在bd perm洗涤液中透化15分钟，并与在bd perm洗涤液中稀释的第一抗体在4℃下温育1小时。最后，在4℃下添加与荧光标志物偶联的第二抗体持续1小时，并在4℃下储存在pbs中，直到通过流式细胞术(macsquant分析仪，美天旎生物技术有限公司
(miltenyi biotec))进行分析。作为第一抗体，已经使用了特异性识别hmpv f蛋白的融合前构象的mpe8 n113s抗体(pro-2015-026-01)，或识别融合前和融合后hmpv f蛋白的ds7 igg1(pro-2016-003)抗体。荧光fitc第二抗体是山羊抗小鼠igg igm(jir 115-096-068)。
[0223]
蛋白质纯化
[0224]
将冷冻的上清液置于室温并用标准级再生纤维素透析膜1-7cr(mwco:3.5kda)(斯百全公司(spectrum))对pbs进行透析。随后，将其用ph 8.0下的50mm na2hpo4缓冲液、300mm nacl平衡，并使用固定金属离子亲和色谱(imac)，然后通过凝胶过滤色谱进行蛋白质的纯化。
[0225]
对于imac，制造商(通用电气医疗集团(ge healthcare))将含有ni
2
(his gravitrap)的琼脂糖树脂装入色谱柱中。树脂用两体积的去离子水洗涤，并用三体积的平衡和洗涤缓冲液(20mm磷酸钠，ph 7.4，含0.5m氯化钠和20mm咪唑)平衡，如制造商所指示的。样品加载后，用10ml洗涤缓冲液洗涤柱。使用如制造商所指示的3-10个柱体积的洗脱缓冲液(50mm磷酸钠，ph 8.0，含0.5m氯化钠和500mm咪唑)从柱上洗脱带his标签的蛋白质。然后将洗脱液在0.22μm过滤器上过滤并在slide-a-lyzer
tm
透析盒中针对储存缓冲液(50mm na2hpo4，300mm nacl，5mm edta，ph 8.0)透析两次，然后分装并储存在-20℃下。
[0226]
重组蛋白的纯度、大小和聚集的分析通过尺寸排阻色谱法(se-hplc)进行，并且sds-page se-hplc(岛津公司(shimadzu))在柱superdex200(通用电气医疗集团)上运行。对于sds-pasge蛋白质，在样品缓冲液(ph 8.8下的0.08m tris-hcl、2％sds、10％甘油、0.01％溴酚蓝)中稀释，在存在β-巯基乙醇(或dtt)的情况下煮沸五分钟，并且在标准xt 4-12％bis-tris甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(伯乐公司(biorad))(sds-page)上进行电泳分离。凝胶在考马斯蓝(instant blue，西格玛奥德里奇公司)溶液中染色。用水去除多余的染色，并使用imager 600(安玛西亚公司(amersham))观察条带。图4示出了对纯化的重组f蛋白的se-hplc分析。重组f蛋白的示例性产量在表4中示出。
[0227]
表4.重组f蛋白的产量
[0228][0229]
实例3：重组hmpv f蛋白的构象
[0230]
通过夹心elisa确定构象谱
[0231]
用200ng/孔的人igg1 ds7捕获抗体(williams等人,2007)包被培养基(葛莱娜公司(greiner))并在4℃下温育过夜。将板在37℃下用pbs 0.05％tween 20和5％脱脂奶粉在搅拌下(饱和缓冲液)饱和2小时。将液体从孔中去除，并且将板与在饱和缓冲液中稀释的2.5ng/孔的所关注纯化蛋白在37℃下温育1小时。洗涤后，在针对融合前hmpv f蛋白的小鼠
抗体mpe8 n113s(corti等人,2013)或针对融合后hmpv f蛋白的小鼠抗体mf1(melero，个人通讯)的饱和缓冲液中的5倍连续稀释在37℃下温育1小时。然后通过在37℃下与和过氧化物酶hrp山羊抗小鼠igg(covalab#lab0252)缀合的二级α-ig物种特异性抗体温育一小时来检测免疫复合物，然后加入50μl的过氧化物酶底物(tmb，西格玛(sigma))。通过添加3n h2so4终止比色反应，并利用分光光度计(multiskan)在490nm处测量每个孔的吸光度。
[0232]
图5示出了利用融合前或融合后特异性抗体对重组f蛋白进行的elisa结果。除了存在于融合前和融合后构象中两者的一个候选物l7f_a1_4.2之外，所有测试的候选物都表现出融合前谱的丰度。重组蛋白l7f_a1_23.3与l7f_a1_23的不同之处仅在于异源接头中的一个氨基酸残基，即其在接头(cgagv)的位置5处包括缬氨酸，其对应于seq id no:1的位置118处的缬氨酸。
[0233]
实例4：免疫原性研究
[0234]
小鼠的免疫原性
[0235]
在有或没有不同佐剂，特别是明矾、明矾 mpl、addavax
tm
