用于疫苗递送的细胞外囊泡的制作方法

用于疫苗递送的细胞外囊泡
1.相关申请的交叉引用
2.本pct申请要求2019年3月21日提交的美国临时申请第62/822,008号；2019年4月17日提交的第62/835,437号；2019年4月29日提交的第62/840,348号；2019年8月23日提交的第62/891,048号；2019年9月16日提交的第62/901,166号；2019年12月10日提交的第62/946,280号；和2020年3月2日提交的第62/984,146号的优先权权益，所述美国临时申请的每一个都通过引用以其整体并入本文。
3.通过efs-web电子提交的序列表的引用
4.本技术中提交的电子提交的序列表(名称：4000_032pc07_seque ncelisting_st25.txt，大小：283,505字节；以及创建日期：2020年3月20日)的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
5.本公开涉及经修饰的细胞外囊泡，例如外来体(例如，包含一种或多种有效载荷，例如抗原和佐剂/免疫调节剂)，其可用作可用于治疗和/或预防一系列医学病症，包括但不限于癌症、移植物抗宿主病(gvhd)、自身免疫性疾病、传染病和纤维化疾病的疫苗。本公开还涉及产生此类ev(例如，外来体)的方法及其用途。
技术背景
6.ev(例如，外来体)是细胞间通讯的重要介质。它们也是许多疾病(诸如癌症)的诊断和预后的重要生物标志物。作为药物递送媒介物，ev(例如，外来体)作为许多治疗领域中的新治疗方式，提供了优于常规药物递送方法(例如，肽免疫、dna疫苗)的许多有利方面。然而，尽管有其利方面，但许多ev(例如，外来体)的临床功效有限。例如，在ii期临床试验中，将树突状细胞来源的外来体(dex)作为不能手术的非小细胞肺癌(nsclc)患者的一线化学疗法后的维持性免疫疗法进行了研究。然而，试验因为未达到主要终点(至少50％的患者在化学疗法停止后具有4个月的无进展生存期(pfs))而被终止。besse,b.等人，oncoimmunology 5(4):e1071008(2015)。
7.因此，需要新的且更有效的工程化ev(例如，外来体)来更好地实现基于ev的技术的治疗性用途和其它应用。


技术实现要素：

8.本文提供了分离的ev(例如，外来体)，其包含(i)至少一种抗原和(ii)至少一种佐剂。在一些方面，ev包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种不同的抗原。在一些方面，ev包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种不同的佐剂。在一些方面，抗原不存在于i类和/或ii类mhc分子上。
9.在一些方面，ev(例如，外来体)不源自天然存在的抗原呈递细胞。在某些方面，ev(例如，外来体)不源自天然存在的树突状细胞、天然存在的b细胞、天然存在的肥大细胞、天
然存在的巨噬细胞、天然存在的中性粒细胞、天然存在的kupffer-browicz细胞、源自任何这些细胞的细胞或其任意组合。
10.在一些方面，ev(例如，外来体)诱导细胞免疫反应、体液免疫反应或细胞和体液免疫反应。在某些方面，与(i)不包含佐剂或抗原的相应的ev(例如，外来体)或(ii)没有ev的情况下的佐剂或抗原(即，非ev递送媒介物)相比，细胞免疫反应、体液免疫反应或细胞免疫反应和体液免疫反应的诱导增加了至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或更多。
11.在一些方面，本文所述的ev(例如，外来体)诱导cd4 t细胞反应、cd8 t细胞反应或cd4 和cd8 t细胞反应。在某些方面，ev(例如，外来体)不直接与t细胞的t细胞受体(tcr)相互作用。
12.在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)还包含第一支架部分。在某些方面，抗原与第一支架部分连接。在一些方面，佐剂与第一支架部分连接。在一些方面，ev(例如，外来体)还包含第二支架部分。在某些方面，抗原与第一支架部分连接，并且佐剂与第二支架部分连接。在一些方面，第一支架部分与第二支架部分相同。在其它方面，第一支架部分与第二支架部分不同。
13.在一些方面，第一支架部分是支架x。在其它方面，第一支架部分是支架y。在一些方面，第二支架部分是支架x。在某些方面，第二支架部分是支架y。
14.在一些方面，支架x能够：(i)将抗原锚定至ev(例如，外来体)的腔表面；(ii)将抗原锚定在ev(例如，外来体)的外表面上；(iii)将佐剂锚定至ev(例如，外来体)的腔表面上；(iv)将佐剂锚定ev(例如，外来体)的外表面上；或者(v)其组合。在某些方面，支架x选自由以下组成的组：前列腺素f2受体负调节因子(ptgfrn蛋白)；basigin(bsg蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(igsf2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(igsf3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(igsf8蛋白)；整联蛋白β-1(itgb1蛋白)；整联蛋白α-4(itga4蛋白)；4f2细胞表面抗原重链(slc3a2蛋白)；一类atp转运蛋白(atp1a1、atp1a2、atp1a3、atp1a4、atp1b3、atp2b1、atp2b2、atp2b3、atp2b4蛋白)及其任意组合。
15.在一些方面，支架y能够：(i)将抗原锚定至ev(例如，外来体)的腔表面；(ii)将佐剂锚定至ev(例如，外来体)的腔表面；或者(iii)两者皆有。在某些方面，支架y选自由以下组成的组：富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶c底物(marcks蛋白)；富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶c底物样蛋白1(marcksl1蛋白)；脑酸溶性蛋白1(basp1蛋白)及其任意组合。
16.在一些方面，抗原与ev(例如，外来体)(例如本文所述的那些)的腔表面上的第一支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)(例如本文所述的那些)的腔表面上的第二支架部分连接。在一些此类方面，(a)第一支架部分和第二支架部分中的每一种都是支架y；(b)第一支架部分是支架y，并且第二支架部分是支架x；(c)第一支架部分是支架x，并且第二支架部分是支架y；或者(d)第一支架部分和第二支架部分中的每一种都是支架x。
17.在一些方面，抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架部分连接，并且佐剂在ev的腔内。在某些方面，抗原在ev(例如，外来体)的腔内，并且佐剂与ev腔表面上的第一支架部分连接。在另外的方面，抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架部分连接，并且佐剂与外来体的外表面上的第二支架部分连接。在这些方面中的一些方面，(a)第一支
架部分是支架y，并且第二支架部分是支架x；或者(b)第一支架部分和第二支架部分中的每一种都是支架x。
18.在一些方面，抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架部分连接，并且佐剂与ev的腔表面内的第二支架部分连接。在这些方面的某些方面，(a)第一支架部分是支架x，并且第二支架部分是支架y；或者(b)第一支架部分和第二支架部分中的每一种都是支架x。
19.在一些方面，抗原在ev(例如，外来体)的腔内或与其腔表面连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内或与其腔表面连接。
20.在一些方面，抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架部分连接。在一些此类方面，第一支架部分和第二支架部分是支架x。
21.在一些方面，抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架部分连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内。在这些方面中的某些方面，第一个支架是支架x。
22.在一些方面，抗原在ev(例如，外来体)的腔内，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架部分连接。在这些方面中的一些方面，第一个支架是x。
23.在一些方面，抗原与ev(例如，外来体)的表面上的第一支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架部分连接。在某些方面，抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架部分连接。在这些方面中的一些方面，第一支架部分是支架x。
24.在一些方面，(i)抗原通过接头与第一支架部分连接，(ii)抗原通过接头与第二支架部分连接，(iii)佐剂通过接头与第一支架部分连接，(iv)佐剂通过接头与第二部分连接，或(v)其组合。在某些方面，接头是多肽。在其它方面，接头是非多肽部分。在一些方面，接头包含马来酰亚胺部分。在一些方面，接头包含胆固醇部分。
25.在一些方面，第一支架部分或第二支架部分是ptgfrn蛋白。在某些方面，第一支架部分或第二支架部分包含如seq id no:33中所示的氨基酸序列。在另外的方面，第一支架部分或第二支架部分包含与seq id no:1具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％同一性的氨基酸序列。
26.在一些方面，第一支架部分或第二支架部分是basp1蛋白。在一些方面，第一支架部分或第二支架部分包含(m)(g)(π)(x)(φ/π)(π)( )( )或(g)(π)(x)(φ/π)(π)( )( )的肽，其中每个括号位置代表氨基酸，并且其中π为选自由pro、gly、ala和ser组成的组的任意氨基酸，x为任意氨基酸，φ为选自由val、ile、leu、phe、trp、tyr和met组成的组的任意氨基酸，并且( )为选自由lys、arg和his组成的组的任意氨基酸；并且其中位置五不是( )并且位置六既不是( )也不是(asp或glu)。在某些方面，第一支架部分或第二支架部分包含seq id no:50-155中的任一个中所示的氨基酸序列。在另外的方面，第一支架部分或第二支架部分包含与seq id no:3具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％同一性的氨基酸序列。
27.本文还提供了ev(例如，外来体)，其包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中：(a)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接；(b)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，并且佐剂在ev
(例如，外来体)的腔内；(c)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接；(d)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接；(e)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接；(f)抗原与ev(例如，外来体)腔表面上的支架y连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接；(g)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接；(h)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接；(i)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接；(j)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接；(k)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内；(l)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接；(m)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接；(n)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接；(o)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内；(p)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接；(q)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接；(r)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔表面上；(s)抗原直接与ev的腔表面连接，并且佐剂直接与ev的腔表面连接；(t)抗原直接与ev的腔表面连接，并且佐剂在ev的腔内；(u)抗原直接与ev的腔表面连接，并且佐剂与ev的腔表面上的支架y连接；(v)抗原直接与ev的腔表面连接，并且佐剂与ev的腔表面上的支架x连接；(w)抗原直接与ev的腔表面连接，并且佐剂直接与ev的外表面连接；(x)抗原直接与ev的腔表面连接，并且佐剂与ev的外表面上的支架x连接；(y)抗原与ev的腔表面上的支架y连接，并且佐剂直接与ev的腔表面连接；(z)抗原与ev的腔表面上的支架y连接，并且佐剂直接与ev的外表面连接；(aa)抗原与ev的腔表面的支架x连接，并且佐剂直接与ev的腔表面连接；(bb)抗原与ev的腔表面上的支架x连接，并且佐剂直接与ev的外表面连接；(cc)抗原在ev的腔内，并且佐剂直接与ev的腔表面连接；或者(dd)抗原在ev的腔内，并且佐剂直接与ev的外部连接。
28.在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)还包含免疫调节剂。在一些方面，免疫调节剂直接与ev的腔表面或外表面连接。在某些方面，免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接。在一些方面，免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。在另外的方面，免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔表面上。
29.在一些方面，ev包含抗原、佐剂和免疫调节剂，其中：(i)抗原通过接头直接与腔表面连接，(ii)佐剂通过接头直接与腔表面连接，(iii)免疫调节剂通过接头直接与腔表面连接，(iv)抗原通过接头直接与外表面连接，(v)佐剂通过接头直接与外表面连接，(vi)免疫调节剂通过接头直接与外表面连接，或(vii)其组合。在一些方面，ev包含抗原、佐剂和免疫调节剂，其中：(i)抗原通过接头与支架x连接，(ii)佐剂通过接头与支架x连接，(iii)免疫调节剂通过接头与支架x连接，(iv)抗原通过接头与支架y连接，(v)佐剂通过接头与支架y
连接，(vi)免疫调节剂通过接头与支架y连接，或(vii)其组合。在一些方面，免疫调节剂在ev的腔内。
30.在一些方面，接头是多肽。在某些方面，接头是非多肽部分。在一些方面，接头包含马来酰亚胺部分。在一些方面，接头包含胆固醇部分。
31.在一些方面，免疫调节剂包括负检查点调节剂的抑制剂或负检查点调节剂的结合配偶体的抑制剂。在某些方面，负检查点调节剂包括细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、淋巴细胞活化基因3(lag-3)、含t细胞免疫球蛋白粘蛋白的蛋白3(tim-3)、b淋巴细胞和t淋巴细胞衰减子(btla)、具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)、t细胞活化的v结构域ig抑制子(vista)、腺苷a2a受体(a2ar)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)、吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)、cd20、cd39、cd73或其任意组合。
32.在一些方面，免疫调节剂包括正共刺激分子的激活剂或正共刺激分子的结合配偶体的激活剂。在某些方面，正共刺激分子是tnf受体超家族成员(例如，cd120a、cd120b、cd18、ox40、cd40、fas受体、m68、cd27、cd30、4-1bb、trailr1、trailr2、trailr3、trailr4、rank、ocif、tweak受体、taci、baff受体、atar、cd271、cd269、aitr、troy、cd358、tramp和xedar)。在一些方面，正共刺激分子的激活剂是tnf超家族成员(例如，tnfα、tnf-c、ox40l、cd40l、fasl、light、tl1a、cd27l、siva、cd153、4-1bb配体、trail、rankl、tweak、april、baff、camlg、ngf、bdnf、nt-3、nt-4、gitr配体和eda-2)。在另外的方面，正共刺激分子是cd28超家族共刺激分子(例如，icos或cd28)。在一些方面，正共刺激分子的激活剂是icosl、cd80或cd86。
33.在一些方面，免疫调节剂包括细胞因子或细胞因子的结合配偶体。在某些方面，细胞因子包括il-2、il-4、il-7、il-10、il-12、il-15、il-21、ifn-γ、il-1α、il-1β、il-1ra、il-18、il-33、il-36α、il-36β、il-36γ、il-36ra、il-37、il-38、il-3、il-5、il-6、il-11、il-13、il-23、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、粒细胞-集落刺激因子(g-csf)、白血病抑制因子(lif)、干细胞因子(scf)、血小板生成素(tpo)、巨噬细胞-集落刺激因子(m-csf)、红细胞生成素(erythropoieticn)(epo)、flt-3、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、il-19、il-20、il-22、il-24、tnf-α、tnf-β、baff、april、淋巴毒素β(tnf-γ)、il-17a、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e、il-17f、il-25、tslp、il-35、il-27、tgf-β或其组合。
34.在一些方面，免疫调节剂包含支持生发中心反应所需的细胞内相互作用的蛋白质。在某些方面，支持生发中心反应所需的细胞内相互作用的蛋白质包括信号传导淋巴细胞活化分子(slam)家族成员、slam相关蛋白质(sap)、icos-icosl、cd40-40l、cd28/b7、pd-1/l1、il-4/il4r、il21/il21r、tlr4、tlr7、tlr8、tlr9、cd180、cd22或其组合。在一些方面，slam家族成员包括slam家族成员1、cd48、cd229(ly9)、ly108、2b4、cd84、ntb-a、cracc、blame、cd2f-10或其组合。
35.本文还提供了分离的ev(例如，外来体)，其包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中：(a)抗原与ev的腔表面上的第一支架y连接，并且免疫调节剂与ev的腔表面上的第二支架y连接；(b)抗原与ev的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂在ev的腔内；(c)抗原在ev的腔内，并且免疫调节剂与ev的腔表面上的支架y连接；(d)抗原与ev的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂与ev的外表面上的支架x连接；(e)抗原在ev的腔内，并且免疫调节剂与ev的外表面上的支架x连接；(f)抗原与ev的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂与ev的
腔表面上的支架x连接；(g)抗原在ev的腔内，并且免疫调节剂与ev的腔表面上的支架x连接；(h)抗原与ev的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev的外表面上的支架x连接；(i)抗原与ev的外表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev的外表面上的第二支架x连接；(j)抗原与ev的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev的腔表面上的支架y连接；(k)抗原与ev的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂在ev的腔内；(l)抗原与ev的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev的腔表面上的支架x连接；(m)抗原与ev的腔表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev的腔表面上的第二支架x连接；(n)抗原与ev的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev的腔表面上的支架y连接；(o)抗原与ev的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂在ev的腔内；(p)抗原与ev的外表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev的腔表面上的第二支架x连接；(q)抗原与ev的腔表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev的外表面上的第二支架x连接；(r)抗原在ev的腔内，并且免疫调节剂在ev的腔内；(s)抗原直接与ev的腔表面连接，并且免疫调节剂直接与ev的腔表面连接；(t)抗原直接与ev的腔表连接，并且免疫调节剂在ev的腔内；(u)抗原直接与ev的腔表面连接，并且免疫调节剂与ev的腔表面上的支架y连接；(v)抗原直接与ev的腔表面连接，并且免疫调节剂与ev的腔表面上的支架x连接；(w)抗原直接与ev的腔表面连接，并且免疫调节剂直接与ev的外表面连接；(x)抗原直接与ev的腔表面连接，并且免疫调节剂与ev的外表面上的支架x连接；(y)抗原与ev的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂直接与ev的腔表面连接；(z)抗原与ev的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂直接与ev的外部连接；(aa)抗原与ev的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂直接与ev的腔表面连接；(bb)抗原与ev的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂直接与ev的外部连接；(cc)抗原在ev的腔内，并且免疫调节剂直接与ev的腔表面连接；或者(dd)抗原在ev的腔内，并且免疫调节剂直接与ev的外部连接。
36.在一些方面，包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂的ev(例如，外来体)还包含佐剂(例如，本文所述的那些)。在这些方面中的一些方面，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接。在这些方面中的一些方面，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。在另外的方面，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内。在一些方面，佐剂直接与ev的腔表面或外表面连接。
37.在一些方面，抗原是肿瘤抗原。在一些方面，肿瘤抗原包括甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、上皮肿瘤抗原(eta)、粘蛋白1(muc1)、tn-muc1、粘蛋白16(muc16)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(mage)、肿瘤蛋白p53(p53)、cd4、cd8、cd45、cd80、cd86、程序性死亡配体1(pd-l1)、程序性死亡配体2(pd-l2)、ny-eso-1、psma、tag-72、her2、gd2、cmet、egfr、间皮素、vegfr、α-叶酸受体、ce7r、il-3、睾丸癌抗原、mart-1gp100、tnf相关凋亡诱导配体、brachyury(例如，在黑色素瘤中表达的抗原(prame))、维尔姆斯肿瘤1(wt1)、cd19、cd22或其任意组合。
38.在一些方面，抗原源自细菌、病毒、真菌、原生动物或其任意组合。在某些方面，抗原源自致癌病毒。在一些方面，抗原源自人γ疱疹病毒4(爱泼斯坦巴尔病毒)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)、hiv(例如，hiv-1、hiv-2)、冠状病毒(例如，covid-19、mers-cov和sars cov)、丝状病毒(例如马尔堡病毒和
埃博拉病毒)、化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、疟原虫属种(例如，间日疟原虫和恶性疟原虫)、基孔肯雅病毒(chikungunya virus)、人乳头瘤病毒(hpv)、乙型肝炎、丙型肝炎、人疱疹病毒8、默克尔细胞多瘤病毒(merkel cell polyomavirus)(mcv)、布尼亚病毒(例如，汉坦病毒)、沙粒病毒(arena virus)(例如，lcmv病毒和拉沙病毒(lassa virus))、黄病毒(例如，登革热病毒、寨卡病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒和黄热病病毒)、肠道病毒(例如，脊髓灰质炎病毒)、星状病毒(例如，胃肠炎病毒)、弹状病毒科(例如，狂犬病病毒)、包柔氏疏螺旋体(borrelia burgdorferi)和梅奥疏螺旋体(burrelia mayonii)(例如，莱姆病)、单纯疱疹病毒2(hsv2)、克雷伯氏菌属某种(klebsiella sp.)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、肠球菌属某种(enterococcus sp.)、变形杆菌属某种(proteus sp.)、肠杆菌属某种(enterobacter sp.)、放线菌属某种(actinobacter sp.)、凝固酶阴性葡萄球菌属(coagulase-negative staphylococci)(cons)、支原体属某种(mycoplasma sp.)、腺病毒、腺相关病毒(aav)或其组合。
39.在一些方面，佐剂是干扰素基因刺激物(sting)激动剂、toll样受体(tlr)激动剂、炎症介质、rig-i激动剂、α-gal-cer(nkt激动剂)、热休克蛋白(例如，hsp65和hsp70)、c型凝集素激动剂(例如，β葡聚糖(dectin 1)、壳多糖和凝胶多糖(curdlan))或其任意组合。
40.在一些方面，佐剂是sting激动剂。在某些方面，sting激动剂包括环状二核苷酸sting激动剂或非环状二核苷酸sting激动剂。
41.在一些方面，佐剂是tlr激动剂。在某些方面，tlr激动剂包括tlr2激动剂(例如，脂磷壁酸、非典型lps、malp-2和malp-404、ospa、孔蛋白(porin)、lcrv、脂甘露聚糖(lipomannan)、gpi锚、溶血磷脂酰丝氨酸、脂磷聚糖(lpg)、糖磷脂酰肌醇(gpi)、酵母聚糖(zymosan)、hsp60、gh/gl糖蛋白、血凝素)、tlr3激动剂(例如，双链rna，例如poly(i:c))、tlr4激动剂(例如，脂多糖(lps)、脂磷壁酸、β-防御素2、纤连蛋白eda、hmgb1、snapin、腱糖蛋白c(tenascin c))、tlr5激动剂(例如，鞭毛蛋白)、tlr6激动剂、tlr7/8激动剂(例如，单链rna、cpg-a、poly g10、poly g3、瑞喹莫德(resiquimod))、tlr9激动剂(例如，未甲基化的cpg dna)或其任意组合。
42.在一些方面，本文公开的ev是外来体。
43.在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)还包含靶向部分。在某些方面，靶向部分与树突状细胞的标志物特异性结合。在某些方面，标志物仅存在于树突状细胞上。在一些方面，树突状细胞包括浆细胞样树突状细胞(pdc)、髓样/常规树突状细胞1(cdc1)、髓样/常规树突状细胞2(cdc2)、炎性单核细胞源性树突状细胞(inflammatory monocyte derived dendritic cell)、朗格汉斯细胞、真皮树突状细胞、表达溶菌酶的树突状细胞(lysodc)、kupffer细胞或其任意组合。在某些方面，树突状细胞是cdc1。在另外的方面，所述标志物包括c型凝集素结构域家族9成员a(clec9a)蛋白、树突状细胞特异性细胞间粘附分子-3-捕捉非整联蛋白(dc-sign)、cd207、cd40、clec6、树突状细胞免疫受体(dcir)、dec-205、凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lox-1)、marco、clec12a、clec10a、dc-无唾液酸糖蛋白受体(dc-asgpr)、dc免疫受体2(dcir2)、dectin-1、巨噬细胞甘露糖受体(mmr)、bdca-1(cd303，clec4c)、dectin-2、bst-2(cd317)、langerin、cd206、cd11b、cd11c、cd123、cd304、xcr1、axl、siglec 6、cd209、sirpa、cx3cr1、gpr182、cd14、cd16、cd32、cd34、cd38、cd10或其任意
组合。在某些方面，标志物是clec9a蛋白。
44.在一些方面，靶向部分特异性结合t细胞的标志物。在某些方面，标志物包括cd3分子。
45.在一些方面，靶向部分直接与ev的外表面连接。在一些方面，靶向部分与ev的外表面上的支架x连接。在一些方面，靶向部分通过接头直接与ev的外表面连接。在一些方面，靶向部分通过接头与支架x连接。在某些方面，接头是多肽。在一些方面，接头是非多肽部分。在一些方面，接头包含马来酰亚胺部分。在一些方面，接头包含胆固醇部分。
46.在一些方面，本文所述的ev(例如，外来体)的支架y包含n端结构域(nd)和效应结构域(ed)，其中nd和/或ed与ev的管腔表面缔合。在一些方面，nd通过肉豆蔻酰化与外来体的腔表面缔合。在一些方面，ed通过离子相互作用与外来体的腔表面缔合。在一些方面，ed在序列中包含(i)一个碱性氨基酸或(ii)两个或更多个碱性氨基酸，其中碱性氨基酸选自由以下组成的组：lys、arg、his及其任意组合。在一些方面，碱性氨基酸是(lys)n，其中n为1与10之间的整数。在一些方面，ed包含lys(k)、kk、kkk、kkkk(seq id no:205)、kkkkk(seq id no:206)、arg(r)、rr、rrr、rrrr(seq id no:207)；rrrrr(seq id no:208)、kr、rk、kkr、krk、rkk、krr、rrk、(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(seq id no:209)、(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(seq id no:210)或其任意组合。
47.在一些方面，nd包含如g:x2:x3:x4:x5:x6所示的氨基酸序列，其中g代表gly；其中“:”代表肽键，其中x2至x6中的每一个独立地是氨基酸，并且其中x6包括碱性氨基酸。在一些方面，
48.(i)x2选自由pro、gly、ala和ser组成的组；
49.(ii)x4选自由pro、gly、ala、ser、val、ile、leu、phe、trp、tyr、gln和met组成的组；
50.(iii)x5选自由pro、gly、ala和ser组成的组；
51.(iv)x6选自由lys、arg和his组成的组；或者
52.(v)(i)-(iv)的任意组合。
53.在一些方面，nd包含氨基酸序列g:x2:x3:x4:x5:x6，其中
54.(i)g代表gly；
55.(ii)“:”代表肽键；
56.(iii)所述x2是选自由pro、gly、ala和ser组成的组的氨基酸；
57.(iv)所述x3是氨基酸；
58.(v)所述x4是选自由pro、gly、ala、ser、val、ile、leu、phe、trp、tyr、gln和met组成的组的氨基酸；
59.(vi)所述x5是选自由pro、gly、ala和ser组成的组的氨基酸；以及
60.(vii)所述x6是选自由lys、arg和his组成的组的氨基酸：
61.在一些方面，x3选自由asn、gln、ser、thr、asp、glu、lys、his和arg组成的组。
62.在一些方面，nd和ed通过接头连接。在一些方面，接头包含一个或多个氨基酸。在一些方面，nd包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)ggklskk(seq id no:211)，(ii)gaklskk(seq id no:212)，(iii)ggkqskk(seq id no:213)，(iv)ggklakk(seq id no:214)或(v)ggklsk(seq id no:215)或(vi)其任意组合。在一些方面，nd包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)ggklskkk(seq id no:238)，(ii)ggklskks(seq id no:239)，(iii)
gaklskkk(seq id no:240)，(iv)gaklskks(seq id no:241)，(v)ggkqskkk(seq id no:242)，(vi)ggkqskks(seq id no:243)，(vii)ggklakkk(seq id no:244)，(viii)ggklakks(seq id no:245)和(ix)其任意组合。在一些方面，nd包含氨基酸序列ggklskk(seq id no:211)。
63.在一些方面，支架y的长度为至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少约85个、至少约90个、至少约95个、至少约100个、至少约105个、至少约110个、至少约120个、至少约130个、至少约140个、至少约150个、至少约160个、至少约170个、至少约180个、至少约190个或至少约200个氨基酸。在一些方面，支架y包含(i)ggklskkkkgynvn(seq id no:246)、(ii)gaklskkkkgynvn(seq id no:247)、(iii)ggkqskkkkgynvn(seq id no:248)、(iv)ggklakkkkgynvn(seq id no:249)、(v)ggklskkkkgysgg(seq id no:250)、(vi)ggklskkkkgsggs(seq id no:251)、(vii)ggklskkkksggsg(seq id no:252)、(viii)ggklskkksggsgg(seq id no:253)、(ix)ggklskksggsggs(seq id no:254)、(x)ggklsksggsggsv(seq id no:255)或(xi)gakkskkrfsfkks(seq id no:256)。在某些方面，支架y由以下序列组成：(i)ggklskkkkgynvn(seq id no:246)、(ii)gaklskkkkgynvn(seq id no:247)、(iii)ggkqskkkkgynvn(seq id no:248)、(iv)ggklakkkkgynvn(seq id no:249)、(v)ggklskkkkgysgg(seq id no:250)、(vi)ggklskkkkgsggs(seq id no:251)、(vii)ggklskkkksggsg(seq id no:252)、(viii)ggklskkksggsgg(seq id no:253)、(ix)ggklskksggsggs(seq id no:254)、(x)ggklsksggsggsv(seq id no:255)或(xi)gakkskkrfsfkks(seq id no:256)。
64.在一些方面，支架y不包含在n端处的met。在一些方面，支架y包含在支架蛋白的n端处的肉豆蔻酰化氨基酸残基。在一些方面，支架y的n端处的氨基酸残基是gly。在一些方面，支架y的n端处的氨基酸残基是合成的。在一些方面，支架y的n端处的氨基酸残基是甘氨酸类似物。
65.本文提供了药物组合物，其包含本文所述的ev(例如，外来体)和药学上可接受的载剂。
66.本文提供了产生本公开的ev(例如，外来体)的细胞。本公开还提供了包含一种或多种载体的细胞，其中载体包含核酸序列，所述核酸序列编码：(i)抗原(例如，本文所述的那些)，(ii)佐剂(例如，本文所述的那些)，(iii)免疫调节剂，(iv)靶向部分(例如，本文所述的那些)，或(v)其组合。
67.本文提供了包含本文所述的ev(例如，外来体)和使用说明的药盒。本文还提供了包含本文所述的任何ev(例如，外来体)的ev-药物缀合物。
68.本文提供了制备ev(例如，外来体)的方法，其包括在合适的条件下培养本文公开的细胞以及获得ev(例如，外来体)。
69.本文提供了诱导有需要的受试者的免疫反应的方法，其包括向受试者施用本公开的ev(例如，外来体)。
70.本文提供了预防或治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括施用本文所述的ev(例如，外来体)，其中疾病与抗原相关联。在某些方面，所述疾病是癌症。在一些方面，所述癌症包括膀胱癌、宫颈癌、肾细胞癌、睾丸癌、结直肠癌、肺癌、头颈癌、卵巢癌、淋巴瘤、肝癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、白血病、胰腺癌或其组合。在其它方面，所述疾病是感染。
71.在一些方面，肠胃外、口服、静脉内、肌内、瘤内、鼻内、皮下或腹膜内施用ev(例如，外来体)。
72.在一些方面，本文公开的方法(例如，诱导免疫反应或者预防或治疗疾病的方法)包括施用附加治疗剂。
73.本文提供了抑制或减少有需要的受试者的癌症转移的方法，其包括向受试者施用本公开的ev(例如，外来体)。
附图说明
74.图1a示出了包含一种或多种抗原、一种或多种佐剂、一种或多种用于靶向部分的分子或其任意组合的示例性ev。
75.图1b示出了包含抗原和佐剂的ev(例如，外来体)的非限制性实例(a-r)。“ag”和“ad”分别表示抗原和佐剂。箭头表示支架y部分。“x”表示支架x部分。从本公开可以明显看出，图1b中所示的ev(例如，外来体)可包含多种抗原、多种佐剂或多种抗原和多种佐剂。ev(例如，外来体)还可包含一个或多个附加部分(例如，免疫调节剂和/或靶向部分)。在整个本公开中提供了对此类ev(例如，外来体)的进一步描述。
76.图2示出了七种包含抗原和免疫调节剂的外来体的选定实例。“ag”和“im”分别表示抗原和免疫调节剂。箭头表示支架y部分。“x”表示支架x部分。如从本公开可以明显看出，图2中所示的ev(例如，外来体)可包含多种抗原、多种免疫调节剂或多种抗原和多种免疫调节剂。ev(例如，外来体)还可以进一步包含一个或多个附加部分(例如佐剂和/或靶向部分)。在整个本公开中提供了对此类ev(例如，外来体)的进一步描述。
77.图3a和图3b示出了工程化ev(例如，包含ova-支架y并装载有sting激动剂(“py-ova-exosting”)的外来体)在静脉内施用至原初c57/bl6小鼠中后诱导ova特异性cd8 t细胞免疫反应的能力。在脾脏(图3a)和合并的外周血单核细胞(pbmc)(图3b)中都显示了ova特异性cd8 t细胞免疫反应的诱导。以下构建体用作对照：(i)抗cd40抗体与可溶性ova蛋白(不是ev(例如外来体)的一部分)的组合(“ip acd40 ova”)；(ii)caim(ps)2difluor(rp/sp)(“cl656”；sting激动剂)与可溶性ova蛋白(不是ev(例如，外来体)的一部分)的组合(“cl656 ova”)；(iii)过表达支架x，装载有sting激动剂与可溶性ova蛋白(ova不是ev(例如，外来体)的一部分)的组合的ev，例如外来体(“px-exosting ova”)；和(iv)仅表达ova-支架y融合蛋白(“py-ova”)的ev(例如，外来体)。单个地显示数据，以及将数据显示为平均值
±
s.d。“***”指示单因素anova的p《0.0005。
78.图4a和图4b示出了工程化ev(例如，包含ova-支架y并装载有sting激动剂的外来体(“py-ova-exosting”))在鼻内施用至原初c57/bl6小鼠中后诱导ova特异性cd8 t细胞免疫反应的能力。在脾脏(图4a)和肺(图4b)中都显示了ova特异性cd8 t细胞免疫反应的诱导。以下构建体用作对照：(i)抗cd40抗体与可溶性ova蛋白(不是ev(例如外来体)的一部
ev”)。****p《0.0001。图11b提供了在以三种不同剂量(0.4nm、1nm或4nm)用以下物质之一刺激后小鼠树突状细胞中sting活性的比较：(i)可溶性sting激动剂(“游离sting”)，(ii)仅表达支架x蛋白(即，无抗clec9a抗体片段)并装载有sting激动剂的ev(例如，外来体)(“prx-sting”)，(iii)表达与支架x蛋白连接的抗clec9a抗体片段的外来体(“aclec9a-sting”)；和(iv)表达非相关抗体并装载有sting激动剂的ev(例如，外来体)(“同种型-sting”)。sting活性通过dc产生的il-12的量来显示。
86.图12a和图12b示出了施用途径对表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的工程化外来体("py-ova exovacc")诱导ova特异性cd8 t
em
细胞的影响。所示施用途径包括：(i)静脉内(“iv”)，(ii)鼻内(“in”)和(iii)皮下(“sq”)。“subq av”对应于用商购可得的制剂(addavax
tm
,inviogen)("subq av")中的可溶性ova处理的动物。图12a提供了显示结果平均值的条形图。***,p＝0.0013；**,p＝0.0074；ns，通过单因素anova，与ova addavax
tm
组相比不显著。图12b提供了来自不同治疗组的代表性样品的流式细胞图。每个流式图的右上象限中提供的百分比代表观察到的ova特异性cd8
t
em
细胞反应的百分比。不同的治疗组显示在每个流式图的左上象限中。
87.图13a、图13b和图13c示出了小鼠肺中ova特异性驻留记忆(t
rm
)cd8 t细胞(图13a)和cd4 t细胞(图13b)的诱导，所述小鼠接受了两次表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的外来体("py-ova exovacc")的施用。对照动物接受以下物质之一：(i)可溶性ova(“ova”)，(ii)仅表达ova-支架y融合蛋白的外来体(“pyova”)，(iii)可溶性ova 可溶性poly i:c(“ova poly i:c”)，以及(iv)仅表达ova-支架y融合蛋白 可溶性poly i:c的外来体(“pyova poly i:c”)。图13c提供了图13a和图13b中所示数据的代表性样品的流式细胞图。顶行对应于cd8 t细胞。底行对应于cd4 t细胞。
88.图14a、图14b、图14c、图14d、图14e、图14f、图14g、图14h、图14i、图14j、图14k、图14l、图14m和图14n示出了接受以下物质之一的小鼠中的抗肿瘤免疫反应：(i)经由鼻内施用的表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的外来体(“exovacc(in)”)，(ii)经由皮下施用的表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的外来体("exovacc(sq)")，(iii)经由鼻内施用的可溶性ova 可溶性poly i:c(“ova poly i:c(in)”)，和(iv)经由皮下施用的可溶性ova 可溶性poly i:c(“ova poly i:c(sc)”)。未处理的动物用作对照。图14a提供了实验设计的示意图。图14b和图14n提供了来自两次独立实验的存活数据。图14c和图14i(未处理)、图14d和图14j(ova poly i:c(sc))、图14e和图14l(exovacc(sq))、图14f和图14k(ova poly i:c(in))、图14g和图14m(exovacc(in))提供了来自两次独立实验的肿瘤体积数据。图14e和14g中显示的百分比代表完全受保护的动物(总组的)数量。图14h示出了每个不同治疗组的肿瘤生长速度。在图14h中，*,p＝0.028；ns，通过单因素anova，与未处理的对照相比不显著。
89.图15a、图15b、图15c、图15d、图15e和图15f示出了本文公开的工程化ev(例如，外来体)在鼻内施用后迁移至肠系膜淋巴结的能力。图15a提供了实验设计的示意图。图15b、图15c和图15d分别示出了如通过ifn-γelispot所测量的脾脏、肺和肠系膜淋巴结中ova特异性cd4 t细胞(每个处理组中的左条块)和ova特异性cd8 t细胞(每个处理组中的右条块)的频率。图15e和图15f分别示出了如通过流式细胞术所测量的肺和脾脏中ova特异性效应记忆cd8 t细胞的频率。
90.图16a、图16b和图16c示出了包含支架x并装载有sting激动剂的表面工程化ev(例如，外来体)诱导抗原特异性免疫反应的能力。图16a提供了实验设计的示意图。如所显示的，cd4肽(itgb1)和/或cd8肽(lama4)与ev(例如，外来体)的支架x连接。图16b和图16c分别示出了如通过ifn-γelispot所测量的不同处理组的动物脾脏中itgb1特异性cd4 t细胞和lama4特异性cd8 t细胞的频率。
91.图17a、图17b和图17c示出了包含支架x并装载有cpg佐剂的表面工程化ev(例如，外来体)诱导抗原特异性免疫反应的能力。图17a提供了实验设计的示意图。如图所示，使用马来酰亚胺化学将(i)单独的cd8肽(lama4)(组2)或(ii)cd8肽和cd4肽(itgb1)(组3)与支架x连接。对照ev仅表达支架x(即，无肽和无cpg佐剂)(组1)。图17b和图17c分别显示了如通过ifn-γelispot所测量的不同处理组的动物脾脏中itgb1特异性cd4 t细胞和lama4特异性cd8 t细胞的频率。
92.图18a、图18b、图18c、图18d、图18e、图18f、图18g、图18h、图18i、图18j、图18k和图18l示出了如通过蛋白质印迹所测量的本文公开的表面工程化ev(例如，外来体)中的hpv16和hpv18的e6和e7蛋白的表达。在图18a、图18b、图18c、图18d、图18e和图18f中，用编码以下全长蛋白质之一的质粒转染293sf细胞：(i)hpv16 e6,(ii)hpv16 e7,(iii)hpv16 e6/e7,(iv)hpv 18e6,(v)hpv18 e7和(vi)hpv18 e6/e7。在图18g、图18h、图18i、图18j、图18k和图18l中，使用分裂蛋白表达策略。用下列质粒之一转染293sf细胞：(i)puc57-kan-aavs1hr-caggs-ptgfrn-flag-cohpv16ne6("pcb-2014")、(ii)puc57-kan-aavs1hr-caggs-ptgfrn-flag-cohpv16ce6("pcb-2015")、(iii)puc57-kan-aavs1hr-caggs-cohpv16ne6-flag-ptgfrn("pcb-2016")、(iv)puc57-kan-aavs1hr-caggs-cohpv16ce6-flag-ptgfrn("pcb-2017")、(v)puc57-kan-aavs1hr-caggs-pry-flag-cohpv16ne6("pcb-2018")和(vi)puc57-kan-aavs1hr-caggs-pry-flag-cohpv16ce6("pcb-2019")。质粒的详细描述可见于实施例23中(也参见表11)。
