一种重组免疫细胞因子的制剂的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种重组免疫细胞因子的制剂。


背景技术：

2.肿瘤细胞的“免疫逃逸”被认为是肿瘤发生、发展的主要机制。肿瘤的免疫治疗是通过激活机体自身的免疫力来清除肿瘤。重组单克隆抗体药物具备靶向专一、疗效确切等优点，因此，三十年来基于抗体的肿瘤免疫治疗策略已经成为临床上肿瘤治疗的主要策略。
3.根据“肿瘤免疫编辑”理论，肿瘤的疾病进程是一个免疫系统与癌细胞相互作用的动态过程，机体的免疫系统在这其中扮演着清除肿瘤和促进进展的双重作用。在正常生理状态下，机体可以通过启动固有免疫与适应性系统，识别肿瘤特异性抗原，进而发现并清除肿瘤细胞。但是有些肿瘤细胞通过“免疫编辑”等多种方式抵御机体免疫系统的攻击，最终发生肿瘤免疫逃逸。肿瘤免疫逃逸机制包括，肿瘤细胞的抗原调变，树突状细胞抗原递呈能力下降、t细胞应答能力缺失及cd8 t细胞活化受到抑制等。此外，肿瘤细胞还可以通过分泌或表达的免疫抑制因子（如：tgf-β，il-10，ctla-4，pd-1等）适宜肿瘤发生、发展，侵袭的肿瘤微环境。
4.肿瘤的免疫疗法是通过增强机体对癌细胞的识别能力，利用机体自身的免疫能力对肿瘤进行清除。与手术、化疗、放疗等传统疗法相比，肿瘤免疫疗法具有肿瘤靶向性好、疗效持久，临床副作用小等优点。目前，应用于临床的肿瘤免疫疗法主要有：细胞疗法（provengetm）、细胞因子（il-2，ifn-α等）和治疗性单克隆抗体药物。这其中，重组单克隆抗体药物具备靶向专一、疗效确切等优点，应用最为广泛。然而由于癌症患者体内基因变异性强、癌细胞免疫逃避往往存在多重途径等原因，现有的抗体药物为基础的免疫疗法对晚期转移性实体瘤的有效率大约30-50%，虽然显著高于化疗，但是对大多数患者来说仍然不甚理想。
5.通过基因重组技术制备的可同时结合两个不同靶点的融合蛋白（双特异性抗体或双功能融合蛋白）是具有新一代分子结构的免疫治疗药物，通过巧妙的设计可实现新的或更佳的药理功能，如可以起到标记肿瘤细胞和招募免疫细胞的双重作用，或者同时调控两个信号途径的协同杀灭肿瘤细胞，预期具有更高的有效率和更好的病情改善效果，弥补了单靶点免疫治疗药物的不足。
[0006]“一种靶向pd-l1与il-2受体的重组免疫细胞因子”（简称bipi，专利申请号cn201610878334.8）是将白细胞介素2融合表达于抗pd-l1抗体重链c端的重组蛋白，既能与pd-l1分子结合，也能与il-2受体（il-2r）结合。
[0007]
pd-l1（programmed cell death 1 ligand 1，细胞程序性死亡配体1）也称为表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274，cd274）或b7同源体1（b7 homolog 1，b7-h1），是大小为40kda 的跨膜蛋白，是pd-1（programmed cell death protein 1）的2个配体之一，在心脏、骨骼肌、胎盘、肺中高表达，在胸腺、脾、肾、肝中低表达，在活化的t细胞、b细胞、树突状细胞等免疫细胞中也有表达，并广泛表达于多种肿瘤细胞上。pd-l1与pd-1结
合后可以传导免疫抑制性信号、减低t细胞的增生，这一“免疫检查点”（immune checkpoints）机制可被癌细胞利用实现免疫逃逸，因此pd-1和pd-l1成为癌症免疫治疗的靶标。
[0008]
il-2（interleukin-2，白细胞介素2）是趋化因子家族的一种细胞因子，主要由t细胞（特别是cd4