(invivogen公司)的情况下，五到十只balb/c小鼠的组以三周的间隔(例如第0天、第14天或第21天和第28天或第42天)用重组f蛋白(用于不同实验，以每只小鼠0.06μg到6.0μg的量)皮下免疫三次。通过眶后出血收集血清。在最后一次接种疫苗后一到四周，抽血并制备血清。th1/th2型免疫应答的评估是通过如下所描述的间接elisa确定血清中的igg1/igg
2a
亚型来进行的。
[0236]
亚类igg elisa
[0237]
重组f蛋白在ph 9.6下的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释，并且将每孔50ng的蛋白质添加到96孔高结合板(50μl/孔，葛莱娜公司)。板在4℃下温育过夜。孔在室温下用150μl的pbs 0.05％tween 20和5％脱脂奶粉(饱和缓冲液)饱和30分钟。将液体从孔中去除，并且将板在室温下用50μl/孔的免疫小鼠血清在饱和缓冲液中以不同稀释度(5倍连续稀释)温育1小时。用pbs 0.05％tween 20洗涤3次后，通过在室温下与50μl的与过氧化物酶缀合的二抗igg1或igg
2a
小鼠特异性抗体温育一小时，然后添加50μl的过氧化物酶底物(tmb，西格玛)。通过添加正磷酸终止比色反应，并利用分光光度计(multiskan)在490nm处测量每个孔的吸光度。
[0238]
图6示出了igg elisa的结果，所述结果通过测试来自用每只小鼠2μg的重组蛋白sf_a1_k_l7(seq id no:6)或sf_a1_mfur(seq id no:53)与不同佐剂组合施用免疫的小鼠的血清获得。无论使用哪种佐剂，两种f蛋白都证明了高igg1/igg
2a
滴度的诱导。
[0239]
图7示出了igg1和igg
2a
滴度的结果，所述结果是在用一种用1:1(v/v)混合的addavax
tm
辅佐的重组f蛋白(2μg)免疫的小鼠中测量的。
[0240]
图8还示出了在用一种用辅佐的重组f蛋白(2μg)进行免疫的小鼠中测量的血清igg1和igg
2a
滴度。尽管存在一些可变性，但数据清楚地表明所有疫苗候选物都具有高度免疫原性并能够引发igg1/igg
2a
抗体。
[0241]
实例5：中和抗体的诱导
[0242]
中和测定
[0243]
简言之，噬斑减少中和测试(prnt)用于确定与对照血清/抗体相比将hmpv病毒噬斑数量减少50％(prnt50)所需的免疫受试者的血清/抗体滴度。prnt50是通过使用可以用hmpv感染的单层细胞进行的。来自受试者的血清被稀释并与活的hmpv病毒一起温育。计数
细胞单层上形成的噬斑，并与病毒在不存在血清或对照抗体的情况下形成的噬斑数量进行比较。prnt50中血清稀释1:10的中和抗体阈值通常被认为是保护的证据(hombach等人2005.《疫苗》23:5205-5211)。
[0244]
prnt方案
[0245]
24孔板在1ml的emem(龙沙公司(lonza))、2mm l-gln(ozyme公司)、5％fbs和1％neaa(ozyme公司)缓冲液下用llc-mk2细胞接种，每孔1.2
×
105个细胞并且在37℃和5％co2下温育24小时。hmpv a1病毒(valneva mvb 1611-009库)稀释到50pfu/62.5μl(每孔)或800pfu/ml。将等体积的病毒和血清稀释液(2
×
62.5μl)组合，并且在37℃下用5％co2温育大约1小时。用pbs洗涤板后，将125μl的病毒/血清混合物添加到每个孔，并且将板在37℃下在振荡下(100rpm)温育2小时。然后，添加225μl/孔的覆盖溶液(emem，2mm gln，0.75％甲基纤维素)，并且将板在37℃用5％co2下温育5天。对于细胞固定，添加225μl/孔的4％pfa/pbs，室温下温育10分钟，并且随后用pbs洗涤3次。对于细胞透化，将0.5ml的pbs、0.5％tween、0.1％bsa添加到每个孔，并且在4℃下温育30分钟。第一抗体(人ds7-pro-2016-003)(0.91μg/ml)在pbs中稀释到5μl/ml最终浓度，并且每孔添加150μl的第一抗体稀释液，并且在37℃下在振荡下温育45分钟。去除第一抗体并用封闭缓冲液洗涤板3次后，添加150μl/孔的经稀释第二抗体-抗人hrp(up783493)，并且将板在37℃下在震荡下温育另外45分钟。然后，去除第二抗体，并且用封闭缓冲液洗涤板3次。对于染色，每孔添加150μl的dab 1x底物。在室温下温育1小时后，在显微镜下手动对细胞计数。
[0246]
图9示出了用在第57天从用重组蛋白sf_a1_k_l7(2μg)在不同佐剂的上下文中免疫的小鼠中收获的血清获得的中和测定的结果。通常，小鼠血清中存在针对测试的f蛋白的中和抗体，不考虑使用的佐剂。
[0247]
在同时测试所有蛋白质候选物的实验中，用addavax
tm
辅佐的l7f_a1_23候选物和用辅佐的l7f_a1_23候选物的ic
50
值最高(参见图10和表5)。独立于所使用的佐剂计算l7f_a1_31候选物的最低ic
50
值。
[0248]
表5.