93.图19a、图19b和图19c示出了装载有sting激动剂并表达(i)与支架x连接的抗clec9a靶向部分和(ii)与支架y连接的ova的表面工程化ev(例如，外来体)的能力。图19a提供了实验设计的示意图。图19b和图19c示出了来自图19a所示的不同处理组的动物的脾脏中观察到的ova特异性cd8 效应记忆t细胞的数量。图19b示出了单次ev施用后一周的结果。图19c示出了第二剂ev施用后一周的结果。
94.图20a、图20b和图20c示出了经工程化表达ova-支架y并装载有sting激动剂的ev(例如，外来体)在体内施用后诱导抗原特异性体液免疫反应的能力。图20a提供了实验设计的示意图。如所显示的，这些动物接受了下列物质之一：(i)单独的可溶性ova(组1)，(ii)与游离sting激动剂组合的可溶性ova(组2)，(iii)仅表达ova-支架y(“pyova”)的ev(例如，外来体)(组3)，(iv)与游离sting激动剂组合的pyova(组4)，(v)表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的工程化外来体("py-ova exovacc")(组5)，以及(vi)与明矾组合的可溶性ova。图20b提供了血清中ova特异性igg1抗体量的比较。图20c提供了血清中ova特异性iga抗体量的比较。
95.图21示出了am152(环丙烷羧酸，1-[4'-[3-甲基-4-[[[(1r)-1-苯基乙氧基]羰基]氨基]-5-异噁唑基][[1,1'-联苯基]-4-基])和am095(1,1
′‑
联苯基]-4-乙酸、4
′‑
[3-甲基-4-[[[(1r)-1-苯基乙氧基]羰基]氨基]-5-异噁唑基[]-)的化学结构。标记为1和2的箭头
表示适于衍生以引入马来酰亚胺反应性基团的位置(羧酸和氨基甲酸酯)。am152中所示的相应位置也存在于am095中。
[0096]
图22提供了示意图，其示出了lpa1拮抗剂(am152)与外来体的缀合，以产生一群在其表面上包含有多个lpa1拮抗剂分子的外来体。
[0097]
图23示出了马来酰亚胺反应性基团可如何通过其羧酸基团添加到am152的实例。所述实例显示马来酰亚胺基团是反应性复合物的一部分，该反应性复合物包含ala-val可裂解的接头和介于马来酰亚胺基团与羧酸反应性氯甲基苯基团之间的c5间隔子。
[0098]
图24示出了可用于衍生am152的两种示例性试剂。顶部试剂包含(i)可与am152的羧酸基团反应的氯甲基苯基团和(ii)马来酰亚胺基团；并且介于它们之间的是可裂解的cit-val二肽和c5间隔子。底部试剂包含(i)可与am152的羧酸基团反应的氯甲基苯基团和(ii)马来酰亚胺基团，并且介于它们之间的是可裂解的ala-val二肽和c5间隔子。
[0099]
图25示出了裂解缀合产物中的cit-val或ala-val二肽(例如，通过组织蛋白酶b)产生的产物。所述产物，即am152苯胺酯，可通过内源酯酶进一步加工，产生游离酸am152产物。
[0100]
图26和图27示出了几种包含游离马来酰亚胺基团和不同间隔子组合的am152衍生物。
[0101]
图28示出了在保护羧酸基团后，可能使用用于衍生羧酸基团的相同试剂在其氨基甲酸酯基团处衍生am152。随后将所得产物去保护以释放羧酸基团。
[0102]
图29示出了其中具有马来酰亚胺基团的复合物通过接头附接至am152的氨基甲酸酯基团的实例。合适的接头包括本说明书中公开的任何接头。
[0103]
图30示出了am152可以附接至衍生的锚定部分，而不是经衍生并随后通过反应性马来酰亚胺基团附接至锚定部分。
[0104]
图31是显示马来酰亚胺化学可如何用于例如通过本文所述的支架部分(例如，支架x蛋白或其片段或脂质)将生物活性分子(bam)与ev(例如，外来体)化学地连接的示意图。附图中描述的接头是任选的，并且当存在时可以包含接头(例如，可裂解的接头)或其组合。
具体实施方式
[0105]
本公开涉及一种工程化ev(例如，外来体)，其将抗原和佐剂同时递送至相同的抗原呈递细胞。ev平台允许抗原的腔表达和免疫共刺激分子的表面表达，旨在产生模块化疫苗接种系统。可将各种佐剂掺入ev(例如，外来体)中以增强针对多种抗原的免疫反应。工程化ev可包含一种或多种有效载荷，并且可改善ev的至少一个特性(例如，本文公开的那些)及其用途。在一些方面，一种或多种有效载荷包括抗原、佐剂和/或免疫调节剂。在某些方面，ev(例如，外来体)包含一种或多种附加的部分(例如，靶向部分)。在一些方面，一种或多种有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)和/或一种或多种附加的部分(例如，靶向部分)可以附接(或连接)到在ev(例如，外来体)表面上或ev(例如，外来体)腔表面的一种或多种支架部分。因此，本公开的ev允许疫苗的平台递送媒介物(即，exovacc
tm
)，其中ev上的抗原和/或在一些方面，一种或多种有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂可以特定方式组合)和/或被不同的抗原和/或一种或多种佐剂或免疫调节剂替代。更多附加的部分(例如，靶向部分)可以直接附接(或连接)至ev(例如，外来体)的外表面和/或腔表面。在本
公开中示出了各个方面的非限制性实例。
[0106]
i.定义
[0107]
为了更容易理解本说明书，首先定义某些术语。在整个详述的说明书中阐述了附加的定义。
[0108]
应当注意，术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”)实体是指一个或多个/种该实体；例如，“一个/种(a)核苷酸序列”被理解为代表一个或多个/种核苷酸序列。因此，术语“一个/种(a)”(或“一个/种(an)”)、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换使用。
[0109]
此外，本文使用的“和/或”应被视为具体地公开两个指定特征或组分中的每个与或不与另一个一起存在。因此，如在本文中诸如“a和/或b”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独的)和“b”(单独的)。同样，如在诸如“a、b和/或c”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括以下方面的每一方面：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独的)；b(单独的)；和c(单独的)。
[0110]
应当理解，本文无论在何处用措辞“包含/包括(comprising)”来描述方面，都还提供了以“由...组成”和/或“基本上由...组成”描述的其它类似方面。
[0111]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，the concise dictionary of biomedicine and molecular biology,juo,pei-show，第2版，2002,crc press；the dictionary of cell and molecular biology，第3版，1999,academic press；和the oxford dictionary of biochemistry and molecular biology,revised,2000,oxford university press为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
[0112]
单位、前缀和符号以它们的国际单位制(syst
è
me international de unites)(si)认可的形式表示。数值范围包括限定范围的数值。除非另有说明，否则核苷酸序列从左至右以5’至3’方向书写。氨基酸序列从左到右以氨基至羧基的方向书写。本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，所述标题可以通过整体参考说明书而获得。因此，通过参考整个说明书更完整地定义了紧接着在下文中定义的术语。
[0113]
术语“约”在本文中用于意指大约、大致近似地、左右或在......范围内。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将边界延伸到高于和低于所述数值来修饰该范围。一般来说，术语“约”可以修饰高于和低于所述值例如上下(更高或更低)10％的差异的数值。
[0114]
如本文所用，术语“细胞外囊泡”或“ev”是指包含包封内部空间的膜的细胞源性囊泡。细胞外囊泡包括所有与膜结合的囊泡(例如，外来体、纳米囊泡)，其直径小于其所源自的细胞的直径。在一些方面，细胞外囊泡的直径在20nm至1000nm的范围内，并且可包含在内部空间(即，腔)内、展示在细胞外囊泡的外表面上和/或跨膜的各种大分子有效载荷。在一些方面，所述有效载荷可包括核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或其组合。在某些方面，细胞外媒介物包含支架部分。作为示例而非限制，细胞外囊泡包括凋亡小体、细胞碎片、通过直接或间接操作(例如，通过连续挤压或用碱性溶液处理)获得的细胞源性囊泡、成泡的细胞器和由活细胞产生的囊泡(例如，通过直接质膜出芽或晚期内体与质膜融合)。细胞外囊泡可源自活的或死的生物体、外植组织或器官、原核或真核细胞和/或培养的细胞。在一些方面，细胞外囊泡由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。
[0115]
如本文所用，术语“外来体”是指直径在20-300nm之间(例如，在40-200nm之间)的细胞外囊泡。外来体包含包封内部空间(即，腔)的膜，并且在一些方面，可通过直接质膜出芽或通过晚期内体或多囊体与质膜的融合由细胞(例如,生产者细胞)产生。在某些方面，外来体包含支架部分。如下文所述，外来体可来源于生产者细胞，并根据其大小、密度、生化参数或其组合从生产者细胞中分离出来。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。
[0116]
如本文中所用，术语“纳米囊泡”是指直径在20-250nm之间(例如，在30-150nm之间)的细胞外囊泡，并且通过直接或间接操作由所述细胞(例如,生产者细胞)产生，使得所述纳米囊泡在没有所述操作的情况下不会由所述细胞产生。对细胞进行适当操作以产生纳米囊泡包括但不限于连续挤压、用碱性溶液处理、超声处理或其组合。在某些方面，纳米囊泡的产生可能导致所述生产者细胞的破坏。在一些方面，本文所述的纳米囊泡群体基本上不含通过从质膜直接出芽或晚期内体与质膜融合的方式从所述细胞得到的囊泡。在某些方面，纳米囊泡包含支架部分。一旦纳米囊泡来源于生产者细胞，则其可基于其尺寸、密度、生物化学参数或其组合从生产细胞中分离。
[0117]
如本文所用，术语“表面工程化ev，例如外来体”(例如，支架x-工程化ev，例如外来体)是指这样的ev(例如，外来体)，其中ev(例如，外来体)的膜或表面在其组成上被修饰，使得工程化ev(例如，外来体)的表面不同于修饰前的ev(例如，外来体)或天然存在的ev(例如，外来体)的表面。工程化可存在于ev(例如，外来体)的表面上，或存在于ev(例如，外来体)的膜中，使得ev(例如，外来体)的表面被改变。例如，膜在其蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等的组成方面被修改。所述组成可以通过化学、物理或生物方法，或者通过从先前或同时通过化学、物理或生物方法修饰的细胞中产生来改变。具体而言，所述组成可通过基因工程来改变，或者通过由先前通过基因工程修饰的细胞产生来改变。在一些方面，表面工程化ev(例如，外来体)包含外源蛋白(即，ev(例如，外来体)不天然表达的蛋白质)或其片段或变体，所述外源蛋白质或其片段或变体可以暴露于ev(例如，外来体)的表面，或者可以是暴露于ev(例如，外来体)表面上的部分的锚定点(附接)。在其它方面，表面工程化ev(例如，外来体)包含天然外来体蛋白(例如，支架x)或其片段或变体的更高表达(例如，更多数量)，所述外来体蛋白或其片段或变体可以暴露于ev(例如，外来体)的表面，或者可以是暴露于ev(例如，外来体)表面上的部分的锚定点(附接)。
[0118]
如本文所用，术语“腔工程化外来体”(例如，支架y工程化外来体)是指这样的ev(例如，外来体)，其中所述ev(例如，外来体)的膜或腔在其组成上被修饰，使得工程化ev(例如，外来体)的腔不同于修饰前的ev(例如，外来体)或天然存在的ev(例如，外来体)的腔。工程化可以直接存在于ev(例如，外来体)的腔内或膜中，使得ev(例如，外来体)的腔被改变。例如，膜在其蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等的组成上被修饰，使得ev(例如，外来体)的腔被修饰。所述组成可以通过化学、物理或生物方法，或者通过从先前通过化学、物理或生物方法修饰的细胞中产生来改变。具体而言，所述组成可通过基因工程来改变，或者通过由先前通过基因工程修饰的细胞产生来改变。在一些方面，腔工程化外来体包含外源蛋白质(即，ev(例如，外来体)不天然表达的蛋白质)或其片段或变体，所述外源蛋白质或其片段或变体可以暴露于ev(例如，外来体)的腔内，或者可以是暴露于ev(例如，外来体)的内层上的部分的锚定点(附接)。在其它方面，腔工程化ev(例如，外来体)包含天然外来体蛋白(例
和/或c-末端缺失或任何部分缺失。如本文所用，术语“功能性片段”是指保留蛋白质功能的蛋白质片段。因此，在一些方面，支架x蛋白的功能性片段保留了将一个部分锚定在ev(例如，外来体)的腔表面或外表面上的能力。类似地，在某些方面，支架y蛋白的功能性片段保留了将一个部分锚定在ev(例如，外来体)的腔表面上的能力。片段是否是功能性片段可通过任何本领域已知的测定ev的蛋白质含量的方法来评估，所述方法包括蛋白质印迹、facs分析和片段与自发荧光蛋白(如例如gfp)的融合。在某些方面，支架x蛋白的功能性片段保留了天然存在的支架x蛋白的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％的能力，例如锚定一个部分的能力。在一些方面，支架y蛋白的功能性片段保留了天然存在的支架y蛋白的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％的能力，例如锚定另一分子的能力。
[0124]
如本文所用，术语分子(例如，功能性分子、抗原、支架x和/或支架y)的“变体”是指通过本领域已知的方法进行比较后与另一分子共有某些结构和功能属性的分子。例如，蛋白质的变体可包括另一蛋白质中的取代、插入、缺失、移码或重排。
[0125]
在一些方面，支架x的变体包括与全长、成熟ptgfrn、bsg、igsf2、igsf3、igsf8、itgb1、itga4、slc3a2或atp转运蛋白或ptgfrn、bsg、igsf2、igsf3、igsf8、itgb1、itga4、slc3a2或atp转运蛋白的片段(例如，功能性片段)具有至少约70％同一性的变体。在一些方面，ptgfrn的变体或片段的变体与根据seq id no:1的ptgfrn或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，bsg的变体或片段的变体与根据seq id no:9的bsg或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，igsf2的变体或片段的变体与根据seq id no:34的igsf2或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，igsf3的变体或片段的变体与根据seq id no:20的igsf3或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，igsf8的变体或片段的变体与根据seq id no:14的igsf8或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，itgb1的变体或片段的变体与根据seq id no:21的itgb1或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，itga4的变体或片段的变体与根据seq id no:22的itga4或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，slc3a2的变体或片段的变体与根据seq id no:23的slc3a2或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，atp1a1的变体或片段的变体与根据seq id no:24的atp1a1或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，atp1a2的变体或片段的变体与根据seq id no:25的
atp1a2或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，atp1a3的变体或片段的变体与根据seq id no:26的atp1a3或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，atp1a4的变体或片段的变体与根据seq id no:27的atp1a4或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，atp1b3的变体或片段的变体与根据seq id no:28的atp1b3或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，atp2b1的变体或片段的变体与根据seq id no:29的atp2b1或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，atp2b2的变体或片段的变体与根据seq id no:30的atp2b2或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，atp2b3的变体或片段的变体与根据seq id no:31的atp2b3或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，atp2b4的变体或片段的变体与根据seq id no:32的atp2b4或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，本文公开的支架x蛋白的变体或片段的变体保留了特异性靶向ev(例如，外来体)的能力。在一些方面，支架x包括一个或多个突变，例如保守氨基酸取代。
[0126]
在一些方面，支架y的变体包括与marcks、marcksl1、basp1或marcks、marcksl1或basp1的片段具有至少约70％同一性的变体。在一些方面，marcks的变体或片段的变体与根据seq id no:47的marcks或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，marcksl1的变体或片段的变体与根据seq id no:48的marcksl1或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，basp1的变体或片段的变体与根据seq id no:49的basp1或其功能性片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面，支架y蛋白的变体或片段的变体保留了特异性靶向ev(例如，外来体)的腔表面的能力。在一些方面，支架y包括一个或多个突变，例如保守氨基酸取代。
[0127]“保守氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多
肽中的一个氨基酸被来自同一侧链家族的另一种氨基酸替代，这种取代被认为是保守的。在另一个方面，一串氨基酸可以被保守地替代为结构相似的串，所述结构相似的串在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同。
[0128]
术语两个多核苷酸或多肽序列之间的“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指在考虑到了为了两个序列的最佳比对而必须引入的添加或缺失(即，空位)的情况下，比较窗口内序列所共有的相同匹配位置的数量。匹配位置是其中在靶序列和参考序列中都存在相同核苷酸或氨基酸的任何位置。由于空位不是核苷酸或氨基酸，所以靶序列中存在的空位不计在内。同样，由于计入靶序列核苷酸或氨基酸，而不计来自参考序列的核苷酸或氨基酸，所以不计参考序列中存在的空位。
[0129]
通过以下计算序列同一性百分比：确定其中两个序列中都出现相同氨基酸残基或核酸碱基的位置数，以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。序列的比较和两个序列之间序列同一性百分比的确定可使用易用于在线使用和下载的软件来完成。合适的软件程序可从各种来源获得，用于蛋白质和核苷酸序列的比对。确定序列同一性百分比的一个合适的程序是bl2seq，其为可从美国政府的国家生物技术信息中心blast网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)上获得的blast程序套件的一部分。bl2seq使用blastn或blastp算法进行两个序列之间的比较。blastn用于比较核酸序列，而blastp用于比较氨基酸序列。其它合适的程序是，例如，needle、stretcher、water或matcher、生物信息学程序的emboss套件的一部分，并且也可在www.ebi.ac.uk/tools/psa上从欧洲生物信息学研究所(ebi)获得。
[0130]
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区域可以各自具有它们自己的序列同一性百分比。请注意，序列同一性百分比值四舍五入到十分位。例如，80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入到80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入到80.2。还应注意，长度值将始终是整数。
[0131]
本领域技术人员将理解，用于计算序列同一性百分比的序列比对的生成不限于仅由一级序列数据驱动的二进制序列-序列比较。序列比对可来源于多重序列比对。产生多重序列比对的一个合适的程序是clustalw2，可从www.clustal.org获得。另一个合适的程序是muscle，可从www.drive5.com/muscle/获得。clustalw2和muscle可以例如从ebi选择获得。
[0132]
还应当理解，序列比对可通过将序列数据与来自异构源的数据(诸如结构数据(例如，晶体学蛋白质结构)、功能数据(例如，突变的位置)或系统发育数据)整合而产生。整合异构数据以生成多重序列比对的合适程序是可在worldwideweb.tcoffee.org上获得，以及另选地可以例如从ebi获得的t-coffee。还应当理解，可以自动或手动策划用于计算序列同一性百分比的最终比对。
[0133]
多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中包含改变。一方面，多核苷酸变体包含产生沉默取代、添加或缺失的改变，但不改变所编码多肽的性质或活性。另一方面，由于遗传密码的简并性，通过沉默取代产生核苷酸变体。在其它方面，其中以任意组合取代、删除或添加5-10个、1-5个或1-2个氨基酸的变体。可以出于多种原因产生多核苷酸变体，例如，为了优化用于特定宿主的密码子表达(将人mrna中的密码子改变为其它密码子，例如，细菌宿主诸如大肠杆菌(e.coli))。
[0134]
天然存在的变体被称为“等位基因变体”，是指占据生物体的染色体上给定基因座的基因的几种替代形式之一(genes ii,lewin,b.，编辑，john wiley&sons,new york(1985))。这些等位基因变体可在多核苷酸和/或多肽水平上变化，并且包含在本公开中。或者，非天然存在的变体可通过诱变技术或直接合成产生。
[0135]
使用蛋白质工程和重组dna技术的已知方法，能产生变体来改善或改变多肽的特征。例如，可从分泌蛋白质的n端或c端删除一个或多个氨基酸，而基本上不损失生物功能。ron等人，j.biol.chem.268:2984-2988(1993)(通过引用整体并入本文)报道了变体kgf蛋白即便是在删除3个、8个或27个氨基末端氨基酸残基之后仍具有肝素结合活性。类似地，干扰素γ在从该蛋白的羧基端删除8-10个氨基酸残基后显示出高达10倍的活性。(dobeli等人，j.biotechnology 7:199-216(1988)，通过引用整体并入本文)。
[0136]
此外，大量的证据表明，变体通常保留着与天然存在的蛋白质相似的生物活性。例如，gayle及同事(j.biol.chem 268:22105-22111(1993)，通过引用整体并入本文)对人细胞因子il-1a进行了广泛的突变分析。他们利用随机诱变生成了3,500多种单独的il-1a突变体，在分子的整个长度上每种变体平均有2.5个氨基酸的变化。在每个可能的氨基酸位置都检查到多重突变。研究人员发现，“大多数分子可被改变，而对[结合或生物活性]几乎没有影响。”(见摘要)。事实上，在检查的3,500多个核苷酸序列中，只有23个独特的氨基酸序列产生了与野生型活性显著不同的蛋白质。
[0137]
如上所述，多肽变体包括例如经修饰的多肽。修饰包括，例如，乙酰化、酰化、adp-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、gpi锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(mei等人，blood 116:270-79(2010)，其通过引用整体并入本文)、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转运rna介导的向蛋白质中添加氨基酸诸如精氨酰化和遍在蛋白化。在一些方面，可在任何方便的位置修饰支架x和/或支架y。
[0138]
如本文所用，术语“与
……
连接”、“融合的”或“与
……
缀合”可互换使用，并且是指第一部分与第二部分(例如，分别为支架x和抗原(或佐剂或免疫调节剂)，例如，在细胞外囊泡中或细胞外囊泡上表达的支架部分和抗原，例如，分别在细胞外囊泡的腔表面中或外表面上表达的支架x(例如，ptgfrn蛋白))之间形成的共价键或非共价键。在一些方面，本文公开的有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)和/或靶向部分可以直接与ev(例如，外来体)的外表面和/或腔表面连接。如本文所用，术语“直接连接”、“直接融合”或“直接与......缀合”是指在不使用本文公开的支架部分的情况下，将部分(例如，有效载荷和/或靶向部分)与ev(例如，外来体)的表面连接(融合或缀合)的过程。
[0139]
如本文所用，术语“融合蛋白”是指两种或更多种相互连接或缀合的蛋白。例如，在一些方面，可在本文公开的ev(例如，外来体)中表达的融合蛋白包括(i)有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)和(ii)支架部分(例如，支架x和/或支架y)。在一些方面，可在可用于本公开的ev(例如，外来体)中表达的融合蛋白包含(i)靶向部分和(ii)支架部分(例如，支架x和/或支架y)。如本文所述，在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)可以表达多种融合蛋白，其中第一融合蛋白包含(i)有效载荷(例如,抗原、佐剂和/或免疫调节剂)和(ii)
支架部分(例如,支架x和/或支架y)，并且其中第二融合蛋白包含(i)靶向部分和(ii)支架部分(例如，支架x和/或支架y)。
[0140]
术语“包封的”，或该术语的语法上不同的形式(例如，包封(encapsulation)或包封(encapsulating))，是指在第二部分(例如，ev，例如，外来体)内具有第一部分(例如，抗原、佐剂或免疫调节剂)而两个部分没有化学或物理地连接的状态或过程。在一些方面，术语“包封的”可以与术语“在
……
腔中”和“装载”互换使用。在本文其它地方公开了将第一部分(例如，有效载荷，例如，抗原、佐剂或免疫调节剂)包封(或加载)到第二部分(例如，ev，例如，外来体)中的非限制性实例。
[0141]
如本文所用，术语“生产者细胞”是指用于产生ev(例如，外来体)的细胞。生产者细胞可以是体外培养的细胞，也可以是体内细胞。生产者细胞包括但不限于已知能有效产生ev(例如，外来体)的细胞，例如，hek293细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、间充质干细胞(msc)、bj人包皮成纤维细胞、fhdf成纤维细胞、age.神经元前体细胞、羊水细胞、脂肪间充质干细胞和rptec/tert1细胞。在某些方面，生产者细胞不是抗原呈递细胞。在一些方面，生产者细胞不是树突状细胞、b细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、kupffer-browicz细胞或源自这些细胞中的任一种的细胞，或其任意组合。在一些方面，生产者细胞不是天然存在的抗原呈递细胞(即，已经被修饰)。在一些方面，生产细胞不是天然存在的树突状细胞、b细胞、肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、kupffer-browicz细胞、来源于这些细胞中的任一种的细胞或其任意组合。在本公开的其它地方提供了与此类生产者细胞相关的其它公开内容。在一些方面，在本公开中有用的ev(例如，外来体)不在暴露在ev(例如，外来体)表面上的mhc i类或ii类分子上携带抗原(即，抗原不存在于mhc i类或ii类分子上)，而是可通过附接至支架x和/或支架y而在ev(例如，外来体)的腔中或者在ev(例如，外来体)的表面上携带抗原。
[0142]
如本文所用，“mhc i类分子”是指编码mhc i类分子的野生型或变体hla i类基因的蛋白质产物。因此，“hla i类分子”和“mhc i类分子”在本文中可互换使用。
[0143]
mhc i类分子是主要组织相容性复合物(mhc)分子的两个主要类别之一(另一个是mhc ii类)，并且存在于有颚脊椎动物体内的所有有核细胞的细胞表面上。它们也存在于血小板上，但不存在于红细胞上。它们的功能是将细胞内蛋白质的肽片段展示给细胞毒性t细胞；这将触发免疫系统对特定非自身抗原的立即反应，所述非自身抗原在mhc i类蛋白的帮助下展示出来。因为mhc i类分子呈递来源于细胞溶质蛋白的肽，所以mhc i类呈递的途径通常被称为细胞溶胶或内源性途径。
[0144]
在人中，对应于mhc i类的hla是hla-a、hla-b和hla-c。mhc i类分子包括两条蛋白质链：α链和β2-微球蛋白(β2m)链。人β2m由b2m基因编码。i类mhc分子结合主要由蛋白酶体降解细胞溶胶蛋白产生的肽。然后，mhc i：肽复合物通过内质网插入细胞的外质膜。表位肽结合在i类mhc分子的细胞外部分上。因此，i类mhc的功能是向细胞毒性t细胞(ctl)展示细胞内蛋白质。然而，i类mhc也可以在被称为交叉呈递的过程中呈递由外源蛋白质产生的肽。
[0145]
正常的细胞会在其i类mhc上展示来自正常细胞蛋白质周转的肽，并且由于中枢和外周耐受机制，ctl不会被激活来响应它们。当细胞表达外来蛋白质时，诸如在病毒感染后，i类mhc的一部分将在细胞表面上展示这些肽。因此，对mhc：肽复合物特异的ctl将识别并杀死呈递细胞。或者，i类mhc本身可以作为天然杀伤细胞(nk)的抑制性配体。表面i类mhc的正
常水平的降低(一些病毒和某些肿瘤用来逃避ctl反应的一种机制)激活了nk细胞的杀伤。
[0146]
如本文所用，“mhc ii类分子”是指编码mhc ii类分子的野生型或变体hla ii类基因的蛋白质产物。因此，“hla ii类分子”和“mhc ii类分子”在本文中可互换使用。
[0147]
mhc ii类分子是一类主要组织相容性复合物(mhc)分子，其通常仅存在于专职抗原呈递细胞(诸如树突状细胞、单核吞噬细胞、一些内皮细胞、胸腺上皮细胞和b细胞)上。这些细胞在启动免疫反应中很重要。由ii类肽呈递的抗原来源于细胞外蛋白质(不像在mhc i类中那样是细胞溶胶蛋白质)。
[0148]
与mhc i类分子一样，ii类分子也是异二聚体，但在这种情况下由两个同质肽(α链和β链，两者均在mhc中编码)组成。子名称(subdesignation)α1、α2等是指hla基因内的独立结构域；每个结构域通常由基因内不同的外显子编码，并且一些基因具有编码前导序列、跨膜序列等的其它结构域。这些分子既有胞外区，也有跨膜序列和胞质尾。链的α1和β1区域聚集在一起形成膜远端肽结合结构域，而α2和β2区域(链的剩余细胞外部分)形成膜近端免疫球蛋白样结构域。抗原或肽结合的抗原结合沟由两个α螺旋壁和β-折叠组成。由于mhc ii类分子的抗原结合沟两端开放，而i类分子上相应的沟每端封闭，所以mhc ii类分子呈递的抗原较长，一般在15与24个氨基酸残基之间。mhc ii类分子的装载通过吞噬作用进行；细胞外蛋白质被内吞，在溶酶体中消化，并且所得的表位肽片段在其迁移至细胞表面之前被加载到mhc ii类分子上。在人中，mhc ii类蛋白复合物由人白细胞抗原基因复合物(hla)编码。对应于mhc ii类的hla为hla-dp、hla-dm、hla-doa、hla-dob、hla-dq和hla-dr。hla基因复合物中的突变可导致裸淋巴细胞综合征(bls)，其为一种类型的mhc ii类缺乏症。
[0149]
如本文所用，术语“分离(isolate)”、“分离的(isolated)”和“分离(isolating)”或“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”和“纯化(purifying)”以及“提取的(extracted)”和“提取(extracting)”可互换使用，是指已经过一个或多个纯化过程的所需ev的制剂状态(例如，多个已知或未知的量和/或浓度)，所述纯化过程例如是所需ev制剂的选择或富集。在一些方面，本文所用的分离或纯化是从含有生产者细胞的样品中除去、部分除去(例如，一部分)ev的过程。在一些方面，分离的ev组合物没有可检测的不希望的活性，或另选地，不希望的活性的水平或量处于或低于可接受的水平或量。在其它方面，分离的ev组合物的所需ev的量和/或浓度等于或高于可接受的量和/或浓度。在其它方面，与从中获得组合物的原料(例如，生产者细胞制剂)相比，分离的ev组合物被富集。与原料相比，这种富集可以是富集10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％、99.9999％或大于99.9999％。在某些方面，分离的ev制剂基本上不含残留的生物产物。在一些方面，分离的ev制剂100％不含、99％不含、98％不含、97％不含、96％不含、95％不含、94％不含、93％不含、92％不含、91％不含或90％不含任何污染性生物物质。残留生物产物可包括非生物物质(包括化学物质)或不想要的核酸、蛋白质、脂类或代谢物。基本上不含残留生物产物也可意味着ev组合物不含可检测的生产者细胞，并且只有ev是可检测的。
[0150]
如本文所用，术语“免疫调节剂”是指作用于与细胞外囊泡接触的靶标(例如，靶细胞)并调节免疫系统的剂(即，有效载荷)。可以引入到ev(例如，外来体)和/或生产者细胞中的免疫调节剂的非限制性实例包括这样的剂，诸如检查点抑制剂的调节剂、检查点抑制剂的配体、细胞因子、其衍生物或其任意组合。免疫调节剂还可包括激动剂、拮抗剂、抗体、抗
原结合片段、多核苷酸，诸如sirna、反义寡核苷酸、磷酸二酰胺吗啉代低聚物(pmo)、缀合有肽的磷酸二酰胺吗啉代低聚物(ppmo)、mirna、lncrna、mrna dna或小分子。
[0151]
如本文所用，术语“生物分布改性剂”是指能够在体内或体外(例如，在不同种类细胞的混合培养物中)改变细胞外囊泡(例如，外来体、纳米囊泡)分布的剂(即，有效载荷)。在一些方面，术语“靶向部分”可以与术语生物分布改性剂互换使用。在一些方面，靶向部分改变ev(例如，外来体)(“向性部分”)的向性。如本文所用，术语“向性部分”是指当在ev(例如，外来体)上表达时改变并且/或者增强ev的自然运动的靶向部分。例如，在一些方面，向性部分可以促进ev被特定的细胞、组织或器官吸收。可与本公开一起使用的向性部分的非限制性实例包括那些能结合在树突状细胞(例如，clec9a或dec205)或t细胞(例如，cd3)上特异性表达的标志物的部分。除非另有说明，否则本文使用的术语“靶向部分”涵盖向性部分。生物分布剂可以是生物分子，诸如蛋白质、肽、脂质或碳水化合物，或合成分子。例如，生物分布改性剂可以是亲和配体(例如，抗体、vhh结构域、噬菌体展示肽、纤连蛋白结构域、camelid、vnar)、合成聚合物(例如，peg)、天然配体/分子(例如，cd40l、白蛋白、cd47、cd24、cd55、cd59)、重组蛋白(例如，xten)，但不限于此。
[0152]
在某些方面，生物分布改性剂和/或靶向部分展示在ev(例如，外来体)的表面上。生物分布改性剂可通过与支架蛋白(例如，支架x)融合(例如作为遗传编码的融合分子)而被展示在ev表面上。在一些方面，生物分布改性剂可通过将生物分布改性剂附接至ev表面分子的化学反应展示在ev表面上。一个非限制性实例是peg化。在一些方面，除了抗原、佐剂或免疫调节剂之外，本文公开的ev(例如，外来体)还可包含生物分布改性剂。可用于本公开的生物分布改性剂或靶向部分的非限制性实例包括c型凝集素结构域家族9成员a(clec9a)蛋白、树突状细胞特异性细胞间粘附分子-3-捕捉非整联蛋白(dc-sign)、cd207、cd40、clec6、树突状细胞免疫受体(dcir)、dec-205、凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lox-1)、marco、clec12a、dc-无唾液酸糖蛋白受体(dc-asgpr)、dc免疫受体2(dcir2)、dectin-1、巨噬细胞甘露糖受体(mmr)、bdca-1(cd303,clec4c)、dectin-2、bst-2(cd317)、cd3或其任意组合。在某些方面，靶向部分是clec9a蛋白。在一些方面，靶向部分是cd3分子。
[0153]
如本文所用，术语“c型凝集素结构域家族9成员a”(clec9a)蛋白质是指作为活化受体起作用并在髓系谱系细胞(例如，dc)上表达的组v c型凝集素样受体(ctlr)。huysamen等人，j biol chem283(24):16693-701(2008)；美国专利第9,988,431b2号，其每一个通过引用以其整体并入本文。clec9a的同义词是已知的，并且包括cd370、dngr-1、5b5、heee9341和含9a的c型凝集素结构域。在一些方面，clec9a蛋白在人cdc1细胞上表达。在一些方面，clec9a蛋白在小鼠cdc1和pdc细胞上表达。除非另有说明，否则如本文所用，clec9a可以指来自一个或多个物种(例如，人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛和熊)的clec9a。
[0154]
如本文所用，术语“cd3”或“分化簇3”是指与t细胞受体(tcr)缔合的蛋白质复合物。cd3分子由四条不同的链(cd3γ、cd3δ和两条cd3ε链)组成。这些链与t细胞受体(tcr)和ζ链缔合，以在t淋巴细胞中产生活化信号。tcr、ζ链和cd3分子一起构成了tcr复合物。cd3分子在所有t细胞(包括cd4 t细胞和cd8 t细胞)上表达。除非另有说明，否则如本文所用，cd3可以指来自一个或多个物种(例如，人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛和熊)的cd3。
[0155]
如本文所用，术语“有效载荷”是指作用于与ev(例如，外来体)接触的靶标(例如，靶细胞)的剂。在一些方面，除非另有说明，术语有效载荷可以与术语“生物活性分子”互换使用。可包含在ev(例如，外来体)上的有效载荷的非限制性实例是抗原、佐剂和/或免疫调节剂。可引入ev(例如，外来体)和/或生产者细胞中的有效载荷包括诸如核苷酸(例如，包含可检测部分或破坏转录的毒素的核苷酸)、核酸(例如，编码诸如酶等多肽的dna或mrna分子，或诸如mirna、dsdna、lncrna、sirna、反义寡核苷酸、磷酸二酰胺吗啉代低聚物(pmo)、缀合有肽的磷酸二酰胺吗啉代低聚物(ppmo)或其组合等的具有调节功能的rna分子)、氨基酸(例如，包含可检测部分或破坏翻译的毒素的氨基酸)、多肽(例如，酶)、脂质、碳水化合物、小分子(例如，小分子药物和毒素)及其组合等剂。在某些方面，有效载荷包括抗原。如本文所用，术语“抗原”是指当被引入受试者时引起针对其本身的免疫反应(细胞或体液)的任何剂。
[0156]
如本文所用，术语“亲和配体”是指能够选择性地和优先与特定标志物(例如，在靶细胞上表达的)结合的分子。可用于本公开的亲和配体的非限制性实例包括抗体、噬菌体展示肽、纤连蛋白结构域、骆驼科(camelid)、vnar、vhh结构域及其组合。如本文所用，术语“抗体”涵盖免疫球蛋白(无论是天然产生的还是部分或完全合成产生的)及其片段。该术语还涵盖任何具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的蛋白质。“抗体”还包括多肽，所述多肽包含来自免疫球蛋白基因或其片段的特异性结合和识别抗原的框架区。术语抗体的使用是指包括完整抗体、多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体、其片段，并且还包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合抗体、鼠-人抗体、鼠-灵长类动物抗体、灵长类动物-人单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段，诸如，例如，scfv、(scfv)2、fab、fab'和f(ab')2、f(ab1)2、fv、dab和fd片段、双抗体和抗体相关多肽。抗体包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性或功能。
[0157]
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，尤其是人。本文描述的组合物和方法适用于人的疗法和兽医应用。在一些方面，受试者是哺乳动物，在其它方面，受试者是人。如本文所用，“哺乳动物受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人、家养动物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、羊、猪、马等)和实验室动物(例如，猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。
[0158]
如本文中所用，术语“基本上不含”意指包含ev(例如，外来体)的样品包含按质量/体积(m/v)百分比浓度计少于10％的大分子。一些级分可含有少于约0.001％、少于约0.01％、少于约0.05％、少于约0.1％、少于约0.2％、少于约0.3％、少于约0.4％、少于约0.5％、少于约0.6％、少于约0.7％、少于约0.8％、少于约0.9％、少于约1％、少于约2％、少于约3％、少于约4％、少于约5％、少于约6％、少于约7％、少于约8％、少于约9％或少于约10％(m/v)的大分子。
[0159]
如本文所用，术语“大分子”意指核酸、污染性蛋白质、脂质、碳水化合物、代谢物或其组合。
[0160]
如本文所用，术语“常规外来体蛋白质”意指先前已知富集在外来体中的蛋白质，包括但不限于cd9、cd63、cd81、pdgfr、gpi锚定蛋白、乳凝集素lamp2和lamp2b、其片段或与其结合的肽。
[0161]
如本文所用，“施用”意指通过药学上可接受的途径向受试者提供包含本文公开的
ev(例如，外来体)的组合物。施用途径可以是静脉内的，例如静脉内注射和静脉内输注。其它施用途径包括，例如，皮下、肌内、口服、鼻内和肺部施用。ev(例如，外来体)可以作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分施用。
[0162]
如本文所用，“免疫反应”是指脊椎动物体内针对外来因子或异常细胞(例如，癌细胞)的生物反应，所述反应保护生物体免受这些因子及其引起的疾病的侵害。免疫反应由免疫系统的一种或多种细胞(例如，t淋巴细胞、b淋巴细胞、天然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞)和由这些细胞或肝脏中的任一种产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导，所述免疫反应导致对入侵病原体、感染了病原体的细胞或组织、癌性或其它异常细胞，或者在自身免疫或病理性炎症的情况下，对正常人细胞或组织的选择性靶向、结合、损伤、破坏，并且/或者从脊椎动物体内将其消除。免疫反应包括例如对t细胞，例如效应t细胞、th细胞、cd4 细胞、cd8 t细胞或treg细胞的活化或抑制，或者对免疫系统的任何其它细胞，例如nk细胞的活化或抑制。因此，免疫反应可包括体液免疫反应(例如，由b细胞介导的)、细胞免疫反应(例如，由t细胞介导的)或体液和细胞免疫反应。在一些方面，免疫反应是“抑制性”免疫反应。“抑制性”免疫反应是指阻断或减弱刺激物(例如，抗原)的作用的免疫反应。在某些方面，抑制性免疫反应包括产生针对刺激物的抑制性抗体。在一些方面，免疫反应是“刺激性”免疫反应。“刺激性”免疫反应是导致产生能破坏和清除靶抗原(例如，肿瘤抗原或病毒)的效应细胞(例如，细胞毒性t淋巴细胞)的免疫反应。
[0163]
如本文所用，术语“细胞免疫反应”可与术语“细胞介导的免疫反应”互换使用，指的是不主要涉及抗体的免疫反应。相反，细胞免疫反应包括活化不同的免疫细胞(例如，吞噬细胞和抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞)，所述细胞在活化时(例如，通过抗原刺激)产生各种效应分子(例如，细胞因子、穿孔素、粒酶)。如本文所用，术语“体液免疫反应”是指主要由在细胞外流体中发现的大分子(诸如分泌的抗体、补体蛋白和某些抗微生物肽)介导的免疫反应。术语“抗体介导的免疫反应”是指由抗体介导的体液免疫反应的一个方面。
[0164]
如本文所用，术语“免疫细胞”是指参与介导免疫反应的免疫系统的任何细胞。免疫细胞的非限制性实例包括t淋巴细胞、b淋巴细胞、天然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞、中性粒细胞或其组合。在一些方面，免疫细胞表达cd3。在某些方面，表达cd3的免疫细胞是t细胞(例如，cd4 t细胞或cd8 t细胞)。在一些方面，可用本文公开的靶向部分(例如，抗cd3)靶向的免疫细胞包括原初cd4 t细胞。在一些方面，免疫细胞包括记忆cd4 t细胞。在一些方面，免疫细胞包含效应cd4 t细胞。在一些方面，免疫细胞包括原初cd8 t细胞。在一些方面，免疫细胞包括记忆cd8 t细胞。在一些方面，免疫细胞包括效应cd8 t细胞。在一些方面，免疫细胞是树突状细胞。在某些方面，树突状细胞包括浆细胞样树突状细胞(pdc)、常规树突状细胞1(cdc1)、常规树突状细胞2(cdc2)、炎性单核细胞源性树突状细胞、朗格汉斯细胞、真皮树突状细胞、表达溶菌酶的树突状细胞(lysodcs)、kupffer细胞或其任意组合。因此，在某些方面，本文公开的ev(例如，外来体)可以特异性靶向的免疫细胞包括常规树突状细胞1(cdc1)和/或浆细胞样树突状细胞(pdc)。
