使用交变电场提高细胞膜通透性的制作方法

使用交变电场提高细胞膜通透性
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求美国临时申请62/693,811(2018年7月3日提交)、62/728,255(2018年9月7日提交)和62/795,136(2019年1月22日提交)的权益，这些申请的中的每一个均通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.使用交变电场治疗胶质母细胞瘤(gbm)是一种新颖且经过验证的疗法，其已成为抗癌治疗的附加物理疗法(术后放化疗)。已对中频交变电场(100-500khz)进行了详细研究。最近，已显示ttfields可延长维持替莫唑胺(temozolomide)化疗的胶质母细胞瘤患者的中位生存期(延长5个月)。在治疗肿瘤的情况下，这些频率下的交变电场通常称为“肿瘤治疗场”或“ttfields”。
4.关于ttfields的机制存在许多假说，但ttfields抗癌作用的最广泛提出的(“标准”)机制集中于微管蛋白亚基具有内在偶极矩的性质。通过外源性强加200khz ttfields，迫使微管结构沿交变电场线排列，通过干扰支持有丝分裂纺锤体的细胞骨架，破坏主动分裂细胞的功能。此类应力最终促进受损的细胞增殖。概念实验验证和相关技术发展在过去十年中出现，最终由美国食品和药物管理局(fda)批准用于治疗复发性和新诊断的胶质母细胞瘤的商业化临床ttfields装置(novocure公司)。
5.在过去的几年中，关于作用机制的更多细节已有报告。例如，已显示ttfields会破坏隔膜蛋白(在细胞分裂期间负责锚定有丝分裂纺锤体的细胞内蛋白质)的定位，从而干扰有丝分裂。一些小组报告化疗或放疗联合ttfields引起的dna损伤延长，而另一些小组则表明通过线粒体基质的溶胀对线粒体功能的影响。其他小组探讨了gbm患者的化疗(如替莫唑胺)与ttfields的联合治疗。对联合干预的此类研究揭示针对胶质母细胞瘤的其他有希望的影响。


技术实现要素：

6.本发明的一个方面涉及用于将物质递送穿过细胞的细胞膜的第一方法。第一方法包括将交变电场施加到细胞达一段时间，其中施加交变电场提高细胞膜的通透性；以及将物质引入细胞附近，其中细胞膜的提高的通透性使物质能够穿过细胞膜。
7.在第一方法的一些情况下，细胞是癌细胞。在第一方法的一些情况下，细胞是胶质母细胞瘤细胞。在第一方法的一些情况下，以约200khz的频率施加交变电场。在第一方法的一些情况下，交变电场以50至190khz之间的频率施加。在第一方法的一些情况下，交变电场以210至400khz之间的频率施加。在第一方法的一些情况下，交变电场的场强为至少1v/cm。
8.在第一方法的一些情况下，细胞处于活体受试者的的身体内，通过向受试者的身体施加电场而将交变电场施加到细胞，并且引入包括向受试者施用物质。在这些情况下，细胞可为癌细胞。在这些情况下，细胞可为胶质母细胞瘤细胞。在这些情况下，交变电场的频率可在50至190khz之间。在这些情况下，交变电场的频率可在210至400khz之间。在这些情
况下，交变电场的场强可为至少1v/cm rms。在这些情况下，交变电场的场强可在1至4v/cm rms之间。在这些情况下，引入物质的步骤可在给定时间开始，且施加交变电场的步骤在给定时间之后至少12小时结束。在这些情况下，施加交变电场的步骤可在给定时间之前至少一小时开始。在这些情况下，物质的分子量可为至少1.2kda。在这些情况下，物质的分子量可为至少4kda。在这些情况下，物质的分子量可为至少20kda。在这些情况下，物质可具有至少一种通常阻碍物质穿过细胞膜的特性。在这些情况下，细胞可为对使用物质的治疗具有天然抗性的癌细胞。在这些情况下，细胞可包括细菌，并且物质包括抗生素。
9.本发明的另一方面涉及用于攻击癌细胞的第二方法。第二方法包括第一频率下的第一交变电场施加到癌细胞达第一时间段，其中将第一频率下的第一交变电场施加到癌细胞达第一时间段提高癌细胞的细胞膜的通透性；将物质引入癌细胞，其中细胞膜的提高的通透性使物质能够穿过细胞膜；以及将第二频率下的第二交变电场施加到癌细胞达第二时间段，其中第二频率不同于第一频率，并且其中第二频率下的第二交变电场降低癌细胞的生存力。
10.在第二方法的一些情况下，癌细胞包括胶质母细胞瘤细胞，第一频率在250khz至350khz之间，并且第二频率在150khz至250khz之间。在第二方法的一些情况下，癌细胞包括子宫肉瘤细胞，第一频率在125khz至175khz之间，并且第二频率在75khz至125khz之间。在第二方法的一些情况下，癌细胞包括乳腺癌细胞，第一频率在75khz至175khz之间，并且第二频率在100khz至300khz之间。在第二方法的一些情况下，引入物质的步骤在给定时间开始，施加第一交变电场的步骤在给定时间之后至少12小时结束。在第二方法的一些情况下，施加第一交变电场的步骤至少在给定时间之前一小时开始。在第二方法的一些情况下，第二时间段包括多个不连续的时间间隔，在该时间间隔期间，将第二频率下的第二交变电场施加到癌细胞，其中多个不连续的时间间隔总计至少一周。
11.在第二方法的一些情况下，癌细胞处于活体受试者的的身体内，通过向受试者的身体施加第一交变电场而将第一交变电场施加到癌细胞，通过向受试者的身体施加第二交变电场而将第二交变电场施加到癌细胞，并且引入包括向受试者施用物质。在第二方法的一些情况下，第一交变电场的场强为至少1v/cm rms。在第二方法的一些情况下，物质的分子量为至少1.2kda。在第二方法的一些情况下，物质的分子量为至少4kda。在第二方法的一些情况下，物质的分子量为至少20kda。
12.本发明的另一方面涉及用于治疗受试者的身体内的肿瘤并将物质递送穿过受试者的身体内的细胞膜的第三方法。第三方法包括将第一频率下的第一交变电场施加到受试者的身体达第一时间段，其中将第一频率下的第一交变电场施加到受试者的身体达第一时间段提高受试者的身体内的细胞膜的通透性；将物质施用到受试者，其中细胞膜的提高的通透性使物质能够穿过细胞膜；以及将第二频率下的第二交变电场施加到受试者的身体达至少一周长的第二时间段，其中第二频率不同于第一频率，并且其中第二频率下的第二交变电场抑制肿瘤的生长。
13.在第三方法的一些情况下，肿瘤包括受试者大脑中的胶质母细胞瘤，第一频率在250khz至350khz之间，并且第二频率在150khz至250khz之间。在第三方法的一些情况下，第二时间段包括多个不连续的时间间隔，在该时间间隔期间，将第二频率下的第二交变电场施加到受试者的身体，其中多个不连续的时间间隔总计至少一周。在第三方法的一些情况
下，施用物质的步骤在给定时间开始，并且施加第一交变电场的步骤在给定时间之后至少12小时结束。在第三方法的一些情况下，施加第一交变电场的步骤至少在给定时间之前一小时开始。
14.在第三方法的一些情况下，物质的分子量为至少1.2kda。在第三方法的一些情况下，物质的分子量为至少4kda。在第三方法的一些情况下，物质的分子量为至少20kda。
15.本发明的另一方面涉及用于治疗受试者的身体内的肿瘤并促进物质递送穿过受试者的身体内的细胞膜的第一装置。第一装置包括能够在50至500khz之间的第一频率和50至500khz之间的第二频率下工作的交流电压发生器。其中第二频率不同于第一频率。交流电压发生器具有控制输入端，并且交流电压发生器被配置为当控制输入端处于第一状态时输出第一频率，并且当控制输入端处于第二状态时输出第二频率。第一装置还包括控制器，该控制器被编程为(a)将控制输入端置于第二状态，使得交流电压发生器输出第二频率，(b)接受切换到第一频率的请求，(c)在接收到请求之后，将控制输入端置于第一状态，使得交流电压发生器输出第一频率达一段时间间隔，以及(d)在经过该时间间隔之后，将控制输入端置于第二状态，使得交流电压发生器输出第二频率。
16.第一装置的一些实施例还包括电极组，该电极组被配置为附着到受试者的身体；和导线，该导线将交流电压发生器的输出端连接到电极组。
17.在第一装置的一些实施例中，第一频率在250khz至350khz之间，并且第二频率在150khz至250khz之间。在第一装置的一些实施例中，第一频率在125khz至175khz之间，并且第二频率在75khz至125khz之间。在第一装置的一些实施例中，第一频率在75khz至175khz之间，并且第二频率在100khz至300khz之间。在第一装置的一些实施例中，时间间隔为至少12小时。在第一装置的一些实施例中，时间间隔在12至72小时之间。在第一装置的一些实施例中，控制器还被编程为在接收到请求之后，在第一状态和第二状态之间来回切换控制输入端。
18.在第一装置的一些实施例中，交流电压发生器能够在50khz至500khz之间的至少一个附加频率下工作，并且交流电压发生器被配置为当控制输入端处于至少一个附加状态时输出至少一个附加频率，并且控制器被编程为在接收到请求之前使控制输入端循环通过第二状态和至少一个附加状态，并且在经过该时间间隔之后使控制输入端循环通过第二状态和至少一个附加状态。