[0249]
蛋白质seq id noic
50
–
addavaxic
50
–
ic31sf_a1_k-e2945194236536sf_a1_k_l76118325250l7f_a1_4.2993444829l7f_a1_235145923891l7f_a1_3174896409l7f_a1_33862366320
[0250]
图11示出了一项剂量应答研究，用于评估在与addavax
tm
组合接种到小鼠中时的重组f蛋白的免疫原性。与安慰剂组(数据未显示)相比，在用0.06μg到6.0μg的重组f蛋白免疫的小鼠的血清中检测到中和抗体。在构建体之间没有观察到ic
50
的显著差异。
[0251]
实例6：对小鼠的保护
[0252]
病毒噬斑(病灶)免疫染色
[0253]
hmpv病灶定量测定是基于以下中发表的方法开发的：williams等人,2005.《病毒学杂志》79(17):10944-51；williams等人,2007.《病毒学杂志》81(15):8315-24；和cox等人
2012.《病毒学杂志》86(22):12148-60。简言之，将vero细胞或llc-mk2细胞在24孔板中的汇合培养物用50μl/孔的hmpv病毒感染，所述病毒在室温下在存在或不存在稀释于培养基中的小鼠血清的情况下预温育30分钟。小鼠igg
2a ds7单克隆抗体用于检测hmpv。在37℃下吸附病毒两小时时段后，添加含有用2mm l-gln和20到50μg/ml的胰蛋白酶补充的emem培养基的1.5％甲基纤维素覆盖物。在感染后第6天，去除上清液并且用pbs洗涤细胞两次。细胞单层被固定并且用人igg
1 ds7抗体染色。对病灶计数并且计算50％噬斑减少滴度，同时考虑相关的阴性和阳性对照。利用蔡司显微镜使用2.5倍或10倍物镜捕获细胞图像。免疫染色的结果表达为每毫升焦点形成单位或ffu/ml。
[0254]
攻击方案
[0255]
在llc-mk2细胞上生长的hmpv a1和a2分离物用于动物攻击实验。balb/c小鼠在两周间隔内用佐剂重组f蛋白免疫三次，如先前所描述的，并且在免疫后第42天，用大约1
×
106pfu的hmpv对所述小鼠进行鼻内攻击。四到五天后，处死动物，并且取出个体血清样品并冷冻。收集肺组织样品，称重并匀浆以确定病毒滴度。如上文所描述的，肺组织中的病毒载量通过病毒病灶免疫染色确定。可替代地或另外地，rt-qpcr用于确定所收获的组织中的病毒载量。
[0256]
图12展示了在用通过rt-qpcr进行野生型hmpv攻击后用佐剂重组f蛋白免疫的小鼠肺中的病毒rna载量(gce)。在安慰剂组中观察到最高的hmpv rna载量，而在经免疫的小鼠的肺中观察到病毒载量的强烈降低，证明了疫苗候选物的保护。当使用病毒噬斑(病灶)免疫染色时，保护效果更明显。对于所有测试的hmpv f蛋白候选物，与安慰剂组相比，在用不同蛋白质剂量(每只小鼠0.06到6.0μg)免疫的小鼠中观察到病毒载量强烈降低(至多4个对数)，以ffu/ml计算，如图13所示。
[0257]
将显而易见的是，在不脱离所描述的实施例的精神的情况下，所描述的方法或组合物的精确细节可以变化或修改。要求保护落入以下权利要求的范围和精神内的所有此类修改和变化。本技术中描述的所有出版物均通过引用并入本文。
[0258]
序列
[0259]
seq id no:1
[0260]
菌株nl/1/00、血清型基因型a1的天然hmpv f蛋白序列(genbank：aak62968.2)
[0261]
mswkvviifsllitpqhglkesyleescstitegylsvlrtgwytnvftlevgdvenltcadgpslikteldltksalrelrtvsadqlareeqienprqsrfvlgaialgvataaavtagvaiaktirlesevtaiknalkktneavstlgngvrvlatavrelkdfvsknltrainknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgfligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsgkkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtaaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrilssaekgntgfiiviiliavlgstmilvsvfiiikktkkptgappelsgvtnngfiphn
[0262]
seq id no:2
[0263]
菌株nl/1/00、血清型a1的天然hmpv f2结构域序列
[0264]
lkesyleescstitegylsvlrtgwytnvftlevgdvenltcadgpslikteldltksalrelrtvsadqlareeqienprqsr
[0265]
seq id no:3
[0266]
菌株nl/1/00、血清型a1的天然hmpv f1结构域序列
[0267]
fvlgaialgvataaavtagvaiaktirlesevtaiknalkktneavstlgngvrvlatavrelkdfvsknltrainknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgfligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsgkkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtaaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrilssaekgntgfiiviiliavlgstmilvsvfiiikktkkptgappelsgvtnngfiphn
[0268]
seq id no:4
[0269]
异源肽接头
[0270]
cgaga
[0271]
seq id no:5
[0272]
l7f_a1_23蛋白序列
[0273]
mswkvviifsllitpqhglkesyleescstitegylsvlrtgwytnvftlevgdvenltcadgpslikteldltksalrelrtvsadqlareeqieqprqsgcgagatagvaiaktirlesevtaiknalkktneavstlgngvrvlatavrelkdfvsknltrainknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgfligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsekkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtcaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrilsagyipeaprdgqayvrkdgewvllstflgglvprgshhhhhhsawshpqfek
[0274]
seq id no:6
[0275]
sf_a1_k_l7蛋白序列
[0276]
mswkvviifsllitpqhglkesyleescstitegylsvlrtgwytnvftlevgdvenltcadgpslikteldltksalrelrtvsadqlareeqieqprqsgcgagatagvaiaktirlesevtaiknalkktneavstlgngvrvlafavrelkdfvsknltralnknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgfligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsekkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtcaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrilssaesaiggyipeaprdgqayvrkdgewvllstflgglvprgshhhhhhsawshpqfek
[0277]
seq id no:7
[0278]
l7f_a1_31蛋白序列
[0279]
mswkvviifsllitpqhglkesyleescstitegylsvlrtgwytnvfmlevgdvenltcadgpsllkteldltksalrnlrtvsadqlareeqieqprqsgcgagatagvaiaktirlesevtaiknalkktneavstlgngvrvlatmvrelkdfvsknltrainknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgiligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsekkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtcaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrilsagyipeaprdgqayvrkdgewvllstflgglvprgshhhhhhsawshpqfek
[0280]
seq id no:8
[0281]
l7f_a1_33蛋白序列
[0282]