[0165]
如本文所用，术语“t细胞”或“t-细胞”是指在胸腺中成熟的一种类型的淋巴细胞。t细胞在细胞介导的免疫中发挥重要作用，并与其它淋巴细胞(诸如b细胞)区别在于细胞表面上存在t细胞受体。t细胞包括所有类型的表达cd3的免疫细胞，包括t辅助细胞(cd4 细
胞)、细胞毒性t细胞(cd8 细胞)、天然杀伤t细胞、t调节细胞(treg)和γ-δt细胞。
[0166]“原初”t细胞是指免疫上保持未分化(即，未活化)的成熟t细胞。在胸腺中进行正和负选择后，t细胞以cd4 或cd8 原初t细胞的形式出现。在其原初状态下，t细胞表达l-选择素(cd62l )、il-7受体-α(il-7r-α)和cd132，但它们不表达cd25、cd44、cd69或cd45ro。如本文所用，“未成熟”也可以指表现出原初t细胞或未成熟t细胞(诸如tscm细胞或tcm细胞)的表型特征的t细胞。例如，未成熟的t细胞可以表达l-选择素(cd62l )、il-7rα、cd132、ccr7、cd45ra、cd45ro、cd27、cd28、cd95、cxcr3和lfa-1中的一种或多种。原初或未成熟t细胞可以与终末分化的效应t细胞(诸如t
em
细胞和t
eff
细胞)形成对比。
[0167]
如本文所用，术语“效应”t细胞或“t
eff”细胞是指能够介导病原体或细胞去除而无需进一步分化的t细胞。因此，效应t细胞有别于原初t细胞和记忆t细胞，并且这些细胞在成为效应细胞之前往往必需分化和增殖。
[0168]
如本文所用，术语“记忆”t细胞是指以前遇到其同源抗原并对其有反应的t细胞的亚组。在某些方面，所述术语与“抗原刺激过的”的t细胞同义。在一些方面，记忆t细胞可以是效应记忆t细胞或中央记忆t细胞。在一些方面，记忆t细胞是组织驻留记忆t细胞。如本文所用，术语“组织驻留记忆t细胞”或“trm细胞”是指占据组织(例如，皮肤、肺、胃肠道)而不再循环的t细胞谱系。trm细胞在转录、表型和功能上不同于中央记忆和效应记忆t细胞，后者在血液、次级淋巴样器官的t细胞区、淋巴与非淋巴组织之间循环。trm细胞的作用之一是在淋巴外组织中提供抗感染的免疫保护。
[0169]
如本文所用，术语“树突状细胞”或“dc”是指一类骨髓来源的免疫细胞，其能够加工细胞外和细胞内蛋白质，并在mhc分子的背景下呈递抗原以启动原初t细胞。在一些方面，树突状细胞可被分成进一步的亚型，诸如常规树突状细胞1(cdc1)、常规树突状细胞2(cdc2)、浆细胞样树突状细胞(pdc)、炎性单核细胞源性树突状细胞、朗格汉斯细胞、真皮树突状细胞、表达溶菌酶的树突状细胞(lysodc)、kupffer细胞及其组合。在某些方面，可以基于它们的表型表达来区分不同的dc亚组。例如，在一些方面，人cdc1细胞是cd1c-和cd141

。在一些方面，人cdc2细胞是cd1c

和cd141-。在某些方面，人pdc细胞是cd123 。在一些方面，小鼠cdc1细胞是xcr1

、clec9a

和sirpa-。在一些方面，小鼠cdc2细胞是cd8

、cd11b

、sirpa

、xcr1-和cd1c,b

。在一些方面，小鼠pdc细胞是cd137

、xcr1-和sirpa-。用于区分不同dc亚组的其它表型标志物在本领域是已知的。参见，例如，collin等人，immunology154(1):3-20(2018)。在一些方面，不同的dc亚组可以基于它们的功能特性来区分。例如，在某些方面，pdc产生大量的ifn-α，而cdc1和cdc2产生炎症细胞因子，诸如il-12、il-6和tnf-α。区分不同dc亚组的其它方法在本领域是已知的。参见，例如，美国专利第8,426,565b2号和第9,988,431号，它们中的每一个通过引用以其整体并入本文。
[0170]
如本文所用，术语“免疫缀合物”是指包含结合分子(例如，抗体)和一个或多个与结合分子化学缀合的部分(例如，治疗性部分或诊断性部分)的化合物。通常，免疫缀合物由通式：a-(l-m)n定义，其中a是结合分子(例如，抗体)，l是任选的接头，m是异源部分，其可以是例如治疗剂、可检测标记等，并且n为整数。在一些方面，多个异源部分可被化学地缀合至同一结合分子(例如，抗体)中的不同附接点。在其它方面，多个异源部分可以串接并附接至结合分子(例如，抗体)中的附接点。在一些方面，多个异源部分(相同的或不同的)可以与结合分子(例如，抗体)缀合。
[0171]
免疫缀合物也可以由通式以相反的顺序定义。在一些方面，免疫缀合物是“抗体-药物缀合物”(“adc”)。在本公开的说明书中，术语“免疫缀合物”不限于化学或酶促缀合物分子。本公开中使用的术语“免疫缀合物”也包括基因融合物。在本公开的一些方面，生物活性分子是免疫缀合物。术语“抗体-药物缀合物”和“adc”可以互换使用，并且是指例如与一种或多种治疗剂(本文有时称为剂、药物或活性药物成分)共价连接的抗体。在本公开的一些方面，生物活性分子(即,有效载荷)是抗体-药物缀合物。
[0172]
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指例如疾病或疾患的严重度降低；病程持续时间的缩短；与疾病或疾患相关的一种或多种症状的改善或消除；向患有疾病或疾患的受试者提供有益作用，但不一定治愈所述疾病或疾患。该术语还包括疾病或疾患或其症状的防御或预防。一方面，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指在受试者中诱导针对抗原的免疫反应。
[0173]
如本文中所用，术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”是指减少或降低特定结果的发生或严重度。在一些方面，通过防御性治疗来实现预防结果。
[0174]
ii.细胞外囊泡，例如，外来体
[0175]
本文公开了能够调节受试者的免疫系统的ev(例如，外来体)。用于本公开的ev(例如，外来体)已被工程化成一起产生多种剂(即，有效载荷)(例如，在单个ev(例如，外来体)中的抗原和佐剂；在单个ev(例如，外来体)中的抗原和免疫调节剂；和在单个ev(例如，外来体)中的抗原、佐剂和免疫调节剂；而不是单一剂，例如单独的抗原、单独的佐剂或单独的免疫调节剂)。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂。在其它方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂。在某些方面，本文公开的ev(例如，外来体)也可包含额外的部分，诸如靶向部分。在一些方面，抗原不在主要组织相容性复合物i和/ii分子上表达或呈递。在其它方面，虽然ev(例如，外来体)中的抗原没有作为mhc i类或ii类复合物的一部分表达或呈递，但是ev(例如，外来体)仍然可以在ev(例如，外来体)的表面上包含mhc i类/ii类分子。因此，在某些方面，本文公开的ev(例如，外来体)，不直接与t细胞的t细胞受体(tcr)相互作用以诱导针对抗原的免疫反应。类似地，在某些方面，本公开的ev(例如，外来体)，不通过变装(cross-dressing)将抗原直接转移至靶细胞(例如，树突状细胞)的表面。“变装”是ev(例如，来源于树突状细胞的外来体(dex))诱导t细胞活化的一种常用机制。参见pitt,j.m.等人，j clin invest 126(4):1224-32(2016)。在其它方面，本公开的ev(例如，外来体)被抗原呈递细胞吞噬，并且可以在抗原呈递细胞的表面上表达为mhc i类和/或mhc ii类复合物。
[0176]
对本领域技术人员来说显而易见的是，本文公开的ev(例如，外来体)不需要包含抗原，而是可包含本文公开的多种其它有效载荷。例如，在一些方面，ev(例如，外来体)可包含多种不同的佐剂。在一些方面，ev(例如，外来体)可包含多个不同的免疫调节剂。在一些方面，ev(例如，外来体)可包含一种或多种佐剂与一种或多种免疫调节剂的组合。此类无抗原的ev(例如，外来体)可用于诱导和/或增加先天免疫反应。其中此类无抗原ev可能有用的治疗环境的非限制性实例包括：治疗细菌和/或病毒感染，诸如对于呼吸机相关肺炎的铜绿假单胞菌、流感和rsv、sars/mer、弓形虫、败血症、黄热病和对于手术部位感染的金黄色葡萄球菌(staph aureus)。在某些方面，此类无抗原ev(例如，外来体)可以与一种或多种附加
的治疗剂组合使用。在一些方面，一种或多种附加的治疗剂包含抗原，其中所述抗原不在ev(例如，外来体)中表达(例如，抗原的可溶性形式)......除非另有说明，否则本文提供的相关公开内容同样适用，无论ev(例如，外来体)是否包含抗原。
[0177]
如上所述，本文所述的ev(例如，外来体)是直径在约20nm与300nm之间的细胞外囊泡。在某些方面，本公开的ev(例如，外来体)的直径在约20nm与290nm之间、约20nm与280nm之间、约20nm与270nm之间、约20nm与260nm之间、约20nm与250nm之间、约20nm与240nm之间、约20nm与230nm之间、约20nm与220nm之间、约20nm与210nm之间、约20nm与200nm之间、约20nm与190nm之间、约20nm与180nm之间、约20nm与170nm之间、约20nm与160nm之间、约20nm与150nm之间、约20nm与140nm之间、约20nm与130nm之间、约20nm与120nm之间、约20nm与110nm之间、约20nm与100nm之间、约20nm与90nm之间、约20nm与80nm之间、约20nm与70nm之间、约20nm与60nm之间、约20nm与50nm之间、约20nm与40nm之间、约20nm与30nm之间、约30nm与300nm之间、约30nm与290nm之间、约30nm与280nm之间、约30nm与270nm之间、约30nm与260nm之间、约30nm与250nm之间、约30nm与240nm之间、约30nm与230nm之间、约30nm与220nm之间、约30nm与210nm之间、约30nm与200nm之间、约30nm与190nm之间、约30nm与180nm之间、约30nm与170nm之间、约30nm与160nm之间、约30nm与150nm之间、约30nm与140nm之间、约30nm与130nm之间、约30nm与120nm之间、约30nm与110nm之间、约30nm与100nm之间、约30nm与90nm之间、约30nm与80nm之间、约30nm与70nm之间、约30nm与60nm之间、约30nm与50nm之间、约30nm与40nm之间、约40nm与300nm之间、约40nm与290nm之间、约40nm与280nm之间、约40nm与270nm之间、约40nm与260nm之间、约40nm与250nm之间、约40nm与240nm之间、约40nm与230nm之间、约40nm与220nm之间、约40nm与210nm之间、约40nm与200nm之间、约40nm与190nm之间、约40nm与180nm之间、约40nm与170nm之间、约40nm与160nm之间、约40nm与150nm之间、约40nm与140nm之间、约40nm与130nm之间、约40nm与120nm之间、约40nm与110nm之间、约40nm与100nm之间、约40nm与90nm之间、约40nm与80nm之间、约40nm与70nm之间、约40nm与60nm之间、约40nm与50nm之间、约50nm与300nm之间、约50nm与290nm之间、约50nm与280nm之间、约50nm与270nm之间、约50nm与260nm之间、约50nm与250nm之间、约50nm与240nm之间、约50nm与230nm之间、约50nm与220nm之间、约50nm与210nm之间、约50nm与200nm之间、约50nm与190nm之间、约50nm与180nm之间、约50nm与170nm之间、约50nm与160nm之间、约50nm与150nm之间、约50nm与140nm之间、约50nm与130nm之间、约50nm与120nm之间、约50nm与110nm之间、约50nm与100nm之间、约50nm与90nm之间、约50nm与80nm之间、约50nm与70nm之间、约50nm与60nm之间、约60nm与300nm之间、约60nm与290nm之间、约60nm与280nm之间、约60nm与270nm之间、约60nm与260nm之间、约60nm与250nm之间、约60nm与240nm之间、约60nm与230nm之间、约60nm与220nm之间、约60nm与210nm之间、约60nm与200nm之间、约60nm与190nm之间、约60nm与180nm之间、约60nm与170nm之间、约60nm与160nm之间、约60nm与150nm之间、约60nm与140nm之间、约60nm与130nm之间、约60nm与120nm之间、约60nm与110nm之间、约60nm与100nm之间、约60nm与90nm之间、约60nm与80nm之间、约60nm与70nm之间、约70nm与300nm之间、约70nm与290nm之间、约70nm与280nm之间、约70nm与270nm之间、约70nm与260nm之间、约70nm与250nm之间、约70nm与240nm之间、约70nm与230nm之间、约70nm与220nm之间、约70nm与210nm之间、约70nm与200nm之间、约70nm与190nm之间、约70nm与180nm之间、约70nm与170nm之间、约70nm与160nm之间、约70nm与150nm之间、约70nm与140nm之间、约70nm与
130nm之间、约70nm与120nm之间、约70nm与110nm之间、约70nm与100nm之间、约70nm与90nm之间、约70nm与80nm之间、约80nm与300nm之间、约80nm与290nm之间、约80nm与280nm之间、约80nm与270nm之间、约80nm与260nm之间、约80nm与250nm之间、约80nm与240nm之间、约80nm与230nm之间、约80nm与220nm之间、约80nm与210nm之间、约80nm与200nm之间、约80nm与190nm之间、约80nm与180nm之间、约80nm与170nm之间、约80nm与160nm之间、约80nm与150nm之间、约80nm与140nm之间、约80nm与130nm之间、约80nm与120nm之间、约80nm与110nm之间、约80nm与100nm之间、约80nm与90nm之间、约90nm与300nm之间、约90nm与290nm之间、约90nm与280nm之间、约90nm与270nm之间、约90nm与260nm之间、约90nm与250nm之间、约90nm与240nm之间、约90nm与230nm之间、约90nm与220nm之间、约90nm与210nm之间、约90nm与200nm之间、约90nm与190nm之间、约90nm与180nm之间、约90nm与170nm之间、约90nm与160nm之间、约90nm与150nm之间、约90nm与140nm之间、约90nm与130nm之间、约90nm与120nm之间、约90nm与110nm之间、约90nm与100nm之间、约100nm与300nm之间、约110nm与290nm之间、约120nm与280nm之间、约130nm与270nm之间、约140nm与260nm之间、约150nm与250nm之间、约160nm与240nm之间、约170nm与230nm之间、约180nm与220nm或约190nm与210nm之间。本文所述的ev(例如，外来体)的大小可以根据下文所述的方法来测量。
[0178]
在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包括双脂质膜(“ev(例如，外来体)膜”)，其包括内表面和外表面。在某些方面，内表面面向ev(例如，外来体)的内核(即，腔)。在某些方面，外表面可以与生产者细胞或靶细胞的内体、多囊体或膜/细胞质接触。
[0179]
在一些方面，ev(例如，外来体)膜包含脂质和脂肪酸。在一些方面，ev(例如，外来体)膜包含磷脂、糖脂、脂肪酸、鞘脂、磷酸甘油酯、甾醇、胆固醇和磷脂酰丝氨酸。
[0180]
在一些方面，ev(例如，外来体)膜包含内小叶和外小叶。内小叶和外小叶的组成可以通过本领域已知的跨双层分布测定来确定，参见，例如，kuypers等人，biohim biophys acta 1985 819:170。在一些方面，外小叶的组成为约70-90％的胆碱磷脂、约0-15％的酸性磷脂和约5-30％的磷脂酰乙醇胺。在一些方面，内小叶的组成为约15-40％的胆碱磷脂、约10-50％的酸性磷脂和约30-60％的磷脂酰乙醇胺。
[0181]
在一些方面，ev(例如，外来体)膜包含一种或多种多糖，诸如聚糖。
[0182]
在一些方面，ev(例如，外来体)膜还包含一种或多种支架部分，其能够将例如抗原和/或佐剂和/或免疫调节剂锚定至ev(例如，外来体)(例如，在腔表面上或在外表面上)。在某些方面，支架部分是多肽(“外来体蛋白质”)。在其它方面，支架部分是非多肽部分。在一些方面，外来体蛋白质包括富集在外来体膜上的各种膜蛋白，诸如跨膜蛋白质、整合蛋白质和外周蛋白质。它们可以包括各种cd蛋白、转运蛋白、整联蛋白、凝集素和钙粘蛋白。在某些方面，支架部分(例如，外来体蛋白质)包含支架x。在其它方面，支架部分(例如，外来体蛋白质)包含支架y。在其它方面，支架部分(例如，外来体蛋白质)包含支架x和支架y。
[0183]
在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)能够将有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)递送至靶标。有效载荷是作用于与ev接触的靶标(例如，靶细胞)的剂。接触可发生在体外或受试者体内。可引入ev的有效载荷的非限制性实例包括诸如核苷酸(例如，包含可检测部分或破坏转录的毒素的核苷酸)、核酸(例如，编码诸如酶等多肽的dna或mrna分子，或诸如mirna、dsdna、lncrna、sirna、反义寡核苷酸、磷酸二酰胺吗啉代低聚物(pmo)、或缀合有肽的磷酸二酰胺吗啉代低聚物(ppmo)等的具有调节功能的rna分子)、氨基酸(例
如，包含可检测部分或破坏翻译的毒素的氨基酸)、多肽(例如，酶)、脂质、碳水化合物、和小分子(例如，小分子药物和毒素)等剂。
[0184]
如本文所证明的(例如，参见实施例16)，在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)能够诱导效应细胞和记忆t细胞。在某些方面，记忆t细胞是组织驻留记忆t细胞。此类ev(例如，外来体)可以特别地用作某些传染病的疫苗。例如，大多数目前可用的流感疫苗是灭活的，并且主要集中于产生针对某些流感表面抗原(例如，血凝素(ha)和神经氨酸酶(na))的中和抗体。参见wang等人，science 367(6480):1-12(2020年2月21日)，其通过引用以其整体并入本文)。然而，此类抗原会不断发生突变，需要每年更新疫苗。即使有年度更新，也有一些年流感疫苗无效，因为疫苗病毒株与循环中的毒株之间的ha和/或na抗原性不匹配。广泛免疫可以通过天然病毒感染或活载体工程化疫苗和减毒疫苗来诱发，因为除了体液免疫外，这些都还诱导组织(肺)驻留记忆t细胞。然而，必须在这些“复制型”疫苗的安全性与免疫原性之间取得微妙的平衡，并且所述平衡通常只适合某些个体。本公开的ev(例如，外来体)没有此类限制。因此，在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)(例如，包含一种或多种流感抗原与本文公开的有效载荷，例如，sting激动剂的组合)可用作针对特定病原体(例如，不同流感亚型)的“通用”疫苗。
[0185]
在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)固有地能够诱导参与免疫反应的信号传导途径的激活。在某些方面，参与免疫反应的信号传导途径包括toll样受体(tlr)、维甲酸诱导型基因i(rig-i)样受体(rlr)、干扰素基因刺激因子(sting)途径或其组合。在一些方面，这种信号传导途径的激活可导致i型干扰素的产生。例如，在某些方面，本文公开的ev(例如，外来体)的双脂质膜包含一种或多种共有以下特征之一的脂质：(i)不饱和脂质尾，(ii)二氢咪唑接头，(iii)环胺头基团，和(iv)其组合。具有此类特征的脂质已被证明激活不依赖于tlr/rlr的sting途径。参见miao等人，nature biotechnology 37:1174-1185(2019年10月)，其通过引用以其整体并入本文。
[0186]
ii.a抗原
[0187]
在一些方面，有效载荷是抗原，其能够在受试者中诱导免疫反应。在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)包含单一抗原。在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)包含多种抗原。在某些方面，多种抗原的每一种都是不同的。在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种不同的抗原。如本文所公开的，可使用支架部分(例如，支架x和/或支架y)将抗原与ev(例如，外来体)的表面连接。在某些方面，抗原可以直接(即，不使用支架部分)与ev(例如，外来体)的表面连接。在一些方面，抗原可以在ev(例如，外来体)的腔内。
[0188]
在一些方面，ev(例如，外来体)包含一种或多种抗原与本文所述的一种或多种附加的有效载荷(例如，佐剂和/或免疫调节剂)的组合。在一些方面，ev(例如，外来体)可包含一种或多种附加的部分(例如，靶向部分)。例如，在某些方面，本文公开的ev(例如，外来体)可包含(i)一种或多种附加的抗原，(ii)一种或多种附加的有效载荷(例如，佐剂和/或免疫调节剂)，和(iii)一种或多种靶向部分。
[0189]
在一些方面，抗原包括肿瘤抗原。肿瘤抗原的非限制性实例包括：甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、上皮肿瘤抗原(eta)、粘蛋白1(muc1)、tn-muc1、粘蛋白16(muc16)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(mage)、肿瘤蛋白p53(p53)、cd4、cd8、cd45、cd80、cd86、程序性死亡
配体1(pd-l1)、程序性死亡配体2(pd-l2)、ny-eso-1、psma、tag-72、her2、gd2、cmet、egfr、间皮素、vegfr、α-叶酸受体、ce7r、il-3、睾丸癌抗原(cta)、mart-1gp100、tnf相关凋亡诱导配体、brachyury(优先地在黑色素瘤中表达的抗原(prame))、维尔姆斯肿瘤1(wt1)、cd19、cd22或其组合。
[0190]
在一些方面，所述抗原是通用肿瘤抗原。如本文所用，术语“通用肿瘤抗原”是指通常在肿瘤细胞中以比在非肿瘤细胞中更高的水平表达，并且也在不同来源的肿瘤中表达的免疫原性分子(诸如蛋白质)。在一些方面，通用肿瘤抗原在超过约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的癌症(例如，人癌症)中表达。在一些方面，通用肿瘤抗原可以在非肿瘤细胞(例如，正常细胞)中表达，但是其水平低于其在肿瘤细胞中表达的水平。在某些方面，，通用肿瘤抗原在肿瘤细胞上的表达水平是在非肿瘤细胞上的约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍或更多倍。在某些方面，通用肿瘤抗原不在正常细胞中表达，而且仅在肿瘤细胞中表达。可用于本公开的通用肿瘤抗原的非限制性实例包括肿瘤脉管系统中的内皮衬里抗原、存活素(survivin)、肿瘤蛋白d52(tpd52)、雄激素受体表位、肝配蛋白(ephrin)a型受体2(epha2)、人端粒酶逆转录酶(htert)、存活素、小鼠双微体2同源物(mouse double minute 2homolog)(mdm2)、细胞色素p450 1b1(cyp1b)、her2/neu、维尔姆斯肿瘤基因1(wt1)、生存蛋白(livin)、甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、粘蛋白16(muc16)、muc1、前列腺特异性膜抗原(psma)、p53或细胞周期蛋白(d1)。
[0191]
在另外的方面，抗原可包括新抗原。如本文所用，术语“新抗原”是指由肿瘤特异性突变基因编码的抗原。
[0192]
在一些方面，抗原源自细菌、病毒、真菌、原生动物或其任意组合。在一些方面，抗原来源于致癌病毒(本文也称为癌症相关病毒(cav))。在另外的方面，抗原源自包括以下的组：人γ疱疹病毒4(即，爱泼斯坦巴尔病毒(ebv))、甲型流感病毒、乙型流感病毒、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、沙眼衣原体、hiv(例如，hiv-2)、冠状病毒(例如，covid-19、mers-cov和sars cov)、丝状病毒(例如马尔堡病毒和埃博拉病毒)、化脓性链球菌、肺炎链球菌、疟原虫属种(例如，间日疟原虫和恶性疟原虫)、基孔肯雅病毒、人乳头瘤病毒(hpv)、乙型肝炎(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、人t嗜淋巴细胞病毒(htlv1)、人疱疹病毒8(hhv8)、默克尔细胞多瘤病毒(mcv)、布尼亚病毒(例如，汉坦病毒)、沙粒病毒(例如，lcmv病毒和拉沙病毒)、黄病毒(例如，登革热病毒、寨卡病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒和黄热病病毒)、肠道病毒(例如，脊髓灰质炎病毒)、星状病毒(例如，胃肠炎病毒)、弹状病毒科(例如，狂犬病病毒)、包柔氏疏螺旋体和梅奥疏螺旋体(例如，莱姆病)、单纯疱疹病毒2(hsv-2)、克雷伯氏菌属某种、铜绿假单胞菌、肠球菌属某种、变形杆菌属某种、肠杆菌属某种、放线菌属某种、凝固酶阴性葡萄球菌属(cons)、支原体属某种、腺病毒、腺相关病毒(aav)或其组合。
[0193]
在一些方面，来源于ebv的抗原是bzlf1。bzlf1(也称为zta或eb1)是ebv的立即早期病毒基因，其可诱发癌症并主要感染95％的人口的b细胞。该基因(和其它基因一起)在疾病进展的其它阶段产生其它ebv基因的表达，并参与将病毒从潜伏形式转化为裂解形式。zebra(bamhi z爱泼斯坦-巴尔病毒复制激活因子，又称zta和bzlf1)是由bzlf1编码的ebv的早期裂解蛋白。参见hartlage等人(2015)cancer immunol.res.3(7):787-94和rist等人
(2015)j.virology 70:703-12，所述两个文献通过引用以其整体并入本文。本文公开的包含ebv抗原例如bzlf1的ev(例如，外来体)可用于例如治疗移植后淋巴增生性病症(ptld)。可向接受ebv阳性移植物的ebv阴性患者施用这种ev。bzlf1是与ptld患者的持久缓解相关的显性t细胞抗原。本文公开的包含bzlf1的ev(例如，外来体)可引发bzlf1的强效cd8 t细胞介导的免疫。因此，粘膜免疫和组织驻留记忆细胞(参见图图7a和图7b)可以保护患者免于发展ptldf。非限制性示例性抗原包括但不限于美国专利第8,617,564b2号(其通过引用以其整体并入本文)中公开的抗原。
[0194]
在一些方面，抗原来源于结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)以诱导细胞和/或体液免疫反应。在一些方面，抗原包含结核分枝杆菌(tb抗原)的一个或多个表位。多种抗原与结核分枝杆菌感染相关，包括esat-6、tb10.4、cfp10、rv2031(hspx)、rv2654c(tb7.7)和rv1038c(esxj)。参见，例如，lindestam等人，j.immunol.188(10):5020-31(2012)，以其整体并入本文。在一些方面，可用于本公开的抗原包含esat6的一个或多个表位。在一些方面，可用于本公开的抗原包括tb10.4的一个或多个表位。在一些方面，可用于本公开的抗原包含cfp10的一个或多个表位。在一些方面，可用于本公开的抗原包含一个或多个rv2031(hspx)的一个或多个表位。在一些方面，可用于本公开的抗原包含rv2654c(tb7.7)的一个或多个表位。在一些方面，可用于本公开的抗原包含rv1038c(esxj)的一个或多个表位。在一些方面，可用于本公开的抗原包含选自由以下组成的组的表位：esat6、tb10.4(esat-6样蛋白esxh；cfp7)、cfp10、rv2031(hspx)、rv2654c(tb7.7)、rv1038c(esxj)及其任意组合。
[0195]
在一些方面，tb抗原包含tb抗原的特定表位，例如esat6或tb10.4的特定表位。在一些方面，esat6抗原包含如下表位，所述表位具有如mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihsldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqkwdatatelnnalqnlartiseagqamastegnvtgmfa(seq id no:370)中所示的氨基酸序列的至少三个氨基酸、至少四个氨基酸、至少五个氨基酸、至少六个氨基酸、至少七个氨基酸、至少八个氨基酸、至少九个氨基酸、至少十个氨基酸、至少十一个氨基酸、至少十二个氨基酸、至少十三个氨基酸、至少十四个氨基酸、至少十五个氨基酸。在一些方面，其中tb10.4抗原包含如下表位，所述表位具有如msqimynypamlghagdmagyagtlqslgaeiaveqaalqsawqgdtgityqawqaqwnqamedlvrayhamsstheantmammardtaeaakwgg(seq id no:371)中所示的氨基酸序列的至少三个氨基酸、至少四个氨基酸、至少五个氨基酸、至少六个氨基酸、至少七个氨基酸、至少八个氨基酸、至少九个氨基酸、至少十个氨基酸、至少十一个氨基酸、至少十二个氨基酸、至少十三个氨基酸、至少十四个氨基酸、至少十五个氨基酸。
[0196]
在一些方面，抗原包括自身抗原。如本文所用，术语“自身抗原”是指由宿主细胞或组织表达的抗原。在正常健康状态下，此类抗原被身体识别为自身的，并且不会引发免疫反应。然而，在某些患病条件下，人体自身的免疫系统可以将自身抗原识别为外来物，并对其产生免疫反应，从而导致自身免疫。在某些方面，本公开的ev(例如，外来体)可包含自身抗原(即，已经诱导t细胞反应并导致自身免疫的自身(种系)蛋白)。此类ev(例如，外来体)可用于靶向自身反应性t细胞并抑制其活性。自身抗原(包括相关疾病或病症)的非限制性实例包括：(i)β细胞蛋白、胰岛素、胰岛抗原2(ia-2)、谷氨酸脱羧酶(gad65)和锌转运蛋白8(znt8)(i型糖尿病)，(ii)髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(mog)、髓磷脂碱性蛋白(mbp)、蛋白
脂质蛋白(plp)和髓磷脂相关糖蛋白(mag)(多发性硬化)，(iii)瓜氨酸化抗原和滑膜蛋白(类风湿性关节炎)，(iv)水通道蛋白-4(aqp4)(视神经脊髓炎)，(v)烟碱乙酰胆碱受体(nachr)(重症肌无力)，(vi)桥粒芯蛋白-1(dsg1)和desoglein-2(dsg2)(寻常型天疱疮)，(v)促甲状腺素受体(graves病)，(vi)iv型胶原(古德帕斯丘综合征(goodpasture syndrome))，(vii)甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶和促甲状腺激素受体(tshr)(桥本氏甲状腺炎)，或(viii)其组合。
[0197]
ii.b佐剂
[0198]
如上所述，本公开的ev(例如，外来体)可包含佐剂(例如，与抗原和/或本文公开的其它有效载荷组合)。在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)包含多种佐剂。在某些方面，多种佐剂中的每一种都不同。在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种不同的佐剂。如本文所公开的，可使用支架部分(例如，支架x和/或支架y)将佐剂与ev(例如，外来体)的表面连接。在某些方面，佐剂可直接(即，不使用支架部分)与ev(例如，外来体)的表面连接。在一些方面，佐剂可以在ev(例如，外来体)的腔内。
[0199]
在一些方面，ev(例如，外来体)包含一种或多种佐剂与一种或多种附加的有效载荷(例如，抗原和/或免疫调节剂)的组合。在一些方面，ev(例如，外来体)可包含一种或多种附加的部分(例如，靶向部分)。例如，在某些方面，本文公开的ev(例如，外来体)可包含(i)一种或多种附加的佐剂，(ii)一种或多种附加的有效载荷(例如，抗原和/或免疫调节剂)，和(iii)一种或多种靶向部分。
[0200]
如本文所用，术语“佐剂”是指增强有效载荷的治疗效果(例如，增强对抗原的免疫反应)的任何物质。因此，本文所述的包含佐剂的ev(例如，外来体)与参考(例如，不含佐剂的相应ev或包含单独的或与佐剂组合的抗原的非ev递送媒介物)相比，能够使例如针对抗原的免疫反应增强至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约250％、至少约500％、至少约750％，至少约1,000％或更多。在一些方面，将本文公开的佐剂掺入ev(例如，外来体)与参考(例如，包含单独的抗原的相应ev或包含单独的或与佐剂组合的抗原的非ev递送媒介物)相比，可使例如针对抗原的免疫反应增强至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍、至少约2,000倍、至少约3,000倍、至少约4,000倍、至少约5,000倍、至少约6,000倍、至少约7,000倍、至少约8,000倍、至少约9,000倍、至少约10,000倍或更多倍。
[0201]
可用于本公开的佐剂的非限制性实例包括：干扰素基因刺激物(sting)激动剂、toll样受体(tlr)激动剂、炎症介质、rig-i激动剂、α-gal-cer(nkt激动剂)、热休克蛋白(例如，hsp65和hsp70)、c型凝集素激动剂(例如，β葡聚糖(dectin 1)、壳多糖和凝胶多糖)及其组合。
[0202]
在一些方面，将佐剂(诸如，本文公开的那些)掺入ev(例如，外来体)可以拓宽ev诱导的免疫反应。如本文所用，“拓宽免疫反应”是指增强免疫反应的多样性。在一些方面，免
疫反应的多样性可通过表位扩散(即，针对抗原上更多数量/种类的表位诱导和/或增强免疫反应(细胞和/或体液免疫反应))来增强。在一些方面，可通过产生不同和/或多种抗体同种型(例如，igg、iga、igd、igm和/或ige)来增加免疫反应的多样性。
[0203]
在一些方面，佐剂(例如，诸如本文公开的那些)也可以帮助调节由ev(例如，外来体)诱导的免疫反应的类型。例如，在一些方面，将佐剂掺入ev(例如，外来体)可以有助于将免疫反应驱向更具th1表型。如本文所用，“th1”免疫反应的特征通常在于产生ifn-γ，ifn-γ可激活先天细胞(例如，巨噬细胞)的杀菌活性，帮助诱导b细胞产生调理作用(标记用于吞噬)和补体结合抗体，并且/或者导致细胞介导的免疫(即，不由抗体介导)。一般来说，th1反应对细胞内病原体(宿主细胞内的病毒和细菌)和/或癌症更有效。
[0204]
在一些方面，将佐剂掺入ev(例如，外来体)可以有助于将免疫反应驱向更具th2表型。如本文所用，“th2”免疫反应的特征可在于某些细胞因子，诸如il-5(诱导嗜酸性粒细胞清除寄生虫)和il-4(促进b细胞同种型转换)的释放。一般来说，th2反应对细胞外细菌、寄生虫(包括蠕虫)和毒素更有效。
[0205]
在一些方面，将佐剂掺入ev(例如，外来体)可以助于将免疫反应驱向更具th17表型。如本文所用，“th17”免疫反应由th17细胞介导。如本文所用，“th17细胞”是指cd4 t细胞的亚组，其特征在于产生促炎细胞因子，诸如il-17a、il-17f、il-21、il-22和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。th17细胞通常被认为通过向感染组织募集中性粒细胞和巨噬细胞，在宿主防御感染中发挥重要作用。
[0206]
在一些方面，将佐剂掺入到ev(例如，外来体)中可以有助于将免疫反应驱向更具细胞免疫反应(例如，t细胞介导的)。在一些方面，将佐剂掺入到ev(例如，外来体)中有助于将免疫反应驱向更具体液免疫反应(例如，抗体介导的)。
[0207]
在一些方面，佐剂诱导细胞溶质模式识别受体的激活。细胞溶质模式识别受体的非限制性实例包括：干扰素基因刺激物(sting)、维甲酸诱导型基因i(rig-1)、黑色素瘤分化相关蛋白5(mda5)、核苷酸结合寡聚化结构域、含富含亮氨酸重复序列和pyrin结构域(nlrp)、炎性小体(inflammasome)或其组合。在某些方面，佐剂是sting激动剂。干扰素基因刺激物(sting)是典型地由细菌产生的环状二核苷酸的细胞溶质感应器。激活后，其导致产生i型干扰素(例如，ifn-α(alpha)、ifn-β(beta)、ifn-κ(kappa)、ifn-δ(delta)、ifn-ε(epsilon)、ifn-τ(tau)、ifn-ω(omega)和ifn-ζ(zeta，也称为limitin))并启动免疫反应。在某些方面，sting激动剂包括环状二核苷酸sting激动剂或非环状二核苷酸sting激动剂。如本文所述，在一些方面，sting激动剂装载在ev(例如，外来体)的腔中。在一些方面，此类ev(例如，外来体)在本文中被称为“exosting”。在国际公布第wo2019183578a1号(其通过引用以其整体并入本文)中提供了exosting的非限制性实例。有用的sting激动剂的进一步公开也在整个本公开中提供。
[0208]
已知环状嘌呤二核苷酸，诸如但不限于cgmp、环状二-gmp(c-二-gmp)、camp、环状二-amp(c-二-amp)、环-二-gmp-amp(cgamp)、环状二-imp(c-二-imp)、环状amp-imp(caimp)及其任何类似物，可刺激或增强患者的免疫或炎症反应。cdn可具有连接环状二核苷酸的2'2'、2'3'、2'5'、3'3'或3'5'键，或其任意组合。
[0209]
环状嘌呤二核苷酸可以通过标准有机化学技术进行修饰，以产生嘌呤二核苷酸的类似物。合适的嘌呤二核苷酸包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、异鸟
嘌呤或本领域已知的任何其它合适的嘌呤二核苷酸。环状二核苷酸可以是经修饰的类似物。可使用本领域已知的任何合适的修饰，包括但不限于硫代磷酸酯、双硫代磷酸酯(biphosphorothioate)、氟化和二氟化修饰。
[0210]
还可使用非环状二核苷酸激动剂，诸如5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(dmxaa)，或本领域已知的任何其它非环状二核苷酸激动剂。
[0211]
可用于本公开的sting激动剂的非限制性实例包括：dmxaa、sting激动剂-1、ml rr-s2 cda、ml rr-s2c-二-gmp、ml-rr-s2cgamp、2'3'-c-二-am(ps)2、2'3'-cgamp、2'3'-cgampdfhs、3'3'-cgamp、3'3'-cgampdfsh、caimp、caim(ps)2、3'3'-caimp、3'3'-caimpdfsh、2'2'-cgamp、2'3'-cgam(ps)2、3'3'-cgamp及其组合。sting激动剂的非限制性实例可见于美国专利第9,695,212号、wo 2014/189805 a1、wo 2014/179335 a1、wo 2018/100558 a1、美国专利第10,011,630b2号、wo 2017/027646 a1、wo 2017/161349 a1和wo 2016/096174 a1(其每一个通过引用以其整体并入)中。
[0212]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包含具有下式的化合物：
[0213][0214]
其中：
[0215]
x1为h、oh或f；
[0216]
x2为h、oh或f；
[0217]
z为oh、or1、sh或sr1，其中：
[0218]
i)r1为na或nh4，或
[0219]
ii)r1为在体内提供oh或sh的酶不稳定基团，诸如新戊酰氧基甲基；
[0220]
bi和b2是选自以下的碱基：
[0221][0222]
条件是：
[0223]-在式(i)中：x1和x2不是oh，
[0224]-在式(ii)中：当x1和x2为oh时，b1不是腺嘌呤并且b2不是鸟嘌呤，以及
[0225]-在式(iii)中：当x1和x2为oh时，b1不是腺嘌呤，b2不是鸟嘌呤并且z不是oh。参见wo 2016/096174，其内容通过引用整体并入本文。
[0226]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括：
[0227]
[0228][0229]
其药学上可接受的盐。参见wo 2016/096174 a1，其通过引用以其整体并入本文。
[0230]
在其它方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0231]
[0232]
[0233][0233]
或其任何药学上可接受的盐。
[0234]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0235][0236]
其中每个符号在wo 2014/093936(其内容通过引用以其整体并入本文)中进行了定义。
[0237]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0238][0239]
其中每个符号在wo 2014/189805(其内容通过引用以其整体并入本文)中进行了定义。
[0240]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0241][0242]
其中每个符号在wo 2015/077354(其内容通过引用以其整体并入本文)中进行了定义。另请参见cell reports 11,1018-1030(2015)，其通过引用以其整体并入本文。
[0243]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括c-二-amp、c-二-gmp、c-二-imp、c-amp-gmp、c-amp-imp和c-gmp-imp，如wo 2013/185052和sci.transl.med.283,283ra52(2015)(所述文献通过引用整体并入本文)中所述。
[0244]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0245][0246]
其中每个符号在wo 2014/189806(其内容通过引用以其整体并入本文)中进行了定义。
[0247]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0248][0249]
其中每个符号在wo 2015/185565(其内容通过引用以其整体并入本文)中进行了定义。
[0250]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0251][0252]
其中每个符号在wo 2014/179760(其内容通过引用以其整体并入本文)中进行了定义。
[0253]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0254]
[0255][0256]
其中每个符号在wo 2014/179335(其内容通过引用以其整体并入本文)中进行了定义。
[0257]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0258][0259]
如wo 2015/017652中所述，其内容通过引用以其整体并入本文。
[0260]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0261][0262]
如wo 2016/096577(其内容通过引用以其整体并入本文)中所述。
[0263]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0264][0265]
其中每个符号在wo 2016/120305(其内容通过引用整体并入本文)中进行了定义。
[0266]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0267][0268]
其中每个符号在wo 2016/145102(其内容通过引用以其整体并入本文)中进行了定义。
[0269]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0270][0271]
其中每个符号在wo 2017/027646(其内容通过引用以其整体并入本文)中进行了
定义。
[0272]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0273][0274]
其中每个符号在wo 2017/075477(其内容通过引用以其整体并入本文)中进行了定义。
[0275]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0276][0277]
其中每个符号在wo 2017/027645(其内容通过引用以其整体并入本文)中进行了定义。
[0278]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0279]
[0280]
其中每个符号在wo 2018/100558(其内容通过引用以其整体并入本文)中进行了定义。
[0281]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0282][0283]
其中每个符号在wo 2017/175147(其内容通过引用以其整体并入本文)中进行了定义。
[0284]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂包括具有下式的化合物：
[0285][0286]
其中每个符号在wo 2017/175156(其内容通过引用以其整体并入本文)中进行了定义。
[0287]
在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl606、cl611、cl602、cl655、cl604、
cl609、cl614、cl656、cl647、cl626、cl629、cl603、cl632、cl633、cl659或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl606或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl611或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl602或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl655或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl604或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl609或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl614或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl656或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl647或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl626或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl629或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl603或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl632或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl633或其药学上可接受的盐。在一些方面，可用于本公开的sting激动剂是cl659或其药学上可接受的盐。
[0288]