19.第一装置的一些实施例还包括用户界面，并且请求经由用户界面被接受。在第一装置的一些实施例中，请求经由rf被接受。
附图说明
20.图1是显示ttfields对调节细胞膜的完整性并因此调节细胞膜的通透性的替代影响的示意图。
21.图2a通过生物发光成像扫描来描绘ttfields对u87-mg/egfp-fluc细胞的生物发光的示例性影响，其作为ttfields与无ttfields条件下时间的函数。
22.图2b描绘ttfields对u87-mg/egfp-fluc细胞的egfp荧光的示例性影响，其作为ttfields与无ttfields条件下时间的函数。
23.图2c描绘ttfields对u87-mg/egfp fluc细胞的fluc生物发光(fluc-bli)与egfp
荧光(egfp-fl)比率的影响，其作为ttfields暴露长度的函数。
24.图2d描绘ttfields暴露与未暴露对fluc-bli/egfp-fl比率的影响，其作为ttfields暴露时间的函数。
25.图3a描绘在无ttfields和存在ttfields(200khz)下的ttfields对u87-mg/egfp-fluc细胞中的乙锭d的时间依赖性摄取的示例性影响。
26.图3b-3d分别描绘ttfields与无ttfields条件对4kda葡聚糖-fitc、20kda葡聚糖-fitc和50kda葡聚糖-fitc的葡聚糖-fitc摄取的时间进程的示例性影响。
27.图4a描绘ttfields(200khz)对5-氨基乙酰丙酸(5-ala)摄取的示例性影响，如ttfields与无ttfields暴露的u87-mg细胞在6和24小时的代表性原卟啉ix(ppix)荧光所示。
28.图4b描绘在经受ttfields的共培养平台中，胶质母细胞瘤与成纤维细胞中ppix荧光如何随时间变化。
29.图5提供通过暴露于ttfields和未暴露于ttfields 3天的u87-mg/egfp-fluc细胞中的质膜孔的sem比较来定量孔的数量和大小。
30.图6提供通过暴露于ttfields和未暴露于ttfields 3天的正常人pcs-201细胞中的质膜孔的sem比较来定量孔的数量和大小。
31.图7a-7c分别描绘显示交变电场如何可逆地提高u87-mg细胞对d-荧光素、5-ala和葡聚糖-fitc(4kda)的摄取的实验的结果。
32.图7d描绘显示通过向u87-mg细胞施加ttfields而诱导的通透性的定时特性的实验的结果。
33.图8a描绘显示交变电场如何影响mda-mb-435细胞膜对7-aad的通透性的实验的结果。
34.图8b描绘显示交变电场如何影响mda-mb-435和mda-mb-435阿霉素抗性细胞膜对阿霉素的通透性的实验的结果。
35.图8c描绘显示交变电场如何影响mcf-7和mcf-7米托蒽醌抗性细胞膜对米托蒽醌的通透性的实验的结果。
36.图9a-9g描绘ttfields对七种不同物质组合和对应细胞类型的敏感性的影响。
37.图10a和图10b分别描绘施加交变电场和将物质引入癌细胞附近之间的适当定时关系。
38.图11a描绘用于确定对u-87 mg细胞提供最高水平的细胞毒性的频率的实验的结果。
39.图11b描绘用于确定提供u-87 mg细胞的细胞膜的通透性的最大提高的频率的实验的结果。
40.图12a描绘用于确定对mes-sa细胞提供最高水平的细胞毒性的频率的实验的结果。
41.图12b描绘用于确定提供mes-sa细胞的细胞膜的通透性的最大提高的频率的实验的结果。
42.图12c描绘用于确定150khz交变电场如何影响mes-sa细胞的细胞膜对阿霉素的通透性的实验的结果。
43.图13a描绘用于确定对mcf-7细胞提供最高水平的细胞毒性的频率的实验的结果。
44.图13b描绘用于确定提供mcf-7细胞的细胞膜的通透性的最大提高的频率的实验的结果。
45.图14描绘用于确定提供gbm39/luc细胞的细胞膜的通透性的最大提高的频率的实验的结果。
46.图15是双频装置的框图，该装置产生用于诱导细胞通透性的第一频率和用于诱导细胞毒性的第二频率。
47.下面参考附图详细描述各种实施例，其中相似的附图标记表示相似的元件。
具体实施方式
48.如本文所用，术语“降低细胞生存力”是指降低细胞的生长、增殖或存活，或提高细胞的细胞毒性。
49.本技术描述新颖方法，该方法使用交变电场临时提高癌细胞的质细胞膜的通透性，使得通常被细胞膜阻止的物质能够穿过细胞膜，或者使得通常被细胞膜阻碍的物质将能够更容易穿过细胞膜。在本文所述的示例中的一些中，此方法用于使用交变电场临时提高胶质母细胞瘤质细胞膜的通透性，使得通常被胶质母细胞瘤细胞膜阻碍的物质将能够更容易地穿过胶质母细胞瘤细胞膜。
50.发明人已证明，ttfields治疗结合新型抗癌化合物醉茄素a协同抑制人胶质母细胞瘤细胞的生长。发明人假设此类协同作用是由于通过ttfields瞬时提高肿瘤细胞膜通透性的能力，醉茄素a对胶质母细胞瘤细胞的可及性提高，如图1示意性所示。在此图中，5-ala＝5-氨基乙酰丙酸；乙锭d＝溴化乙锭；且fitc＝异硫氰酸荧光素酶。
51.然后进行验证假设的研究。特别是，发现证据表明，ttfields暴露在经修饰以表达荧光素酶(海肾和萤火虫)的人胶质母细胞瘤细胞中诱导出更大的生物发光，并且这种诱导是由于底物(分别为d-荧光素和腔肠素)通过质膜的通透性提高。用其他膜渗透试剂(诸如葡聚糖-fitc和乙锭d)也证明ttfields暴露引起的膜通透性提高。
52.使用5-氨基乙酰丙酸(5-ala)也显示使用ttfields提高胶质母细胞瘤细胞的膜通透性。5-ala是血红蛋白前体，其在所有哺乳动物细胞中转化为荧光原卟啉ix(ppix)。然而，许多恶性细胞(包括高级胶质瘤)的血红蛋白生物合成升高，这反映在转化细胞和组织内ppix的积累增强(与非癌细胞相比)。这一性质促使许多医学研究使用5-ala摄取(并由此的其酶转化成的ppix)作为肿瘤细胞的荧光生物标志物。然而，在当前的技术水平上，可难以在术中区分肿瘤和非肿瘤组织之间的精确细胞边界。本文所述的实验表明，ttfields显著增强针对ppix荧光(由5-ala暴露和摄取带来)的肿瘤与正常细胞的比率，并且以这种方式，可用于在术中更好地划定肿瘤边界。
53.使用扫描电子显微镜(sem)数据的进一步实验证明，由ttfields暴露引起的胶质母细胞瘤细胞膜中孔的数量和大小增加，以及当施加ttfields时，胶质母细胞瘤细胞膜的形态受到干扰。通过研究的所有方式(生物发光、荧光和sem)，发现ttfields对gbm细胞膜通透性的影响在停止ttfields暴露之后是可逆的。
54.结果
55.ttfields的诱导提高表达荧光素酶的胶质母细胞瘤的生物发光(bli)。
56.将u87-mg/egfp-fluc细胞接种在thermanox玻璃盖玻片上，允许其固定并生长，然后使其经受ttfields或无ttfields。在此实验中，与未暴露条件相比，使用ttfields(4v/cm，200khz，0.5-24小时持续时间)显著提高u87-mg/egfp-fluc细胞的生物发光强度(bli)。bli的此提高最早发生在ttfields开始之后30分钟，并持续到ttfields暴露24小时。当进行roi定量时，ttfields暴露样品的bli强度的时间进程与ttfields-未暴露样品相比显著提高(p《0.0001，双因素方差分析，ttfields与无ttfields)。描绘这些实验的bli结果的时间量化的数据汇总在图2a中。不受此理论的束缚，据信生物发光的升高不是由于ttfields对萤火虫荧光素酶活性的直接影响，因为纯化萤火虫萤光素酶暴露于200khz ttfields致使ttfields启动之后60分钟酶活性损失超过1000倍。
57.图2b描绘从ttfields暴露与ttfields未暴露的u87-mg/egfp-fluc的代表性图像(未显示)的时间进程中观察到的ttfields对u87-mg/egfp-fluc细胞中egfp荧光的影响。在整个实验过程中，ttfields的存在并未显著提高egfp荧光(egfp-fl)。当在ttfields与无ttfields样品之间比较bli与egfp-fl的比率时，对于ttfields样品，相对于ttfields温育时间的比率显著增加，如图2c、图2d所示(p《0.0001，双因素方差分析，ttfields与无ttfields)。更具体地，图2c描绘ttfields对u87-mg/egfp-fluc细胞的fluc生物发光(fluc-bli)与egfp荧光(egfp-fl)比率的影响，其作为ttfields暴露的长度的函数；以及图2d描绘ttfields暴露与未暴露对fluc-bli/egfp-fl比率的影响，其作为ttfields暴露时间(小时)的函数。与无ttfields相比，ttfields显著降低纯化萤火虫荧光素酶的活性(p《0.01，双因素方差分析，ttfields与无ttfields)。