mswkvviifsllitpqhglkesyleescstitegylsvlrtgwytnvfmlcvgdvenltcadgpsllkteldltksalrelrtvsadqlareeqieqprqsgcgagatagvaiaktirlesevtaiknalkktneavstlgngvrvlatmvrelcdfvsknltrainknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgfligvygsdviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsekkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtcaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrccsagyipeaprdgqayvrkdgewvllstflgglvprgshhhhhhsawshpqfek
[0283]
seq id no:9
[0284]
l7f_a1_4.2蛋白序列
[0285]
mswkvviifsllitpqhglkesyleescstitegylsvlrtgwytnvfmlevgdvenltcadgpslikteldltksalrelrtvsadqlareeqieqprqsgcgagatagvaiaktirlesevtawknalkktnevvstlgngvrvlvtmvrelkdfvsknltralnknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgfligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsekkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtcaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrilssaesaiggyipeaprdgqayvrkdgewvllstflgglvprgshhhhhhsawshpqfek
[0286]
seq id no:10
[0287]
来自t4噬菌体的纤维蛋白的三聚化辅助结构域(折叠子)
[0288]
gyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl
[0289]
seq id no:11
[0290]
以gs作为接头的his标签序列
[0291]
gshhhhhh
[0292]
seq id no:12
[0293]
链霉亲和素标签序列
[0294]
sawshpqfek
[0295]
seq id no:13
[0296]
菌株nl/17/00、血清型a2的天然hmpv f蛋白序列(genbank：ay304360.1)
[0297]
mswkvviifsllitpqhglkesyleescstitegylsvlrtgwytnvftlevgdvenltcsdgpslikteldltksalrelktvsadqlareeqienprqsrfvlgaialgvataaavtagvaiaktirlesevtaiknalkttneavstlgngvrvlatavrelkdfvsknltrainknkcdiddlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgiligvygssviytvqlpifgvidtpcwivkaapscsekkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtaaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpikfpedqfnvaldqvfeniensqalvdqsnrilssaekgntgfiiviiliavlgssmilvsifiiikktkkptgappelsgvtnngfiphs
[0298]
seq id no:14
[0299]
菌株can97-83、血清型a2的天然hmpv f蛋白序列(uniprot q6wb98)
[0300]
mswkvviifsllitpqhglkesyleescstitegylsvlrtgwytnvftlevgdvenltcsdgpslikt
eldltksalrelktvsadqlareeqienprqsrfvlgaialgvataaavtagvaiaktirlesevtaiknalkttneavstlgngvrvlatavrelkdfvsknltrainknkcdiddlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgiligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsgkkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtaaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpikfpedqfnvaldqvfeniensqalvdqsnrilssaekgntgfiiviiliavlgssmilvsifiiikktkkptgappelsgvtnngfiphs
[0301]
seq id no:15
[0302]
菌株ncl174、血清型a2的天然hmpv f蛋白序列(uniprot g0zri7)
[0303]
mswkvviifsllitpqhslkesyleescstitegylsvlrtgwytnvftlevgdvenltcadgpslikteldltksalrelkpvsadqlareeqienprqsrfvlgaialgvataaavtagvaiaktirlesevtaiknalkktneavstlgngvrvlatavrelkdfvsknltrainknkcdiddlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptaagqiklmlenramvrrkgfgiligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsekkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtaaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfeniensqalvdqsnrilssaekgntgfiiviiliavlgssmilvsvfiiikktrkptgappelsgvtnngfiphs
[0304]
seq id no:16
[0305]
菌株nl/1/99、血清型b1的天然hmpv f蛋白序列(genbank：ay304361.1)
[0306]
mswkvmiiisllitpqhglkesyleescstitegylsvlrtgwytnvftlevgdvenltctdgpslikteldltksalrelktvsadqlareeqienprqsrfvlgaialgvataaavtagiaiaktirlesevnaikgalkqtneavstlgngvrvlatavrelkefvsknltsainrnkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsymptsagqiklmlenramvrrkgfgiligvygssviymvqlpifgvidtpcwiikaapscsekngnyacllredqgwycknagstvyypnekdcetrgdhvfcdtaaginvaeqsrecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnwvgiikqlpkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpikfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnkilnsaekgntgfiivvilvavlgltmisvsiiiiikktrkptgappelngvtnggfiphs
[0307]
seq id no:17
[0308]
菌株ndl00-1、血清型b1的天然hmpv f蛋白序列(genbank：aak62968.2)
[0309]
mswkvviifsllitpqhglkesyleescstitegylsvlrtgwytnvftlevgdvenltcadgpslikteldltksalrelrtvsadqlareeqienprqsrfvlgaialgvataaavtagvaiaktirlesevtaiknalkktneavstlgngvrvlatavrelkdfvsknltrainknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgfligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsgkkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtaaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrilssaekgntgfiiviiliavlgstmilvsvfiiikktkkptgappelsgvtnngfiphn
[0310]
seq id no:18
[0311]
菌株can98-75、血清型b2的天然hmpv f蛋白序列(uniprot：6wba7)
[0312]