在一些方面，ev(例如外来体)包含环状二核苷酸sting激动剂和/或非环状二核苷酸sting激动剂。在一些方面，当几种环状二核苷酸sting激动剂存在于本文公开的ev(例如，外来体)上时，此类sting激动剂可以是相同的，或者它们可以是不同的。在一些方面，当存在几种非环状二核苷酸sting激动剂时，此类sting激动剂可以是相同的，或者它们可以是不同的。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)组合物可包含两个或更多个ev(例如，外来体)群体，其中每个ev(例如，外来体)群体包含不同的sting激动剂或其组合。
[0289]
还可修饰sting激动剂以增加激动剂在细胞外囊泡或ev中的包封(例如，装载)(例如，或者在腔中均未结合)。在一些方面，sting激动剂与支架部分(例如，支架y)连接。在某些方面，所述修饰允许sting激动剂在ev(例如，外来体)的外表面上更好地表达(例如，与本文公开的支架部分(例如，支架x)连接)。这种修饰可包括通过用化学品或酶处理激动剂，或通过物理或化学地改变sting激动剂的极性或电荷来添加脂质结合标签。sting激动剂可通过单一处理或处理的组合，例如仅添加脂质结合标签，或添加脂质结合标签并改变极性来进行修饰。前面的实例意味着是非限制性的说明性实例。预期可以实践任何修饰组合。所述修饰可使激动剂在ev(例如，外来体)中的包封(即，装载)与未修饰的激动剂的包封(即，装载)相比增加约2倍至约10,000倍、约10倍至约1,000倍，或约100倍至约500倍。所述修饰可使激动剂在ev中的包封(即，装载)与未修饰的激动剂的包封(即，装载)相比增加至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍、至少约,2000倍、至少约3,000倍、至少约4,000倍、至少约5,000倍、至少约6,000倍、至少约7,000倍、至少约8,000倍、至少约9,000倍或至少约10,000倍。
[0290]
在一些方面，sting激动剂可被修饰以允许激动剂在ev表面(例如，ev(例如，外来体)的外表面和/或腔表面，(例如，与本文公开的支架部分(例如，支架x和/或支架y)连接))上更好地表达。可以使用上述任何修饰。所述修饰可使激动剂在ev中(例如，在外来体的表面和/或腔表面上)的表达与未修饰的激动剂的相应表达相比增加约2倍至10,000倍、约10
倍至1,000倍或约100倍至500倍。所述修饰可使激动剂在ev(例如，外来体)的外表面上的表达与未修饰的激动剂的表达相比增加至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍、至少约2,000倍、至少约3,000倍、至少约4,000倍、至少约5,000倍、至少约6,000倍、至少约7,000倍、至少约8,000倍、至少约9,000倍或至少约10,000倍。所述修饰可使激动剂在ev(例如，外来体)的腔表面上的表达与未修饰的激动剂的表达相比增加至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍、至少约2,000倍、至少约3,000倍、至少约4,000倍、至少约5,000倍、至少约6,000倍、至少约7,000倍、至少约8,000倍、至少约9,000倍或至少约10,000倍。
[0291]
与ev(例如，外来体)缔合的sting激动剂的浓度可以为约0.01μm至约1000μm。缔合的sting激动剂的浓度可为约0.01-0.05μm、约0.05-0.1μm、约0.1-0.5μm、约0.5-1μm、约1-5μm、约5-10μm、约10-15μm、约15-20μm、约20-25μm、约25-30μm、约30-35μm、约35-40μm、约45-50μm、约55-60μm、约65-70μm、约70-75μm、约75-80μm、约80-85μm、约85-90μm、约90-95μm、约95-100μm、约100-150μm、约150-200μm、约200-250μm、约250-300μm、约300-350μm、约250-400μm、约400-450μm、约450-500μm、约500-550μm、约550-600μm、约600-650μm、约650-700μm、约700-750μm、约750-800μm、约800-850μm、约805-900μm、约900-950μm或约950-1000μm。缔合的sting激动剂的浓度可以等于或大于约0.01μm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约45μm、约50μm、约55μm、约60μm、约65μm、约70μm、约75μm、约80μm、约85μm、约90μm、约95μm、约100μm、约150μm、约200μm、约250μm、约300μm、约350μm、约400μm、约450μm、约500μm、约550μm、约600μm、约650μm、约700μm、约750μm、约800μm、约850μm、约900μm、约950μm或约1,000μm。
[0292]
在一些方面，佐剂是tlr激动剂。tlr激动剂的非限制性实例包括：tlr2激动剂(例如，脂磷壁酸、非典型lps、malp-2和malp-404、ospa、孔蛋白、lcrv、脂甘露聚糖、gpi锚、溶血磷脂酰丝氨酸、脂磷聚糖(lpg)、糖磷脂酰肌醇(gpi)、酵母聚糖、hsp60、gh/gl糖蛋白、血凝素)、tlr3激动剂(例如，双链rna，例如poly(i:c))、tlr4激动剂(例如，脂多糖(lps))、脂磷壁酸、β-防御素2、纤连蛋白eda、hmgb1、snapin、腱糖蛋白c、tlr5激动剂(例如，鞭毛蛋白)、tlr6激动剂、tlr7/8激动剂(例如，单链rna、cpg-a、poly g10、poly g3、瑞喹莫德)、tlr9激动剂(例如，未甲基化的cpg dna)及其组合。tlr激动剂的非限制性实例可见于wo2008115319a2,us20130202707a1,us20120219615a1,us20100029585a1,wo2009030996a1,wo2009088401a2和wo2011044246a1(所述文献中的每一篇均通过引用以其整体并入)中。
[0293]
在一些方面，佐剂是炎症介质。
[0294]
在一些方面，抗原在ev(例如，外来体)的外表面上或腔内(例如，在腔表面上)表达。在一些方面，佐剂在ev(例如，外来体)的外表面上或腔表面中表达，直接与脂双层连接。在这些方面，抗原和/或佐剂可与支架部分(例如，支架x和/或支架y)连接。
[0295]
在一些方面，本文所述的ev(例如，外来体)包含第一支架部分。在某些方面，抗原与第一支架部分连接。在其它方面，佐剂连接至第一支架部分。在另外的方面，抗原和佐剂都连接至第一支架部分。在一些方面，ev(例如，外来体)还包含第二支架部分。在某些方面，抗原与第一支架部分连接，并且佐剂与第二支架部分连接。在一些方面，第一支架部分和第二支架部分是相同的(例如，两者都为支架x或两者都为支架y)。在其它方面，第一支架部分和第二支架部分是不同的(例如，第一支架部分是支架x，并且第二支架部分是支架y；或者第一支架部分是支架y，并且第二支架部分是支架x)。
[0296]
支架x的非限制性实例包括：前列腺素f2受体负调节剂(ptgfrn)；basigin(bsg)；免疫球蛋白超家族成员2(igsf2)；免疫球蛋白超家族成员3(igsf3)；免疫球蛋白超家族成员8(igsf8)；整联蛋白β-1(itgb1)；整联蛋白α-4(itga4)；4f2细胞表面抗原重链(slc3a2)；和一类atp转运蛋白(atp1a1、atp1a2、atp1a3、atp1a4、atp1b3、atp2b1、atp2b2、atp2b3、atp2b)。在某些方面，支架x是完整的蛋白质。在其它方面，支架x是蛋白质片段(例如，功能性片段)。
[0297]
在其它方面，可用于本公开的支架部分，第一支架部分、第二支架部分和/或第三支架部分，包括常规的外来体蛋白质，包括但不限于四跨膜蛋白(tetraspanin)分子(例如，cd63、cd81、cd9等)、溶酶体缔合的膜蛋白2(lamp2和lamp2b)、血小板衍生生长因子受体(pdgfr)、gpi锚蛋白、乳凝集素及其片段、对这些蛋白或其片段中的任一种具有亲和力的肽或其任意组合。
[0298]
支架y的非限制性实例包括：富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶c底物(marcks)蛋白；富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶c底物样蛋白1(marcksl1)蛋白；和脑酸溶性蛋白1(basp1)蛋白。在一些方面，支架y是完整的蛋白质。在某些方面，支架y是蛋白质片段(例如，功能片段)
[0299]
在一些方面，抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架部分连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内。如本文所用，当分子(例如，抗原或佐剂)被描述为在例如ev(例如，外来体)的“腔内”时，这意味着该分子未与本文所述的支架部分连接。在一些方面，抗原在ev(例如，外来体)的腔内，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架部分连接。在这些方面，第一支架部分可以是支架x或支架y。
[0300]
在一些方面，抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架部分连接。在一些方面，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架部分连接，并且抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架部分连接。在这些方面，第一支架部分可以是支架y，并且第二支架部分可以是支架x。在其它方面，第一支架部分和第二支架部分中的每一种都可以是支架x。
[0301]
在一些方面，抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架部分连接。在其它方面，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架部分连接，并且抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架部分连接。在这些方面，第一支架部分是支架x，并且第二支架部分是支架y；或者第一支架部分和第二支架部分中的每一种都是支架x。
[0302]
在一些方面，抗原在ev(例如，外来体)的腔内，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内。
[0303]
在一些方面，抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架部分连接。在其它方面，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架部分连接，并且抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架部分连接。在一些方面，第一支架部分和第二支架部分均为支架x。
[0304]
在一些方面，抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架部分连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内。在一些方面，抗原在ev(例如，外来体)的腔内，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架部分连接。在这些方面，第一支架部分可以是支架x。
[0305]
在一些方面，抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架部分连接。在其它方面，抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架部分连接。在这些方面，第一支架部分可以是支架x。
[0306]
特定方面的非限制性实例包括包含(i)抗原和(ii)佐剂的ev，例如外来体，其中：
[0307]
(a)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接；
[0308]
(b)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接；
[0309]
(c)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接；
[0310]
(d)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接；
[0311]
(e)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接；
[0312]
(f)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接；
[0313]
(g)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接；
[0314]
(h)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接；
[0315]
(i)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接；
[0316]
(j)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接；
[0317]
(k)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接；
[0318]
(l)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接；
[0319]
(m)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接；
[0320]
(n)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来
体)的腔表面上的支架y连接；
[0321]
(o)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接；
[0322]
(p)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接；
[0323]
(q)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接；
[0324]
(r)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接；
[0325]
(s)抗原直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接，并且佐剂直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接；
[0326]
(t)抗原直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内；
[0327]
(u)抗原直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接；
[0328]
(v)抗原直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接；
[0329]
(w)抗原直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接，并且佐剂直接与ev(例如，外来体)的外部连接；
[0330]
(x)抗原直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外部上的支架x连接；
[0331]
(y)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且佐剂直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接；
[0332]
(z)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且佐剂直接与ev(例如，外来体)的外部连接；
[0333]
(aa)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且佐剂直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接；
[0334]
(bb)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且佐剂直接与ev(例如，外来体)的外部连接；
[0335]
(cc)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，并且佐剂直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接；或者
[0336]
(dd)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，并且佐剂直接与ev(例如，外来体)的外部连接。
[0337]
在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原直接与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来
体)的腔表面上的支架y连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，并且佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原直接与ev的腔表面连接，并且佐剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原直接与ev的腔表面连接，并且佐剂在ev的腔内。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原直接与ev的腔表面连接，并且佐剂与ev的腔表面上的支架y连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原直接与ev的腔表面连接，并且佐剂与ev的腔表面上的支架x连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原直接与ev的腔表面连接，并且佐剂直接与ev的外部连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原直接与ev的腔表面连接，并且佐剂与ev的外部上的支架
x连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev的腔表面上的支架y连接，并且佐剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev的腔表面上的支架y连接，并且佐剂直接与ev的外部连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev的腔表面上的支架x连接，并且佐剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原与ev的腔表面上的支架x连接，并且佐剂直接与ev的外部连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原在ev的腔内，并且佐剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)佐剂，其中抗原在ev的腔内，并且佐剂直接与ev的外部连接。
[0338]
在一些方面，佐剂和/或抗原可被修饰以增加在ev(例如，外来体)中的包封(即，装载)。这种修饰可包括通过用化学品或酶处理激动剂(即，佐剂和/或抗原)，或通过物理或化学地改变佐剂和/或抗原的极性或电荷来添加脂质结合标签。佐剂和/或抗原可通过单一处理或通过处理的组合，例如仅添加脂质结合标签，或添加脂质结合标签并改变极性来进行修饰。前面的实例意味着是非限制性的说明性实例。预期可以实践任何修饰组合。所述修饰可使佐剂和/或抗原在ev(例如，外来体)中的包封(即，装载)与未修饰的激动剂(即，佐剂和/或抗原)的包封(即，装载)相比增加约2倍至约10,000倍、约10倍至1,000倍，或约100倍至约500倍。所述修饰可使佐剂和/或抗原在ev(例如，外来体)中的包封(即，装载)与未修饰的佐剂和/或抗原的包封(即，装载)相比增加至少约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍、约100倍、约200倍、约300倍、约400倍、约500倍、约600倍、约700倍、约800倍、约900倍、约1,000倍、约2,000倍、约3,000倍、约4,000倍、约5,000倍、约6,000倍、约7,000倍、约8,000倍、约9,000倍或约10,000倍。
[0339]
在一些方面，佐剂和/或抗原可被修饰以允许在ev表面(例如，ev的外表面和/或腔表面，(例如，与本文公开的支架部分(例如，支架x和/或支架y)连接))上更好地表达。可以使用上述任何修饰。所述修饰可使激动剂在ev中(例如，在外来体的表面和/或腔表面上)的表达与未修饰的激动剂的相应表达相比增加约2倍至10,000倍、约10倍至1,000倍或约100倍至500倍。所述修饰可使激动剂在ev(例如，外来体)的外表面上的表达与未修饰的激动剂的表达相比增加至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍、至少约2,000倍、至少约3,000倍、至少约4,000倍、至少约5,000倍、至少约6,000倍、至少约7,000倍、至少约8,000倍、至少约9,000倍或至少约10,000倍。所述修饰可使激动剂在ev(例如，外来体)的腔表面上的表达与未修饰的激动剂的表达相比增加至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍、至少约2,000倍、至少约3,000倍、至少约4,000倍、至少约5,000倍、至少约6,000倍、至少约7,000倍、至少约8,000倍、至少约9,000倍或至少约10,000倍。
[0340]
在一些方面，ev(例如，外来体)被进一步修饰以展示附加的蛋白质(或其片段)，所述附加的蛋白质或其片段可以帮助指导ev摄取(例如，靶向部分)、激活或阻断细胞途径以
增强与ev相关的组合作用(例如，装载到外来体中的有效载荷例如sting激动剂的作用)。在某些方面，本文公开的ev(例如，外来体)还包含能够改变ev在体内或体外的分布的靶向部分。在一些方面，靶向部分可以是生物分子，诸如蛋白质、肽、脂质或合成分子。
[0341]
在一些方面，本公开的靶向部分与树突状细胞的标志物特异性结合。在某些方面，所述标志物仅在树突状细胞上表达。在一些方面，树突状细胞包括祖先(pre)树突状细胞、炎性单树突状细胞、浆细胞样树突状细胞(pdc)、髓样/常规树突状细胞1(cdc1)、髓样/常规树突状细胞2(cdc2)、炎性单核细胞源性树突状细胞、朗格汉斯细胞、真皮树突状细胞、表达溶菌酶的树突状细胞(lysodc)、kupffer细胞、非经典单核细胞或其任意组合。在这些树突状细胞上表达的标志物是本领域已知的。参见，例如，collin等人，immunology 154(1):3-20(2018)。在一些方面，靶向部分是蛋白质，其中蛋白质是能够与选自以下的标志物特异性结合的抗体或其片段：dec205、clec9a、clec6、dcir、dc-sign、lox-1、marco、clec12a、clec10a、dc-无唾液酸糖蛋白受体(dc-asgpr)、dc免疫受体2(dcir2)、dectin-1、巨噬细胞甘露糖受体(mmr)、bdca-2(cd303、clec4c)、dectin-2、bst-2(cd317)、langerin、cd206、cd11b、cd11c、cd123、cd304、xcr1、axl、siglec 6、cd209、sirpa、cx3cr1、gpr182、cd14、cd16、cd32、cd34、cd38、cd10或其任意组合。在一些方面，可用于本公开有用的标志物包括c型凝集素样结构域。在某些方面，标志物是clec9a，并且树突状细胞是cdc1。
[0342]
在一些方面，本文公开的靶向部分可与人和小鼠clec9a(包括其任何变体)两者结合。在一些方面，本公开的靶向部分可与来自其它物种(包括但不限于黑猩猩、恒河猴、狗、牛、马或大鼠)的clec9a结合。这种clec9a蛋白的序列是本领域已知的。参见，例如，美国专利第8,426,565b2号，其通过引用以其整体并入本文。
[0343]
在一些方面，本公开的靶向部分与t细胞的标志物特异性结合。在某些方面，t细胞是cd4 t细胞。在一些方面，t细胞是cd8 t细胞。
[0344]
在一些方面，本文公开的靶向部分与人cd3蛋白或其片段结合。人cd3蛋白的序列是本领域已知的。
[0345]
在一些方面，本文公开的靶向部分可与人和小鼠cd3两者(包括其任何变体)结合。在一些方面，本公开的靶向部分可与来自其它物种(包括但不限于黑猩猩、恒河猴、狗、牛、马或大鼠)的cd3结合。这种cd3蛋白的序列也是本领域已知的。
[0346]
在一些方面，本文公开的靶向部分能够允许表达对靶向部分特异的标志物的细胞(例如cd3：cd4 t细胞和/或cd8 t细胞；clec9a：树突状细胞)更多地摄取ev(例如，外来体)。在一些方面，ev的摄取与参考(例如，不具有靶向部分的相应ev或非ev递送媒介物)相比，增加了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍、至少约2,000倍、至少约3,000倍、至少约4,000倍、至少约5,000倍、至少约6,000倍、至少约7,000倍、至少约8,000倍、至少约9,000倍、至少约10,000倍或更多。在一些方面，参考包括不表达本文公开的靶向部分的ev(例如，外来体)。
[0347]
在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)的摄取增加能够允许更大的免疫反应。因此，在某些方面，表达本文公开的靶向部分的ev(例如，外来体)与参考(例如，不具有靶向
部分的相应ev或非ev递送媒介物)相比，可使免疫反应(例如，针对装载到外来体上的肿瘤抗原)增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍、至少约2,000倍、至少约3,000倍、至少约4,000倍、至少约5,000倍、至少约6,000倍、至少约7,000倍、至少约8,000倍、至少约9,000倍、至少约10,000倍或更多。在一些方面，参考包括不表达本文公开的靶向部分的ev(例如，外来体)。在某些方面，免疫反应由t细胞(例如，cd8 t细胞或cd4 t细胞)和/或b细胞介导。
[0348]
如上所述，本文公开的靶向部分可包含肽、抗体或其抗原结合片段、化合物或其任意组合。
[0349]
在一些方面，靶向部分是能够与clec9a特异性结合的肽。参见，例如，yan等人，oncotarget 7(26):40437-40450(2016)。例如，在某些方面，所述肽包含clec9a的可溶性片段。美国专利第9,988,431b2号(其通过引用以其整体并入本文)中描述了这种肽的非限制性实例。在某些方面，所述肽包含clec9a的配体(天然的或合成的)，诸如在ahrens等人，immunity 36(4):635-45(2012)；和zhang等人，immunity36(4):646-57(2012)中描述的那些。包含clec9a配体的肽的非限制性实例描述于国际公布第wo 2013/053008 a2号(其通过引用以其整体并入本文)中。
[0350]
在一些方面，靶向部分是能够与cd3特异性结合的肽。例如，在某些方面，所述肽包含cd3的可溶性片段。在某些方面，所述肽包含cd3的配体(天然的或合成的)。
[0351]
在一些方面，靶向部分是抗体或其抗原结合片段。在某些方面，靶向部分是单链fv抗体片段。在某些方面，靶向部分是单链f(ab)抗体片段。在某些方面，靶向部分是纳米抗体。在某些方面，靶向部分是单体。
[0352]
在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)包含一种或多种(例如，2种、3种、4种、5种或更多种)靶向部分。在某些方面，一种或多种靶向部分与本文公开的其它外源生物活性分子(例如，治疗性分子、佐剂或免疫调节剂)组合表达。在一些方面，一种或多种靶向部分可以在ev(例如，外来体)的外表面上表达。因此，在某些方面，一种或多种靶向部分与ev(例如，外来体)的外表面上的支架部分(例如，支架x)连接。当一种或多种靶向部分与其它外源生物活性分子(例如，治疗性分子、佐剂或免疫调节剂)组合表达时，所述其它外源生物活性分子可以在ev(例如，外来体)的表面(例如，外表面或腔表面)或腔内表达。
[0353]
生产者细胞可被修饰以包含编码附加的蛋白质或其片段的附加的外源序列。或者，附加的蛋白质或其片段可通过本领域已知的任何合适的连接化学方法与ev(例如，外来体)共价连接或缀合。合适的连接化学的非限制性实例包括胺反应性基团、羧基反应性基团、巯基反应性基团、醛反应性基团、光反应性基团、clickit化学、生物素-链霉抗生物素蛋白或其它抗生物素蛋白缀合或其任意组合。
[0354]
ii.c免疫调节剂
[0355]
在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)可包含免疫调节剂(例如，与本文公开的抗原和/或其它有效载荷一起)。在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)包含多种免疫调节剂。在某些方面，多种免疫调节剂中的每一种都不同。在一些方面，本文公开的ev(例如，
外来体)包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种不同的免疫调节剂。
[0356]
在某些方面，ev(例如，外来体)包含一种或多种免疫调节剂与一种或多种附加的有效载荷(例如，抗原和/或佐剂)的组合。在一些方面，ev(例如，外来体)可包含一种或多种附加的部分(例如，靶向部分)。例如，在某些方面，本文公开的ev(例如，外来体)可包含(i)一种或多种免疫调节剂，(ii)一种或多种附加的有效载荷(例如，抗原和/或佐剂)，和(iii)一种或多种靶向部分。
[0357]
在一些方面，免疫调节剂可在ev(例如，外来体)的表面(例如，外表面或腔表面)或腔内表达。因此，在某些方面，免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架部分(例如，支架x)连接。在其它方面，免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架部分(例如，支架y)连接。在另外的方面，免疫调节剂在外来体的腔内(即，未与支架x或支架y连接)。在一些方面，免疫调节剂可直接(即，不使用支架部分)与ev(例如，外来体)的外表面和/或腔表面连接。
[0358]
这些方面的非限制性实例包括ev(例如，外来体)，其包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中：
[0359]
(a)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接；
[0360]
(b)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接；
[0361]
(c)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接；
[0362]
(d)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接；
[0363]
(e)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接；
[0364]
(f)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接；或者
[0365]
(g)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接；
[0366]
特定方面的非限制性实例包括ev(例如，外来体)，其包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中：
[0367]
(a)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接；
[0368]
(b)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接；
[0369]
(c)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接；
[0370]
(d)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接；
[0371]
(e)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与
ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接；
[0372]
(f)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接；
[0373]
(g)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接；
[0374]
(h)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接；
[0375]
(i)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接；
[0376]
(j)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接；
[0377]
(k)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接；
[0378]
(l)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接；
[0379]
(m)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接；
[0380]
(n)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接；
[0381]
(o)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接；
[0382]
(p)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接；
[0383]
(q)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接；
[0384]
(r)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接；
[0385]
(s)抗原直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接，并且免疫调节剂直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接；
[0386]
(t)抗原直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内；
[0387]
(u)抗原直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接；
[0388]
(v)抗原直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接；
[0389]
(w)抗原直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接，并且免疫调节剂直接与ev(例如，外来体)的外部连接；
[0390]
(x)抗原直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表上的支架x连接；
[0391]
(y)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接；
[0392]
(z)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂直接与ev(例如，外来体)的外部连接；
[0393]
(aa)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂直接与ev(例如，外来体)的腔表连接；
[0394]
(bb)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂直接与ev(例如，外来体)的外部连接；
[0395]
(cc)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，并且免疫调节剂直接与ev(例如，外来体)的腔表面连接；或者
[0396]
(dd)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，并且免疫调节剂直接与ev(例如，外来体)的外部连接。
[0397]
在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，
其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原直接与ev的腔表面连接，并且免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原直接与ev的腔表面连接，并且免疫调节剂在ev的腔内。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原直接与ev的腔表面连接，并且免疫调节剂与ev的腔表面上的支架y连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原直接与ev的腔表面连接，并且免疫调节剂与ev的腔表面上的支架x连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原直接与ev的腔表面连接，并且免疫调节剂直接与ev的外部连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原直接与ev的腔表面连接，并且免疫调节剂与ev的外部上的支架x连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂直接与ev的外部连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原与ev的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂直接与ev的外部连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原在ev的腔内，并且免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含(i)抗原和(ii)免疫调节剂，其中抗原在ev的腔内，并且免疫调节剂直接与ev的外部连接。
[0398]
特定方面的非限制性实例包括ev(例如，外来体)，其包含(i)抗原、(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中：
[0399]
(a)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接，并且免疫调节剂(a1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(a2)与第三支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔内的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0400]
(b)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂(b1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何
支架部分连接，或(b2)与支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0401]
(c)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂(c1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(c2)与支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0402]
(d)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂(d1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(d2)与第三支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0403]
(e)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂(e1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(e2)与支架部分(例如，外来体表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0404]
(f)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂(f1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(f2)与第三支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0405]
(g)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂(g1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(g2)与支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0406]
(h)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂(h1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(h2)与支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0407]
(i)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂(i1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(i2)与第三支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0408]
(j)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂(j1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(j2)与第三支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0409]
(k)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂(k1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(k2)与支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0410]
(l)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的
腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂(l1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(l2)与支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0411]
(m)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架连接，并且免疫调节剂(m1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(m2)与第三支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0412]
(n)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂(n1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(n2)与第三支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0413]
(o)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂(o1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(o2)与支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0414]
(p)抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂(p1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(p2)与第三支架部分(例如，外来体表面上或外来体腔内的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0415]
(q)抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂(q1)在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，或(q2)与第三支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接；
[0416]
(r)抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂(r1)在外来体的腔内，或(r2)与支架部分(例如，外来体外表面上或外来体腔表面上的支架x或ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y)连接。
[0417]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第三支架y连接。
[0418]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接。
[0419]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接。
[0420]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接。
[0421]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在