58.当与无ttfields对照相比时，随时间的推移在另一种源自患者的胶质母细胞瘤细胞系gbm2/gfp-fluc上施加ttfields还诱导ttfields暴露的gbm2/gfp-fluc细胞中生物发光的时间依赖性提高(p《0.0001，双因素方差分析，ttfields与无ttfields)。在经基因修饰以表达海肾荧光素酶-红色荧光蛋白融合蛋白的鼠星形细胞瘤细胞系(kr158b)中也观察到相同的效果(p《0.0001，双因素方差分析，ttfields与无ttfields)。海肾荧光素酶活性不依赖于atp和镁(与萤火虫荧光素酶相反)。因此，据信ttfields对生物发光的诱导不是由于内源性atp库的改变。
59.ttfields对膜相关联试剂摄取的影响。
60.为了测试强加ttfields是否影响细胞膜性质，从而影响膜的通透性，测定ttfields对结合到细胞膜的荧光标记试剂的行为的影响。最初，测量ttfields对膜联蛋白-v-apc与u87-mg/egfp-fluc细胞的膜结合的影响。膜联蛋白-v-apc结合是早期细胞凋亡的标志，其特征在于膜的皱曲。细胞凋亡的正向控制(向u87-mg/egfp-fluc细胞添加21μm醉茄素a)用于评估膜联蛋白-v-apc与u87-mg/egfp-fluc细胞结合的可见性，并显示此类结合可经由荧光显微镜在ttfields未暴露样品上观察到。然而，当将ttfields施加到u87-mg/egfp-fluc细胞时，在暴露于ttfields的任何时间点均未观察到膜联蛋白-v-apc结合。因此看来，ttfields没有诱导在u87-mg细胞中的任何显著程度的凋亡。
61.值得注意的是，当u87-mg/egfp-fluc细胞经受200khz ttfields时，乙锭d的摄取显著提高，如图3a所示(p《0.0001，双因素方差分析，ttfields与无ttfields)。乙锭d穿透质膜和核膜，并嵌入基因组dna。因此，这些发现表明，ttfields可对u87-mg/egfp-fluc细胞中质膜的通透性产生影响。
62.由ttfields增强的膜通透性的另一个结果是改变葡聚糖fitc在细胞膜上的结合。已知葡聚糖-fitc结合并嵌入质膜中。当u87-mg细胞经受200khz ttfields达1小时的情况下，与无ttfields暴露相比，分子量为4kda和20kda的葡聚糖-fitc被显著摄取，如图3b和3c所描绘。但如图3d所描绘，对于50kda的葡聚糖-fitc的摄取没有显著差异。更具体地说，在暴露0.5-24小时的时间框架中，在存在ttfields的情况下检查葡聚糖-fitc的结合，与未暴露ttfields的样品相比，发现4kda葡聚糖-fitc的摄取显著提高(p《0.0001，双因素方差分析，ttfields与无ttfields)，在ttfields暴露下20kda葡聚糖-fitc的摄取显著提高(p《0.01，ttfields与无ttfields)，并且在ttfields暴露下50kda葡聚糖-fitc的摄取无显著差异(p＝0.26，不显著，ttfields与无ttfields)。这些数据表明，在此实验中，在ttfields暴露下，结合并进入质膜的葡聚糖-fitc的最大大小为约20至50kda之间。在此段描述的所有统计比较中，每个数据点代表n＝3个实验。在图3a-3d中，apc＝别藻蓝蛋白；乙锭d＝溴化乙锭；且fitc＝异硫氰酸荧光素酶。
63.ttfields对5-氨基乙酰丙酸(5-ala)酸摄取的影响：单一u87-mg培养。
64.进行实验以确定ttfields对胶质母细胞瘤细胞中5-ala摄取的影响(通过ppix积累及其产生的荧光来测量)。由于使用当前的5-ala生物测定法很难区分肿瘤细胞和正常细胞之间的边界，因此使用ppix荧光测量来解决此问题。进行研究以确定5-ala通过细胞膜并进入胶质母细胞瘤细胞的渗透是否可通过ttfields暴露而提高。将u87-mg细胞暴露于或未暴露于ttfields，每次持续6-24小时。汇总在图4a中的结果如下：ttfields暴露引起早在ttfields暴露6小时后，5-ala进入u87-mg/egfp-fluc细胞的摄取显著提高(p＝0.047，student t检验，ttfields与无ttfields)并且此提高随ttfields暴露24小时的延长而维持(p＝0.011)。
65.为了生成图4a中描绘的数据，在暴露6小时和24小时后，获得ttfields未暴露与ttfields暴露的u87-mg细胞的原卟啉ix(ppix)荧光板。在6小时(p＝0.047)和24小时(p＝0.01)两个时间点，与无ttfields相比，对这些图像的定量显示出在ttfields暴露的细胞中的ppix信号显著提高。针对每个时间点的n＝3个实验，通过student t检验进行在无ttfields与ttfields样品之间的所有单变量统计比较。
66.ttfields对5-氨基乙酰丙酸摄取的影响：pcs-201成纤维细胞共培养物上的u87-mg gbm。
67.在患者胶质母细胞瘤切除期间，5-ala用于协助神经外科医生在肿瘤和周围正常脑组织之间划定界限。同样，为了区分胶质母细胞瘤和正常细胞之间5-ala摄取的差异，开发共培养物，其中将u87-mg细胞接种在pcs-201成纤维细胞床的中心，并使其经受ttfields或不经受ttfields。荧光和明场显微照片证实在共培养设置中存在离散的胶质母细胞瘤和成纤维细胞的细胞区域。当将共培养物用苏木精和曙红(h&e)染色时，显微照片揭示，针对暴露于ttfields的样品，浸润到成纤维细胞周围的gbm细胞数量减少。
68.特别是，在没有ttfields暴露的情况下，gbm细胞形成许多以前报告过的附着神经球的袋囊。荧光图像显示，在经受ttfields 6小时的共培养平台中，胶质母细胞瘤与成纤维细胞的ppix荧光提高。汇总在图4b中的结果如下：与ttfields未暴露共培养物相比，对于ttfields暴露共培养物来说，ppix荧光随时间积累，但荧光强度增加的速率显著增加(p《0.001，双因素方差分析，ttfields与无ttfields)。为了生成在图4b中描绘的数据，获得无
ttfields和ttfields的5-ala摄取的荧光板(以及随后的ppix荧光，ex＝558nm，em＝583nm)。暴露的持续时间为2、6和24小时。在ttfields暴露与未暴露条件下，胶质母细胞瘤-成纤维细胞共培养平台中ppix积累的时间进程的定量(及因此定量以光子/秒表示的荧光通量的积累)(p《0.001)。统计分析由无ttfields与ttfields条件下的双因素方差分析以及每个时间点n＝3次实验组成。
69.在单独一组实验中，通过24小时的ttfields施加，与在无ttfields条件下共培养细胞的荧光强度比率相比，u87-mg胶质母细胞瘤细胞相对于周围pcs-201成纤维细胞的ppix荧光强度比率显著增加。(p＝0.043，双因素方差分析，ttfields与无ttfields)。
70.扫描电子显微镜(sem)显示ttfields改变u87-mg/egfp-fluc细胞的膜形态。
71.在2000倍、20,000倍和60,000倍的放大倍数下获得未暴露于ttfields或暴露于ttfields 3天的低密度(5,000个细胞/盖玻片)u87-mg/egfp-fluc细胞的sem图像。通过查看这些sem图像获得的数据汇总在图5中。与ttfields未暴露细胞(23.9
±
11.0)相比，暴露于ttfields的细胞的roi内，大小大于51.8nm2(相当于放大60,000倍的9个像素平方)的孔的数量显著增加(53.5
±
19.1)(p＝0.0002，单变量mann-whitney检验)。与ttfields未暴露细胞(129.8
±
31.9nm2)相比，ttfields暴露细胞中在roi内的孔的平均大小(240.6
±
91.7nm2)也显著更大(p＝0.0005(单变量mann-whitney检验))。为了获得图5中描绘的数据，在500nm半径的感兴趣的圆形区域内，对ttfields未暴露和暴露细胞之间孔的数量和大小进行定量和比较。最小孔径界限分别基于3.3和5.0nm斯托克斯(stokes)半径的20kda和50kda葡聚糖-fitc。使用每种条件下三个实验的盖玻片，并以双盲方式分析每个盖玻片至少5个细胞的孔计数和大小。
72.肉眼观察24小时暴露于ttfields对高密度接种的u87_mg细胞的质膜的影响。对于无ttfields样品，细胞表面似乎被浓密的缠结、细长和扁平的膜延伸物所覆盖，类似于膜褶边并与细胞膜邻接。相比之下，暴露于ttfields 24小时后，密集缠结和细长的结构被短的、球状的和水泡状的结构所取代。