mswkvmiiisllitpqhglkesyleescstitegylsvlrtgwytnvftlevgdvenltctdgpslikteldltksalrelktvsadqlareeqienprqsrfvlgaialgvataaavtagiaiaktirlesevnaikgalkttneavstlgngvrvlatavrelkefvsknltsainknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsymptsagqiklmlenramvrrkgfgiligvygssviymvqlpifgvidtpcwiikaapscsekdgnyacllredqgwycknagstvyypnkkdcetrgdhvfcdtaaginvaeqsrecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlpkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpikfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnkilnsaekgntgfiiviiliavlgltmisvsiiiiikktrkptgappelngvtnggfiphs
[0313]
seq id no:19
[0314]
sf_a1_k_l7编码核苷酸序列，密码子优化
[0315]
atgtcttggaaggtggtcatcatcttctccctgctgatcacccctcagcacggcctgaaagagtcctacctggaagagagctgctccaccatcaccgagggctacctgtctgtgctgagaaccggctggtacaccaacgtgttcaccctggaagtgggcgacgtggaaaacctgacctgtgctgatggccccagcctgatcaagaccgagctggacctgaccaagtctgccctgagagaactgaggaccgtgtctgccgatcagctggccagagaggaacagatcgagcagcctagacagtccggatgtggtgctggtgctacagctggcgtggccattgccaagaccatccggctggaatctgaagtgaccgccatcaagaacgccctgaaaaagaccaacgaggccgtgtctaccctcggcaatggcgttagagtgctggcctttgctgtgcgcgagctgaaggacttcgtgtccaagaacctgaccagggctctgaacaagaacaagtgtgatatcgccgacctgaagatggccgtgtcctttagccagttcaaccggcggttcctgaacgtcgtgcggcagttctctgataacgccggcatcacccctgccatcagcctggatctgatgaccgatgccgagctggctagagccgtgtccaacatgcctacctctgccggccagatcaagctgatgctggaaaacagagccatggtccgacggaaaggcttcggctttctgatcggcgtgtacggctcctccgtgatctacatggtgcagctgcctatcttcggcgtgatcgacaccccttgctggatcgtgaaggccgctcctagctgctctgagaagaagggcaactacgcctgcctgctgagagaggaccaaggctggtactgtcagaacgccggctccaccgtgtactaccccaacgagaaggactgcgagacaagaggcgaccacgtgttctgcgatacctgcgctggcatcaatgtggccgagcagtccaaagagtgcaacatcaacatctccaccaccaactatccctgcaaggtgtccaccggcaggcaccctatttccatggtggctctgtctccactgggcgccctggtggcttgttataagggcgtgtcctgctccatcggctccaacagagtgggcatcatcaagcagctgaacaagggctgcagctacatcaccaaccaggacgccgataccgtgaccatcgacaataccgtgtatcagctgtccaaggtggaaggcgagcagcacgtgatcaagggcagacctgtgtcctccagcttcgaccccgtgaagttccctgaggatcagttcaacgtggccctggaccaggtgttcgagtccatcgagaactctcaggctctggtggaccagtccaaccggatcctgtcctctgccgagtctgctatcggcggctatatccccgaggctcctagagatggccaggcctatgttcggaaggatggcgaatgggtgctgctgtctaccttcctcggaggcctggtgcctagaggctctcaccaccatcatcaccactccgcttggtcccatccacagttcgagaagtga
[0316]
seq id no:20
[0317]
l7f_a1_23编码核苷酸序列，密码子优化
[0318]
atgtcttggaaggtggtcatcatcttctccctgctgatcacccctcagcacggcctgaaagagtcctacctggaagagagctgctccaccatcaccgagggctacctgtctgtgctgagaaccggctggtacaccaacgtgttcaccctggaagtgggcgacgtggaaaacctgacctgtgctgatggccccagcctgatcaagaccgagctggacctgaccaagtctgccctgagagaactgaggaccgtgtctgccgatcagctggccagagaggaacagatcgagcagcctagacagtccggatgtggtgctggtgctacagctggcgtggccattgccaagaccatccggctggaatctgaagtgaccgccatcaagaacgccctgaaaaagaccaacgaggccgtgtctaccctcggcaatggcgttagagtgctggccacagccgtgc
gcgagctgaaggatttcgtgtccaagaacctgaccagggccatcaacaagaacaagtgtgatatcgccgacctgaagatggccgtgtccttcagccagttcaaccggcggttcctgaatgtcgtgcggcagttctctgacaacgccggcatcacccctgccatcagcctggatctgatgaccgatgccgagctggctagagccgtgtccaacatgcctacctctgccggccagatcaagctgatgctggaaaacagagccatggtccgacggaaaggcttcggctttctgatcggcgtgtacggctcctccgtgatctacatggtgcagctgcctatcttcggcgtgatcgacaccccttgctggatcgtgaaggccgctcctagctgctctgagaagaagggcaactacgcctgcctgctgagagaggaccaaggctggtactgtcagaacgccggctccaccgtgtactaccccaacgagaaggactgcgagacaagaggcgaccacgtgttctgcgatacctgcgctggcatcaatgtggccgagcagtccaaagagtgcaacatcaacatctccaccaccaactatccctgcaaggtgtccaccggcaggcaccctatttccatggtggctctgtctccactgggcgccctggtggcttgttataagggcgtgtcctgctccatcggctccaacagagtgggcatcatcaagcagctgaacaagggctgcagctacatcaccaaccaggacgccgataccgtgaccatcgacaataccgtgtatcagctgtccaaggtggaaggcgagcagcacgtgatcaagggcagacctgtgtcctccagcttcgaccccgtgaagttccctgaggatcagttcaacgtggccctggaccaggtgttcgagtccatcgagaactctcaggctctggtggaccagtccaaccggattctgtctgccggctacatccccgaggctcctagagatggacaggcctacgtcagaaaggacggcgaatgggtgctgctgtctacctttctcggaggcctggtgcctagaggctctcaccaccatcatcaccactccgcttggtcccatccacagttcgagaagtga
[0319]
seq id no:21
[0320]
l7f_a1_31编码核苷酸序列，密码子优化
[0321]