一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。
[0422]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接。
[0423]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。
[0424]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体
包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。
[0425]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第三支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第三支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。
[0426]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接。
[0427]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开
的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。
[0428]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。
[0429]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第三支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第三支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。
[0430]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架y连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架y连接。
[0431]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。
[0432]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第三支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第三支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的外表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。
[0433]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第三支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的第三支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原与ev(例如，外来体)的腔表面上的第一支架x连接，佐剂与ev(例如，外来体)的外表面上的第二支架x连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。
[0434]
在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连
接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的外表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架x连接。在一些方面，本公开的外来体包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中抗原在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，佐剂在ev(例如，外来体)的腔内，不与任何支架部分连接，并且免疫调节剂与ev(例如，外来体)的腔表面上的支架y连接。
[0435]
在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的腔表面连接，(a2)佐剂直接与ev的腔表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的腔表面连接，(a2)佐剂直接与ev的腔表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的外表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的腔表面连接，(a2)佐剂直接与ev的腔表面连接并且(a3)免疫调节剂与ev腔内的支架y连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的腔表面连接，(a2)佐剂直接与ev的腔表面连接并且(a3)免疫调节剂与ev腔内的支架x连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的腔表面连接，(a2)佐剂直接与ev的腔表面连接并且(a3)免疫调节剂与ev的外表面中的支架x连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的腔表面连接，(a2)佐剂直接与ev的腔表面连接并且(a3)免疫调节剂在ev腔内。
[0436]
在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的腔表面连接，(a2)佐剂直接与ev的外表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂，和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的腔表面连接，(a2)佐剂与ev的腔表面上的支架y连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂，和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的腔表面连接，(a2)佐剂与ev的腔表面上的支架x连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂，和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的腔表面连接，(a2)佐剂与ev的外表面上的支架x连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的腔表面连接，(a2)佐剂在ev腔内并且(a3)免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。
[0437]
在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的外表面连接，(a2)佐剂直接与ev的腔表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原与ev的腔表面上的支架y连接，(a2)佐剂直接与ev的腔表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原与ev的腔表面上的支架x连接，(a2)佐剂直接
与ev的腔表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原与ev的外表面上的支架x连接，(a2)佐剂直接与ev的腔表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原在ev的腔内，(a2)佐剂直接与ev的腔表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。
[0438]
在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的外表面连接，(a2)佐剂直接与ev的外表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的外表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的外表面连接，(a2)佐剂直接与ev的外表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的腔表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的外表面连接，(a2)佐剂直接与ev的外表面连接并且(a3)免疫调节剂与ev的腔表面上的支架y连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的外表面连接，(a2)佐剂直接与ev的外表面连接并且(a3)免疫调节剂与ev的腔表面上的支架x连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的外表面连接，(a2)佐剂直接与ev的外表面连接并且(a3)免疫调节剂与ev的外表面上的支架x连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的外表面连接，(a2)佐剂直接与ev的外表面连接并且(a3)免疫调节剂在ev腔内。
[0439]
在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的外表面连接，(a2)佐剂直接与ev的腔表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的外表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂，和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的外表面连接，(a2)佐剂与ev的腔表面上的支架y连接，以及(a3)免疫调节剂直接与ev的外表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂，和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的外表面连接，(a2)佐剂与ev的腔表面上的支架x连接，以及(a3)免疫调节剂直接与ev的外表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的外表面连接，(a2)佐剂与ev的外表面上的支架x连接，并且(a3)免疫调节剂直接与ev的外表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的外表面连接，(a2)佐剂在ev腔内并且(a3)免疫调节剂直接与ev的外表面连接。
[0440]
在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原直接与ev的腔表面连接，(a2)佐剂直接与ev的外表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的外表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原与ev的腔表面上的支架y连接，(a2)佐剂直接与ev的外表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的外表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原与ev的腔表面上的支架x连接，(a2)佐剂直接与ev的外表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的外表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原与ev的外表面上的支架x
连接，(a2)佐剂直接与ev的外表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的外表面连接。在一些方面，ev(例如，外来体)包含：(i)抗原，(ii)佐剂和(iii)免疫调节剂，其中(a1)抗原在ev的腔内，(a2)佐剂直接与ev的外表面连接并且(a3)免疫调节剂直接与ev的外表面连接。
[0441]
在一些方面，可与本文所述的ev(例如，外来体)一起使用的免疫调节剂具有抗肿瘤活性。在其它方面，可用于本公开的免疫调节剂具有致耐受性活性。在一些方面，免疫调节剂可以调节先天免疫反应。在某些方面，免疫调节剂通过靶向天然杀伤细胞来调节先天免疫反应。在一些方面，免疫调节剂可以调节适应性免疫反应。在一些方面，免疫调节剂通过靶向细胞毒性t细胞来调节适应性免疫反应。在另外的方面，免疫调节剂通过靶向b细胞来调节适应性免疫反应。在某些方面，本文公开的免疫调节剂可以调节外来体至细胞毒性t细胞或b细胞的分布(即，生物分布改性剂)。
[0442]
在一些方面，免疫调节剂包括负检查点调节剂的抑制剂或负检查点调节剂的结合配偶体的抑制剂。在某些方面，负检查点调节剂包括细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、淋巴细胞活化基因3(lag-3)、含t细胞免疫球蛋白粘蛋白的蛋白3(tim-3)、b淋巴细胞和t淋巴细胞衰减子(btla)、具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)、t细胞活化的v结构域ig抑制子(vista)、腺苷a2a受体(a2ar)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)、吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)、cd20、cd39、cd73或其任意组合。
[0443]
在一些方面，免疫调节剂是细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)的抑制剂。在某些方面，ctla-4抑制剂是ctla-4的单克隆抗体(“抗ctla-4抗体”)。在某些方面，所述抑制剂是ctla-4的单克隆抗体的片段。在某些方面，所述抗体片段是ctla-4的单克隆抗体的scfv、(scfv)2、fab、fab'和f(ab')2、f(ab1)2、fv、dab或fd。在某些方面，所述抑制剂是针对ctla-4的纳米抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在某些方面，抗ctla-4抗体是伊匹木单抗。在其它方面，抗ctla-4抗体是曲美木单抗。
[0444]
在一些方面，免疫调节剂是程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)的抑制剂。在一些方面，免疫调节剂是程序性死亡配体1(pd-l1)的抑制剂。在一些方面，免疫调节剂是程序性死亡配体2(pd-l2)的抑制剂。在某些方面，pd-1、pd-l1或pd-l2的抑制剂是pd-1(“抗pd-1抗体”)、pd-l1(“抗pd-l1抗体”)或pd-l2(“抗pd-l2抗体”)的单克隆抗体。在一些方面，所述抑制剂是抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体或抗pd-l2抗体的片段。在某些方面，抗体片段是pd-1、pd-l1或pd-l2的单克隆抗体的scfv、(scfv)2、fab、fab'和f(ab')2、f(ab1)2、fv、dab或fd。在某些方面，所述抑制剂是针对pd-1、pd-l1或pd-l2的纳米抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在一些方面，抗pd-1抗体是纳武单抗。在一些方面，抗pd-1抗体是帕博利珠单抗。在一些方面，抗pd-1抗体是匹地利珠单抗。在一些方面，抗pd-l1抗体是阿替利珠单抗。在其它方面，抗pd-l1抗体是阿维鲁单抗。
[0445]
在一些方面，免疫调节剂是淋巴细胞活化基因3(lag3)的抑制剂。在某些方面，lag3的抑制剂是lag3的单克隆抗体(“抗lag3抗体”)。在一些方面，抑制剂是抗lag3抗体的片段，例如，scfv、(scfv)2、fab、fab'和f(ab')2、f(ab1)2、fv、dab或fd。在某些方面，抑制剂是针对lag3的纳米抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
[0446]
在一些方面，免疫调节剂是含t细胞免疫球蛋白粘蛋白3(tim-3)的抑制剂。在一些方面，免疫调节剂是b淋巴细胞和t淋巴细胞衰减因子(btla)的抑制剂。在某些方面，免疫调节剂是具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)的抑制剂。在一些方面，免疫调节剂
是t细胞活化的v结构域ig抑制因子(vista)的抑制剂。在一些方面，免疫调节剂是腺苷a2a受体(a2ar)的抑制剂。在一些方面，免疫调节剂是杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的抑制剂。在一些方面，免疫调节剂是吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)的抑制剂。在一些方面，免疫调节剂是cd20、cd39或cd73的抑制剂。
[0447]
在一些方面，免疫调节剂包括正共刺激分子的激活剂或正共刺激分子的结合配偶体的激活剂。在某些方面，正共刺激分子包括tnf受体超家族成员(例如，cd120a、cd120b、cd18、ox40、cd40、fas受体、m68、cd27、cd30、4-1bb、trailr1、trailr2、trailr3、trailr4、rank、ocif、tweak受体、taci、baff受体、atar、cd271、cd269、aitr、troy、cd358、tramp和xedar)。在一些方面，正共刺激分子的激活剂是tnf超家族成员(例如，tnfα、tnf-c、ox40l、cd40l、fasl、light、tl1a、cd27l、siva、cd153、4-1bb配体、trail、rankl、tweak、april、baff、camlg、ngf、bdnf、nt-3、nt-4、gitr配体和eda-2)。
[0448]
在一些方面，免疫调节剂是tnf受体超家族成员4(ox40)的激活剂。在某些方面，ox40的激活剂是激动性抗ox40抗体。在另外的方面，ox40的激活剂是ox40配体(ox40l)。
[0449]
在一些方面，免疫调节剂是cd27的激活剂。在某些方面，cd27的激活剂是激动性抗cd27抗体。在其它方面，cd27的激活剂是cd27配体(cd27l)。
[0450]
在一些方面，免疫调节剂是cd40的激活剂。在某些方面，cd40的激活剂是激动性抗cd40抗体。在一些方面，cd40的激活剂是cd40配体(cd40l)。在某些方面，cd40l是单体cd40l。在其它方面，cd40l是三聚体cd40l。
[0451]
在一些方面，免疫调节剂是糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白(gitr)的激活剂。在某些方面，gitr的激活剂是激动性抗gitr抗体。在其它方面，gitr的激活剂是gitr的天然配体。
[0452]
在一些方面，免疫调节剂是4-1bb的激活剂。在特定方面，4-1bb的激活剂是激动性抗4-1bb抗体。在某些方面，4-1bb的激活剂是4-1bb的天然配体。
[0453]
在一些方面，免疫调节剂是fas受体(fas)。在此类方面，fas受体展示在ev(例如，外来体)的表面上。在一些方面，免疫调节剂是fas配体(fasl)。在某些方面，fas配体展示在ev(例如，外来体)的表面上。在一些方面，免疫调节剂是抗fas抗体或抗fasl抗体。
[0454]
在一些方面，免疫调节剂是cd28超家族共刺激分子的激活剂。在某些方面，cd28超家族共刺激分子是icos或cd28。在某些方面，免疫调节组分是icosl、cd80或cd86。
[0455]
在一些方面，免疫调节剂是诱导型t细胞共刺激因子(icos)的激活剂。在某些方面，icos的激活剂是激动性抗icos抗体。在其它方面，icos的激活剂是icos配体(icosl)。
[0456]
在一些方面，免疫调节剂是cd28的激活剂。在一些方面，cd28的激活剂是激动性抗cd28抗体。在其它方面，cd28的激活剂是cd28的天然配体。在某些方面，cd28的配体是cd80。
[0457]
在一些方面，免疫调节剂包括细胞因子或细胞因子的结合配偶体。在一些方面，细胞因子选自(i)细胞因子的共同γ链家族；(ii)il-1细胞因子家族；(iii)造血细胞因子；(iv)干扰素(例如，i型、ii型或iii型)；(v)tnf细胞因子家族；(vi)il-17细胞因子家族；(vii)损伤相关分子模式(damp)；(viii)致耐受性细胞因子；或(ix)其组合。在某些方面，细胞因子包括il-2、il-4、il-7、il-10、il-12、il-15、il-21、ifn-γ、il-1α、il-1β、il-1ra、il-18、il-33、il-36α、il-36β、il-36γ、il-36ra、il-37、il-38、il-3、il-5、il-6、il-11、il-13、il-23、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、粒细胞-集落刺激因子(g-csf)、白
血病抑制因子(lif)、干细胞因子(scf)、血小板生成素(tpo)、巨噬细胞-集落刺激因子(m-csf)、红细胞生成素(erythropoieticn)(epo)、flt-3、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、il-19、il-20、il-22、il-24、tnf-α、tnf-β、baff、april、淋巴毒素β(tnf-γ)、il-17a、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e、il-17f、il-25、tslp、il-35、il-27、tgf-β或其组合。
[0458]
在一些方面，免疫调节剂包括趋化因子。在某些方面，趋化因子包括(i)cc趋化因子(例如，ccl1、ccl2、ccl3、ccl4、ccl5、ccl6、ccl7、ccl8、ccl9、ccl10、ccl11、ccl12、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl20、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27、ccl28)；(ii)cxc趋化因子(例如，cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl4、cxcl5、cxcl6、cxcl7、cxcl8、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl15、cxcl16、cxcl17)；(iii)c趋化因子(例如，xcl1、xcl2)；(iv)cx3c趋化因子(例如，cx3cl1)；(v)或其组合。
[0459]
在一些方面，免疫调节剂包括溶血磷脂酸(lpa)的抑制剂。lpa是一种高度强效的内源性脂质介质，其保护和拯救细胞免受程序性细胞死亡。lpa，通过其高亲和力的lpa-1受体，是纤维生成的重要介质。
[0460]
在一些方面，lpa-1抑制剂包括am095，其为lpa-1的强效口服生物可利用的拮抗剂，其中对小鼠lpa-1或重组人lpa-1的ic
50
值分别为0.73μm和0.98μm。在体外，am095已被证明抑制lpa-1诱导的小鼠lpa-1/cho细胞和人a2058黑色素瘤细胞的趋化性，其中ic
50
值为0.78μm和0.23μm。在体内，am095可以在小鼠中剂量依赖性地阻断lpa诱导的组胺释放，其中ed
50
值为8.3mg/kg。另外，am095已被揭示能在肺中显著减少balf胶原蛋白和蛋白质，其中ed
50
值为10mg/kg。am095也被证明可以在小鼠中减少博莱霉素诱导的巨噬细胞和淋巴细胞浸润。参见swaney等人(2018)mol.can.res.16:1601-1613，其通过引用以其整体并入本文。
[0461]
在一些方面，lpa-1抑制剂包括am152(也称为bms-986020)。am152是高亲和力lpa-1拮抗剂，其抑制胆汁酸和磷脂转运蛋白，其中针对bsep、mrp4和mdr3的ic
50
分别为4.8μm、6.2μm和7.5μm。am152可用于治疗特发性肺纤维化(ipf)。参见kihara等人(2015)exp.cell res.333:171-7；rosen等人(2017)european respiratory journal 50:pa1038；和palmer等人(2018)chest 154:1061-1069，所述文献通过引用以其整体并入本文。由于胆囊毒性和肝脏毒性肝脏转运蛋白(2种特异性转运蛋白)的早期迹象，am152的2期研究(在palmer 2018中描述)提前终止。
[0462]
在本公开的其它地方提供了与包含lpa-1抑制剂的ev(例如，外来体)相关的其它公开内容(例如，参见实施例24)。
[0463]
在一些方面，可与抗原例如hsv-2抗原组合的免疫调节剂是il-21。本文其它地方公开了hsv-2抗原的非限制性实例。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含在ev的腔中的il-21和hsv-2抗原两者。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的il-21以及在ev的外表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x)连接的hsv-2抗原，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的il-21以及在ev的腔表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的hsv-2抗原。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的hsv-2抗原以及在ev的腔表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的il-21。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的il-21以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分
(例如，支架x或支架y)连接的hsv-2抗原，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的hsv-2抗原以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x或支架y)连接的il-21，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在一些方面，本公开的ev包含在ev的腔表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x或支架y)连接的il-21以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x或支架y)连接的hsv-2抗原，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。
[0464]
在一些方面，可与抗原例如hsv-2抗原组合的免疫调节剂是cd40l。本文其它地方公开了hsv-2抗原的非限制性实例。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含在ev的腔内的cd40l和hsv-2抗原两者。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的cd40l以及在ev的外表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x)连接的hsv-2抗原，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的cd40l以及在ev的腔表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的hsv-2抗原。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的hsv-2抗原以及在ev的腔表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的cd40l。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的cd40l以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x或支架y)连接的hsv-2抗原，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的hsv-2抗原以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x或支架y)连接的cd40l，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在一些方面，本公开的ev包含在ev的腔表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x或支架y)连接的cd40l以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x或支架y)连接的hsv-2抗原，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。
[0465]
在一些方面，包含hsv-2抗原(例如，本文公开的)和免疫调节剂(例如，il-21或cd40l)的ev(例如，外来体)还可包含佐剂。在本文其它地方描述了可用于本公开的佐剂的非限制性实例。
[0466]
在一些方面，包含hsv-2抗原和一种或多种附加的有效载荷(例如，上述免疫调节剂和/或佐剂)的ev(例如，外来体)与参考相比可增强对hsv-2抗原的免疫反应。在一些方面，参考包括仅包含hsv-2抗原的ev(例如，外来体)。在另一方面，参考包括未与本文公开的ev(例如，外来体)连接或不存在于其中的hsv-2抗原(单独的或与一种或多种附加的有效载荷(例如，佐剂和/或免疫调节剂)组合的)。在一些方面，免疫反应包括先天免疫反应、体液免疫反应、细胞介导的免疫反应或其组合。在某些方面，所述免疫反应与参考相比增强了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约250％、至少约500％、至少约750％、至少约1,000％或更多。在一些方面，所述免疫反应与参考(例如，不具有靶向部分的相应ev或非ev递送媒介物)相比增强了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90
倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍、至少约2,000倍、至少约3,000倍、至少约4,000倍、至少约5,000倍、至少约6,000倍、至少约7,000倍、至少约8,000倍、至少约9,000倍、至少约10,000倍或更多。
[0467]
在一些方面，当向有需要的受试者施用包含hsv-2抗原和一种或多种附加的有效载荷(例如，上述免疫调节剂和/或佐剂)的ev(例如，外来体)时，其可减少病毒脱落。在某些方面，与参考(例如，仅包含抗原的相应ev或仅包含抗原或与一种或多种附加的有效载荷组合的非ev递送媒介物)相比，病毒脱落减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，当向有需要的受试者施用包含hsv-2抗原和一种或多种附加的有效载荷(例如，免疫调节剂和/或佐剂)的ev(例如，外来体)时，其可增加病毒清除。在某些方面，与参考(例如，仅包含抗原的相应ev或仅包含抗原或与一种或多种附加的有效载荷组合的非ev递送媒介物)相比，病毒清除增加了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约250％、至少约500％、至少约750％、至少约1,000％或更多。在一些方面，与参考(例如，仅包含抗原的相应ev或仅包含抗原或与一种或多种附加的有效载荷组合的非ev递送媒介物)相比，病毒清除增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍、至少约2,000倍、至少约3,000倍、至少约4,000倍、至少约5,000倍、至少约6,000倍、至少约7,000倍、至少约8,000倍、至少约9,000倍、至少约10,000倍或更多。在另外的方面，当向有需要的受试者施用包含hsv-2抗原和一种或多种附加的有效载荷(例如，免疫调节剂和/或佐剂)的ev(例如，外来体)时，其可减少hsv-2介导的病变形成。在某些方面，与参考(例如，仅包含抗原的相应ev或仅包含抗原或与一种或多种附加的有效载荷组合的非ev递送媒介物)相比，病变形成减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
[0468]
在一些方面，参考包括仅包含hsv-2抗原的ev(例如，外来体)。另一方面，参考包括未与本文公开的ev连接或不存在于其中的hsv-2抗原(单独的或与佐剂和/或免疫调节剂组合的)。
[0469]
在一些方面，可与抗原例如ebv抗原组合的免疫调节剂是il-21。ebv抗原(例如，bzlf1)的非限制性实例在本文其它地方公开。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含在ev的腔中的il-21和ebv抗原(例如，bzlf1)两者。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的il-21以及在ev的外表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x)连接的ebv抗原(例如，bzlf1)，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的il-21以及在ev的腔表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的ebv抗原(例如，bzlf1)。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接
的ebv抗原(例如，bzlf1)以及在ev的腔表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的il-21。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的il-21以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x或支架y)连接的ebv抗原(例如，bzlf1)，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的ebv抗原(例如，bzlf1)以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x或支架y)连接的il-21，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在一些方面，本公开的ev包含在ev的腔表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x或支架y)连接的il-21以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x或支架y)连接的ebv抗原(例如，bzlf1)，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。
[0470]
在一些方面，可与抗原例如ebv抗原(例如，bzlf1)组合的免疫调节剂是cd40l。ebv抗原(例如bzlf1)的非限制性实例公开于在本文其它地方。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含在ev的腔中cd40l和ebv抗原(例如，bzlf1)两者。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的cd40l以及在ev的外表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x)连接的ebv抗原(例如，bzlf1)，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的cd40l以及在ev的腔表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的ebv抗原(例如，bzlf1)。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的ebv抗原(例如，bzlf1)以及在ev的腔表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的cd40l。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的cd40l以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x或支架y)连接的ebv抗原(例如，bzlf1)，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的ebv抗原(例如，bzlf1)以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x或支架y)连接的cd40l，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在一些方面，本公开的ev包含在ev的腔表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x或支架y)连接的cd40l以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x或支架y)连接的ebv抗原(例如，bzlf1)，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。
[0471]
在一些方面，包含ebv抗原和免疫调节剂(例如，il-21或cd40l)的ev(例如，外来体)还可包含本文公开的一种或多种附加的有效载荷(例如，附加的抗原、附加的免疫调节剂和/或佐剂)和/或一种或多种靶向部分。在一些方面，包含ebv抗原(例如，bzlf1)(例如，本文公开的)和免疫调节剂(例如，il-21或cd40l)的ev(例如，外来体)还可包含佐剂。在本文其它地方描述了可用于本公开的佐剂的非限制性实例。在一些方面，ev还可包含附加的抗原(例如，不同的ebv抗原)。在一些方面，ev还可包含本文公开的附加的免疫调节剂(例如，不同于il-21或cd40l)。
[0472]
在一些方面，包含ebv抗原(例如，bzlf1)和一种或多种附加的有效载荷(例如，上述免疫调节剂和/或佐剂)的ev(例如，外来体)与参考相比可增强对ebv抗原(例如，bzlf1)的免疫反应。在一些方面，参考包括仅包含ebv抗原(例如，bzlf1)的ev(例如，外来体)。在其它方面，参考包括未与本文公开的ev(例如，外来体)连接或不存在于其中的ebv抗原(例如，
bzlf1)(单独的或与佐剂和/或免疫调节剂组合的)。在一些方面，免疫反应包括先天免疫反应、体液免疫反应、细胞介导的免疫反应或其组合。在某些方面，所述免疫反应与参考相比增强了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约250％、至少约500％、至少约750％、至少约1,000％或更多。在一些方面，所述免疫反应与参考相比增强了至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍、至少约2,000倍、至少约3,000倍、至少约4,000倍、至少约5,000倍、至少约6,000倍、至少约7,000倍、至少约8,000倍、至少约9,000倍、至少约10,000倍或更多。
[0473]
在一些方面，当向有需要的受试者施用包含ebv抗原(例如，bzlf1)和一种或多种附加的有效载荷(例如，上述免疫调节剂和/或佐剂)的ev(例如，外来体)时，其可减少病毒脱落。在某些方面，与参考(例如，仅包含抗原的相应ev或仅包含抗原或与一种或多种附加的有效载荷组合的非ev递送媒介物)相比，病毒脱落减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，当向有需要的受试者施用包含ebv抗原(例如，bzlf1)和一种或多种附加的有效载荷(例如，免疫调节剂和/或佐剂)的ev(例如，外来体)时，其可增加病毒清除。在某些方面，与参考(例如，仅包含抗原的相应ev或仅包含抗原或与一种或多种附加的有效载荷组合的非ev递送媒介物)相比，病毒清除增加了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约250％、至少约500％、至少约750％、至少约1,000％或更多。在一些方面，当向有需要的受试者施用包含ebv抗原(例如，bzlf1)和一种或多种附加的有效载荷(例如，免疫调节剂和/或佐剂)的ev(例如，外来体)时，其可减少ebv介导的病变形成。在某些方面，与参考(例如，仅包含抗原的相应ev或仅包含抗原或与一种或多种附加的有效载荷组合的非ev递送媒介物)相比，病变形成减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
[0474]
在一些方面，参考包括仅包含ebv抗原(例如，bzlf1)的ev(例如，外来体)。在其它方面，参考包括未与本文公开的ev连接或不存在于其中的ebv抗原(例如，bzlf1)(单独的或与佐剂和/或免疫调节剂组合的)。
[0475]
在一些方面，可与抗原例如tb抗原组合的免疫调节剂是il-12。
[0476]
本文其它地方公开了tb抗原的非限制性实例。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含在ev的腔内的il-12和tb抗原两者。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的il-12以及在ev的外表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x)连接的tb抗原，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的il-12以及在ev的腔表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的tb抗原。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的tb抗原以及在ev的腔表面上的
任选地经由支架部分(例如，支架x)连接的il-12。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的il-12以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x或支架y)连接的tb抗原，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在其它方面，ev包含在ev的外表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x)连接的tb抗原以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x或支架y)连接的il-12，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。在一些方面，本公开的ev包含在ev的腔表面上的任选地经由第一支架部分(例如，支架x或支架y)连接的il-12以及在ev的腔表面上的任选地经由第二支架部分(例如，支架x或支架y)连接的tb抗原，其中第一支架部分与第二支架部分相同或不同。
[0477]
包含il-12和tb抗原的ev可在有需要的受试者中诱导免疫反应。在一些方面，免疫反应是cd4 t细胞反应、cd8 t细胞反应或cd4 t细胞和cd8 t细胞反应。在一些方面，免疫反应是具有对tb抗原(例如，esat6抗原)是特异性的效应功能的cd4 t细胞免疫反应。在一些方面，免疫反应是对tb抗原(例如，tb10.4抗原)特异的cd8 t细胞免疫反应。
[0478]
在一些方面，包含tb抗原和免疫调节剂(例如，il-12)的ev(例如，外来体)还可包含本文公开的一种或多种附加的有效载荷(例如，附加的抗原、附加的免疫调节剂和/或佐剂)。例如，在某些方面，ev(例如，外来体)还可包含佐剂(例如，诸如本文公开的那些)。在一些方面，ev还可包含附加的抗原(例如，不同的ebv抗原)。在一些方面，ev还可包含本文公开的附加的免疫调节剂(例如，不同于il-21或cd40l)。
[0479]
在一些方面，可用于本公开的免疫调节剂包含支持生发中心反应所需的细胞内相互作用的蛋白。在某些方面，这种蛋白包括信号传导淋巴细胞活化分子(slam)家族成员或slam相关蛋白(sap)。在一些方面，slam家族成员包括slam、cd48、cd229(ly9)、ly108、2b4、cd84、ntb-a、cracc、blame、cd2f-10或其组合。可在生发中心反应中发挥作用的其它免疫调节剂的非限制性实例包括：icos-icosl、cd40-40l、cd28/b7、pd-1/l1、il-4/il4r、il21/il21r、tlr4、tlr7、tlr8、tlr9、cd180、cd22及其组合。
[0480]
在一些方面，免疫调节剂包括t细胞受体(tcr)或其衍生物。在某些方面，免疫调节剂是tcrα链或其衍生物。在其它方面，免疫调节剂是tcrβ链或其衍生物。在另外的方面，免疫调节剂是t细胞的共受体或其衍生物。
[0481]
在一些方面，免疫调节剂包括嵌合抗原受体(car)或其衍生物。在某些方面，car与本文公开的一种或多种抗原(例如，肿瘤抗原，例如，甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、上皮肿瘤抗原(eta)、粘蛋白1(muc1)、tn-muc1、粘蛋白16(muc16)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(mage)、肿瘤蛋白p53(p53)、cd4、cd8、cd45、cd80、cd86、程序性死亡配体1(pd-l1)、程序性死亡配体2(pd-l2)、ny-eso-1、psma、tag-72、her2、gd2、cmet、egfr、间皮素、vegfr、α-叶酸受体、ce7r、il-3、睾丸癌抗原、mart-1gp100和tnf相关凋亡诱导配体)结合。
[0482]
在一些方面，免疫调节剂包括t细胞受体或共受体的激活剂。在某些方面，免疫调节组分是cd3的激活剂。在某些方面，激活剂是cd3的单克隆抗体的片段。在某些方面，抗体片段是针对cd3的单克隆抗体的scfv、(scfv)2、fab、fab'和f(ab')2、f(ab1)2、fv、dab或fd。在某些方面，激活剂是针对cd3的纳米抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在某些方面，免疫调节组分是cd28的激活剂。在某些方面，激活剂是cd28的单克隆抗体的片段。在某些方面，抗体片段是cd28的单克隆抗体的scfv、(scfv)2、fab、fab'和f(ab')2、f(ab1)2、fv、dab或