73.为了进行比较，还获得并分析正常人pcs-201细胞的sem图像。pcs-201细胞以低密度接种(每13毫米玻璃盖玻片5,000个细胞)。细胞在标准组织培养条件下(37℃，95％o2、5％co2)生长。在研究的持续时间内，将无ttfields暴露细胞置于这些条件下。将其他细胞暴露于ttfields 72小时。72小时后，以2000倍、20,000倍和60,000倍的放大倍数获得sem图像。在500nm半径的感兴趣的圆形区域内，对ttfields未暴露和暴露细胞之间的面积大于51.8nm2(相当于一个4nm半径的圆，或60,000倍放大图像上的9个像素平方)的孔的数量和大小进行定量和比较。最小孔径的界限分别基于3.3和5.0nm斯托克斯半径的20kda和50kda葡聚糖-fitc。图6中描绘的结果如下：ttfields未暴露和暴露的正常人pcs-201细胞之间的孔的数量或大小没有显著差异(wilcoxon秩和分析)。使用每种条件下三个实验的盖玻片，并以双盲方式分析每个盖玻片至少5个细胞的孔计数和大小。
74.肉眼观察24小时暴露于ttfields对pcs-201细胞的质膜的影响。与上述针对u87-mg细胞的情况不同，ttfields似乎并未改变pcs-201细胞的膜形态。
75.ttfields对膜通透性的影响是可逆的。
76.为评估ttfields对癌细胞的的影响的可逆性，使u87-mg/egfp-fluc细胞经受三种条件：(1)无ttfields暴露，标准细胞培养条件(37℃，95％o2、5％co2)，(2)ttfields暴露24
小时，和(3)ttfields暴露24小时，然后无ttfields暴露24小时。获取bli、ppix荧光(5-ala产物)和葡聚糖-fitc(4kda)荧光的读数。所有实验条件重复三次。图7a汇总bli的数据：与无ttfields暴露(左条形)相比，存在ttfields24小时(中间条形)显著提高bli通量(p《0.0005，双因素方差分析，ttfields与无ttfields)，但当细胞被重新引入到无ttfields条件下24小时(右条形)时，这种提高显著减弱(双因素方差分析，p《0.005，ttfields 24小时与ttfields 24小时后跟无ttfields 24小时)。图7b显示ppix荧光发生类似的可逆读数模式(p《0.0005，双因素方差分析，ttfields(中间条形)与无ttfields(左条形)和p《0.0004，ttfields与ttfields后跟无ttfields(右条形))。并且图7c显示对于4kda葡聚糖-fitc荧光发生类似的可逆读数模式(p《0.05，双因素方差分析，ttfields(中间条形)与无ttfields(左条形)；以及p《0.05，ttfields与ttfields后跟无ttfields(右条形)。对于每个实验组，egfp荧光没有显著变化。sem研究还揭示，在24小时无暴露之后，孔的数量(p＝0.007，双因素方差分析，ttfields与无ttfields)和孔的大小(p＝0.0007，双因素方差分析，ttfields与无ttfields)两者由ttfields的显著增强也是可逆的。在此，ns＝不显著；bli＝生物发光成像；egfp＝增强的绿色荧光蛋白；fluc＝萤火虫荧光素酶；5-ala＝5氨基乙酰丙酸；fitc＝异硫氰酸荧光素酶；ppix＝原卟啉ix；而fl＝荧光。
77.总而言之，当施加交变电场时(与未施加交变电场时相比)，相关化合物的摄取增加。这些图的每一个还显示，在交变电场停止24小时后，摄取量显著降低。由此可推断，由交变电场引起的细胞膜通透性的提高不是永久性影响，并且在交变电场停止后通透性回落。
78.图7d描绘测试通透性在停止交变电场之后回落的速度有多快的实验的结果。更具体地，7-氨基放线菌素d(7-aad)是对dna具有强亲和力的荧光化合物。7-aad是相对大的分子(1270.43g/mol，即1.27kda)，通常不容易穿过完整的细胞膜。图7d显示通过对u87-mg细胞施加ttfields而诱导的对7-aad的通透性的定时特性。在此实验中，在环境温度18℃的条件下，将细胞以场强为1.62v/cm rms的300khz下的交变电场处理24小时。在五个不同的时间将7-aad引入样品中：交变电场停止前15分钟；紧接着交变电场停止；以及交变电场停止后的15、30和60分钟。在每种情况下，在引入7-aad之后，将细胞与7-aad一起温育30分钟，随后针对不同定时中的每个，用流式细胞术分析荧光7-aad的积累增加的细胞百分比。如图7d所示，仅在经受交变电场的同时与7-aad一起温育的样品中观察到7-aad的积累显著增加。
79.不同药物和不同类型癌细胞的附加结果。
80.本文所述的方法不限于胶质母细胞瘤。相比之下，它们适用于其他类型的癌细胞。更具体地，可通过以下方式将物质递送穿过细胞的细胞膜：(a)向细胞施加交变电场达一段时间，其中施加交变电场提高细胞膜的通透性；和(b)将物质引入细胞附近。细胞膜通透性的提高使物质能够穿过细胞膜。值得注意的是，本文所述的方法可用于将大分子(通常不会穿过相关细胞膜)递送穿过不同类型的细胞(即，胶质母细胞瘤以外的细胞)(包括但不限于其他类型的癌细胞(例如，mda-mb-435和mcf-7细胞))的细胞膜。
81.图8a描绘用于确定交变电场如何影响mda-mb-43 5人黑色素瘤细胞系细胞的细胞膜的通透性而进行的实验的结果。在此实验中，将mda-mb-435细胞在18℃的环境温度和37℃的培养皿温度下，以场强为1.62v/cm的150khz下的交变电场处理24小时(在此示例和其他示例中，由于交变电场引起的加热，培养皿温度高于环境温度)。在最初的23.75小时后，向培养物中加入7-aad并温育15分钟，在此期间持续交变电场(以完成24小时周期)。在这15
分钟之后，终止交变电场的施加，并将细胞在室温下再温育15分钟。使用流式细胞术分析确定荧光7-aad积累增加的细胞百分比。～66％的细胞表现出7-aad积累增加(图8a中的条形2)，相比之下，对照组(条形1)的细胞不到5％，该对照组除了没有施加交变电场之外经受相同的条件。这些结果指示由交变电场引起细胞膜通透性的显著提高。
82.在此实验的变型中，将mda-mb-435人黑色素瘤细胞系细胞在18℃的环境温度和37℃的培养皿温度下，以场强为1.62v/cm的150khz下的交变电场处理24小时。在此24小时时段后，关闭交变电场15分钟，在此之后加入7-aad。在等待另外15分钟后，使用流式细胞术确定荧光7-aad积累增加的细胞的百分比。这次，仅～20％的细胞表现出7-aad积累增加(图8a中的条形3)。这些结果指示，由交变电场引起的细胞膜通透性的提高是相对短暂的，并且在交变电场停止后通透性迅速且急剧下降。
83.图8b描绘用于确定交变电场如何影响mda-mb-43 5人黑色素瘤细胞系细胞的细胞膜对阿霉素(543.52g/mol)的通透性而进行的另一个实验的结果。在此实验中，将mda-mb-435细胞的野生型和阿霉素抗性变体两者均以场强为1.62v/cm的150khz下的交变电场处理23小时。在此23小时之后，加入浓度为10μm的阿霉素并温育1小时，在此时间期间持续交变电场。然后测量阿霉素的细胞内积累。对于野生型细胞(将条形1和条形3进行比较)和阿霉素抗性细胞(将条形2和条形4进行比较)，阿霉素的细胞内积累均增加。
84.图8c描绘使用mcf-7人乳腺癌细胞系细胞和米托蒽醌(444.481g/mol)的类似实验的结果。在此实验中，将mcf-7细胞的野生型和米托蒽醌抗性变体均以场强为1.62v/cm的150khz下的交变电场处理23小时。在此23小时之后，加入浓度为2μm的米托蒽醌并温育1小时，在此期间持续交变电场。然后测量米托蒽醌的细胞内积累。对于野生型细胞(将条形1和条形3进行比较)和米托蒽醌抗性细胞(将条形2和条形4进行比较)，米托蒽醌的细胞内积累均增加。
85.上文结合图8b和图8c描述的结果指示交变电场改善野生型和抗药型细胞中化疗分子的细胞内积累，并且交变电场可有利地在癌细胞对这些化学物质产生多重抗药性之后恢复这些细胞中化疗化学物质的细胞内积累。
86.进行附加实验以确定对于各种癌症细胞系，ttfields和各种药物之间是否存在协同作用，并且图9a-9g描绘这些实验中的一些的结果。更具体地，图9a显示施用ttfields 3天如何改善u87-mg/gfp-luc细胞对各种浓度的洛莫司汀的敏感性(与其中未施用ttfields的对照相比)。图9b显示施用ttfields 3天如何改善pcgbm2/gfp-luc细胞对各种浓度的洛莫司汀的敏感性(与未施用ttfields的对照相比)。图9c显示施用ttfields 3天如何改善gbm39细胞对各种浓度的洛莫司汀的敏感性(与未施用ttfields的对照相比)。图9d显示施用ttfields 3天如何改善gbm39细胞对各种浓度的替莫唑胺的敏感性(与未施用ttfields的对照相比)。图9e显示施用ttfields 3天如何改善gbm39/luc细胞对各种浓度的伊立替康(irinotecan)的敏感性(与未施用ttfields的对照相比)。图9f显示施用ttfields 3天如何改善mda-mb-235细胞对各种浓度的阿霉素的敏感性(与未施用ttfields的对照相比)。并且图9g显示施用ttfields 4天如何改善u87-mg/egfp-luc细胞对各种浓度的甘露糖的敏感性(与未施用ttfields的对照相比)。