atgtcttggaaggtggtcatcatcttctccctgctgatcacccctcagcacggcctgaaagagtcctacctggaagagagctgctccaccatcaccgagggctacctgtctgtgctgagaaccggctggtacaccaacgtgttcatgctggaagtgggcgacgtggaaaacctgacctgtgctgatggccccagcctgctgaaaacagagctggacctgaccaagagcgccctgagaaatctgaggaccgtgtctgccgatcagctggccagagaggaacagatcgagcagcctagacagtccggatgtggtgctggtgctacagctggcgtggccattgccaagaccatccggctggaatctgaagtgaccgccatcaagaatgccctgaaaaagaccaacgaggccgtgtctaccctcggcaatggcgttagagtgctggccacaatggtccgagagctgaaggacttcgtgtccaagaacctgaccagggccatcaacaagaacaagtgtgatatcgccgacctgaagatggccgtgtcctttagccagttcaaccggcggttcctgaacgtcgtgcggcagttctctgataacgccggcatcacccctgccatcagcctggatctgatgaccgatgccgagctggctagagccgtgtccaacatgcctacctctgccggccagatcaagctgatgctcgagaacagagctatggtccgacggaaaggcttcggcatcctgatcggcgtgtacggctcctccgtgatctacatggtgcagctgcctatcttcggcgtgatcgacaccccttgctggatcgtgaaggccgctcctagctgctctgagaagaagggcaactacgcctgcctgctgagagaggaccaaggctggtactgtcagaacgccggctccaccgtgtactaccccaacgagaaggactgcgagacaagaggcgaccacgtgttctgcgatacctgcgctggcatcaatgtggccgagcagtccaaagagtgcaacatcaacatctccaccaccaactatccctgcaaggtgtccaccggcaggcaccctatttccatggtggctctgtctccactgggcgccctggtggcttgttataagggcgtgtcctgctccatcggctccaacagagtgggcatcatcaagcagctgaacaagggctgcagctacatcaccaaccaggacgccgataccgtgaccatcgacaataccgtgtatcagctgtccaaggtggaaggcgagcagcacgtgatcaagggcagacctgtgtcctccagcttcgaccccgtgaagttccctgaggatcagttcaacgtggccctggaccaggtgttcgagtccatcgagaactctcaggctctggtggaccagtccaaccggattctgtctgccggctacatccccgaggctcctagagatggacaggcctacgtcagaaaggacggcgaatgggtgctgctgtctacctttctcggaggcctggtgcctagaggctctcaccaccatcatcaccactccgcttggtcccatcctcagttcgagaagtga
[0322]
seq id no:22
[0323]
l7f_a1_33编码核苷酸序列，密码子优化
[0324]
atgtcttggaaggtggtcatcatcttctccctgctgatcacccctcagcacggcctgaaagagtcctacctggaagagagctgctccaccatcaccgagggctacctgtctgtgctgagaaccggctggtacaccaacgtgttcatgctgtgtgtgggcgacgtggaaaacctgacctgtgctgatggccccagcctgctgaaaacagagctggacctgaccaagagcgccctgagagaactgaggaccgtgtctgcagatcagctggccagagaggaacagatcgagcagcctagacagtccggatgtggtgctggtgctacagctggcgtggccattgccaagaccatccggctggaatctgaagtgaccgccatcaagaatgccctgaaaaagaccaacgaggccgtgtctaccctcggcaatggcgttagagtgctggccacaatggtccgagagctgtgcgacttcgtgtccaagaatctgacccgggccatcaacaagaacaagtgtgatatcgccgacctgaagatggccgtgtccttcagccagttcaaccggcggttcctgaatgtcgtgcggcagttctctgacaacgccggcatcacccctgccatcagcctggatctgatgaccgatgccgagctggctagagccgtgtccaacatgcctacctctgccggccagatcaagctgatgctcgagaacagagctatggtccgacggaaaggcttcggcttcctgatcggcgtgtacggctctgacgtgatctacatggtgcagctgcctatcttcggcgtgatcgacaccccttgctggatcgtgaaggccgctcctagctgctctgagaagaagggcaactacgcctgcctgctgagagaggaccaaggctggtactgtcagaacgccggctccaccgtgtactaccccaacgagaaggactgcgagacaagaggcgaccacgtgttctgcgatacctgcgctggcatcaatgtggccgagcagtccaaagagtgcaacatcaacatctccaccaccaactatccctgcaaggtgtccaccggcagacaccccatttccatggtggctctgtctccactgggtgccctggtggcttgttataagggcgtgtcctgctccatcggctccaacagagtgggcatcatcaagcagctgaacaagggctgcagctacatcaccaaccaggacgccgataccgtgaccatcgacaataccgtgtatcagctgtccaaggtggaaggcgagcagcacgtgatcaagggcagacctgtgtcctccagcttcgaccccgtgaagttccctgaggatcagttcaacgtggccctggaccaggtgttcgagtccatcgagaactctcaggctctggtggaccagtccaacagatgctgttccgccggctacatccccgaggctcctagagatggacaggcctacgtcagaaaggacggcgaatgggtgctgctgtctacctttctcggaggcctggtgcctagaggctctcaccaccatcatcaccactccgcttggtcccatccacagttcgagaagtga
[0325]
seq id no:23
[0326]
l7f_a1_4.2编码核苷酸序列，密码子优化
[0327]
atgtcttggaaggtggtcatcatcttctccctgctgatcacccctcagcacggcctgaaagagtcctacctggaagagagctgctccaccatcaccgagggctacctgtctgtgctgagaaccggctggtacaccaacgtgttcatgctggaagtgggcgacgtggaaaacctgacctgtgctgatggccccagcctgatcaagaccgagctggacctgaccaagtctgccctgagagaactgaggaccgtgtctgccgatcagctggccagagaggaacagatcgagcagcctagacagtccggatgtggtgctggtgctacagctggcgtggccattgccaagaccatccggctggaatctgaagtgaccgcctggaagaacgccctgaaaaagaccaacgaggtggtgtctaccctcggcaacggcgtcagagtgctggtcacaatggtccgagagctgaaggacttcgtgtccaagaacctgaccagggctctgaacaagaacaagtgtgatatcgccgacctgaagatggccgtgtctttcagccagttcaaccggcggttcctgaacgtcgtgcggcagttctctgataacgccggcatcacccctgccatcagcctggatctgatgaccgatgccgagctggctagagccgtgtccaacatgcctacctctgccggccagatcaagctgatgctggaaaacagagccatggtccgacggaaaggcttcggctttctgatcggcgtgtacggctcctccgtgatctacatggtgcagctgcctatcttcggcgtgatcgacaccccttgctggatcgtgaaggccgctcctagctgctctgagaagaagggcaactacgcctgcctgctgagagaggaccaaggctggtactgtcagaacgccggctccaccgtgtactaccccaacgagaaggactgcgagacaagaggcgaccacgtgttctgcgatacctgcgctggcatcaatgtggccgagcagtccaaagagtgcaacatcaacatctccaccaccaactatccctgcaaggtgtccaccggcaggcaccctatttccatggtggctctgtctccactgggcgccctggtggcttgttataagggcgtgtcctgctccatcggct