fd。在某些方面，激活剂是针对cd28的纳米抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
[0483]
在一些方面，免疫调节剂包括耐受性诱导剂。在某些方面，耐受性诱导剂包括nf-κb抑制剂。可用于本公开的nf-κb抑制剂的非限制性实例包括：ikk复合物抑制剂(例如，tpca-1、nf-κb激活抑制剂vi(bot-64)、bms 345541、氨来呫诺(amlexanox)、sc-514(gk 01140)、imd 0354、ikk-16)、iκb降解抑制剂(例如，bay 11-7082、mg-115、mg-132、乳胞素、环氧霉素、小白菊内酯(parthenolide)、卡非佐米布(carfilzomib)、mln-4924(pevonedistat))、nf-κb核易位抑制剂(例如，jsh-23、咯利普兰(rolipram))、p65乙酰化抑制剂(例如，没食子酸、漆树酸)、nf-κb-dna结合抑制剂(例如，gyy 4137、p-xsc、cv 3988、前列腺素e2(pge2))、nf-κb反式激活抑制剂(例如，ly 294002、渥曼青霉素(wortmannin)、美沙拉嗪)或其组合。另参见，gupta，s.c.等人，biochim biophys acta 1799:775-787(2010)，其通过引用以其整体并入本文。在一些方面，可以抑制nf-κb活性并与本文公开的ev(例如，外来体)一起使用的免疫调节剂包括特异性靶向nf-κb的反义寡核苷酸。在另外的方面，能够诱导耐受性的免疫调节剂包括cox-2抑制剂、mtor抑制剂(例如，雷帕霉素和衍生物，例如，靶向mtor的反义寡核苷酸)、前列腺素、非甾体抗炎剂(nsaids)、抗白三烯、芳烃受体(ahr)配体、维生素d、维甲酸、类固醇、fas受体/配体、cd22配体、il-10、il-35、il-27、代谢调节剂(例如，谷氨酸盐)、聚糖(例如，es62、lewisx、lnfpiii)、过氧化物酶体增殖物激活受体(ppar)激动剂、免疫球蛋白样转录物(ilt)受体家族(例如，ilt3、ilt4、hla-g、ilt-2)、米诺环素、tlr4激动剂或其组合。
[0484]
在一些方面，免疫调节剂是激动剂。在某些方面，激动剂是内源性激动剂，诸如激素或神经递质。在其它方面，激动剂是外源性激动剂，诸如药物。在一些方面，激动剂是物理激动剂，其可产生激动剂反应而不与受体结合。在一些方面，激动剂是超激动剂，其能产生比内源性激动剂更大的最大反应。在某些方面，激动剂是在受体上具有完全效力的完全激动剂。在其它方面，激动剂是相对于完全激动剂在受体上仅具有部分功效的部分激动剂。在一些方面，激动剂是能够抑制受体的组成型活性的反向激动剂。在一些方面，激动剂是与其它共激动剂协同作用以对受体产生作用的共激动剂。在某些方面，激动剂是不可逆的激动剂，其通过形成共价键与受体永久键合。在某些方面，激动剂是特定类型受体的选择性激动剂
[0485]
在一些方面，免疫调节剂是拮抗剂。在特定方面，拮抗剂是竞争性拮抗剂，其在与内源性配体或激动剂相同的结合位点可逆地结合受体，而不激活受体。竞争性拮抗剂能够影响达到最大反应所需的激动剂的量。在其它方面，拮抗剂是非竞争性拮抗剂，其与受体的活性位点或受体的变构位点结合。非竞争性拮抗剂可降低任何量的激动剂所能达到的最大反应的幅度。在另外的方面，拮抗剂是非竞争性拮抗剂，其需要受体在所述受体与单独的变构结合位点结合之前被激动剂激活。
[0486]
在一些方面，免疫调节剂包括抗体或抗原结合片段。免疫调节组分可以是全长蛋白质或其片段。抗体或抗原结合片段可来源于天然来源，或者部分或全部合成产生。在一些方面，抗体是单克隆抗体。在这些方面中的一些方面，单克隆抗体是igg抗体。在某些方面，单克隆抗体是igg1、igg2、igg3或igg4。在一些其它方面，抗体是多克隆抗体。在某些方面，抗原结合片段选自fab、fab'和f(ab')2、f(ab1)2、fv、dab和fd片段。在某些方面，抗原结合片段是scfv或(scfv)2片段。在某些其它方面，抗体或抗原结合片段是(单结
构域抗体)。在一些方面，抗体或抗原结合片段是双特异性或多特异性抗体。
[0487]
在各个方面，抗体或抗原结合片段完全是人的。在一些方面，抗体或抗原结合片段是人源化的。在一些方面，抗体或抗原结合片段是嵌合的。在这些方面中的一些方面，嵌合抗体具有非人v区结构域和人c区结构域。在一些方面，抗体或抗原结合片段是非人的，诸如鼠类或兽医的。
[0488]
在某些方面，免疫调节组分是多核苷酸。在这些方面中的一些方面，多核苷酸包括但不限于mrna、mirna、sirna、反义寡核苷酸(例如，反义rna或反义dna)、磷酸二酰胺吗啉代低聚物(pmo)、肽缀合的磷酸二酰胺吗啉代低聚物(ppmo)、shrna、lncrna、dsdna及其组合。在一些方面，多核苷酸是rna(例如，mrna、mirna、sirna、反义寡核苷酸(例如，反义rna)、shrna或lncrna)。在这些方面中的一些方面，当多核苷酸是mrna时，其可被翻译成所需的多肽。在一些方面，多核苷酸是微小rna(mirna)或pre-mirna分子。在这些方面中的一些方面，mirna被递送到靶细胞的细胞质中，使得mirna分子可以沉默靶细胞中的天然mrna。在一些方面，多核苷酸是能够干扰癌基因或其它失调多肽的表达的小干扰rna(sirna)或短发夹rna(shrna)。在这些方面中的一些方面，sirna被递送到靶细胞的细胞质中，使得sirna分子可以沉默靶细胞中的天然mrna。在一些方面，多核苷酸是与mrna互补的反义寡核苷酸(例如，反义rna)。在一些方面，多核苷酸是能够调控基因表达和调节疾病的长非编码rna(lncrna)。在一些方面，多核苷酸是可被转录成rna的dna。在这些方面中的一些方面，转录的rna可被翻译成所需的多肽。
[0489]
在一些方面，免疫调节组分是蛋白质、肽、糖脂或糖蛋白。
[0490]
在各个方面，ev(例如，外来体)组合物包含两种或更多种上述免疫调节组分，包括原子、分子等的混合物、融合物、组合和缀合物。在一些方面，组合物包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种不同的与膜缔合或被包封在细胞外囊泡(例如，外来体)的封闭体积内的免疫调节组分。在某些方面，组合物包含与多肽组合的核酸。在某些方面，组合物包含两种或多种相互缀合的多肽。在某些方面，组合物包含与生物活性分子缀合的蛋白质。在这些方面中的一些方面，生物活性分子是前药。
[0491]
ii.d支架x-工程化细胞，例如，外来体，
[0492]
在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包含在其组成上被修饰的膜。例如，可通过改变膜的蛋白质、脂质或聚糖含量来改变它们的膜组成。
[0493]
在一些方面，通过化学和/或物理方法，诸如peg诱导的融合和/或超声融合，产生表面工程化ev(例如，外来体)。在其它方面，表面工程化ev(例如，外来体)通过遗传工程产生。从遗传修饰的生产者细胞或遗传修饰的细胞的后代产生的ev(例如，外来体)可以包含改变的膜组成。在一些方面，表面工程化ev(例如，外来体)具有较高或较低密度(例如，较多的数目)的支架部分(例如，外来体蛋白，例如，支架x)，或包括支架部分的变体或片段。
[0494]
例如，表面(例如，支架x)工程化ev可以从用编码支架部分(例如，外来体蛋白，例如，支架x)或其变体或片段的外源序列转化的细胞(例如，hek293细胞)产生。包括由外源序列表达的支架部分的ev可包括改变的膜组成。
[0495]
支架部分的各种修饰或片段可用于本发明的方面。例如，经修饰而对结合剂具有增强的亲和力的支架部分可用于产生可使用结合剂纯化的表面工程化ev。可使用经修饰而更有效地靶向ev和/或膜的支架部分。还可使用经修饰而包含特异性且有效地靶向外来体
膜所需的最小片段的支架部分。
[0496]
支架部分可被工程化成表达为融合分子，例如支架x与抗原、佐剂和/或免疫调节剂的融合分子。例如，融合分子可包含本文公开的与抗原、佐剂和/或免疫调节剂连接的支架部分(例如，支架x，例如ptgfrn、bsg、igsf2、igsf3、igsf8、itgb1、itga4、slc3a2、atp转运蛋白或其片段或变体)。在融合分子的情况下，抗原、佐剂和/或免疫调节剂可以是天然肽、重组肽、合成肽或其任意组合。
[0497]
在一些方面，本文所述的表面(例如，支架x)工程化ev，与本领域已知的ev相比，表现出优异的特征。例如，表面(例如，支架x)-工程化在其表面上包含富集程度比在天然存在的ev或使用常规外来体蛋白产生的ev上的富集程度更高的经修饰的蛋白。此外，本发明的表面(例如，支架x)工程化ev，与天然存在的ev或使用常规外来体蛋白产生的ev相比，可以具有更大、更特异或更可控的生物活性。
[0498]
在一些方面，支架x包含前列腺素f2受体负调节因子(ptgfrn多肽)。ptgfrn蛋白也可称为cd9配偶体1(cd9p-1)、含glu-trp-ile ewi基序的蛋白f(ewi-f)、前列腺素f2-α受体调节蛋白、前列腺素f2-α受体相关蛋白或cd315。人ptgfrn蛋白(uniprot登记号q9p2b2)的全长氨基酸序列在表7中显示为seq id no:1。ptgfrn多肽包含信号肽(seq id no:1的氨基酸1至25)、胞外结构域(seq id no:1的氨基酸26至832)、跨膜结构域(seq id no:1的氨基酸833至853)和胞质结构域(seq id no:1的氨基酸854至879)。成熟ptgfrn多肽由无信号肽的seq id no:1，即seq id no:1的氨基酸26至879组成。在一些方面，可用于本公开的ptgfrn多肽片段包含ptgfrn多肽的跨膜结构域。在其它方面，可用于本公开的ptgfrn多肽片段包含ptgfrn多肽的跨膜结构域并且(i)在跨膜结构域的n端包含至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个氨基酸，(ii)在跨膜结构域的c端包含至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或至少25个氨基酸，或(i)和(ii)两者。
[0499]
在一些方面，ptgfrn多肽的片段缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0500]
在其它方面，支架x包含与seq id no:1的氨基酸26至879具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在其它方面，支架x包含与seq id no:33具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在其它方面，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，支架x包含seq id no:33的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或其任意组合。在一些方面，支架x包含seq id no:33的氨基酸序列并且在seq id no:33的n端和/或c端包含1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、或20个氨基酸或更多个氨基酸。
[0501]
在其它方面，支架x包含与seq id no:2、3、4、5、6或7具有至少约70％、至少约
75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在其它方面，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，支架x包含seq id no:2、3、4、5、6或7的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或其任意组合。在一些方面，支架x包含seq id no:2、3、4、5、6或7的氨基酸序列并且在seq id no:2、3、4、5、6或7的n端和/c端包含1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、或20个氨基酸或更多个氨基酸。
[0502]
表7.示例性支架x蛋白序列
[0503]
[0504]
[0505][0506]
在一些方面，支架x包含由seq id no:9表示的basigin(bsg蛋白)。bsg蛋白也称为5f7、胶原酶刺激因子、细胞外基质金属蛋白酶诱导剂(emmprin)、白细胞活化抗原m6、ok血型抗原、肿瘤细胞来源的胶原酶刺激因子(tcsf)或cd147。人bsg蛋白的uniprot编号是p35613。bsg蛋白的信号肽是seq id no:9的氨基酸1至21。seq id no:9的氨基酸138-323是胞外结构域，氨基酸324-344是跨膜结构域，seq id no:9的氨基酸345-385是胞质结构域。
[0507]
在其它方面，支架x包含与seq id no:9的氨基酸22至385具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约
98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，bsg多肽的片段缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv，例如seq id no:9的氨基酸221至315。在其它方面，支架x包含与seq id no:10、11或12具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在其它方面，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，支架x包含seq id no:10、11或12的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或其任意组合。在一些方面，支架x包含seq id no:10、11或12的氨基酸序列并且在seq id no:10、11或12的n端和/或c端包含1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸或20个氨基酸或更多个氨基酸。
[0508]
在一些方面，支架x包含免疫球蛋白超家族成员8(igsf8或igsf8蛋白)，其也被称为cd81配偶体3、含glu-trp-ile ewi基序的蛋白2(ewi-2)、角质形成细胞相关跨膜蛋白4(kct-4)、lir-d1、前列腺素调控样蛋白(pgrl)或cd316。全长人igsf8蛋白在uniprot中的登录号为q969p0，在本文中显示为seq id no:14。人igsf8蛋白具有信号肽(seq id no:14的氨基酸1至27)、胞外结构域(seq id no:14的氨基酸28至579)、跨膜结构域(seq id no:14的氨基酸580至600)和胞质结构域(seq id no:14的氨基酸601至613)。
[0509]
在其它方面，支架x包含与seq id no:14的氨基酸28至613具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，igsf8蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，例如igv。在其它方面，支架x包含与seq id no:15、16、17或18具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在其它方面，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，支架x包含seq id no:15、16、17或18的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或其任意组合。在一些方面，支架x包含seq id no:15、16、17或18的氨基酸序列并且在seq id no:15、16、17或18的n端和/或c端包含1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸或20个氨基酸或更多个氨基酸。
[0510]
在一些方面，本文公开的支架x包含免疫球蛋白超家族成员3(igsf3或igsf3蛋白)，其也被称为含glu-trp-ile ewi基序的蛋白3(ewi-3)，并显示为seq id no:20的氨基酸序列。人igsf3蛋白具有信号肽(seq id no:20的氨基酸1至19)、胞外结构域(seq id no:20的氨基酸20至1124)、跨膜结构域(seq id no:20的氨基酸1125至1145)和胞质结构域(seq id no:20的氨基酸1146至1194)。
[0511]
在其它方面，支架x包含与seq id no:20的氨基酸28至613具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，igsf3蛋白缺乏一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0512]
在一些方面，用于本公开的支架x包含整联蛋白β-1(itgb1蛋白)(其也被称为纤连蛋白受体亚单位β)、糖蛋白iia(gpiia)、vla-4亚单位β或cd29，并显示为seq id no:21的氨基酸序列。人itgb1蛋白具有信号肽(seq id no:21的氨基酸1至20)、胞外结构域(seq id no:21的氨基酸21至728)、跨膜结构域(seq id no:21的氨基酸729至751)和胞质结构域(seq id no:21的氨基酸752至798)。
[0513]
在其它方面，支架x包含与seq id no:21的氨基酸21至798具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，itgb1蛋白缺少一个或多个功能性或结构结性构域，诸如igv。
[0514]
在其它方面，支架x包含itga4蛋白，其包含与seq id no:22具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽(seq id no:22的氨基酸1至33)的氨基酸序列。在一些方面，itga4蛋白缺乏一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0515]
在其它方面，支架x包含slc3a2蛋白，其包含与seq id no:23具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些方面，slc3a2蛋白缺少一个或多个功能性或结构结性构域，诸如igv。
[0516]
在其它方面，支架x包含atp1a1蛋白，其包含与seq id no:24具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些方面，atp1a1蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0517]
在其它方面，支架x包含atp1a2蛋白，其包含与seq id no:25具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些方面，atp1a2蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0518]
在其它方面，支架x包含atp1a3蛋白，其包含与seq id no:26具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些方面，atp1a3蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0519]
在其它方面，支架x包含atp1a4蛋白，其包含与seq id no:27具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些方面，atp1a4蛋白缺少一个或多个功能性或结构结性构域，诸如igv。
[0520]
在其它方面，支架x包含atp1a5蛋白，其包含与seq id no:28具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些方面，atp1a5蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0521]
在其它方面，支架x包含atp2b1蛋白，其包含与seq id no:29具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至
少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些方面，atp2b1蛋白缺少一个或多个功能性或结构结性构域，诸如igv。
[0522]
在其它方面，支架x包含atp2b2蛋白，其包含与seq id no:30具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些方面，atp2b2蛋白缺少一个或多个功能性或结构结性构域，诸如igv。
[0523]
在其它方面，支架x包含atp2b3蛋白，其包含与seq id no:31具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些方面，atp2b3蛋白缺少一个或多个功能性或结构结性构域，诸如igv。
[0524]
在其它方面，支架x包含atp2b4蛋白，其包含与seq id no:32具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些方面，atp2b4蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0525]
在其它方面，支架x包含igsf2蛋白，其包含与seq id no:34具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性但不含信号肽的氨基酸序列。在一些方面，igsf2蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0526]
其它支架x蛋白的非限制性实例可见于2019年2月5日发布的美国专利第us10195290b1号(其通过引用以其整体并入)中。
[0527]
在一些方面，所述序列编码支架部分的片段，所述片段缺少来自天然蛋白质的n端的至少5个、10个、50个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个或800个氨基酸。在一些方面，所述序列编码支架部分的片段，所述片段缺少来自天然蛋白质的c端的至少5个、10个、50个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个或800个氨基酸。在一些方面，所述序列编码支架部分的片段，所述片段缺少来自天然蛋白质的n端和c端的至少5个、10个、50个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个或800个氨基酸。在一些方面，所述序列编码缺少天然蛋白质的一个或多个功能性或结构性结构域的支架部分的片段。
[0528]
在一些方面，支架部分，例如支架x，例如ptgfrn蛋白，与一种或多种异源蛋白质连接。一种或多种异源蛋白质可以与架部分的n端连接。一种或多种异源蛋白质可与支架部分的c端连接。在一些方面，一种或多种异源蛋白质与支架部分的n端和c端都连接。在一些方面，异源蛋白质是哺乳动物蛋白质。在一些方面，异源蛋白质是人蛋白质。
[0529]
在一些方面，支架x可用于同时将任何部分连接至ev(例如，外来体)的腔表面和外表面上。例如，除了ev(例如，外来体)的外表面之外，ptgfrn多肽还可用于在腔内(例如，腔表面上)连接一种或多种本文公开的有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)。因此，在某些方面，支架x可用于双重目的，例如ev(例如，外来体)的腔表面上的抗原和外表面上的佐剂或免疫调节剂，ev(例如，外来体)的外表面上的抗原以及ev(例如，外来体)的腔表面上的佐剂或免疫调节剂，腔表面上的佐剂和外表面上的免疫调节剂，或者ev(例如，外来体)的腔表面上的免疫调节剂和外表面上的佐剂。
[0530]
ii.e支架y-工程化ev，例如外来体
[0531]
在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)包括不同于天然存在的ev的内部空间的内部空间(即，腔)。例如，可改变ev，使得ev(例如，外来体)的腔表面中的组成具有与天然存在的外来体的蛋白质、脂质或聚糖含量不同的蛋白质、脂质或聚糖含量。
[0532]
在一些方面，可从用编码支架部分(例如，外来体蛋白质，例如，支架y)或改变ev(例如，外来体)的腔表面的组成或内容物的支架部分的修饰或片段的外源序列转化的细胞产生工程化ev(例如，外来体)。可在ev(例如，外来体)的腔表面上表达的外来体蛋白质的各种修饰或片段可用于本公开的方面。
[0533]
在一些方面，能够改变ev(例如，外来体)的腔表面的外来体蛋白质包括但不限于富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶c底物(marcks)蛋白、富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶c底物样蛋白1(marcksl1)蛋白、脑酸溶性蛋白1(basp1)蛋白或其任意组合。
[0534]
在一些方面，支架y包含marcks蛋白(uniprot登录号p29966)。marcks蛋白也被称为蛋白激酶c底物、80kda蛋白、轻链。全长人marcks蛋白的长度为332个氨基酸，并且在氨基酸残基152-176处包含钙调素结合结构域。在一些方面，支架y包含marcksl1蛋白(uniprot登录号p49006)。marcksl1蛋白也被称为marcks样蛋白1和巨噬细胞富含肉豆蔻酰化丙氨酸的c激酶底物。全长人marcksl1蛋白的长度为195个氨基酸。marcksl1蛋白具有在氨基酸残基87-110处的参与脂质结合和钙调蛋白结合的效应结构域。在一些方面，支架y包含basp1蛋白(uniprot登录号p80723)。basp1蛋白也被称为22kda神经元组织富集酸性蛋白或神经元轴突膜蛋白nap-22。全长人basp1蛋白序列(异构体1)的长度为227个氨基酸。通过选择性剪接产生的异构体缺失了seq id no:49的氨基酸88至141(异构体1)。表8提供了本文公开的示例性支架y(即，marcks、marcksl1和basp1蛋白)的全长序列。
[0535]
表8.示例性支架y蛋白序列
[0536][0537]
成熟的basp1蛋白序列缺失seq id no:49的第一个met，因此含有seq id no:49的氨基酸2至227。同样，成熟的marcks和marcksl1蛋白也分别缺失seq id no:47和48的第一
个met。因此，成熟的marcks蛋白包含seq id no:47的氨基酸2至332。成熟的marcksl1蛋白包含seq id no:48的氨基酸21至227。
[0538]
在其它方面，用于本公开的支架y包含与seq id no:49的氨基酸2至227具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在其它方面，支架y包含与seq id no:50-155中的任一个具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在其它方面，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，可用于本公开的支架y包含seq id no:49的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或其任意组合。在一些方面，可用于本公开的支架y包含seq id no:50-155中的任一个的氨基酸序列并且包含在seq id no:50-155的n端和/或c端的1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸或20个氨基酸或更多个氨基酸。
[0539]
在某些方面，seq id no:47-155中的任一个的蛋白质序列足以作为本公开的支架y(例如，与抗原和/或佐剂和/或免疫调节剂连接的支架部分)。
[0540]
在某些方面，可用于本公开的支架y包含具有mgxklskkk的肽，其中x为丙氨酸或任何其它氨基酸(seq id no:163)。在一些方面，可用于本公开的支架y包含具有gxklskkk的肽(s，其中x是丙氨酸或任何其它氨基酸(seq id no:372)。在一些方面，ev(例如，外来体)包含具有序列(m)(g)(π)(ξ)(φ/π)(s/a/g/n)( )( )或(g)(π)(ξ)(φ/π)(s/a/g/n)( )( )的肽，其中每个括号位置代表氨基酸，并且其中π为选自由(pro、gly、ala、ser)组成的组的任意氨基酸，ξ为选自由(asn、gln、ser、thr、asp、glu、lys、his、arg)组成的组的任意氨基酸，φ为选自由(val、ile、leu、phe、trp、tyr、met)组成的组的任意氨基酸，并且( )为选自由(lys、arg、his)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是( )并且位置6既不是( )也不是(asp或glu)。在另外的方面，本文所述的外来体(例如，工程化外来体)包含具有序列(m)(g)(π)(x)(φ/π)(π)( )( )或(g)(π)(x)(φ/π)(π)( )( )的肽，其中每个括号位置代表氨基酸，并且其中π为选自由(pro、gly、ala、ser)组成的组的任意氨基酸，x为任意氨基酸，φ为选自由(val、ile、leu、phe、trp、tyr、met)组成的组的任意氨基酸，并且( )为选自由(lys、arg、his)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是( )并且位置6既不是( )也不是(asp或glu)。关于氨基酸命名法，参见aasland等人，febs letters 513(2002)141-144。
[0541]
在其它方面，支架x包含与seq id no:47-155中的任一个具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
[0542]
支架y-工程化ev(例如，本文所述的外来体)可从用seq id no:47-155中所示的序列转化的细胞产生。
[0543]
在一些方面，可用于本公开的支架y蛋白包含“n端结构域”(nd)和“效应结构域”(ed)，其中nd和/或ed与ev(例如，外来体)的腔表面缔合。在一些方面，可用于本公开的支架
y蛋白包含胞内结构域、跨膜结构域和胞外结构域；其中所述胞内结构域包含“n端结构域”(nd)和“效应结构域”(ed)，其中所述nd和/或ed与ev(例如，外来体)的腔表面缔合。如本文所用，术语“与......缔合”是指支架蛋白与ev(例如，外来体)的腔表面之间的相互作用，其不涉及与膜组分的共价连接。例如，可用于本公开的支架可以例如通过脂质锚(例如，肉豆蔻酸)和/或与膜磷脂的带负电荷的头部静电相互作用的多碱结构域(polybasic domain)，与ev的腔表面缔合。在其它方面，支架y蛋白包含n端结构域(nd)和效应结构域(ed)，其中nd与ev的腔表面缔合，并且ed通过离子相互作用与ev的腔表面缔合，其中ed依次包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个连续的碱性氨基酸，例如赖氨酸(lys)。
[0544]
在其它方面，支架y蛋白包含n端结构域(nd)和效应结构域(ed)，其中nd与ev(例如，外来体)的腔表面缔合，并且ed通过离子相互作用与ev的腔表面缔合，其中ed依次包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个连续的碱性氨基酸，例如赖氨酸(lys)。
[0545]
在一些方面，nd通过脂质化，例如通过肉豆蔻酰化，与ev(例如，外来体)的腔表面缔合。在一些方面，nd具有在n端的gly。在一些方面，n端gly是肉豆蔻酰化的。
[0546]
在一些方面，ed通过离子相互作用与ev(例如，外来体)的腔表面缔合。在一些方面，ed通过静电相互作用，特别是吸引静电相互作用与ev(例如，外来体)的腔表面缔合。
[0547]
在一些方面，ed包含(i)一个碱性氨基酸(例如，赖氨酸)，或(ii)在多肽序列中彼此相邻的两个或更多个碱性氨基酸(例如，赖氨酸)。在一些方面，碱性氨基酸是赖氨酸(lys；k)、精氨酸(arg,r)或组氨酸(his,h)。在一些方面，碱性氨基酸是(lys)n，其中n为1与10之间的整数。
[0548]
在其它方面，如果ed的n端直接与nd的c端的赖氨酸连接，即赖氨酸在ed的n端中并与nd的c端的赖氨酸融合，则ed包含至少一个赖氨酸，并且nd包含在c端的一个赖氨酸。在其它方面，当ed的n端通过接头，例如一个或多个氨基酸与nd的c端连接时，ed包含至少两个赖氨酸、至少三个赖氨酸、至少四个赖氨酸、至少五个赖氨酸、至少六个赖氨酸或至少七个赖氨酸。
[0549]
在某些方面，ed包含k、kk、kkk、kkkk(seq id no:205)、kkkkk(seq id no:206)、r、rr、rrr、rrrr(seq id no:207)；rrrrr(seq id no:208)、kr、rk、kkr、krk、rkk、krr、rrk、(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(seq id no:209)、(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(seq id no:210)或其任意组合。在一些方面，ed包括kk、kkk、kkkk(seq id no:205)、kkkkk(seq id no:206)或其任意组合。在一些方面，nd包含如g:x2:x3:x4:x5:x6中所示的氨基酸序列，其中g代表gly；其中“:”代表肽键，其中x2至x6中的每一个独立地代表氨基酸，并且其中x6代表碱性氨基酸。在一些方面，x6氨基酸选自由lys、arg和his组成的组。在一些方面，x5氨基酸选自由pro、gly、ala和ser组成的组。在一些方面，x2氨基酸选自由pro、gly、ala和ser组成的组。在一些方面，x4选自由pro、gly、ala、ser、val、ile、leu、phe、trp、tyr、gln和met组成的组。
[0550]
在一些方面，支架y蛋白包含n端结构域(nd)和效应结构域(ed)，其中nd包含如g:x2:x3:x4:x5:x6中所示的氨基酸序列，其中g代表gly；其中“:”代表肽键；其中x2至x6中的每一个独立地是氨基酸；其中x6包含碱性氨基酸，并且其中ed通过肽键与x6连接，并且在ed的n端包含至少一个赖氨酸。
[0551]
在一些方面，支架y蛋白的nd包含氨基酸序列g:x2:x3:x4:x5:x6，其中g代表gly；“:”代表肽键；x2代表选自由pro、gly、ala和ser组成的组的氨基酸：x3代表任意氨基酸；x4代表选自由pro、gly、ala、ser、val、ile、leu、phe、trp、tyr、gln和met组成的组的氨基酸；x5代表选自由pro、gly、ala和ser组成的组的氨基酸；并且x6代表选自由lys、arg和his组成的组的氨基酸。
[0552]
在一些方面，x3氨基酸选自由asn、gln、ser、thr、asp、glu、lys、his和arg组成的组。
[0553]
在一些方面，nd和ed通过接头连接。在一些方面，接头包含一个或多个氨基酸。在一些方面，术语“接头”是指肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)或非多肽，例如烷基链。在一些方面，可将两个或更多个接头串联连接。一般来说，接头提供了灵活性或防止/改善了空间障碍。接头通常不被裂解；然而，在某些方面，这种裂解可以是想要的。因此，在一些方面，接头可包含一个或多个蛋白酶可裂解位点，其可以位于接头序列内或接头序列任一端的接头侧翼。当nd和ed通过接头连接时，ed包含至少两个赖氨酸、至少三个赖氨酸、至少四个赖氨酸、至少五个赖氨酸、至少六个赖氨酸或至少七个赖氨酸。
[0554]
在一些方面，接头是肽接头。在一些方面，肽接头可以包含至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个，至少约80、至少约85、至少约90、至少约95或至少约100个氨基酸。
[0555]
在一些方面，接头是甘氨酸/丝氨酸接头。在一些方面，肽接头是根据式[(gly)n-ser]m的甘氨酸/丝氨酸接头，其中n为1至100的任何整数，m为1至100的任何整数。在其它方面，甘氨酸/丝氨酸接头根据式[(gly)x-sery]z，其中x为1至4的整数，y为0或1，z为1至50的整数。在一些方面，肽接头包含序列gn，其中n可为1至100的整数。在一些方面，肽接头可包含序列(glyala)n，其中n为1与100之间的整数。在其它方面，肽接头可包含序列(glyglyser)n，其中n为1与100之间的整数。
[0556]
在一些方面，肽接头是合成的，即非天然存在的。在一个方面，肽接头包括肽(或多肽)(例如，天然或非天然存在的肽)，其包含将第一线性氨基酸序列与第二线性氨基酸序列连接或遗传融合，所述第一线性氨基酸序列在自然界中与所述第二线性氨基酸序列不是天然连接或遗传融合的。例如，在一个方面，肽接头可包含非天然存在的多肽，其是天然存在的多肽的修饰形式(例如，包含突变诸如添加、取代或缺失)。
[0557]
在其它方面，肽接头可包含非天然存在的氨基酸。在其它方面，肽接头可包含天然存在的氨基酸，其以天然不存在的线性序列存在。在其它方面，肽接头可包含天然存在的多肽序列。
[0558]
本公开还提供了分离的细胞外囊泡(ev)(例如，外来体)，其包含与支架y蛋白连接的生物活性分子(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)，其中支架y蛋白包含nd-ed，其中：nd包含g:x2:x3:x4:x5:x6；其中：g代表gly；“:”代表肽键；x2代表选自由pro、gly、ala和ser组成的组的氨基酸；x3代表任意氨基酸；x4代表选自由pro、gly、ala、ser、val、ile、leu、phe、trp、tyr、glu和met组成的组的氨基酸；x5代表选自由pro、gly、ala和ser组成的组的氨基酸；x6代表选自由lys、arg和his组成的组的氨基酸；“—”代表任选的接头；并且ed是效应结构域，其包含(i)通过肽键或一个或多个氨基酸与x6连接的至少两个连续赖氨酸(lys)，或
(ii)通过肽键直接与x6连接的至少一个赖氨酸。
[0559]
在一些方面，x2氨基酸选自由gly和ala组成的组。在一些方面，x3氨基酸是lys。在一些方面，x4氨基酸是leu或glu。在一些方面，x5氨基酸选自由ser和ala组成的组。在一些方面，x6氨基酸是lys。在一些方面，x2氨基酸是gly、ala或ser；x3氨基酸是lys或glu；x4氨基酸是leu、phe、ser或glu；x5氨基酸是ser或ala；并且x6氨基酸是lys。在一些方面，“—”接头包含肽键或一个或多个氨基酸。
[0560]
在一些方面，支架蛋白中的ed包含lys(k)、kk、kkk、kkkk(seq id no:205)、kkkkk(seq id no:206)、arg(r)、rr、rrr、rrrr(seq id no:207)；rrrrr(seq id no:208)、kr、rk、kkr、krk、rkk、krr、rrk、(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(seq id no:209)、(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(seq id no:210)或其任意组合。
[0561]
在一些方面，支架y蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)ggklskk(seq id no:211)、(ii)gaklskk(seq id no:212)、(iii)ggkqskk(seq id no:213)、(iv)ggklakk(seq id no:214)或(v)其任意组合。
[0562]
在一些方面，支架y蛋白中的nd包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)ggklsk(seq id no:215)、(ii)gaklsk(seq id no:216)、(iii)ggkqsk(seq id no:217)、(iv)ggklak(seq id no:218)或(v)其任意组合，并且支架蛋白中的ed包含k、kk、kkk、kkkg(seq id no:219)、kkkgy(seq id no:220)、kkkgyn(seq id no:221)、kkkgynv(seq id no:222)、kkkgynvn(seq id no:223)、kkkgys(seq id no:224)、kkkgyg(seq id no:225)、kkkgygg(seq id no:226)、kkkgs(seq id no:227)、kkkgsg(seq id no:228)、kkkgsgs(seq id no:229)、kkks(seq id no:230)、kkksg(seq id no:231)、kkksgg(seq id no:232)、kkksggs(seq id no:233)、kkksggsg(seq id no:234)、kksggsgg(seq id no:235)、kkksggsggs(seq id no:236)、krfsfkks(seq id no:237)。
[0563]
在一些方面，可用于本公开的支架y蛋白的多肽序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：(i)ggklskk(seq id no:211)、(ii)gaklskk(seq id no:212)、(iii)ggkqskk(seq id no:213)、(iv)ggklakk(seq id no:214)或(v)其任意组合。
[0564]
在一些方面，支架y蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)ggklskkk(seq id no:238)、(ii)ggklskks(seq id no:239)、(iii)gaklskkk(seq id no:240)、(iv)gaklskks(seq id no:241)、(v)ggkqskkk(seq id no:242)、(vi)ggkqskks(seq id no:243)、(vii)ggklakkk(seq id no:244)、(viii)ggklakks(seq id no:245)和(ix)其任意组合。
[0565]
在一些方面，可用于本公开的支架y蛋白的多肽序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：(i)ggklskkk(seq id no:238)、(ii)ggklskks(seq id no:239)、(iii)gaklskkk(seq id no:240)、(iv)gaklskks(seq id no:241)、(v)ggkqskkk(seq id no:242)、(vi)ggkqskks(seq id no:243)、(vii)ggklakkk(seq id no:244)、(viii)ggklakks(seq id no:245)和(ix)其任意组合。
[0566]
在一些方面，支架y蛋白的长度为至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约26个、至少约27个、至少约28个、至少约29个、至少约30、至少31个、至少约32个、
至少约33个、至少约34个、至少约35个、至少约36个、至少约37个、至少约38个、至少约39个、至少约39个、至少约40个、至少约41个、至少约42个、至少约43个、至少约44个、至少约50个、至少约46个、至少约47个、至少约48个、至少约49个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少85个、至少约90个、至少约95个、至少约100个、至少约105个、至少约110个、至少约115个、至少约120个、至少约125个、至少约130个、至少约135个、至少约140个、至少约145个、至少约150个、至少约155个、至少约160个、至少约165个、至少约170个、至少约175个、至少约180个、至少约185个、至少约190个、至少约195个、至少约200个、至少约205个、至少约210个、至少约215个、至少约220个、至少约225个、至少约230个、至少约235个、至少约240个、至少约245个、至少约250个、至少约255个、至少约260个、至少约265个、至少约270个、至少约275个、至少约280个、至少约285个、至少约290个、至少约295个、至少约300个、至少约305个、至少约310个、至少约315个、至少约320个、至少约325个、至少约330个、至少约335个、至少约340个、至少约345或至少约350个氨基酸。
[0567]
在一些方面，支架y蛋白的长度为约5个至约10个、约10个至约20个、约20个至约30个、约30个至约40个、约40个至约50个、约50个至约60个、约60个至约70个、约70个至约80个、约80个至约90个、约90个至约100个、约100个至约110个、约110个至约120个、约120个至约130个、约130个至约140个、约140个至约150个、约150个至约160个、约160个至约170个、约170个至约180个、约180个至约190个、约190个至约200个、约200个至约210个、约210个至约220个、约220个至约230个、约230个至约240个、约240个至约250个、约250个至约260个、约260个至约270个、约270个至约280个、约280个至约290个、约290个至约300个、约300个至约310个、约310个至约320个、约320个至约330个、约330个至约340个或约340个至约250个氨基酸。
[0568]
在一些方面，支架y蛋白包含(i)ggklskkkkgynvn(seq id no:246)、(ii)gaklskkkkgynvn(seq id no:247)、(iii)ggkqskkkkgynvn(seq id no:248)、(iv)ggklakkkkgynvn(seq id no:249)、(v)ggklskkkkgysgg(seq id no:250)、(vi)ggklskkkkgsggs(seq id no:251)、(vii)ggklskkkksggsg(seq id no:252)、(viii)ggklskkksggsgg(seq id no:253)、(ix)ggklskksggsggs(seq id no:254)、(x)ggklsksggsggsv(seq id no:255)或(xi)gakkskkrfsfkks(seq id no:256)。
[0569]
在一些方面，可用于本公开的支架y蛋白的多肽序列由以下序列组成：(i)ggklskkkkgynvn(seq id no:246)、(ii)gaklskkkkgynvn(seq id no:247)、(iii)ggkqskkkkgynvn(seq id no:248)、(iv)ggklakkkkgynvn(seq id no:249)、(v)ggklskkkkgysgg(seq id no:250)、(vi)ggklskkkkgsggs(seq id no:251)、(vii)ggklskkkksggsg(seq id no:252)、(viii)ggklskkksggsgg(seq id no:253)、(ix)ggklskksggsggs(seq id no:254)、(x)ggklsksggsggsv(seq id no:255)或(xi)gakkskkrfsfkks(seq id no:256)。
[0570]
可用于本公开的支架y蛋白的非限制性实例列于下面。在一些方面，支架y蛋白包含表9中所示的氨基酸序列。在一些方面，支架y蛋白由表9中所示的氨基酸序列组成。
[0571]
表9.