87.迄今为止，发现ttfields加醉茄素a的联合对于gbm39/luc、u87-mg/gfp-luc和pcgbm2/gfp-luc具有协同作用；发现ttfields加洛莫司汀的联合对于gbm39/luc、u87-mg/
gfp-luc和pcgbm2/gfp-luc具有协同作用；发现ttfields加伊立替康的联合对于gbm39/luc具有协同作用；并且发现ttfields和甘露糖的联合对于u87-mg/gfp-luc具有协同作用。还发现ttfields加阿霉素的联合对于mda-mb-235具有协同作用的证据。
88.讨论
89.先前的研究集中在ttfields对细胞核(例如，微管)、隔蛋白、线粒体和自噬的影响。但本文所描述的实验被认为是首次报告ttfields对癌细胞膜完整性的影响，并使用各种评估技术(例如，生物发光成像、荧光成像和扫描电子显微镜)证明ttfields的存在下癌细胞(例如，多种人gbm细胞系)的细胞膜通透性提高。
90.观察结果揭示，在多种人gbm细胞系中，存在ttfields的情况下胶质母细胞瘤的细胞膜通透性提高。用于验证假设的方法包括生物发光成像、荧光成像和扫描电子显微镜。观察结果还揭示，在ttfields的存在下，其他类型的癌细胞的细胞膜通透性提高。对ttfields与化疗药物联合的研究显示治疗加成性和协同性。对于此研究，我们假设ttfields介导对癌细胞的改善的可及性。若干个实验显示ttfields对膜的影响具有可逆性，从而证明ttfields与膜通透性的提高之间存在因果关系。此类观察结果还表明，ttfields可用于调节药物对癌细胞的可及性。
91.对ttfields作用的细胞通透性假说的研究部分地开始，因为观察到ttfields在表达荧光素酶的gbm细胞中提高生物发光。尽管不受此理论的束缚，但据信ttfields诱导gbm细胞的细胞膜的提高的通透性。据信，如通过bli测量的gbm细胞对d-荧光素的通透性提高不是由于ttfields对荧光素酶本身的影响，而是由于其底物d-荧光素向工程化表达萤火虫荧光素酶的细胞中的流入提高。此外，此发现对于atp依赖性(fluc)和atp非依赖性荧光素酶(rluc)均适用。因此，尽管有初步报告表明暴露于ttfields的ct26大肠癌细胞中细胞内atp增加，但在ttfields暴露的设定中观察到胶质母细胞瘤细胞膜通透性提高表明这是独立的现象。由于ttfields暴露引起的萤光素酶表达或激活的增加无法解释bli信号的提高，因为在这些细胞中，荧光素酶由与egfp相同的启动子控制，并且在相同细胞中未观察到荧光信号的提高。然而，暴露于ttfields可能会影响细胞代谢，这可通过atp水平的变化、膜形态的改变和耗氧量的变动来体现。
92.支持通透性假说的一些关键发现来自于上文结合图3b至图3d所述的葡聚糖-fitc验证实验。用fitc标记的葡聚糖测试在ttfields的设定中细胞膜对小探针的可及性，这引起4kda(斯托克斯半径～1.4nm)和20kda(斯托克斯半径～3.3nm)的流入量增加，而不是50kda的葡聚糖(斯托克斯半径～5nm)的流入量增加。这表明ttfields使gbm细胞对大到20kda但不大于50kda的物质更具通透性。作为参考，萤光素和腔肠素底物的分子量足够小，可在ttfields暴露下通过膜进入。d-萤光素(萤火虫萤光素酶的底物)的分子量为280.3g/mol(～280da)，腔肠素h(海肾萤光素酶的底物)的分子量为407.5g/mol(～408da)，并且5-ala的分子量为167.6g/mol(169da)，与关于葡聚糖-fitc的发现一致。
93.本文所述的sem发现揭示，在低播种密度下，与无ttfields条件下相比，3天的ttfields暴露使得面积大于51.8nm2的孔的数量和大小显著增加，如上文结合图5所述。此孔大小的界限代表半径为4.1nm的圆，该圆是大小为20-40kda的fitc-葡聚糖分子的斯托克斯半径。因此，通过sem可视化的细胞膜破裂的差异证实来自本文所述的fitc-葡聚糖研究的间接观察结果。
94.有趣的是，正常人成纤维细胞(pcs-201)暴露于ttfields不会引起细胞膜孔数量或大小的显著增加，因此表明通透性效应可对癌细胞具有一定的特异性。定性而言，对于u87-mg细胞，由于在高接种密度下24小时暴露于ttfields，出现明显的球状、水泡状结构。这些结构的出现与外膜通透性的提高和细胞凋亡的诱导一致，并且在24小时ttfields暴露下似乎没有凋亡表型的证据。此外，高密度pcs-201细胞在ttfields暴露下未表现出此类变化(数据未显示)，因此再次表明ttfields效应对癌细胞的特异性。
95.尽管对于实验，细胞周期未同步，但u87-mg细胞的倍增时间为～48h，并且考虑到ttfields对分裂细胞发挥最大的抗增殖作用，这可解释24小时ttfields暴露之后没有观察到大量的凋亡。另一种解释可在于细胞起泡可赋予细胞裂解抗性的报道。先前关于非同步胶质母细胞瘤细胞的报告证明，ttfields暴露72小时诱导细胞死亡，其中膜联蛋白v阳性细胞比例显著。使用透射电子显微镜，这些报告描述自噬的迹象，包括自噬体，肿胀的线粒体和扩张的内质网。相比之下，本文的结果使用sem来更好地可视化ttfields特异性地对浆细胞膜的影响。
96.通过ttfields的膜通透性提高具有重要的临床意义。使用在正常人成纤维细胞上分层的人gbm细胞共培养平台，研究ttfields对gbm细胞摄取5-氨基乙酰丙酸(5-ala)的影响。与成纤维细胞相比，ttfields暴露引起gbm细胞中5-ala摄取显著增加。2017年6月，美国食品药品监督管理局批准5-ala在美国的临床使用，以协助神经外科医生在神经胶质瘤切除术中划定出肿瘤-正常大脑边界。因此，在5-ala施用之前用ttfields预处理脑胶质瘤患者将有助于增强肿瘤切除过程中浸润性肿瘤边界的划定。
97.关于检测和测量ttfields对癌细胞的影响，迄今为止，大多数基于细胞培养的研究均集中于细胞计数/生存力作为主要的读数。这是基于普遍的理解，即ttfields干扰快速分裂的肿瘤细胞的有丝分裂，从而引起癌细胞死亡。另外，细胞培养中ttfields的计算模型研究目前由细胞计数作为模型的主要结果来驱动。
98.gbm的复发是不可避免的，尽管采用标准疗法，但首次复发的中位时间约为7个月。在ttfields对gbm患者的临床应用中，数据表明ttfields使用的依从性和持续时间的增加与存活率的增加相关。在完整ef-14试验数据集的回顾性分析中，ttfields的依从性(》75％与《75％)是整体存活率的独立预测因素，并且也发现使用ttfields的持续时间影响整体存活率。综上所述，这些数据可作为在基于细胞培养的ttfields实验设定中观察到的影响的临床相关因素。也就是说，观察到ttfields暴露的长度和ttfields停止后其对细胞膜通透性的影响的持续时间之间的相关性。在ttfields暴露的长度为0.5-3小时下，bli增强的持续时间(与无ttfields条件相比)持续约5分钟。然而，在ttfields暴露时间为12-25小时下，ttfields与无ttfields条件之间的此bli差异持续超过20分钟。同样，对ram等人报告的数据进行的重新分析表明，整体存活率的增加(在用ttfields加替莫唑胺治疗的患者与仅用替莫唑胺治疗的患者中)从ttfields暴露1年后的32％分别跃升至ttfields暴露5年后的551％。
99.本文所述的结果，即交变电场提高细胞膜通透性，不同于先前报告的ttfields的影响。这将对治疗胶质母细胞瘤以及其他类型癌症的当前外科和临床实践产生重大影响。
100.在上述体外实验中，交变电场的频率为200khz。但在替代实施例中，交变电场的频率可为另一频率，例如，约200khz，在50至500khz之间，在25khz至1mhz之间，在50至190khz
之间，在25至190khz之间，或在210至400khz之间。
101.在上述体外实验中，交变电场的场强在1至4v/cm rms之间。但在替代实施例中，可使用不同的场强(例如，在0.1至10v/cm之间)。
102.在上述体外实验中，交变电场被施加0.5小时至72小时的各种不同间隔。但在替代实施例中，可使用不同的持续时间(例如，在0.5小时至14天之间)。在一些实施例中，交变电场的施加可周期性地重复。例如，交变电场可每天施加两小时的持续时间。