ccaacagagtgggcatcatcaagcagctgaacaagggctgcagctacatcaccaaccaggacgccgataccgtgaccatcgacaataccgtgtatcagctgtccaaggtggaaggcgagcagcacgtgatcaagggcagacctgtgtcctccagcttcgaccccgtgaagttccctgaggatcagttcaacgtggccctggaccaggtgttcgagtccatcgagaactctcaggctctggtggaccagtccaaccggatcctgtcctctgccgagtctgctatcggcggctatatccccgaggctcctagagatggccaggcctatgttcggaaggatggcgaatgggtgctgctgtctaccttcctcggaggcctggtgcctagaggctctcaccaccatcatcaccactccgcttggtcccatccacagttcgagaagtga
[0328]
seq id no:24
[0329]
sf_a1_k_l7成熟蛋白序列，无纯化标签
[0330]
lkesyleescstitegylsvlrtgwytnvftlevgdvenltcadgpslikteldltksalrelrtvsadqlareeqieqprqsgcgagatagvaiaktirlesevtaiknalkktneavstlgngvrvlafavrelkdfvsknltralnknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgfligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsekkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtcaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrilssaesaiggyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl
[0331]
seq id no:25
[0332]
l7f_a1_23成熟蛋白序列，无纯化标签
[0333]
lkesyleescstitegylsvlrtgwytnvftlevgdvenltcadgpslikteldltksalrelrtvsadqlareeqieqprqsgcgagatagvaiaktirlesevtaiknalkktneavstlgngvrvlatavrelkdfvsknltrainknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgfligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsekkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtcaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrilsagyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl
[0334]
seq id no:26
[0335]
l7f_a1_31成熟蛋白序列，无纯化标签
[0336]
lkesyleescstitegylsvlrtgwytnvfmlevgdvenltcadgpsllkteldltksalrnlrtvsadqlareeqieqprqsgcgagatagvaiaktirlesevtaiknalkktneavstlgngvrvlatmvrelkdfvsknltrainknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgiligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsekkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtcaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrilsagyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl
[0337]
seq id no:27
[0338]
l7f_a1_33成熟蛋白序列，无纯化标签
[0339]
lkesyleescstitegylsvlrtgwytnvfmlcvgdvenltcadgpsllkteldltksalrelrtvsadqlareeqieqprqsgcgagatagvaiaktirlesevtaiknalkktneavstlgngvrvlatmvrelcdfvsknltrainknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgfligvygsdviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsekkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetr
gdhvfcdtcaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrccsagyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl
[0340]
seq id no:28
[0341]
l7f_a1_4.2成熟蛋白序列，无纯化标签
[0342]
lkesyleescstitegylsvlrtgwytnvfmlevgdvenltcadgpslikteldltksalrelrtvsadqlareeqieqprqsgcgagatagvaiaktirlesevtawknalkktnevvstlgngvrvlvtmvrelkdfvsknltralnknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgfligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsekkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtcaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrilssaesaiggyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl
[0343]
seq id no:29
[0344]
折叠子-glyc-1
[0345]
gyipeaprngtayvrkdgewvllstfl
[0346]
seq id no:30
[0347]
折叠子-glyc-2
[0348]
gyipeaprdgqayvrkngtwvllstfl
[0349]
seq id no:31
[0350]
折叠子-glyc-3
[0351]
gyipeaprdgqayvrkdgnwtllstfl
[0352]
seq id no:32
[0353]
折叠子-glyc-4
[0354]
gyipeaprngtayvrkngtwvllstfl
[0355]
seq id no:33
[0356]
折叠子-glyc-5
[0357]
gyipeaprngtayvrkdgnwtllstfl
[0358]
seq id no:34
[0359]
三聚化辅助vsl基序
[0360]
ilsa
[0361]
seq id no:35
[0362]
三聚化辅助vsa基序
[0363]
ccsa
[0364]
seq id no:36
[0365]
cckqtneccknleravsa
[0366]
seq id no:37
[0367]
ccrelkeccknlenavsa
[0368]
seq id no:38
[0369]
ccrelkdccknlenavsa
[0370]
seq id no:39
[0371]
ccrelkdccknleravsa
[0372]
seq id no:40
[0373]
ccrelkdcckqlnkavsa
[0374]
seq id no:41
[0375]
ccrelkecckqlnkavsa
[0376]
seq id no:42
[0377]
凝血酶切割位点
[0378]
lvprgs
[0379]
seq id no:43
[0380]
tev-切割位点
[0381]
enlyfqg
[0382]
seq id no:44
[0383]
因子xa切割位点
[0384]
iegr
[0385]
seq id no:45
[0386]
cckqtneccknleravs
[0387]
seq id no:46
[0388]
cckqtneccknleravs
[0389]
seq id no:47
[0390]
cckqtneccknleravs
[0391]
seq id no:48
[0392]
ccrelkeccknlenavs
[0393]
seq id no:49
[0394]
ccrelkeccknlenavs
[0395]
seq id no:50
[0396]
ccrelkeccknlenavs
[0397]
seq id no:51
[0398]
sf_a1_k-e294蛋白序列，具有取代a113c、a339c、t160f、i177l和三聚化辅助kll
[0399]
mswkvviifsllitpqhglkesyleescstitegylsvlrtgwytnvftlevgdvenltcadgpslikteldltksalrelrtvsadqlareeqienprqsrfvlgaialgvctaaavtagvaiaktirlesevtaiknalkktneavstlgngvrvlafavrelkdfvsknltralnknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgfligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsekkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtacginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrilssaesaiggyipeaprdgqayvrkdgewvllstflgglvprgshhhhhhsawshpqfek