[0572]
[0573]
[0574][0575]
在一些方面，可用于本公开的支架y蛋白不包含n端met。在一些方面，支架y蛋白包含在支架蛋白的n端的脂质化氨基酸，例如肉豆蔻酰化氨基酸，其用作脂质锚。在一些方面，支架蛋白的n端处的氨基酸残基是gly。n端gly的存在是n-肉豆蔻酰化的绝对要求。在一些方面，支架蛋白的n端处的氨基酸残基是合成的。在一些方面，支架蛋白的n端的氨基酸残基是甘氨酸类似物，例如烯丙基甘氨酸、丁基甘氨酸或炔丙基甘氨酸。
[0576]
在其它方面，脂质锚可以是本领域已知的任何脂质锚，例如棕榈酸或糖基磷脂酰肌醇。在不寻常的情况下，例如，通过使用限制肉豆蔻酸的培养基，可使一些其它脂肪酸，包括短链和不饱和脂肪酸，附接至n端甘氨酸。例如，在bk通道中，据报道肉豆蔻酸通过羟基酯键联翻译后附接至内部丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸残基。本领域已知的膜锚示于下表中：
[0577][0578]
ii.f缀合的ev(例如，外来体)
[0579]
与抗体不同，ev(例如，外来体)可以容纳大量附接至其表面的分子，例如每个ev(例如，外来体)约数千至数万个分子。因此，ev(例如，外来体)-药物缀合物代表了这样的平台，其将高浓度的治疗性化合物递送至离散的细胞类型，同时限制了对该化合物的整体系统性暴露，这又降低了脱靶毒性。
[0580]
本公开提供了已通过使包含游离硫醇基团的第一分子实体与包含马来酰亚胺基团的第二分子实体反应而对其工程化的ev(例如，外来体)，其中马来酰亚胺部分经由图31所示的马来酰亚胺部分将第一分子实体与第二分子实体共价连接。
[0581]
可经由马来酰亚胺部分附接至ev(例如，外来体)的生物活性分子的非限制性实例包括诸如以下物质的剂：核苷酸(例如，包含可检测部分或毒素的核苷酸或破坏转录的核苷酸)、核酸(例如，编码多肽诸如酶的dna或mrna分子，或具有调控功能的rna分子，诸如mirna、dsdna、lncrna或sirna)、吗啉代、氨基酸(例如，包含可检测部分或破坏翻译的毒素的氨基酸)、多肽(例如，酶)、脂质、碳水化合物、小分子(例如，小分子药物和毒素)、抗原(例如，疫苗抗原)、佐剂(例如，疫苗佐剂)等。
[0582]
在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)可包含不止一种类型的生物活性分子。在一些方面，生物活性分子可以是例如诸如环状二核苷酸等小分子、诸如澳瑞他汀类(auristatins)(例如，单乙基澳瑞他汀e，mmae)等毒素、抗体(例如，裸抗体或抗体-药物缀合物)、sting激动剂、耐受剂(tolerizing agent)、反义寡核苷酸、protac、吗啉代、溶血磷脂酸受体拮抗剂(例如，lpa1拮抗剂)或其任意组合。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)可包含例如疫苗抗原和任选的疫苗佐剂。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)可包含治疗性有效载荷(例如，sting或下文公开的一种有效载荷)和靶向部分和/或向性部分。
[0583]
因此，在一些方面，本公开提供了如图31所示的分子实体，其中ev(例如，外来体)或其任何分子组分诸如多肽(例如，支架x蛋白或其片段)、脂质、脂蛋白、糖蛋白或位于ev(例如，外来体)上的天然存在或非天然存在的蛋白质的任何变体或衍生物可经由马来酰亚胺部分与生物活性分子(例如，治疗性有效载荷、靶向部分、向性部分或其任何组合)化学连接。如图31所示，在一些方面，包含巯基(硫醇)基团的ev(例如，外来体)或其分子组分可与附接至生物活性部分的马来酰亚胺基团反应。在其它方面，包含马来酰亚胺基团的ev(例如，外来体)或其分子组分可与生物活性部分中存在的巯基(硫醇)基团反应。在这两种情况下，终产物都是经由硫醚键化学地附接至ev(例如，外来体)的生物活性分子。
[0584]
ii.g马来酰胺部分
[0585]
如上所述，在一些方面，可用于本公开的接头可包含马来酰亚胺部分(即，“马来酰亚胺接头”)。可使用本领域已知的技术(例如，化学缀合、重组技术或肽合成)将接头引入马来酰亚胺部分。在一些方面，可使用重组技术引入接头。在其它方面，可使用固相肽合成来引入接头。在某些方面，本文公开的马来酰亚胺部分可以同时包含一个或多个使用重组技术引入的接头和一个或多个使用固相肽合成或本领域已知的化学缀合方法引入的接头。
[0586]
因此，在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)可包含一个或多个有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)，其中一个或多个有效载荷通过马来酰亚胺接头附接至ev。在某些方面，本文公开的ev(例如，外来体)还可包含一个或多个靶向部分，其中一个或多个靶向部分通过马来酰亚胺接头附接至ev。如本文所述，在一些方面，一个或多个有效载荷和/或一个或多个靶向部分通过支架部分(例如，支架x和/或支架y)与ev(例如，外来体)连接。在某些方面，一个或多个有效载荷和/或一个或多个靶向部分通过马来酰亚胺部分共价附接至支架部分。在一些方面，支架部分包括支架x和/或支架y。可用于本公开的其它支架部分的非限制性实例包括：氨肽酶n(cd13)；脑啡肽酶(膜金属内肽酶；mme)；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(enpp1)；神经纤毛蛋白-1(nrp1)；cd9、cd63、cd81、pdgfr、gpi锚蛋白、乳凝集素、lamp2和lamp2b、其片段及其任意组合。
[0587]
如本文所用，术语“马来酰亚胺部分”或“mm”是指将ev(例如，外来体)与接头或生物活性分子连接的双官能化学部分，并且包含马来酰亚胺基团：
[0588][0589]
其中*表示至ev(例如，外来体)上的任何硫醇基团(例如，支架x中存在的游离硫醇)的附接点，波浪线表示至马来酰亚胺部分的其余部分的附接点。在一些方面，*表示至有效载荷和/或靶向部分上的任何硫醇基团的附接点，波浪线表示马来酰亚胺部分的其余部分与ev(例如，外来体)的附接位点(例如，支架x)。
[0590]
在一些方面，马来酰亚胺部分附接至与ev(例如，外来体)附接的硫原子，例如巯醇基团中天然存在的硫原子或通过化学修饰或突变引入的硫原子。
[0591]
在一些方面，马来酰亚胺部分具有式(i)：
[0592][0593]
其中
[0594]
(i)r1选自由以下组成的组：-c
1-10
亚烷基-、-c
3-8
碳环-、-o-(c
1-8
亚烷基)-、-亚芳基-、-c
1-10
亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-c
1-10
亚烷基-、-c
1-10
亚烷基-(c
3-8
碳环)-、-(c
3-8
碳环)-c
1-10
亚烷基-、-c
3-8
杂环-、-c
1-10
亚烷基-(c
3-8
杂环)-、-(c
3-8
杂环)-c
1-10
亚烷基-、-(ch2ch2o)
r-和-(ch2ch2o)
r-ch
2-；
[0595]
(ii)r为例如1至10的整数；
[0596]
(iii)*表示至ev(例如，外来体)上存在的任何可用的活性硫原子(例如，硫醇基团中的硫)的附接点；以及，
[0597]
(iv)波浪线表示马来酰亚胺部分至生物活性分子(即，有效载荷)的附接位点。
[0598]
在一些方面，r1是-c
1-8
亚烷基-、-c
3-6
碳环-、-o-(c
1-6
亚烷基)-、-亚芳基-、-c
1-8
亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-c
1-8
亚烷基-、-c
1-8
亚烷基-(c
3-6
碳环)-、-(c
3-6
碳环)-c
1-8
亚烷基-、-c
3-6
杂环-、-c
1-8
亚烷基-(c
3-6
杂环)-、-(c
3-6
杂环)-c
1-8
亚烷基-、-(ch2ch2o)
r-和-(ch2ch2o)
r-ch
2-；其中r为例如1至10的整数。
[0599]
在一些方面，r1是
–
(ch2)
s-、环戊基，环己基，-o-(ch2)
s-、-苯基-、-ch
2-苯基-、-苯基-ch
2-、-ch
2-环戊基-、-环戊基-ch
2-、-ch
2-环己基-、-环己基-ch
2-、-(ch2ch2o)
r-和-(ch2ch2o)
r-ch
2-；其中r为例如1至6的整数。
[0600]
在一些方面，r1是
–
(ch2)
s-，其中s是例如4、5或6。
[0601]
在一些方面，马来酰亚胺部分具有式(ii)，其中r1为
–
(ch2)
5-：
[0602][0603]
在一些方面，马来酰亚胺部分具有式(iii)，其中r1是-(ch2ch2o)
r-ch
2-，并且其中r为2：
[0604]
[0605]
在一些方面，马来酰亚胺部分与ev(例如，外来体)上存在的官能团共价连接，其中所述官能团是巯基(硫醇)基团。一个方面，巯基在ev(例如，外来体)表面上的蛋白质(例如，支架x或其变体)上。例如，在一些方面，巯基可以存在于硫醇脂质(例如，胆固醇-sh、dspe-sh或其衍生物，例如胆固醇-peg-sh或dspe-peg-sh)上。
[0606]
在一些方面，马来酰亚胺部分与已被化学衍生以提供马来酰亚胺部分的ev(例如，外来体)上存在的官能团共价连接。例如，在某些方面，ev(例如，外来体)上存在的胺官能团(例如，赖氨酸或精氨酸侧链上的胺，或蛋白质的末端胺基)可用包含琥珀酰亚胺部分和马来酰亚胺部分的双功能试剂进行衍生。
[0607]
在一些方面，ev(例如，外来体)上存在的羧基官能团(例如，谷氨酸或天冬氨酸侧链上的羧基，或蛋白质的末端羧基)可用包含异氰酸酯部分和马来酰亚胺部分的双官能试剂进行衍生。在其它方面，存在于ev(例如，外来体)上的羰基(氧化的碳水化合物)可以用包含肼部分和马来酰亚胺部分的双官能试剂进行衍生。
[0608]
一般而言，本文提供的公开内容可使用任何试剂(例如，双官能或多官能)试剂来实施，所述试剂在与ev(例如，外来体)表面(外表面或腔表面)上存在的分子(例如，蛋白质、脂质、糖)反应时，将共价或非共价地修饰该分子，得到包含至少一个马来酰亚胺部分的经修饰的分子。ev(例如，外来体)表面(外表面或腔表面)上存在的分子可以是天然存在的，或者可以是非天然存在的，即，已例如通过化学修饰、与包含非天然存在的分子的组合物一起孵育，或者通过突变(例如，通过突变将一个或多个半胱氨酸氨基酸引入蛋白质中)对其进行了修饰。
[0609]
包含马来酰亚胺部分的双官能试剂，其中许多含马来酰亚胺的单元可以多聚化的试剂，或者可以通过马来酰亚胺基团添加官能部分(例如，peg)的含马来酰亚胺的试剂包括，例如，包含肼部分和马来酰亚胺部分的双官能试剂、包含异氰酸酯部分和马来酰亚胺部分的双官能试剂、包含n-羟基琥珀酰亚胺酯部分和马来酰亚胺部分的双官能试剂、包含琥珀酰亚胺部分和马来酰亚胺部分的双官能试剂、生物素-马来酰亚胺、链霉抗生物素蛋白-马来酰亚胺、n-4-马来酰亚胺丁酸、n-(4-马来酰亚胺丁基氧基)琥珀酰亚胺、n-[5-(3
′‑
马来酰亚胺丙基酰胺)-1-羧基戊基]亚氨基二乙酸、马来酰亚胺-peg-琥珀酰亚胺酯(例如，马来酰亚胺-peg
12-琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺-peg
2-琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺-peg
2000-琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺-peg
5000-琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺-peg
n-琥珀酰亚胺酯，其中1《n《5000)、马来酰亚胺-peg-马来酰亚胺(例如，马来酰亚胺-peg
12-马来酰亚胺、马来酰亚胺-peg
2-马来酰亚胺、马来酰亚胺-peg
2000-马来酰亚胺、马来酰亚胺-peg
5000-马来酰亚胺或马来酰亚胺-peg
n-马来酰亚胺，其中1《n《5000)、马来酰亚胺-oh、马来酰亚胺-peg
n-oh，其中1《n《5000，马来酰亚胺-聚(乙二醇)-b-聚(ε-己内酯)、(s)-(-)-n-(1-苯基乙基)马来酰亚胺、n-(4-氯苯基)马来酰亚胺、n-(1-芘基)马来酰亚胺、甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺、聚(乙二醇)甲基醚马来酰亚胺、n-(4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11-十七氟十一烷基)马来酰亚胺、去铁胺-马来酰亚胺(即，螯合剂-马来酰亚胺)、马来酰亚胺缩水甘油基醚、双官能马来酰亚胺dtpa、双官能nota-马来酰亚胺螯合剂、同型双官能马来酰亚胺交联剂(即，在每端具有马来酰亚胺基团的那些)、双马来酰亚胺聚亚烷基二醇、dbco-马来酰亚胺、苯并三唑马来酰亚胺、炔马来酰亚胺、马来酰亚胺官能化脂质、马来酰亚胺官能化peg脂质，以及通常包含至少一个马来酰亚胺部分、至少一个附加的反应性部分(例如，马来酰亚胺或另一
反应性基团)和一个或多个任选的接头(例如，peg或另一种聚合物，诸如聚甘油)的任何分子。
[0610]
ii.h接头
[0611]
如上所述，本公开的细胞外囊泡(ev)(例如，外来体和纳米囊泡)可包含一个或多个将目标分子(例如，抗原、佐剂或免疫调节剂)连接至ev(例如，至外表面或在腔表面上)的接头。在一些方面，目标分子(即，有效载荷)(例如，抗原、佐剂或免疫调节剂)直接或通过支架部分(例如，支架x或支架y)与ev连接。例如，在某些方面，有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)通过支架x与外来体的外表面连接。在其它方面，有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)通过支架x或支架y与外来体的腔表面连接。在一些方面，有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)通过支架x与外来体的腔表面连接。在一些方面，有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)通过支架y与外来体的腔表面连接。在一些方面，有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)通过支架x和支架y与外来体的腔表面连接。在一些方面，有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)通过接头(例如，本文所述的那些)与支架x缀合。在某些方面，使用不止一个接头(即“接头组合”)将有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)与支架x缀合。在一些方面，将有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)通过接头(例如，本文所述的那些)与支架y缀合。在某些方面，使用接头组合将有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)与支架y缀合。在一些方面，接头组合包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个或更多个不同的本文公开的接头。在一些方面，可通过酯键联(例如，磷酸二酯或硫代磷酸酯)连接接头组合中的接头。
[0612]
接头可以是本领域已知的任何化学部分。
[0613]
如本文所用，术语“接头”是指肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)或非多肽，例如烷基链。在一些方面，可将两个或更多个接头串联连接。当存在多个接头时，每个接头可以相同或不同。一般来说，接头提供了灵活性或防止/改善了空间障碍。接头通常不被裂解；然而，在某些方面，这种裂解可以是想要的。因此，在一些方面，接头可包含一个或多个蛋白酶可裂解位点，其可以位于接头序列内或位于接头序列任一端的接头侧翼。
[0614]
在一些方面，接头是肽接头。在一些方面，肽接头可以包含至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95或至少约100个氨基酸。
[0615]
在一些方面，肽接头可包含至少约110个、至少约120个、至少约130个、至少约140个、至少约150个、至少约160个、至少约170个、至少约180个、至少约190个或至少约200个氨基酸。
[0616]
在其它方面，肽接头可包含至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约800个、至少约900个或至少约1,000个氨基酸。肽接头可包含1至约5个氨基酸、1至约10个氨基酸、1至约20个氨基酸、约10至约50个氨基酸、约50至约100个氨基酸、约100至约200个氨基酸、约200至约300个氨基酸、约300至约400个氨基酸、约400至约500个氨基酸、约500至约600个氨基酸、约600至约700个氨基酸约700至约800个氨基酸约800至约900个氨基酸，或约900至约1000个氨基酸。
[0617]
如本文所述，在一些方面，可用于本公开的接头包括甘氨酸/丝氨酸接头。在一些
方面，肽接头是根据式[(gly)n-ser]m(seq id no:374)的甘氨酸/丝氨酸接头，其中n为1至100的任何整数，m为1至100的任何整数。在一些方面，甘氨酸/丝氨酸接头根据式[(gly)x-sery]z(seq id no:375)，其中x为1至4的整数，y为0或1，z为1至50的整数。在一些方面，肽接头包含序列gn(seq id no:376)，其中n可为1至100的整数。在一些方面，肽接头可包含序列(glyala)n(seq id no:377)，其中n为1与100之间的整数。在一些方面，肽接头可包含序列(glyglyser)n(seq id no:378)，其中n为1与100之间的整数。在某些方面，肽接头包含序列gggg(seq id no:197)。
[0618]
在一些方面，肽接头包含序列(gggs)n(seq id no:203)。在某些方面，肽接头包含序列(ggs)n(ggggs)n(seq id no:204)。在此类方面，n可以是1至100的整数。在一些方面，n可以是1至20的整数，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些方面，n为1至100的整数。
[0619]
可用于本公开的接头的实例包括，但不限于，ggg、sggsggs(seq id no:198)、ggsggsggsggsggg(seq id no:199)、ggsggsggggsggggs(seq id no:200)、ggsggsggsggsggsggs(seq id no:201)或ggggsggggsggggs(seq id no:202)。在一些方面，接头是聚g序列(gggg)n(seq id no:373)，其中n可以是1至100的整数。
[0620]
在一些方面，肽接头是合成的，即非天然存在的。在一个方面，肽接头包括肽(或多肽)(例如，天然或非天然存在的肽)，其包含将第一线性氨基酸序列与第二线性氨基酸序列连接或遗传融合的氨基酸序列，所述第一线性氨基酸序列在自然界中与所述第二线性氨基酸序列不是天然连接或遗传融合的。例如，在一个方面，肽接头可包含非天然存在的多肽，其是天然存在的多肽的修饰形式(例如，包含突变诸如添加、取代或缺失)。
[0621]
在一些方面，肽接头可包含非天然存在的氨基酸。在其它方面，肽接头可包含天然存在的氨基酸，其以天然不存在的线性序列存在。在其它方面，肽接头可包含天然存在的多肽序列。
[0622]
在一些方面，接头包括非肽接头。在其它方面，接头由非肽接头组成。在一些方面，非肽接头可以是例如马来酰亚胺基己酰基(mc)、马来酰亚胺基丙酰基(mp)、甲氧基聚乙二醇(mpeg)、琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸酯(smcc)、间马来酰亚胺苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯(mbs)、4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(smpb)、n-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(siab)、6-[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺]己酸琥珀酰亚胺酯(lc-spdp)、4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(smpt)等(参见，例如，美国专利第7,375,078号，其通过引用以其整体并入本文。
[0623]
在一些方面，可使用本领域已知的技术(例如，化学缀合、重组技术或肽合成)将本文公开的接头引入马来酰亚胺部分。在一些方面，可使用重组技术引入接头。在其它方面，可使用固相肽合成来引入接头。在某些方面，本文公开的马来酰亚胺部分可以同时包含一个或多个使用重组技术引入的接头和一个或多个使用固相肽合成或本领域已知的化学缀合方法引入的接头。在一些方面，接头可包含胆固醇部分。参见，例如，us 2008/0085869 a1，其通过引用以其整体并入本文。
[0624]
接头可易于裂解(“可裂解的接头”)，从而促进生物活性分子(例如，抗原、佐剂或免疫调节剂)的释放。因此，在一些方面，可用于本公开的接头包括可裂解的接头。在生物活性分子保持活性的条件下，此类可裂解的接头可能易受例如酸诱导的裂解、光诱导的裂解、
肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解。在一些方面，可裂解的接头包括间隔子。在某些方面，间隔子包括peg。
[0625]
在一些方面，接头是“还原敏感型接头”。在一些方面，还原敏感型接头包含二硫键。在一些方面，接头是“酸不稳定型接头”。在一些方面，酸不稳定型接头含有腙。合适的酸不稳定型接头还包括，例如，顺式乌头酸接头、酰肼接头、硫代氨甲酰基接头或其任意组合。
[0626]
在一些方面，接头包括不可裂解的接头(即，对裂解具有抗性或基本上具有抗性)。
[0627]
在一些方面，本文公开的接头组合仅包含可裂解的接头。在一些方面，本文公开的接头组合仅包含不可裂解的接头。在一些方面，本文公开的接头组合包含可裂解和不可裂解的接头。下面提供了与可用于本发明的可裂解和不可裂解的接头相关的其它公开内容。
[0628]
ii.h.1不可裂解的接头
[0629]
不可裂解的接头是能够以稳定的共价方式连接本公开的经修饰的生物活性分子的两种或更多种组分(例如，生物活性分子和锚定部分；生物活性分子和可裂解的接头；锚定部分和可裂解的接头)的任何化学部分，并且不属于上面列出的可裂解的接头的类别。因此，不可裂解的接头基本上对酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解具有抗性。
[0630]
此外，“不可裂解的”是指在环状二核苷酸和/或抗体不丧失其活性的条件下，接头中或与接头相邻的化学键抵抗由酸、光不稳定型裂解剂、肽酶、酯酶或裂解二硫键的化学或生理化合物诱导的裂解的能力。在一些方面，生物活性分子通过另一种接头，例如自消耗接头(self-immolative linker)，附接至接头。
[0631]
在一些方面，本文公开的接头组合包含不可裂解的接头，所述接头包含例如四乙二醇(teg)、六乙二醇(heg)、聚乙二醇(peg)、琥珀酰亚胺或其任意组合。在一些方面，不可裂解的接头包括将生物活性分子与不可裂解的接头连接的间隔子单元。
[0632]
在一些方面，一个或多个不可裂解的接头包含连接在一起的较小单元(例如，heg、teg、甘油、c2至c12烷基等)。在一些方面，所述键联是酯键联(例如，磷酸二酯或硫代磷酸酯)或其它键联。可用于本公开的不可裂解接头的实例是本领域已知的，参见，例如us 7,569,657 b2；us 8,465,730 b1；us 7,087,229 b2；和美国公布第2014/0193849 a1号，其每一个通过引用以其整体并入本文。
[0633]
ii.h.2可裂解的接头
[0634]
如本文所述，可用于将目标分子(例如，抗原、佐剂或免疫调节剂)与ev(例如，外来体)连接的一个或多个接头(即，接头组合)可包含可裂解的接头。术语“可裂解的接头”是指包含至少一个可被断裂或裂解的键联或化学键的接头。如本文所用，术语“裂解”是指以产生两个或更多个相对较小分子的方式断裂相对较大的分子中的一个或多个化学键。裂解可以例如由例如核酸酶、肽酶、蛋白酶、磷酸酶、氧化酶或还原酶介导，或者由特定的物理化学条件(例如，氧化还原环境、ph、活性氧种类的存在或特定的光波长)介导。
[0635]
在一些方面，如本文中所用，术语“可裂解的”是指例如可快速降解的接头，例如磷酸二酯和二硫化物，而术语“不可裂解的”是指例如更稳定的键联，例如抗核酸酶的硫代磷酸酯。
[0636]
在一些方面，可裂解的接头包括二核苷酸或三核苷酸接头、二硫化物、亚胺、酮缩硫醇(thioketal)、val-cit二肽或其任意组合。
[0637]
在一些方面，可裂解的接头包括缬氨酸-丙氨酸-对氨基苄基氨基甲酸酯、缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基氨基甲酸酯或两者。
[0638]
在一些方面，可裂解的接头包括氧化还原可裂解的接头、活性氧种类(ros)可裂解的接头、ph依赖性可裂解的接头、酶促可裂解的接头、蛋白酶可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头、光活化可裂解的接头、自消耗接头或其组合。涉及这些可裂解的接头中的一种或多种的其它公开内容将在下面进一步提供，并且在本领域中也是已知的，参见，例如us 2018/0037639 a1；trout等人，79proc.natl.acad.sci.usa,626-629(1982)；umemoto等人43int.j.cancer,677-684(1989)；cancer res.77(24):7027-7037(2017)；doronina等人nat.biotechnol.21:778-784(2003)；us 7,754,681 b2；us 2006/0269480；us 2010/0092496；us 2010/0145036；us 2003/0130189；us 2005/0256030，其每一篇都通过引用以其整体并入本文。
[0639]
ii.h.2.a氧化还原可裂解的接头
[0640]
在一些方面，接头组合包括氧化还原可裂解的接头。在某些方面，这种接头可包含氧化还原可裂解的连接基团，所述连接基团在还原时或氧化时被裂解。
[0641]
在一些方面，氧化还原可裂解的接头包含二硫键，即其为二硫化物可裂解的接头。在一些方面，可以例如通过细胞内硫醇、氧化酶、还原酶或其组合来还原氧化还原可裂解的接头。
[0642]
ii.h.2.b活性氧种类(ros)可裂解的接头
[0643]
在一些方面，接头组合可包含可裂解的接头，所述接头可被活性氧种类(ros)诸如超氧化物(of)或过氧化氢(h2o2)裂解，所述活性氧种类例如由炎症过程诸如活化的中性粒细胞产生。在一些方面，ros可裂解的接头是酮缩硫醇可裂解的接头。参见，例如，美国专利8,354,455b2，其通过引用以其整体并入本文。
[0644]
ii.h.2.c ph依赖性可裂解的接头
[0645]
在一些方面，接头是酸不稳定型接头，其包含酸可裂解的连接基团，所述连接基团是在酸性条件下(ph《7)被选择性裂解的连接基团。
[0646]
在一些方面，酸可裂解的连接基团在酸性环境(例如，约6.0、约5.5、约5.0或更低)中被裂解。在一些方面，ph值为约6.5或更低。在一些方面，接头被诸如可作为通用酸的酶例如肽酶(其可以是底物特异性的)或磷酸酶的剂裂解。在细胞内，某些低ph值的细胞器，诸如内体和溶酶体，可为酸可裂解的连接基团提供裂解环境。虽然人血清的ph值为7.4，但细胞内的平均ph值略低，约为7.1至7.3。内体也有酸性ph，范围为5.5至6.0，并且溶酶体在甚至更加酸性的ph下约为5.0。因此，在本领域中，ph依赖性可裂解的接头有时被称为内体不稳定型接头(endosomically labile linker)。
[0647]
在一些方面，酸可裂解的基团可具有通式-c＝nn-、c(o)o或-oc(o)。在另一个非限制性实例中，当附接至酯氧(烷氧基)的碳附接至芳基、取代的烷基或叔烷基诸如二甲基戊基或叔丁基上时。酸可裂解的连接基团的实例包括但不限于胺、亚胺、氨基酯、苯甲酸亚胺、二原酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈、缩醛、乙烯基醚、腙、顺乌头酸盐、酰肼、硫代氨甲酰基、亚胺嗪(imizine)、叠氮甲基-甲基马来酸酐、硫代丙酸酯、掩蔽的内溶剂、梓康酰基或其任意组合。二硫化物键联也容易受到ph值的影响。
[0648]
在一些方面，接头包含低ph不稳定型腙键。这种酸不稳定型键已广泛用于缀合物
领域，例如抗体-药物缀合物。参见，例如，zhou等人，biomacromolecules 2011,12,1460-7；yuan等人，acta biomater.2008,4,1024-37；zhang等人，acta biomater.2007,6,838-50；yang等人，j.pharmacol.exp.ther.2007,321,462-8；reddy等人，cancer chemother.pharmacol.2006,58,229-36；doronina等人，nature biotechnol.2003,21,778-84，其中每一篇都通过引用以其整体并入本文。
[0649]
在一些方面，接头包含选自以下的低ph不稳定型键：在酸性环境(例如，ph小于7，大于约4)中不稳定以形成二醇和酮的缩酮；在酸性环境(例如，ph小于7，大于约4)中不稳定以形成二醇和醛的缩醛；在酸性环境(例如，ph小于7，大于约4)中不稳定以形成胺和醛或酮的亚胺或亚胺(iminium)；在酸性条件下不稳定的硅-氧-碳键联；硅-氮(硅氮烷)键联；硅-碳键联(例如芳基硅烷、乙烯基硅烷和烯丙基硅烷)；马来酸酯(由马来酸酐衍生物和胺合成的酰胺键)；原酸酯；腙；设计用于进行酸催化的水解的活化羧酸衍生物(例如，酯、酰胺)；或乙烯基醚。
[0650]
其它实例可见于美国专利第9,790,494 b2号和第8,137,695 b2号，其内容通过引用以其整体并入本文。
[0651]
ii.h.2.d酶促可裂解的接头
[0652]
在一些方面，接头组合可包含可被细胞内或细胞外酶例如蛋白酶、酯酶、核酸酶、酰胺酶裂解的接头。能够裂解接头组合中特定接头的酶的范围取决于接头的特定键和化学结构。因此，肽接头可被例如肽酶(peptidade)裂解，含有酯键联的接头可被例如酯酶裂解；含有酰胺键联的接头可被例如酰胺酶(amidade)裂解；等等。
[0653]
ii.h.2.e酯酶可裂解的接头
[0654]
一些接头被酯酶裂解(“酯酶可裂解的接头”)。只有某些酯能被存在于细胞内部或外部的酯酶和酰胺酶裂解。酯是由羧酸和醇缩合而形成的。简单酯是用简单的醇，诸如脂肪醇，和小的环状醇和小的芳族醇产生的酯。基于酯的可裂解的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可裂解的连接基团具有通式-c(o)o-或-oc(o)-。
[0655]
ii.h.2.f磷酸酶可裂解的接头
[0656]
在一些方面，接头组合可包括基于磷酸的可裂解的连接基团，所述基团被降解或水解磷酸基团的剂裂解。裂解细胞内磷酸基团的剂的实例是酶，诸如细胞内磷酸酶。基于磷酸的连接基团的实例是—o—p(o)(or k)—o—、—o—p(s)(ork)—o—、—o—p(s)(srk)—o-、-s-p(o)(ork)-o、-o-p(o)(ork)-s-、-s-p(o)(ork)-s-、-o-p(s)(ork)-s-、-sp(s)(ork)-o-、-op(o)(rk)-o-、-op(s)(rk)-o-、-sp(o)(rk)-o-、-sp(s)(rk)-o-、-sp(o)(rk)-s-或-op(s)(rk)-s-。
[0657]
在一些方面，rk是以下中的任一种：nh2、bh3、ch3、c
1-6
烷基、c
6-10
芳基、c
1-6
烷氧基和c
6-10
芳基-氧基。在一些方面，c
1-6
烷基和c
6-10
芳基是未取代的。其它非限制性实例包括-o-p(o)(oh)-o-、-o-p(s)(oh)-o-、-o-p(s)(sh)-o-、-s-p(o)(oh)-o-、-o-p(o)(oh)-s-、-s-p(o)(oh)-s-、-o-p(s)(oh)-s-、-s-p(s)(oh)-o-、-o-p(o)(h)-o-、-o-p(s)(h)-o-、-s-p(o)(h)-o-、-sp(s)(h)-o-、-sp(o)(h)-s-、-op(s)(h)-s-或-o-p(o)(oh)
–
o-。
[0658]
ii.h.2.g光活化的可裂解的接头
[0659]
在一些方面，组合接头包括光活化的可裂解的接头，例如硝基苄基接头或包含硝基苄基反应性基团的接头。
[0660]
常规疫苗已经证明了一些挑战。在一些方面，常规疫苗不能诱导强劲的t细胞反应。此外，常规疫苗产生的任何反应可能仅限于组织特异性反应并且/或者缺乏抗体多样性。在一些方面，与单独的抗原(疫苗)相比，包含可用于本公开的抗原的ev(例如，外来体)表现出有利的性质。在一些方面，与单独的抗原相比，本公开的ev(例如，外来体)能够诱导改善的t细胞定向免疫反应。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)能够在外周组织中诱导t细胞反应。在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)表现出增强的抗体多样性和/或亲合力。
[0661]
常规疫苗，例如抗原，也面临抗原呈递细胞吸收差、免疫原性差和/或复杂性有限的问题。与常规抗原相比，本公开的ev(例如，外来体)能够在ev(例如，外来体)上呈递多种抗原并且/或者调节对特定免疫细胞(例如，b细胞和/或树突状细胞)的抗原暴露。
[0662]
常规疫苗的佐剂也面临挑战。例如，佐剂的潜在毒性限制了其施用途径、剂量和佐剂的组合。另外，rna和/或dna是差的佐剂。本公开的ev(例如，外来体)克服了这些问题。本公开的ev(例如，外来体)允许将一种或多种抗原和一种或多种佐剂(和/或本文公开的其它有效载荷)选择性共递送至抗原呈递细胞；这可减少佐剂剂量并实现组合，从而提高疫苗的整体安全性。
[0663]
iii.用于生产工程化ev(例如，外来体)的生产者细胞
[0664]
本公开的ev(例如，外来体)可从体外生长的细胞或受试者的体液中产生。当从体外细胞培养物产生外来体时，可使用各种生产者细胞，例如，hek293细胞、cho细胞和msc。在某些方面，生产者细胞不是天然存在的树突状细胞、巨噬细胞、b细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、kupffer-browicz细胞、源自这些细胞中的任一种的细胞或其任意组合(即，非天然存在的生产者细胞)。如本文所用，术语“非天然存在的生产者细胞”是指这样的生产者细胞(例如，树突状细胞、巨噬细胞、b细胞、肥大细胞、中性粒细胞、kupffer-browicz细胞、源自这些细胞中的任一种的细胞或其任意组合)，所述生产者细胞已被修饰，使得所述生产者细胞与天然存在的对应细胞相比在结构和/或功能上不同。如下文进一步描述的，在一些方面，非天然存在的生产者细胞已被修饰以表达本文公开的一种或多种有效载荷(例如，抗原、免疫调节剂和/或佐剂)。在某些方面，非天然存在的生产细胞已被修饰以表达本文公开的一种或多种靶向部分。在一些方面，非天然存在的生产者细胞已被修饰以表达本文公开的一种或多种支架部分(例如，支架x和/或支架y)。
[0665]
生产者细胞可被遗传修饰成包含一个或多个外源序列(例如，编码抗原、佐剂、免疫调节剂和/或靶向部分)，以产生本文所述的ev(例如，外来体)。经遗传修饰的生产细胞可通过瞬时或稳定转化来包含外源序列。外源序列可被转化为质粒。可将外源序列在靶向位点处或随机位点中稳定地整合到生产者细胞的基因组序列中。在一些方面，产生稳定的细胞系以用于生产腔工程化ev(例如，外来体)。
[0666]
可将外源序列插入到生产者细胞的基因组序列中，位于编码ev(例如，外来体)蛋白质的内源序列内、其上游(5
’‑
末端)或下游(3
’‑
末端)。本领域已知的各种方法可用于将外源序列引入生产者细胞。例如，使用各种基因编辑方法(例如，使用同源重组、转座子介导的系统、loxp-cre系统、crispr/cas9或talen的方法)修饰的细胞在本公开的范围内。
[0667]
外源序列可以包含编码本文公开的支架部分或其片段或变体的序列。可引入额外拷贝的编码支架部分的序列以产生本文所述的ev(例如，外来体)(例如，在ev(例如，外来
体)的表面或腔表面上具有更高密度的支架部分)。可引入编码支架部分的修饰或片段的外源序列，以产生含有支架部分的该修饰或支架部分的片段的腔工程化和/或表面工程化外来体。
[0668]
在一些方面，可用一种或多种载体修饰(例如，转染)生产者细胞，所述载体编码与有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)和/或靶向部分连接的支架部分。
[0669]
在一些方面，本文公开的生产者细胞被进一步修饰以包含附加的外源序列。例如，可以引入附加的外源序列来调节内源基因表达，或产生包含某种多肽作为有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)和/或靶向部分的ev(例如，外来体)。在一些方面，生产者细胞被修饰以包含两个外源序列，一个编码支架部分(例如，支架x和/或支架y)或其变体或片段，另一个编码有效载荷和/或靶向部分。在某些方面，生产者细胞可被进一步修饰以包含附加的外源序列，所述序列赋予ev(例如，外来体)附加的功能性(例如，佐剂或免疫调节剂)。在一些方面，生产者细胞被修饰以包含两个外源序列，一个编码本文公开的支架部分或其变体或片段，另一个编码赋予ev(例如，外来体)附加的功能性的蛋白质(例如，佐剂或免疫调节剂)。在一些方面，生产者细胞被进一步修饰以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个附加的外源序列。在某些方面，附加的外源序列编码本文公开的任何有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)和/或靶向部分。
[0670]
在一些方面，本公开的ev(例如，外来体)(例如，表面工程化和/或腔工程化外来体)可以从用编码本文公开的全长成熟支架部分或与有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)和/或靶向部分连接的支架部分的序列转化的细胞产生。本文所述的任何支架部分都可以从质粒、插入基因组的外源序列或其它外源核酸(诸如合成信使rna(mrna))表达。
[0671]
iv.药物组合物
[0672]
本文提供了呈适合向受试者施用的形式的药物组合物，其包含具有所需纯度的本公开的ev(例如，外来体)和药学上可接受的载剂或赋形剂。药学上可接受的赋形剂或载剂可以部分地由所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法来确定。因此，有很多种合适的药物组合物制剂，其包含多种细胞外囊泡。(参见，例如，remington's pharmaceutical sciences,mack publishing co.,easton,pa.第21版(2005))。药物组合物通常是无菌配制的，并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(gmp)规程。
[0673]
在一些方面，药物组合物包含一种或多种治疗剂和本文所述的外来体。在某些方面，将ev(例如，外来体)与一种或多种附加的治疗剂于药学上可接受的载剂中共施用。在一些方面，在施用附加的治疗剂之前，施用包含ev(例如，外来体)的药物组合物。在其它方面，在施用附加的治疗剂之后，施用包含ev(例如，外来体)的药物组合物。在另外的方面，将包含ev(例如，外来体)的药物组合物与附加的治疗剂同时施用。
[0674]
可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者(例如，动物或人)无毒，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苯乙铵；苯酚、丁醇或苄醇)；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，
诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐平衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
[0675]
载体或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。此类介质和化合物用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。除非任何常规介质或化合物与本文所述的细胞外囊泡不相容，否则考虑其于组合物中的使用。还可将补充治疗剂并入组合物中。通常，将药物组合物配制成可与其预期施用途径相容。ev(例如，外来体)可通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、皮内、经皮、直肠、颅内、腹膜内、鼻内、瘤内、肌内途径施用或作为吸入剂施用。在某些方面，静脉内施用(例如通过注射)包含外来体的药物组合物。可将ev(例如，外来体)任选地与在治疗所述ev(例如，外来体)所要治疗的疾病、病症或疾患方面至少部分有效的其它治疗剂联合施用。
[0676]
溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，诸如水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，诸如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲剂，诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及调节张力的化合物诸如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱(诸如盐酸或氢氧化钠)调节ph。可将制剂封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