103.在使用本文所述的inovitro
tm
系统的体外实验中，交变电场的方向在两个垂直方向之间以一秒的间隔切换。但在替代实施例中，交变电场的方向可以更快的速率(例如，以1至1000毫秒之间的间隔)或以更慢的速率(例如，以1至100秒之间的间隔)来切换。
104.在使用本文所述的inovitro
tm
系统的体外实验中，通过向在2d空间中以交替顺序彼此相隔90
°
设置的两对电极施加交流电压，在两个垂直方向之间切换交变电场的方向。但在替代实施例中，交变电场的方向可通过重新定位电极对而在两个不垂直的方向之间切换，或者在三个或更多个方向之间切换(假设提供附加的电极对)。例如，交变电场的方向可在三个方向之间切换，方向中的每一个由其自己的一对电极的放置确定。任选地，这三对电极可被定位成使得所产生的场在3d空间中彼此间隔90
°
。在其他替代实施例中，电极不必成对布置。参见，例如，在美国专利7,565,205中描述的电极定位，该专利通过引用并入本文。在其他替代实施例中，场的方向保持恒定。
105.在使用本文所述的inovitro
tm
系统进行的体外实验中，电场被电容性耦合到培养物中，因为inovitro
tm
系统使用设置在培养皿侧壁外表面上的导电电极并且侧壁的陶瓷材料充当电介质。但在替代实施例中，电场可在没有电容耦合的情况下直接施加到细胞(例如，通过修改inovitro
tm
系统配置，使得导电电极设置在侧壁的内表面上，而不是侧壁的外表面上)。
106.对于胶质母细胞瘤细胞和其他类型的癌细胞，本文所述的方法也可通过向活体受试者的身体的目标区域施加交变电场而在体内背景下应用。在目标区域中强加电场将提高目标区域中细胞膜的通透性，这将使得通常被细胞膜阻止或阻碍的分子能够穿过细胞膜。例如，这可通过将电极放置在受试者皮肤之上或之下来实现，使得在这些电极的选定子集之间施加交流电压将在受试者的身体的目标区域中强加交变电场。
107.例如，在相关细胞位于受试者肺部的情况下，一对电极可位于受试者胸部的前部和后部，并且第二对电极可位于受试者胸部的右侧和左侧。在一些实施例中，电极被电容耦合到受试者的身体(例如，通过使用包括导电板并且还具有设置在导电板和受试者的身体之间的电介质层的电极)。但在替代实施例中，可省略电介质层，在这种情况下，导电板将与受试者身体直接接触。在另一个实施例中，可将电极皮下插入到患者皮肤下。交流电压发生器在右电极和左电极之间以选定的频率(例如100至200khz之间)施加交流电压达第一时间段(例如1秒)，这感应出交变电场，其中场线的最显著分量平行于受试者身体的横向轴线。然后，交流电压发生器在前电极和后电极之间以相同频率(或不同频率)施加交流电压达第二时间段(例如1秒)，这感应出交变电场，其中场线的最显著分量平行于受试者身体的前后轴线。然后在治疗的持续时间内重复此两个步骤。任选地，可在电极处包括热传感器，并且交流电压发生器可被配置为如果在电极处感测到的温度变得过高，则减小施加到电极的交流电压的幅度。在一些实施例中，可在序列中加入一对或更多对电极并将其包括。在替代实
施例中，仅使用一对电极，在这种情况下，不切换场线的方向。注意，此体内实施例的参数中的任一个(例如，频率、场强度、持续时间、方向转换速率和电极的放置)可如上文结合体外实施例所述而变化。但在体内背景下必须小心，以确保电场对受试者始终是安全的。
108.在体内背景下，可以容易地想到提高细胞膜的通透性的各种应用。在一个示例中，在体内背景中，局部增强肿瘤细胞对药物摄取可通过在施用化疗或其它抗肿瘤药剂之前和期间向相关身体部位施加交变电场达一段时间(例如12或24小时)来诱导。在另一个示例中，在施用化疗剂或其它抗肿瘤剂之前和期间，通过向相关身体部位施加交变电场达一段时间(例如12或24小时)来恢复多药抗性肿瘤细胞的药物摄取。在另一个示例中，在施用适当的药物之前和期间(无论受试者是否患有正在用交变电场治疗的原发性肿瘤)，通过向易于转移的区域施加交变电场达一段时间(例如12或24小时)来防止多药抗性转移的发展。
109.图10a描绘在体外背景下在以下项的第一合适的定时关系：施加交变电场和将物质引入癌细胞附近之间；或者在施加交变电场和向活体患者施用物质之间。基于上文结合图7a至图7d和图8a描述的数据，并且假设物质在给定时间t＝0被引入或施用，交变电场可在给定时间之后开始并且持续一段时间间隔(例如12小时)，同时物质在细胞附近仍然可用。在此情况下，通透性将在交变电场开始之后开始提高，而通透性的此提高将使物质能够进入相关细胞。在化疗的情况下，这将对应于向患者施用化疗剂，随后施加交变电场达一段时间间隔(例如12小时)。
110.另选地，如图10b所描绘，交变电场可在给定时间之前(例如，t＝0之前的1小时)开始，并且持续一定时间间隔(例如，直到t＝0之后12小时)，同时该物质在细胞附近仍然可用。在此情况下，相关细胞的通透性将在物质到达细胞附近之前(或在向活体患者施用物质之前)开始提高。这将使物质在到达细胞附近后立即穿过细胞膜。在化疗的情况下，这将对应于开始施加交变电场，随后在仍然施加交变电场的同时施用化疗剂，随后在附加时间间隔内持续施加交变电场(例如，直到施用化疗剂的时间后12小时)。
111.注意，上文结合图10a和图10b所论述的时间间隔可为不间断的，或者可包括优选较短的间歇。例如，假设时间间隔为12小时，则它可通过12小时的单个不中断块来满足。另选地，12小时的间隔可通过以下来满足：施加6小时的交变电场，随后是1小时的间歇，随后施加交变电场达附加6小时(同时该物质在细胞附近仍然可用)。还应注意，在图10a和图10b的上下文中，当向活体患者施用物质时，物质的施用可使用包括但不限于静脉注射、口服、皮下注射、鞘内注射、脑室内注射和腹膜内注射等多种方法中的任一种来进行。
112.可针对给定类型的宿主细胞和要递送通过细胞膜的给定类型的物质的每种组合，通过实验确定最佳频率、场强和切换特性。在一些优选实施例中，频率小于190khz(例如，在50至190khz之间或在25至190khz之间)。在其他优选实施例中，频率在210至400khz之间。
113.治疗肿瘤(例如，胶质母细胞瘤)的一种现有方法是通过以50至500khz之间，优选100至300khz之间的频率施加交变电场。对于胶质母细胞瘤，200khz是最优选的频率。在这些频率下的交变电场称为ttfields，并在美国专利6,868,289和7,565,205中有所描述，这些专利中的每一个均通过引用整体并入本文。简而言之，这两个应用描述破坏有丝分裂期间的分裂细胞。当电场的方向周期性地切换时，当肿瘤的至少一部分中的电场强度至少为1v/cm时，以及当电场在尽可能少的间歇情况下长时间段(例如，数周或数月)施加时，ttfields的有效性得到改善。
114.可出现以下情况：期望用ttfields治疗肿瘤，并将物质递送穿过肿瘤细胞的细胞膜(例如，以帮助获得治疗有效量的化疗药物通过细胞膜，以提供针对肿瘤的附加攻击路线)。在一些情况下，可使用单一频率的交变电场来治疗肿瘤并提高细胞膜的通透性。在其他情况下，可期望使用具有不同频率的交变电场：第一频率被选择用于提供提高细胞膜的通透性的改善结果，而第二频率被选择用于提供ttfields的抗肿瘤作用的改善结果。
115.图11a和图11b描绘对u-87 mg胶质母细胞瘤细胞的两次体外实验的结果。更具体地，图11a描绘第一实验的结果，该实验确定提供对u-87 mg细胞最高水平的细胞毒性的频率；并且图11b描绘第二实验结果，该实验确定提供u-87 mg细胞的细胞膜通透性最大提高的频率。
116.在第一实验中，在18℃的环境温度下，使u-87 mg细胞经受不同频率下的场强为1.62v/cm rms的交变电场达72小时。在此72小时后，使用流式细胞术测量每种不同频率的样品中存在的细胞数量。如图11a所示，对于经受200khz下的交变电场的样品，观察到最低数量的细胞(其指示最高水平的细胞毒性)。
117.在第二实验中，测量对7-aad(分子量为1270.43g/mol的荧光化学物质，其通常不易穿过完整的细胞膜)的通透性。在此实验中，在18℃的环境温度和37℃的培养皿温度下，以场强为1.62v/cm rms的不同频率下的交变电场处理细胞达24小时。在最初的23.75小时后，向培养物中加入7-aad并温育15分钟，在此期间，持续交变电场(以完成24小时的周期)。在此15分钟之后，终止施加交变电场，并将细胞在室温下再温育15分钟，随后通过流式细胞术分析针对每种不同频率的荧光7-aad积累增加的细胞的百分比。如图11b所示，对于经受300khz的交变电场的样品，观察到具有最高百分比的7-aad积累增加的细胞(其指示最高水平的通透性)。