[0400]
seq id no:52
[0401]
sf_a1_k-e294编码核苷酸序列，密码子优化
[0402]
atgtcttggaaggtggtcatcatcttctccctgctgatcacccctcagcacggcctgaaagagtcctacctggaagagagctgctccaccatcaccgagggctacctgtctgtgctgagaaccggctggtacaccaacgtgttcaccctggaagtgggcgacgtggaaaacctgacctgtgctgatggccccagcctgatcaagaccgagctggacctgaccaagtctgccctgagagaactgaggaccgtgtctgccgatcagctggccagagaggaacagatcgagaaccctcggcagtccagattcgtgctgggagctattgctctgggcgtgtgtacagccgctgctgtgacagctggtgtcgctatcgccaagaccatccggctggaatctgaagtgaccgccatcaagaacgccctgaaaaagaccaacgaggccgtgtccacactcggcaatggcgttagagtgctggcctttgctgtgcgcgagctgaaggacttcgtgtccaagaacctgaccagggctctgaacaagaacaagtgtgatatcgccgacctgaagatggccgtgtctttcagccagttcaaccggcggttcctgaacgtcgtgcggcagttctctgataacgccggcatcacccctgccatcagcctggatctgatgaccgatgccgagctggctagagccgtgtctaacatgcctacctctgccggccagatcaagctgatgctggaaaacagagccatggtccgacggaaaggcttcggctttctgatcggcgtgtacggctcctccgtgatctacatggtgcagctgcctatcttcggcgtgatcgacaccccttgctggatcgtgaaggccgctcctagctgctctgagaagaagggcaactacgcctgcctgctgagagaggaccaaggctggtactgtcagaacgccggctccaccgtgtactaccccaacgagaaggactgcgagacaagaggcgaccacgtgttctgcgataccgcctgtggcatcaatgtggccgagcagtccaaagagtgcaacatcaacatctccaccaccaactatccctgcaaggtgtccaccggcaggcaccctatttccatggtggctctgtctccactgggcgccctggtggcttgttataagggcgtgtcctgctccatcggctccaacagagtgggcatcatcaagcagctgaacaagggctgcagctacatcaccaaccaggacgccgataccgtgaccatcgacaataccgtgtatcagctgtccaaggtggaaggcgagcagcacgtgatcaagggcagacctgtgtcctccagcttcgaccccgtgaagttccctgaggatcagttcaacgtggccctggaccaggtgttcgagtccatcgagaactctcaggctctggtggaccagtccaaccggatcctgtcctctgccgagtctgctatcggcggctatatccccgaggctcctagagatggccaggcctatgttcggaaggatggcgaatgggtgctgctgtctaccttcctcggaggcctggtgcctagaggctctcaccaccatcatcaccactccgcttggtcccatccacagttcgagaagtga
[0403]
seq id no:53
[0404]
sf_a1_mfur蛋白序列，其中在位置103到111处缺失氨基酸，用弗林蛋白酶位点kkrkrr和取代g294e替换r102，在融合后构象下稳定
[0405]
mswkvviifsllitpqhglkesyleescstitegylsvlrtgwytnvftlevgdvenltcadgpslikteldltksalrelrtvsadqlareeqienprqskkrkrrvataaavtagvaiaktirlesevtaiknalkktneavstlgngvrvlatavrelkdfvsknltrainknkcdiadlkmavsfsqfnrrflnvvrqfsdnagitpaisldlmtdaelaravsnmptsagqiklmlenramvrrkgfgfligvygssviymvqlpifgvidtpcwivkaapscsekkgnyacllredqgwycqnagstvyypnekdcetrgdhvfcdtaaginvaeqskecninisttnypckvstgrhpismvalsplgalvacykgvscsigsnrvgiikqlnkgcsyitnqdadtvtidntvyqlskvegeqhvikgrpvsssfdpvkfpedqfnvaldqvfesiensqalvdqsnrilssaekgntsgrenlyfqggggsgyipeaprdgqayvrkdgewvllstflggiegrhhhhhh
[0406]
seq id no:54
[0407]
sf_a1_mfur编码核苷酸序列，密码子优化
[0408]
atgtcctggaaggtcgtgatcatcttctccctgctgatcaccccccagcacggcctgaaagagtcctacctggaagagagctgctccaccatcaccgagggctacctgtctgtgctgcggaccggctggtacaccaacgtgttcaccctggaagtgggcgacgtggaaaacctgacctgcgccgatggccccagcctgatcaagaccgagctggacctgaccaagtccgccctgcgggaactgagaaccgtgtctgccgatcagctggccagagaggaacagatcgagaacccccggcag
tccaagaaacggaagcggagagtggccaccgccgctgctgtgacagctggcgtggccattgccaagaccatccggctggaatccgaagtgaccgccatcaagaacgccctgaaaaagaccaacgaggccgtgtctaccctgggcaatggcgtgcgagtgctggctacagctgtgcgcgagctgaaggacttcgtgtccaagaacctgacccgggccatcaacaagaacaagtgtgatatcgccgacctgaagatggccgtgtcctttagccagttcaaccggcggttcctgaacgtcgtgcggcagttctctgacaacgccggcatcacccctgccatctccctggatctgatgaccgacgccgagctggctagagccgtgtccaacatgcctacctctgccggccagatcaagctgatgctggaaaaccgggccatggtgcgacggaagggcttcggctttctgatcggcgtgtacggctcctccgtgatctacatggtgcagctgcctatcttcggcgtgatcgacaccccctgctggatcgtgaaggccgctcctagctgctccgagaagaagggcaactacgcctgcctgctgagagaggaccagggctggtactgtcagaacgccggctccaccgtgtactaccccaacgagaaggactgcgagacacggggcgaccacgtgttctgtgataccgctgctggcatcaacgtggccgagcagtccaaagagtgcaacatcaacatctccaccaccaactacccctgcaaggtgtccaccggcaggcaccccatctctatggtggccctgtctcctctgggcgccctggtggcttgttacaagggcgtgtcctgctccatcggctccaacagagtgggcatcatcaagcagctgaacaagggctgcagctacatcaccaaccaggacgccgacaccgtgaccatcgacaataccgtgtatcagctgtccaaggtggaaggcgagcagcacgtgatcaagggcagacccgtgtcctccagcttcgaccccgtgaagttccccgaggatcagttcaatgtggccctggaccaggtgttcgagtccatcgagaactcccaggctctggtggaccagtccaaccggatcctgtcctctgccgagaagggaaacacctccggcagagagaacctgtattttcaaggcggcggaggctccggctacatccctgaggctcctagagatggccaggcctacgtgcggaaggatggcgaatgggtgctgctgtccaccttcctgggcggcatcgagggcagacaccaccatcatcaccactga