t细胞）受抗原或丝裂原刺激后合成；b细胞、nk细胞及单核－巨噬细胞也能产生il-2。il-2的靶细胞包括t细胞、nk细胞、b细胞及单核－巨噬细胞等，这些细胞表面均可表达il-2受体（il-2r）。il-2的生物学活性包括刺激t细胞生长、诱导细胞毒作用，此外还有促进b细胞的生长、分化，增强单核-巨噬细胞的抗原递呈能力、杀菌力、细胞毒性等作用。然而il-2广泛应用最大的限制是以高血压和发热为特点的血管渗漏综合征这一严重不良反应，以及只有5～7分钟的半衰期；另外一个缺点是它广泛与表达在免疫细胞上的受体结合，使调节性t细胞（treg）扩增，而阻碍机体的抗癌免疫。
[0009]
靶向pd-l1与il-2受体的重组免疫细胞因子bipi利用抗pd-l1抗体封锁pd-1/pd-l1信号通路，激活t细胞自体免疫；另一方面与il-2融合赋予il-2靶向性，使il-2更多募集于肿瘤部位，使机体适应性免疫和固有免疫相结合，加大抑瘤效果。
[0010]
然而这种双靶点药物具有独特的结构，要充分发挥作用，需要保证在制剂中药物分子的两个构成部分（抗pd-l1抗体及其c端融合表达的il-2）都稳定保持良好的生物学活性，需要有针对性的研究制剂配方以达到最优的效果。