118.图12a和图12b描绘类似于上文结合图11a/b所描述的那些实验的两个体外实验的结果，不同之处在于使用mes-sa子宫肉瘤细胞。更具体地，图12a描绘用于确定对mes-sa细胞提供最高水平的细胞毒性的频率的实验的结果。对于经受在100khz下的交变电场的样品，观察到最低数量的mes-sa细胞(这指示最高水平的细胞毒性)。图12b描绘用于确定提供mes-sa细胞的细胞膜的通透性最大提高的频率的实验的结果。对于经受在150khz下的交变电场的样品，观察到最高百分比的7-aad积累增加的mes-sa细胞(其指示最高水平的通透性)。
119.图12c描绘用于确定150khz交变电场如何影响mes-sa细胞的细胞膜对阿霉素(543.52g/mol)的通透性而进行的另一实验的结果。在此实验中，将mes-sa细胞以场强为1.62v/cm rms的150khz下的交变电场处理24小时。在最初的23小时后，加入浓度为10μm的阿霉素并温育1小时，在此期间持续交变电场(以完成24小时的周期)。然后测量阿霉素的细胞内积累。对于用150khz交变电场处理的样品，阿霉素的积累增加2倍以上。
120.图13a和图13b描绘类似于上文结合图11a/b所描述的那些实验的两个体外实验的结果，不同之处在于使用mcf-7乳腺癌细胞。更具体地，图13a描绘用于确定对mcf-7细胞提供最高水平的细胞毒性的频率的实验的结果。对于经受在200khz下的交变电场的样品，观察到最低数量的mcf-7细胞(其指示最高水平的细胞毒性)。图13b描绘用于确定提供mcf-7细胞的细胞膜的通透性的最大提高的频率的实验的结果。对于经受在150khz下的交变电场的样品，观察到具有最高百分比的7-aad积累增加的mcf-7细胞(其指示最高水平的通透
性)。
121.上文结合图11至图13描述的实验揭示诱导细胞通透性的最佳频率不同于诱导细胞毒性的最佳频率。更具体地，对于胶质母细胞瘤，最佳第一频率(用于诱导细胞通透性)在250khz至350khz之间；并且最佳第二频率(用于诱导细胞毒性)在150khz至250khz之间。对于子宫肉瘤，最佳第一频率(用于诱导细胞通透性)在125khz至175khz之间；并且最佳第二频率(用于诱导细胞毒性)在75khz至125khz之间。并且对于乳腺癌，最佳第一频率(用于诱导细胞通透性)在75khz至175khz之间；并且最佳第二频率(用于诱导细胞毒性)在100khz至300khz之间。其他类型癌症的成对频率范围可通过实验确定。
122.当不同的频率用于诱导细胞通透性和诱导细胞毒性时，细胞毒性频率优选应用于患者可舒适耐受的最长时间。优选地，施加细胞毒性频率至少一周。更优选地，施加细胞毒性频率达许多月。任选地，可将在其间施加细胞毒性频率的时间间隔分成多个由间歇分隔的不连续的时间间隔，其中多个不连续的时间间隔总计至少一周。相比之下，优选施加用于诱导通透性的频率，使得当相关物质位于靶细胞附近时通透性高(例如，如上文结合图10a至图10b所述)。施加这两个不同频率可使用单个交流电压发生器来实现，该单个交流电压发生器可控制以在特定时间输出第一频率来诱导细胞通透性，而在其他时间输出第二频率来诱导细胞毒性。相同组换能器阵列(即，电极)可用于施加在这两个频率下的交变电场(取决于交流电压发生器施加哪个频率)。
123.图15是生成用于诱导细胞通透性的第一频率和用于诱导细胞毒性的第二频率的装置的框图。该装置包括交流电压发生器44，其类似于常规的场发生器单元，但具有在两个不同频率下工作的能力。这些频率中的每一个均在50至500khz之间。此能力可通过例如使用继电器将第一组组件或第二组组件切换成生成交流电压的常规电路并调节振荡器的工作频率来实现。交流电压发生器44被配置为取决于控制输入端的状态来输出第一频率或第二频率。当控制输入端处于第一状态时，交流电压发生器44输出第一频率，而当控制输入端处于第二状态时，交流电压发生器44输出第二频率。控制器42被编程为将控制输入端置于第二状态，使得交流电压发生器44输出第二频率。控制器42还被编程为接受切换到第一频率的请求。在图15所描绘的实施例中，该请求经由用户界面40到达，该用户界面可使用多种常规方法(包括但不限于按钮、触摸屏等)中的任一种来实现。在替代实施例中，该请求可经由来自平板电脑、智能手机等的rf(例如蓝牙、wifi等)到达。
124.一旦接收到请求，控制器42将控制输入端置于第一状态，使得交流电压发生器44将输出第一频率达一段时间间隔(例如，至少1小时、至少12小时或至少24小时)。在经过该时间间隔之后，控制器42将控制输入端置于第二状态，使得交流电压发生器44恢复到输出第二频率。
125.任选地，取决于控制输入端的状态，交流电压发生器44可被配置为输出一个或多个附加频率(例如，第三频率、第四频率等)。优选地，选择这些附加频率中的每一个来诱导细胞毒性。在这些实施例中，控制器42被编程为在请求到达之前使控制输入端循环通过使得交流电压发生器44输出第二频率和一个或多个附加频率的状态。控制器42还被编程为接受切换到第一频率的请求。在接收到请求之后，控制器42将控制输入端置于第一状态，使得交流电压发生器44将输出第一频率达一段时间间隔(例如，至少1小时、至少12小时或至少24小时)。在经过该时间间隔之后，控制器42将恢复到使控制输入端循环通过使得交流电压
发生器44输出第二频率和一个或多个附加频率的状态。
126.当一个人的肿瘤正在接收包括ttfields和化疗的联合疗法的治疗时，图15中描绘的系统特别有用。在此情况下，系统大部分时间均在第二频率下工作，以提供最大的细胞毒性效应。但是当一个人为了一定剂量的化疗而去化疗诊所时，医护人员(或用户)启动用户界面40，以将系统切换到促进通透性的第一频率。在此情况下，启动用户界面可例如在化疗预期开始之前一小时或在化疗实际开始之后的短时间内完成。
127.另选地，在接收到请求之后(例如，从用户界面40接收)，控制器42可控制控制输入端，使得交流电压发生器44将输出第一频率达一段时间(例如，1小时，然后在第二频率和第一频率之间来回切换(例如，每小时切换一次)。最终(例如，当相关物质已从患者的血流中排出时)，控制器42控制控制输入端，使得交流电压发生器44恢复到输出第二频率。
128.类似于与一起使用的常规电极的一组电极(未显示)连接到交流电压发生器44的输出端。
129.图14描绘用于确定提供gbm39/luc细胞的细胞膜通透性的最大提高的频率的另一实验的结果。在此实验中，将细胞在4kda葡聚糖fitc(通常不容易通过完整的细胞膜)的存在下用不同频率的交变电场处理2天。如图14所示，对于经受在100khz下的交变电场的样品，观察到最高水平的葡聚糖-fitc荧光(其指示最高水平的通透性)。
130.结合图11至图14论述的实验数据含有信息，该信息在不考虑可作为次要影响而发生的任何细胞毒性情况下对最大程度地诱导细胞通透性(使更多相关物质能够穿过细胞膜)有用。在这些情况下，交变电场优选仅在单个频率下施加，选择该频率以诱导最高水平的细胞通透性。在一些情况下(例如gbm39/luc、子宫肉瘤和乳腺癌)，此频率将在50至190khz之间；而在其他情况下(例如u-87 mg胶质母细胞瘤)，此频率将在210至400khz之间。
131.对于那些通常可在很大程度上横穿细胞膜的物质，本文所述的用于提高细胞膜通透性的技术可用于提高将进入细胞的物质的量。这可改善那些物质提供的治疗结果。上面论述的此类物质的示例包括溴化乙锭(大小＝394da)、阿霉素(大小＝544da)、米托蒽醌(大小＝445da)等。
132.并且值得注意的是，本文所述的技术还可用于使通常不能在很大程度上横穿细胞膜的物质进入细胞。上面论述的这类物质的示例包括(a)至少1.2kda的化合物(例如7-aad，其大小为1.27kda)，(b)至少4kda的化合物(例如4kda葡聚糖-fitc和(c)至少20kda的化合物(例如20kda葡聚糖-fitc)，(d)遗传物质，包括但不限于超螺旋质粒dna、sirna和shrna构建体，(e)基因组编辑系统，包括不限于巨核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应子基核酸酶(talen)和有规则间隔的簇状短回文重复序列(crispr/cas9)，(f)任何形式的抗体，包括但不限于igg、fab、fab'、f(ab')2、scfv、di-scfv、sdab。此类抗体可非偶联或偶联到细胞毒剂、毒素、荧光团、量子点和酶，(g)带电分子和(h)小分子、治疗实体、肽和蛋白质，它们通常不渗透细胞膜或在胞吞期间被破坏。提供使这些物质穿过细胞膜的能力意味着，先前在化合物筛选过程中可因无效而被拒绝的化合物(由于它们无法横穿细胞膜)，当与增强细胞通透性的交变电场结合使用时，可突然变得可用于治疗目的。
133.本文所述的方法也可用于癌细胞以外的情况。更具体地，本文所述的方法可用于将大分子(其通常不会穿过相关细胞膜)递送穿过某些其他非癌细胞(例如，肾细胞、肺细胞、肝细胞、心细胞、脑细胞、肌肉细胞、骨髓细胞等)的细胞膜。通过内向相关身体部位施加