技术实现要素：

[0011]
为了提高“一种靶向pd-l1与il-2受体的重组免疫细胞因子”（简称bipi，专利申请号cn201610878334.8）在储存中的稳定性、延长保质期，本发明提供了一种制剂配方，技术方案如下：所述的bipi蛋白具有seq id no: 1的轻链序列和seq id no:2的重链序列，轻链和重链两条肽链之间通过二硫键链接。
[0012]
所述的制剂配方包括以下剂量或浓度的bipi蛋白和辅料：bipi，20 mg/ml～50 mg/ml；组氨酸，1.55
±
0.5 mg/ml；聚山梨酯80（peg80），0.1
±
0.01 mg/ml；海藻糖，50
±
5 mg/ml；盐酸，调溶液ph至6.0
±
0.3。
[0013]
更具体而言，所述的制剂配方包括以下剂量或浓度的bipi蛋白和辅料：bipi，50 mg/ml；组氨酸，1.55 mg/ml；peg80，0.1 mg/ml；海藻糖，50 mg/ml；盐酸，调溶液ph至6.0。
[0014]
所使用的溶剂是水，应达到注射用水的质量标准。
[0015]
所述的辅料组氨酸、聚山梨酯80、海藻糖、盐酸等的质量和生产过程应符合行政机构对药用辅料的要求，达到中国药典规定的质量标准。
[0016]
所述的制剂配方适用于静脉注射的给药方式。
[0017]
本发明的有益效果是，能够显著提高bipi蛋白在20～50 mg/ml浓度下的储存的稳定性，减少储存过程中聚集体和电荷异质体的产生。
附图说明
[0018]
图1 储存后的bipi重组蛋白的双特异性结合能力的检测结果。
具体实施方式
[0019]
实施例1、一种靶向pd-l1与il-2受体的重组免疫细胞因子的制剂配方将“一种靶向pd-l1与il-2受体的重组免疫细胞因子”（简称bipi，专利申请号cn201610878334.8）溶解于表1所示配方的溶液中，形成注射液制剂，用于静脉注射。
[0020]
表1 bipi的制剂配方组分终浓度浓度单位bipi50mg/ml组氨酸1.55mg/mlpeg800.1mg/ml海藻糖50mg/mlhcl调溶液ph至6.0 该制剂配方的实现方法：将含有bipi的细胞培养液通过一系列层析、过滤等步骤进行纯化、除病毒后，将获得的含有目的蛋白的溶液浓缩，然后透析、稀释，配制入按照上述配方配置的缓冲液中。
[0021]
实施例2、不同缓冲液和ph对目的蛋白稳定性的影响将bipi蛋白分别以20 mg/ml的浓度溶解于不同ph的20 mm磷酸盐缓冲液（pbs）、柠檬酸盐缓冲液（cbs）、醋酸缓冲液（abs）、组氨酸缓冲液（hbs）中，在45℃放置28天，然后分别用反相层析（rp-hplc）、分子排阻层析（se-hplc）、阳离子交换层析（cex-hplc）分析溶液中的蛋白分布情况，并以未经45℃温育的初始样品作为对照，分析结果列示在表2。
[0022]
表2 不同缓冲液对bipi重组蛋白稳定性的影响
结果表明，从聚集体和电荷异质体形成情况来看，使用ph6.0的20 mm组氨酸缓冲液最有利于bipi重组蛋白的稳定。
[0023]
为了进一步优化缓冲液的浓度，分别采用20 mm、10 mm、5 mm的ph6.0组氨酸缓冲液重复上述分析步骤，分析结果见表3。
[0024]
表3 不同组氨酸缓冲液对bipi重组蛋白稳定性的影响结果表明，20 mm和10 mm浓度有相似的结果，而5 mm浓度的结果显著降低，因此选择10 mm的ph6.0组氨酸缓冲液作为bipi重组蛋白制剂的缓冲液。
[0025]
实施例3、不同表面活性剂对目的蛋白稳定性的影响将bipi蛋白分别以50 mg/ml的浓度溶解于添加不同浓度聚山梨酯20（peg20）、聚山梨酯80（peg80）的10 mm的ph6.0组氨酸缓冲液中，在45℃放置28天，然后分别用反相层析（rp-hplc）、分子排阻层析（se-hplc）、阳离子交换层析（cex-hplc）分析溶液中的蛋白分布情况，并分别以未经45℃温育的初始样品和未添加聚山梨酯的样品作为对照，分析结果列示在表
4。
[0026]
表4 不同表面活性剂对bipi重组蛋白稳定性的影响上表中peg20、peg80的浓度单位为mg/ml。
[0027]
结果表明添加peg20、peg80等非离子型表面活性剂有助于增强bipi在50 mg/ml浓度下的稳定性，但是不同浓度peg20、peg80的效果并无显著差别，因此选择0.1 mg/ml聚山梨酯80（peg80）作为制剂组分。
[0028]
实施例4、不同糖类对目的蛋白稳定性的影响将bipi蛋白分别以50 mg/ml的浓度溶解于添加不同浓度糖类和0.1 mg/ml聚山梨酯80的10 mm、ph6.0组氨酸缓冲液中，在45℃放置28天，然后分别用反相层析（rp-hplc）、分子排阻层析（se-hplc）、阳离子交换层析（cex-hplc）分析溶液中的蛋白分布情况，并分别以未经45℃温育的初始样品和未添加糖类的样品作为对照，分析结果列示在表5。
[0029]
表5 不同糖类对bipi重组蛋白稳定性的影响结果表明添加海藻糖对bipi的稳定性改善最强，但是10%、5%浓度的海藻糖的效果并无
显著差别，因此选择5%（相当于50 mg/ml）海藻糖作为制剂组分。
[0030]
实施例5、bipi重组蛋白制剂在不同储存温度稳定性的检测将bipi蛋白按照实施例1所述的配方和方法制成制剂，然后在-80℃、-20℃、4℃、25℃的条件下分别储存6个月，取出后分别用反相层析（rp-hplc）、分子排阻层析（se-hplc）、阳离子交换层析（cex-hplc）分析溶液中的蛋白分布情况，分析结果列示在表6表6 bipi重组蛋白制剂在不同储存温度稳定性的检测结果表明该制剂在-80℃、-20℃、4℃的条件下储存6个月分子的分布基本无变化，se-hplc分析蛋白纯度仍在95%以上，聚集体、酸性峰、碱性峰比例无明显变化。但在25℃条件下储存6个月分子的分布略有值得关注的变化。
[0031]
实施例6、流式细胞术检测储存后的bipi重组蛋白的双特异性结合能力将实施例5中在-80℃、-20℃、4℃、25℃的条件下储存6个月的bipi样品按下面的方法进行流式细胞术的检测：(1) 将生长状态良好的ct26细胞（小鼠结肠癌细胞）收集到15 ml离心管中，1000 rpm，离心5分钟， 倒掉上层培养液，将细胞用含有1% fbs 的pbs 溶液重悬；(2) 对细胞进行计数，并以2
×
106个细胞/管的量加入流式管中，每管100 μl，设置三复孔；(3) 将bipi和igg分别以10 μg/ml的浓度起始稀释，2倍比稀释，每组三复孔，共稀释12个浓度，将100 μl稀释后的实验药物和对照分别垂直加入流式管，震荡3秒，使细胞和抗体充分混合，用锡箔纸盖住，置于4 ℃冰箱1小时；(4) 将流式管1000 rpm离心5 min，迅速倾倒出上层液体，勿震荡以免管底部的细胞损失，之后以200 μl/管的体积加入含1% fbs的pbs溶液， 震荡混匀后再次离心，重复该步骤2次，洗去细胞表面未结合的抗体；(5) 加入pe标记的兔抗人il-2二抗（1:300稀释），100 μl/管加入流式管，震荡混匀，于4 ℃避光孵育45 min；(6) 重复步骤(4)，洗涤细胞2次后，用200 μl含1% fbs的pbs溶液重悬细胞，震荡混匀后上机检测荧光读数，然后将荧光读数对bipi浓度作图（见图1）。
[0032]
通过曲线分析，在-80℃、-20℃、4℃、25℃的条件下储存6个月的bipi样品的ec50分别为0.486 mg/ml、0.501 mg/ml、0.522 mg/ml、0.619 mg/ml，说明在使用实施例1所列配方后bipi蛋白在-20℃至4℃的低温储存过程中很好的保存了抗pd-l1和il-2的结合活性。