交变电场达施用这些药物之前和期间的一段时间(例如24小时)，可增强此类药物的递送。此类药物的候选药物包括但不限于抗癫痫药和精神药物(例如，奥氮平、9-羟基利培酮和其他种类的利培酮等)。
134.在又一个示例中，通过向相关身体部位施加交变电场达在施用合适的抗生素之前和施用期间的一段时间(例如24小时)，可实现细菌中药物摄取的局部增强。在特定细菌已进化到抗药性或多重抗药性的情况下(例如，基于涉及细胞膜的作用机制)，施加交变电场可将细菌细胞膜的通透性提高到可克服抗药性的程度。类似的方法可用于增强药物的摄取，以对抗脑膜炎、肺炎、感染性心内膜炎等。注意，在体内背景下，可向无肿瘤的目标区域(例如，肺部)施加交变电场。另选地，可向含有肿瘤的目标区域(例如，包括胶质母细胞瘤的大脑)施加交变电场。
135.尽管已参考某些实施例公开本发明，但在不脱离如所附权利要求所限定的本发明的领域和范围的情况下，对所述实施例的许多修改、改变和变化是可以的。因此，意图是本发明不限于所描述的实施例，而是具有由下面列出的权利要求及其等效物的语言定义的全部范围。
136.材料和方法
137.细胞培养研究：使用两种源自患者的gbm细胞系(gbm2、gbm39)、可商购的人gbm细胞系(u87-mg，来自美国弗吉尼亚州马纳萨斯(manassas,va,usa)的atcc)以及小鼠星形细胞瘤细胞系(kr158b；来自佛罗里达大学医学院神经外科系(department of neurosurgery at the university of florida school of medicine)的duane mitchell博士赠送的礼物)。人u87-mg、人pcs-201和鼠kr158b胶质母细胞瘤细胞系在dmem(英杰/生物技术公司(invitrogen/life technologies)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德(carlsbad,ca,usa))/10％fbs/和1x抗生素-抗真菌剂(英杰/生物技术公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)中生长。gbm2和gbm39在限定的无血清培养基中生长，其成分已在前面进行描述。
138.将细胞接种到玻璃盖玻片上以进行ttfields实验：简而言之，经由标准方案对培养的细胞进行胰蛋白酶处理，并将10,000-50,000个单细胞悬浮在200或75μl dmem/10％fbs/1x抗生素-抗真菌剂中，然后将其分别接种到直径22mm或12mm的玻璃thermanox
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盖玻片(thermofisher scientific(赛默飞世尔公司)，美国马塞诸塞州沃尔瑟姆(waltham,ma,usa))的中心。将细胞在37℃下的湿润95％空气/5％co2培养箱中温育过夜。一旦细胞附着到盖玻片上，就分别在6孔或12孔平板的每个孔中加入2ml或1ml dmem/10％fbs/lx抗生素-抗真菌剂。除非在“结果”部分中另有说明，否则将细胞在盖玻片上生长两到三天(以确保细胞处于生长阶段)，然后再转移到inovitro
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体外ttfields装置(novocure公司，以色列海法(haifa,israel))的陶瓷培养皿中。在“结果”部分或对应的图例中指定生长条件(即，允许细胞在ttfields暴露与未暴露条件下生长的时间)。
139.体外肿瘤治疗场装置：将盖玻片转移至inovitro
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系统的陶瓷培养皿中，然后将其安装在inovitro
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基板上(novocure公司，以色列海法)。在200khz(1-4v/cm)下的肿瘤治疗场通过inovitro
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电力发电机施加。施加ttfields后，陶瓷培养皿中培养箱的环境温度跨度为20-27℃，目标温度为37℃。ttfields暴露的持续时间从0.5到72小时不等，此后将盖玻片取出并进行适当的生物测定(见下文)。对于可逆性实验，在进行适当的生物测定之前，将ttfields暴露盖玻片转移到无ttfields暴露的常规培养箱中24小时(在ttfields时期之
外，以评估ttfields对细胞膜通透性影响的可逆性)。在整个实验过程中，每24小时手动更换培养基以解决蒸发问题。对应的对照实验(无ttfields)通过以下来进行：将6孔或12孔板的同样的盖玻片放入常规湿润的组织培养箱(37℃，95％空气/5％co2)中，并且使细胞与ttfields暴露盖玻片平行生长。除非另有说明，否则所有实验均在每个条件和每个时间点至少三份样品中进行。
140.通过血细胞计数仪进行细胞计数测定：通过已建立的方案制备用于计数的细胞，并在zeiss primovert台式显微镜(美国加利福尼亚州都柏林(dublin,ca,usa))上可视化。除非另有说明，否则用血细胞计数器在胰蛋白酶消化的单细胞悬液上进行细胞计数，并计算四个细胞计数测量值的平均值，并四舍五入为最接近的整数。
141.生物发光成像：对于所有生物发光工作，我们使用基因修饰的gbm2、gbm39和u87-mg，其中胶质母细胞瘤细胞被慢病毒载体转染，该慢病毒载体表达萤火虫荧光素酶(对于fluc为gbm39)或gfp和萤火虫荧光素酶的融合蛋白(对于gbm2为gfp/fluc，而对于u87-mg为egfp-fluc)或海肾荧光素酶-红色荧光蛋白融合体(对于kr158b为rluc-rl8)。使用病毒上清液转导细胞，并在fluc的d-荧光素(0.3mg/ml终浓度)和rluc的腔肠素(1μg/ml)的存在下，通过测量细胞荧光素酶活性(ivis spectrum；马萨诸塞州沃尔曼的珀金
·
埃尔默(perkin elmer,waltman,ma))来确认荧光素酶的表达。
142.扫描电子显微镜(sem)：将5,000(低接种条件)至50,000(高接种条件)个u87-mg/egfp-fluc细胞或pcs-201成纤维细胞沉积在13mm玻璃盖玻片上，且然后准备用于ttfields实验。细胞在标准组织培养箱条件下(37℃，95％o2，5％co2)生长。在ttfields暴露和ttfields未暴露的实验结束时(高接种条件下为1天且低接种条件下为3天)，将盖玻片进行sem处理。所有roi分析均以盲法进行，其中负责sem图像采集的人员和进行数据分析的人员均不知道样品的实验条件。第三人知道样品的鉴别特征。
143.化学试剂：除非另有说明，否则所有化学药品均购自赛莱克化学公司(selleckchem inc.)(美国德克萨斯州休斯顿(houston,tx,usa))、赛默飞尔科技公司(thermo-fisher scientific)(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆(waltham,ma,usa))或西格玛-奥尔德里奇公司(sigma-aldrich)(美国密苏里州圣路易斯(st.louis,mo,usa))。纯化的萤火虫萤光素或萤火虫萤光素酶(sre0045-2mg)以及乙锭d细胞凋亡试剂盒(11835246001)购自西格玛
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奥尔德里奇公司(密苏里州圣路易斯)。分子量为4kda、20kda和50kda的葡聚糖-fitc(fd4、fd20和fd50)也购自西格玛
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奥尔德里奇公司。5-氨基乙酰丙酸(5-ala、aaa16942me)和膜联蛋白v-apc试剂盒(50712549)购自赛默飞尔科技公司(马萨诸塞州沃尔瑟姆)。
144.统计分析：prism 7.0软件(graphpad软件公司(graphpad software inc.)，美国加利福尼亚州拉霍亚(la jolla,ca,usa))用于确定数据是否正态分布。正态分布的数据通过均值的双向student t检验或方差分析(anova)比较进行分析，而非正态分布的数据通过非参数分析进行分析(例如，中位数的mann-whitney u检验比较)。统计显著性水平设定为α＝0.05。bonferroni或dunnet事后校正用于调整多次比较的α。所有数据均以范围、平均值
±
标准偏差、中位数(四分位间距)或百分比表示。在所有图中，统计学上显著差异的水平表示为：*p《0.05、**p《0.01和***p《0.001。