[0677]
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(如果是水溶性的话)或分散体和无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、cremophor el
tm
(basf,parsippany,n.j.)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。组合物通常是无菌的并且具有达到容易注射的程度的流动性。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散体的情况下通过保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持。微生物作用的防止可通过各种抗细菌和抗真菌化合物(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。如果需要，可向组合物中加入等渗化合物，例如，糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)和氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的化合物(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
[0678]
可按需要，通过将有效量的ev(例如，外来体)与本文列举的成分之一或其组合并入合适的溶剂中来制备无菌注射溶液。一般地，通过将ev(例如，外来体)并入含有基础分散介质和任何所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，所述方法从其预先无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。可将ev(例如，外来体)以贮库注射或植入制剂的形式施用，所述制剂可以以允许ev(例如，外来体)的持续或脉冲释放的方式配制。
[0679]
包含外来体的组合物的全身性施用还可通过经粘膜手段来进行。对于经粘膜施用，制剂中使用对于待穿透屏障合适的渗透剂。此类渗透剂在本领域中是众所周知的，且例如对于经粘膜施用包括去垢剂、胆汁盐和夫西地酸(fusidic acid)衍生物。经粘膜施用可通过使用例如鼻喷雾剂来实现。
[0680]
在某些方面，将包含外来体的药物组合物静脉内施用到可受益于该药物组合物的
受试者中。在某些其它方面，将所述组合物例如通过淋巴内注射或通过结节内注射(参见例如senti等人，pnas 105(46):17908(2008))或者通过肌内注射、通过皮下施用、通过瘤内注射、通过直接注射到胸腺或肝脏中来施用至淋巴系统。
[0681]
在某些方面，将包含外来体的药物组合物作为液体悬浮液施用。在某些方面，将药物组合物以能够在施用后形成贮库的制剂形式施用。在某些优选方面，贮库将ev(例如外来体)缓慢地释放到循环中，或者保持贮库形式。
[0682]
通常，药学上可接受的组合物是高度纯化的，不含污染物，是生物相容的且无毒的，并且适于向受试者施用。如果水是载剂的成分，则水被高度纯化并处理成不含污染物，例如内毒素。
[0683]
药学上可接受的载剂可以是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和/或矿物油，但不限于此。药物组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、增味剂、乳化剂、混悬剂和/或防腐剂。
[0684]
本文所述的药物组合物包含本文所述的ev(例如，外来体)以及任选的药物活性剂或治疗剂。治疗剂可以是生物剂、小分子剂或核酸剂。
[0685]
提供了包含药物组合物的剂型，所述药物组合物包含本文所述的ev(例如，外来体)。在一些方面，剂型被配制成用于静脉内注射的液体混悬剂。在一些方面，剂型被配制成用于瘤内注射的液体混悬剂。
[0686]
在某些方面，使外来体的制剂经受辐射，例如x射线、γ射线、β粒子、α粒子、中子、质子、元素核、紫外线，以便破坏残余的有复制能力的核酸。
[0687]
在某些方面，使用大于1kgy、5kgy、10kgy、15kgy、20kgy、25kgy、30kgy、35kgy、40kgy、50kgy、60kgy、70kgy、80kgy、90kgy、100kgy或大于100kgy的辐射剂量对外来体的制剂进行γ辐射。
[0688]
在某些方面，使用大于0.1msv、0.5msv、1msv、5msv、10msv、15msv、20msv、25msv、30msv、35msv、40msv、50msv、60msv、70msv、80msv、90msv、100msv、200msv、300msv、400msv、500msv、600msv、700msv、800msv、900msv、1000msv、2000msv、3000msv、4000msv、5000msv、6000msv、7000msv、8000msv、9000msv、10000msv或大于10000msv的辐射剂量对外来体的制剂进行x射线辐射。
[0689]
v.药盒
[0690]
本文还提供了包含一种或多种本文所述外来体的药盒。在一些方面，本文提供了药物包或药盒，其包括一个或多个装有本文所述药物组合物的一种或多种成分(诸如本文提供的一种或多种外来体)的容器、任选的使用说明。在一些方面，药盒包含本文所述的药物组合物和任何预防剂或治疗剂，诸如本文所述的那些。
[0691]
vi.产生ev(例如，外来体)的方法
[0692]
本公开的ev(例如，外来体)与常规疫苗的不同之处在于，ev可被快速工程化以表达目标部分(例如，抗原、佐剂、免疫调节剂和/或靶向部分)。如本文所述，目标部分(i)可直接与ev的表面(例如，外表面和/或腔表面)连接，(ii)可与支架部分(例如，支架x和/或支架y)连接，然后在ev的表面(例如，外表面和/或腔表面)上表达，(iii)可在ev的腔中表达，或者(iv)其组合。这种快速工程化ev(例如，外来体)的能力在开发基于ev(例如，外来体)的疫
苗中特别有用。例如，通过简单地将目标抗原“插入”ev中，被工程化成表达某些有效载荷和/或靶向部分的单个ev(例如，外来体)可用于治疗多种疾病或病症。
[0693]
因此，在一些方面，本公开涉及产生这种模块化或“即插即用”ev(例如，外来体)疫苗的方法。在某些方面，产生基于ev(例如，外来体)的疫苗的方法包括将工程化ev(例如，外来体)与目标抗原混合，使得目标抗原在工程化ev中表达。在一些方面，工程化ev(例如，外来体)包含一种或多种本文公开的有效载荷(例如，抗原、佐剂和/或免疫调节剂)。在某些方面，工程化ev(例如，外来体)还包含一种或多种支架部分(例如，支架x和/或支架y)。在一些方面，工程化ev(例如，外来体)另外包含一种或多种靶向部分。在一些方面，可使用本文公开的任何方法产生工程化ev(例如，外来体)。
[0694]
在一些方面，本公开还涉及产生本文所述的ev(例如，外来体)的方法。在一些方面，所述方法包括：从生产者细胞获得ev(例如，外来体)，其中生产者细胞包含ev(例如，外来体)的两种或更多种组分(例如，(i)抗原和佐剂，(ii)抗原和免疫调节剂，(iii)抗原和靶向部分，(iv)抗原、佐剂和靶向部分，(v)抗原、免疫调节剂和靶向部分，(vi)抗原、佐剂和免疫调节剂，(vii)抗原、佐剂、免疫调节剂和靶向部分)；以及任选地分离所获得的ev(例如，外来体)。在一些方面，所述方法包括：通过引入本文公开的ev(例如，外来体)的两种或更多种组分(例如，(i)抗原和佐剂，(ii)抗原和免疫调节剂，(iii)抗原和靶向部分，(iv)抗原、佐剂和靶向部分，(v)抗原、免疫调节剂和靶向部分，(vi)抗原、佐剂和免疫调节剂，(vii)抗原、佐剂、免疫调节剂和靶向部分)来修饰生产者细胞；从经修饰的生产者细胞获得ev(例如，外来体)；以及任选地分离所获得的ev(例如，外来体)。在另外的方面，所述方法包括：从生产者细胞获得ev(例如，外来体)；分离所获得的ev(例如，外来体)；以及修饰分离的ev(例如，外来体)(例如，通过插入多个外源生物活性分子，例如抗原、佐剂和/或免疫调节剂和/或靶向部分)。在某些方面，所述方法还包括将分离的ev(例如，外来体)配制成药物组合物。
[0695]
vi.a修饰生产者细胞的方法
[0696]
如上所述，在一些方面，产生ev(例如，外来体)的方法包括用多种(例如，两种或更多种)目标分子(例如，本文所述的外源生物活性分子(例如，抗原、佐剂、免疫调节剂)和/或靶向部分)修饰生产者细胞。在一些方面，本文公开的生产者细胞可用本文公开的支架部分(例如，支架x或支架y)进一步修饰。
[0697]
在一些方面，生产者细胞可以是哺乳动物细胞系、植物细胞系、昆虫细胞系、真菌细胞系或原核细胞系。在某些方面，生产者细胞是哺乳动物细胞系。哺乳动物细胞系的非限制性实例包括：人胚胎肾(hek)细胞系、中国仓鼠卵巢(cho)细胞系、ht-1080细胞系、hela细胞系、perc-6细胞系、cevec细胞系、成纤维细胞细胞系、羊水细胞细胞系、上皮细胞系、间充质干细胞(msc)细胞系及其组合。在某些方面，哺乳动物细胞系包括hek-293细胞、bj人包皮成纤维细胞、fhdf成纤维细胞、age.神经元前体细胞、羊水细胞、脂肪间充质干细胞、rptec/tert1细胞或其组合。在一些方面，生产者细胞是原代细胞。在某些方面，原代细胞可以是原代哺乳动物细胞、原代植物细胞、原代昆虫细胞、原代真菌细胞或原代原核细胞。
[0698]
在一些方面，生产者细胞不是免疫细胞，诸如抗原呈递细胞、t细胞、b细胞、天然杀伤细胞(nk细胞)、巨噬细胞、t辅助细胞或调节性t细胞(treg细胞)。在其它方面，生产者细胞不是抗原呈递细胞(例如，树突状细胞、巨噬细胞、b细胞、肥大细胞、中性粒细胞、
kupffer-browicz细胞或来源于任何此类细胞的细胞)。在一些方面，生产者细胞不是天然存在的抗原呈递细胞(即，已经被修饰)。在一些方面，生产细胞不是天然存在的树突状细胞、b细胞、肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、kupffer-browicz细胞、来源于这些细胞中的任一种的细胞或其任意组合。
[0699]
在一些方面，一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)可以是转基因或mrna，并通过转染、病毒转导、电穿孔、挤压、超声处理、细胞融合或本领域技术人员已知的其它方法引入生产者细胞。
[0700]
在一些方面，通过转染将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入生产者细胞。在一些方面，可使用合成大分子，诸如阳离子脂质和聚合物，将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入合适的生产细胞(papapetrou等人，gene therapy 12:s118-s130(2005))。在一些方面，阳离子脂质通过电荷相互作用与一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)形成复合物。在这些方面中的一些方面，带正电荷的复合物与带负电荷的细胞表面结合，并被细胞通过内吞作用吸收。在一些其它方面，阳离子聚合物可用于转染生产者细胞。在这些方面的一些方面，阳离子聚合物是聚乙烯亚胺(pei)。在某些方面，诸如磷酸钙、环糊精或聚芳烃等的化学物质可用于将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入生产者细胞。还可使用物理方法将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入生产者细胞，所述物理方法为诸如粒子介导的转染、“基因枪”、生物弹道技术(biolistics)或粒子轰击技术(papapetrou等人，gene therapy 12:s118-s130(2005))。报告基因诸如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、荧光素酶或绿色荧光蛋白可用于评估生产者细胞的转染效率。
[0701]
在某些方面，通过病毒转导将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入生产者细胞。许多病毒可用作基因转移媒介物，包括莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)、腺病毒、腺相关病毒(aav)、单纯疱疹病毒(hsv)、慢病毒和泡沫病毒(spumavirus)。病毒介导的基因转移媒介物包括基于dna病毒诸如腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒的载体以及基于逆转录病毒的载体。
[0702]
在某些方面，通过电穿孔将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入生产者细胞。电穿孔在细胞膜中产生短暂的孔，允许各种分子引入细胞。在一些方面，可通过电穿孔将dna和rna以及多肽和非多肽治疗剂引入生产者细胞。
[0703]
在某些方面，通过显微注射将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入生产者细胞。在一些方面，可将玻璃微量移液器用于在显微水平上将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)注射到生产者细胞中。
[0704]
在某些方面，通过挤压将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入生产者细胞。
[0705]
在某些方面，通过超声处理将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入生产者细胞。在一些方面，将生产者细胞暴露于高强度声波，引起细胞膜的瞬时破坏，从而允许装载一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)。
[0706]
在某些方面，通过细胞融合将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入生产者细胞。在一些方面，通过电细胞融合引入一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)。在其它方面，将聚乙二醇(peg)用于融合生产者细胞。在另外的方面，将仙台
病毒用于融合生产者细胞。
[0707]
在一些方面，通过低渗裂解将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入生产者细胞。在这些方面，可将生产者细胞暴露于低离子强度缓冲液，所述低离子强度缓冲液导致它们破裂，从而允许装载一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)。在其它方面，针对低渗溶液的受控透析可用于使生产者细胞膨胀并在生产者细胞膜中产生孔。随后将生产者细胞暴露于允许膜重新密封的条件下。
[0708]
在一些方面，通过去垢剂处理将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入生产者细胞。在某些方面，用温和去垢剂处理生产者细胞，所述去垢剂通过产生孔而暂时损伤生产者细胞膜，从而允许装载一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)。在对生产者细胞进行装载后，洗掉去垢剂，从而重新密封膜。
[0709]
在一些方面，通过受体介导的内吞作用将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入生产者细胞。在某些方面，生产者细胞具有表面受体，其在结合一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)时诱导受体和相关部分的内化。
[0710]
在一些方面，通过过滤将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入生产者细胞。在某些方面，可将生产者细胞和一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)强制通过孔径小于生产者细胞的过滤器，从而引起生产者细胞膜的暂时破坏并允许一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)进入生产者细胞。
[0711]
在一些方面，使生产者细胞经历几次冻融循环，导致细胞膜破裂，从而允许装载一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)。
[0712]
vi.b修饰ev(例如，外来体)的方法
[0713]
在一些方面，产生ev(例如，外来体)的方法包括通过将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)直接引入ev(例如，外来体)来修饰分离的ev(例如，外来体)。在某些方面，一个或多个部分包括抗原、佐剂、免疫调节剂、靶向部分或其组合。在一些方面，一个或多个部分包括本文公开的支架部分(例如，支架x或支架y)。
[0714]
在某些方面，通过转染将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入ev(例如，外来体)。在一些方面，可使用合成大分子，诸如阳离子脂质和聚合物，将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入ev(例如，外来体)(papapetrou等人，gene therapy 12:s118-s130(2005))。在某些方面，诸如磷酸钙、环糊精或聚凝胺的化学物质可用于将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入ev(例如，外来体)。
[0715]
在某些方面，通过电穿孔将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入ev(例如，外来体)。在一些方面，将ev(例如，外来体)暴露于电场，所述电场在ev(例如，外来体)膜中导致瞬时孔，允许装载一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)。
[0716]
在某些方面，通过显微注射将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入ev(例如，外来体)。在一些方面，可将玻璃微量移液器用于在显微水平上将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)直接注射到ev(例如，外来体)中。
[0717]
在某些方面，通过挤出将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入ev(例如，外来体)。
[0718]
在某些方面，通过超声处理将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入ev(例如，外来体)。在一些方面，将ev(例如，外来体)暴露于高强度声波，导致ev(例如，
外来体)膜的瞬时破坏，从而允许装载一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)。
[0719]
在一些方面，可将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)与ev(例如，外来体)的表面缀合(即，与ev的外表面或ev的腔表面直接缀合或连接)。通过本领域已知的方法，可以化学地或酶促地实现缀合。
[0720]
在一些方面，ev(例如，外来体)包含一个或多个化学缀合的部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)。化学缀合可通过在使用或不使用接头的情况将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)与另一个分子的共价键合来完成。此类缀合物的形成在技术人员的技能范围内，并且已知各种技术来实现缀合，其中具体技术的选择由待缀合的材料来指导。在某些方面，将多肽与ev(例如，外来体)缀合。在一些方面，将非多肽，诸如脂质、碳水化合物、核酸和小分子，与ev(例如，外来体)缀合。
[0721]
在一些方面，通过低渗裂解将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入ev(例如，外来体)。在此类方面，可将ev(例如，外来体)暴露于低离子强度缓冲液，所述低离子强度缓冲液导致它们破裂，从而允许装载一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)。在其它方面，针对低渗溶液的受控透析可用于使ev(例如，外来体)膨胀并在ev(例如，外来体)膜中产生孔。随后将ev(例如，外来体)暴露于允许膜重新密封的条件下。
[0722]
在一些方面，通过去垢剂处理将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入ev(例如，外来体)。在某些方面，用温和去垢剂处理细胞外囊泡，所述去垢剂通过产生孔而暂时损伤ev(例如，外来体)膜，从而允许装载一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)。在对ev(例如，外来体)进行装载后，洗掉去垢剂，从而重新密封膜。
[0723]
在一些方面，通过受体介导的内吞作用将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入ev(例如，外来体)。在某些方面，ev(例如，外来体)具有表面受体，其在结合一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)时诱导受体和相关部分的内化。
[0724]
在一些方面，通过机械熔结(mechanical firing)将一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)引入ev(例如，外来体)。在某些方面，可用一个或多个附接至重或带电粒子诸如金微载体的部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)轰击细胞外囊泡。在这些方面中的一些方面，粒子可以被机械或电加速，使得其穿过ev(例如，外来体)膜。
[0725]
在一些方面，使细胞外囊泡(例如，外来体)经历几次冻融循环，导致ev(例如，外来体)膜破裂，从而允许装载一个或多个部分(例如，有效载荷和/或靶蛋白部分)。
[0726]
vi.c分离ev(例如，外来体)的方法
[0727]
在一些方面，本文公开的产生ev(例如，外来体)的方法包括从生产细胞中分离ev(例如，外来体)。在某些方面，由生产者细胞释放到细胞培养基中的ev(例如，外来体)。预计所有已知的分离ev(例如，外来体)的方式都被认为适用于本文。例如，ev(例如，外来体)的物理性质可用于将它们从介质或其它源材料中分离出来，包括基于电荷(例如，电泳分离)、尺寸(例如，过滤、分子筛选等)、密度(例如，规则或梯度离心)、svedberg常数(例如，利用或不利用外力的沉降等)的分离。可选地或另外地，分离可基于一种或多种生物学特性，并且包括可使用表面标志物的方法(例如，用于沉淀、与固相的可逆结合、facs分离、特异性配体结合、非特异性配体结合、亲和力纯化等)。
[0728]
分离和富集可以以一般和非选择性方式(通常包括连续离心)进行。另选地，分离和富集可以以更加特异和具选择性的方式(诸如，使用ev(例如，外来体)或生产者细胞特异
性表面标志物)进行。例如，特异性表面标志物可用于免疫沉淀、facs分选、亲和纯化、利用珠粒结合的配体进行的磁性分离。
[0729]
在一些方面，尺寸排阻色谱法可用于分离ev(例如，外来体)。尺寸排阻色谱技术是本领域已知的。本文提供了示例性非限制性技术。在一些方面，分离空隙体积级分，其包含目标ev(例如，外来体)。此外，在一些方面，如本领域所公知的，可在通过离心技术(对一种或多种色谱级分)进行色谱分离后，进一步分离ev(例如，外来体)。在一些方面，例如，可将密度梯度离心用于进一步分离细胞外囊泡。在某些方面，可能需要进一步将生产者细胞来源的ev(例如，外来体)与其它来源的ev分离。例如，通过使用对生产者细胞特异的抗原抗体的免疫吸附捕获，可将生产者细胞来源的ev(例如，外来体)与非生产者细胞来源的ev(例如，外来体)分离。
[0730]
在一些方面，ev(例如，外来体)的分离可涉及方法的组合，所述方法包括但不限于差速离心、基于尺寸的膜过滤、免疫沉淀、facs分选和磁力分离。
[0731]
vii.治疗方法
[0732]
本公开还提供了预防和/或治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用本文公开的ev(例如，外来体)。在一些方面，可用本发明方法治疗的疾病或病症包括癌症、移植物抗宿主病(gvhd)、自身免疫性疾病、传染病或纤维化疾病。可用本公开治疗的疾病或病症的其它非限制性实例包括耐受性、过敏、特应性过敏、疼痛、成瘾及其组合。不受任何一种理论的束缚，在一些方面，本文公开的ev(例如，外来体)可通过诱导中和抗体来治疗和/或预防这些疾病或病症，所述中和抗体可以与疾病或病症相关分子(例如，成瘾：尼古丁；疼痛：cgrp或物质p)特异性结合。例如，有利于针对疼痛介导神经肽诸如物质-p、神经生长因子、缓激肽或降钙素相关基因产物(cgrp)的体液反应的ev(例如，外来体)可用于替代针对这些靶标的被动抗体疗法，以治疗或预防疼痛综合征。最近监管机构批准了几种靶向cgrp的预防性被动抗体疗法用于偏头痛治疗，这为提出的体液主动疫苗方法提供了强有力的理论依据。通过将诸如尼古丁、可卡因、芬太尼、海洛因、甲基苯丙胺等非法药物与ev(例如，外来体)疫苗上表达的蛋白质或其它分子化学缀结合，有可能产生针对这些小分子的抗体反应。此类抗药物滥用疫苗可以限制被滥用物质的大脑暴露，从而降低其产生欣快感和cns毒性的能力。因此，缀合有非法药物的ev与强效th2定向佐剂的组合可为药物滥用康复提供疫苗治疗策略。在某些方面，治疗是预防性的。在其它方面，本公开的ev(例如，外来体)用于诱导免疫反应。在其它方面，本公开的ev(例如，外来体)用于给受试者接种疫苗。
[0733]
在某些方面，疾病或病症是癌症。当向患有癌症的受试者施用时，在某些方面，本公开的ev可以上调受试者免疫系统的免疫反应并增强肿瘤靶向性。在一些方面，所治疗的癌症的特征在于白细胞(t细胞、b细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞)至肿瘤微环境的浸润，或所谓的“热肿瘤(hot tumor)”或“炎性肿瘤(inflammatory tumor)”。在一些方面，所治疗的癌症的特征在于低水平或不可检测的水平的白细胞至肿瘤微环境的浸润，或所谓的“冷肿瘤(cold tumor)”或“非炎性肿瘤”。在一些方面，以足以将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”的量和持续时间施用ev(例如，外来体)，即，所述施用导致白细胞(诸如t细胞)至肿瘤微环境的浸润。在某些方面，癌症包括膀胱癌、宫颈癌、肾细胞癌、睾丸癌、结直肠癌、肺癌、头颈癌以及卵巢癌、淋巴瘤、肝癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、白血病、胰腺癌或其组合。在其它术语中，术语“远端肿瘤(distal tumor)”或“远处肿瘤(distant tumor)”是指从
原始(或原发)肿瘤扩散到远处器官或远处组织例如淋巴结的肿瘤。在一些方面，本公开的ev治疗转移扩散后的肿瘤。
[0734]
在一些方面，疾病或病症是移植物抗宿主病(gvhd)。在一些方面，可用本公开治疗的疾病或病症是自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的非限制性实例包括：多发性硬化、外周神经炎、sjogren综合征、类风湿性关节炎、脱发、自身免疫性胰腺炎、白塞病、大疱性类天疱疮、乳糜泻、devic病(视神经脊髓炎)、肾小球肾炎、iga肾病、各种血管炎、硬皮病、糖尿病、动脉炎、白癜风、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、银屑病、葡萄膜炎、系统性红斑狼疮、graves病、重症肌无力、寻常型天疱疮、抗肾小球基底膜疾病(goodpasture综合征)、桥本甲状腺炎、自身免疫性肝炎及其组合。
[0735]
在一些方面，疾病或病症是传染病。在某些方面，疾病或病症是致癌病毒。在一些方面，可用本公开治疗的传染病包括但不限于人γ疱疹病毒4(爱泼斯坦巴尔病毒)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、沙眼衣原体、hiv(例如，hiv-2)、冠状病毒(例如，covid-19、mers-cov和sars cov)、丝状病毒(例如马尔堡病毒和埃博拉病毒)、化脓性链球菌、肺炎链球菌、疟原虫属种(例如，间日疟原虫和恶性疟原虫)、基孔肯雅病毒、人乳头瘤病毒(hpv)、乙型肝炎、丙型肝炎、人疱疹病毒8、默克尔细胞多瘤病毒(mcv)、布尼亚病毒(例如，汉坦病毒)、沙粒病毒(例如，lcmv病毒和拉沙病毒)、黄病毒(例如，登革热病毒、寨卡病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒和黄热病病毒)、肠道病毒(例如，脊髓灰质炎病毒)、星状病毒(例如，胃肠炎病毒)、弹状病毒科(例如，狂犬病病毒)、包柔氏疏螺旋体和梅奥疏螺旋体(例如，莱姆病)、单纯疱疹病毒2(hsv2)、克雷伯氏菌属某种、铜绿假单胞菌、肠球菌属某种、变形杆菌属某种、肠杆菌属某种、放线菌属某种、凝固酶阴性葡萄球菌属(cons)、支原体属某种或其组合。
[0736]
在一些方面，疾病或病症包括疼痛。如本文所用，术语“疼痛”指所有类别的疼痛，包括但不限于神经性疼痛、炎性疼痛、伤害性疼痛、特发性疼痛、神经痛、口面部疼痛、烧伤疼痛、灼口综合征、躯体疼痛、内脏疼痛、肌面部疼痛、牙疼痛、癌症疼痛、化疗疼痛、创伤疼痛、手术疼痛、手术后疼痛、分娩疼痛、分娩疼痛(labor pain)、反射性交感神经营养不良、臂丛撕脱伤、神经源性膀胱、急性疼痛(例如，肌肉骨骼疼痛和手术后疼痛)、慢性疼痛、持续性疼痛、外周介导的疼痛、中枢介导的疼痛、慢性头痛、偏头痛、家族性偏瘫性偏头痛、与头痛相关的疾患、窦性头痛、紧张性头痛、幻肢疼痛、外周神经损伤、中风后疼痛、丘脑病变、神经根病、hiv(例如，hiv-1、hiv-2)疼痛、疱疹后疼痛、非心脏性胸痛、肠易激综合征和与肠病症和消化不良相关的疼痛、与麻醉药物成瘾戒断相关的疼痛及其组合。
[0737]
在某些方面，疾病或病症包括过敏。如本文所用，术语“过敏”是指对通常无害的物质(“过敏原”)产生免疫介导的不良反应的获得性潜能。过敏的非限制性实例包括湿疹、过敏性鼻炎或鼻伤风、枯草热、结膜炎、支气管或过敏性哮喘、荨麻疹(urticaria)(荨麻疹(hives))、食物过敏、特应性皮炎、药物过敏、血管性水肿、过敏性结膜炎、超敏反应及其组合。在某些方面，可用本公开治疗的过敏是由食物过敏原(例如，花生、牛奶、鸡蛋、贝类和树坚果)引起的(即，食物过敏)。在一些方面，可用本公开治疗的过敏是由环境过敏原(例如，猫皮屑、豚草、草花粉、屋尘螨、蜂毒、胶乳和毒常春藤)引起的。
[0738]
可通过本领域已知的任何有用的方法和/或途径向受试者施用本公开的ev(例如，外来体)。在一些方面，向受试者的循环系统静脉内施用ev(例如，外来体)。在一些方面，将
laboratory manual(第2版；cold spring harbor laboratory press)；sambrook等人，编辑(1992)molecular cloning:a laboratory manual,(cold springs harbor laboratory,ny)；d.n.glover编辑，(1985)dna cloning，第i和ii卷；gait，编辑(1984)oligonucleotide synthesis；mullis等人美国专利第4,683,195号；hames和higgins，编辑(1984)nucleic acid hybridization；hames和higgins，编辑(1984)transcription and translation；freshney(1987)culture of animal cells(alan r.liss,inc.)；immobilized cells and enzymes(irl press)(1986)；perbal(1984)a practical guide to molecular cloning；the treatise,methods in enzymology(academic press,inc.,n.y.)；miller和calos编辑(1987)gene transfer vectors for mammalian cells,(cold spring harbor laboratory)；wu等人，编辑，methods in enzymology，第154和155卷；mayer和walker，编辑(1987)immunochemical methods in cell and molecular biology(academic press,london)；weir和blackwell，编辑，(1986)handbook of experimental immunology，第i-iv卷；manipulating the mouse embryo,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,(1986)；crooke,antisense drug technology:principles,strategies and applications，第2版crc press(2007)和于ausubel等人(1989)current protocols in molecular biology(john wiley和sons,baltimore,md.)中。
[0749]
上面引用的所有参考文献，以及其中引用的所有参考文献，通过引用以其整体并入本文。
[0750]
以下实施例是以举例说明的方式而非限制的方式提供的。
[0751]
实施例
[0752]
实施例1：工程化外来体的产生
[0753]
为了产生本文所述的外来体，使用了人胚胎肾(hek)细胞系(hek293sf)。然后用与目标剂(例如，抗原、佐剂或免疫调节剂)连接的支架x和/或支架y稳定转染细胞。参见图1a、图1b和图2。例如，通过用cd40l-gfp ptgfrn融合分子转染hek293sf细胞产生表达cd40l的外来体，所述融合分子以单体(pcb-518至pcb-526)或强制三聚体(pcb-607和pcb-527)的形式表达。三聚cd40l-gfp ptgfrn融合分子的实例如图1a所示。类似地，为了产生表达鸡卵清蛋白(ova)的外来体，将卵清蛋白作为与basp1的氨基酸1-10的融合物("basp1(1-10)-ova")在hek293sf细胞中稳定表达。
[0754]
转染后，使hek293sf细胞在化学成分确定的培养基中生长至高密度持续7天。收集条件细胞培养基，并在室温下以300
–
800x g离心5分钟，以除去细胞和大碎片。然后用1000u/l的补充培养基上清液，并在37℃水浴中孵育1小时。收集上清液，并在4℃下以16,000x g离心30分钟，以除去残留的细胞碎片和其它大的污染物。然后将上清液以133,900x g于4℃超速离心3小时，以沉淀出外来体。弃去上清液，并从管底部吸取任何残留的培养基。将沉淀重悬于200
–
1000μl pbs(-ca-mg)中。
[0755]
为了进一步富集外来体群体，通过密度梯度纯化(蔗糖或optiprep
tm
)处理沉淀。
[0756]
在4℃下将梯度以200,000x g在置于sw 41ti转子中的12ml ultra-clear(344059)管中旋转16小时，以分离外来体级分。
[0757]
从顶层轻轻取出外来体层，并将其在38.5ml的ultra-clear(344058)管中于约
32.5ml pbs中稀释，并在4℃下以133,900x g再次超速离心3小时，以沉淀纯化的外来体。将所得沉淀重悬于最小体积的pbs(约200μl)中，并在4℃下储存。
[0758]
对于optiprep
tm
梯度，在用于sw 41ti转子的12ml ultra-clear(344059)管中，用等体积的10％、30％和45％的optiprep
tm
制备3层无菌梯度。将沉淀加入optiprep
tm
梯度中，并在4℃下以200,000x g超速离心16小时，以分离外来体级分。然后从管的顶部约3ml轻轻收集外来体层。
[0759]
将外来体级分在38.5ml ultra-clear(344058)管中于约32ml pbs中稀释，并在4℃下以133,900x g超速离心3小时，以沉淀出纯化的外来体。然后将沉淀的外来体重悬浮于最小体积的pbs(约200μl)中，并在4℃下储存备用。
[0760]
实施例2：工程化外来体诱导抗原特异性t细胞反应的功效
[0761]
为了评估本文公开的外来体诱导免疫反应的能力，向小鼠静脉内或鼻内施用表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的工程外来体(“py-ova-exosting”)。施用后一周，分别通过流式细胞术和/或ifn-γelispot测定，通过静脉内或鼻内施用后脾和血液或肺和脾的酶促解离，评估对ova具有反应性的cd8 t细胞的频率。对照动物接受以下物质之一：(i)腹膜内注射的抗cd40抗体与可溶性ova蛋白(不是外来体的一部分)的组合(“ip acd40 ova”)；(ii)caim(ps)2difluor(rp/sp)(“cl656”；sting激动剂)与可溶性ova蛋白(不是外来体的一部分)的组合(“cl656 ova”)；(iii)仅过表达支架x并装载有sting激动剂的外来体与可溶性ova蛋白(ova不是外来体的一部分)的组合(“px-exosting ova”)；和(iv)仅表达ova-支架y融合蛋白(“py-ova”)的外来体。
[0762]
如图3a和图3b所示，在不同的治疗组当中，接受py-ova-exosting外来体的静脉内注射的动物在脾脏和pbmc中都具有最大数量的ova特异性cd8 t细胞。当鼻内施用不同的治疗方案时，观察到相似的结果。(关于流式细胞分析，参见图4a和图4b，关于elispot结果，参见图5a和图5b)。这些结果表明，本文公开的外来体(即，包含ova-支架y并装载有sting激动剂)可用于诱导针对目标抗原(例如，肿瘤或微生物抗原)的强劲免疫反应。
[0763]
实施例3：工程化外来体诱导免疫耐受的功效
[0764]
为了评估本文公开的外来体的耐受性潜力，将构建包含与自身免疫疾病相关的抗原(例如，β细胞蛋白(i型糖尿病)、髓少突胶质细胞糖蛋白(mog，多发性硬化)或滑液蛋白(类风湿性关节炎))的工程化外来体。如实施例2中一样，抗原将与本文所述的支架y蛋白连接。一些工程化外来体还将包含nfkb抑制类的免疫调节剂，诸如雷帕霉素和/或其衍生物。这些免疫调节剂将在与支架蛋白x(例如，本文所述的那些)连接的外来体中表达或被外源性装载到外来体中。
[0765]
将向迟发型超敏反应(dth)或实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)的实验动物模型施用上述工程化外来体。然后，将在动物中使用诸如流式细胞术和elispot测定等测定来评估对靶抗原的致耐受性/调节性t细胞反应。
[0766]
实施例4：工程化外来体与其它抗原佐剂组合在诱导免疫反应方面的比较
[0767]
将本文公开的工程化外来体(例如，参见实施例2)诱导ova特异性免疫反应(t细胞和b细胞两者)的能力与其它已知的抗原-佐剂组合进行比较。具体而言，将针对以下抗原-佐剂组合进行直接的头对头比较：利用可溶性ova(抗原)和单磷酰基脂质a(mpla)、水乳剂中的角鲨烯(addavax
tm
)、基于皂苷的疫苗不完全弗氏佐剂(ifa)和/或聚肌苷
酸-多聚胞苷酸(poly i:c)的疫苗接种。
[0768]
将分析以下终点：(i)诱导的t细胞亚群的分布，即单次施用后一周以及加强施用后一周的ova反应性cd8 t细胞和cd4 t细胞％(两次剂量，其间间隔2周)；(ii)t细胞效应子分析：同上，但检查cd4和cd8区室中t细胞反应的类型。时间点将与上述相同，并且分析将通过流式细胞术进行细胞内细胞因子染色(ics)；以及(iii)加强施用(第2剂)后一周的体液反应：这将是通过elisa或生物层干涉测量法(bio-layer interferometry)(bli)分析血清中的ova特异性抗体和抗体类别，以及基于流式细胞术分析b细胞对生物素化的完整ova抗原的反应性。
[0769]
实施例5：腔抗原的剂量反应分析
[0770]
将进行剂量反应分析，以确定本文公开的工程外来体产生有效免疫反应所需的最低抗原量。所述研究将比较装载有等量cl656的py-ova:py-gfp混合物(即，表达ova和gfp(两者均与支架y蛋白连接)的外来体)，以及随着py-gfp的量增加，py-ova的量减少。参见表10(下方)。
[0771]
表10.不同的待测外来体的组成
[0772][0773]
如实施例2所述，施用后大约一周，将处死动物，并使用流式细胞术和/或elispot测定法评估各种组织(例如脾、肺、血液)中的抗原特异性免疫反应。
[0774]
实施例6：施用途径对诱导免疫反应的影响
[0775]
数据将比较鼻内、静脉内、皮下、腹膜内和肌内施用后几种剂量的py-ova-exosting(参见实施例2)。终点分析将包括单次和两次(间隔两周)施用后一周的脾和循环(pbmc)ova反应性cd4 t细胞和cd8 t细胞。
[0776]
实施例7：粘膜归巢的诱导
[0777]
为了评估本文公开的外来体在粘膜组织内诱导免疫反应的能力，将对雌性小鼠鼻内施用py-ova-exosting(参见实施例2)。在一个或两个剂量后，将通过mpla和角鲨烯的阴道内施用的诱导攻击雌性小鼠。阴道内攻击后5天，将采集生殖道并评估ova特异性cd4 t细胞和cd8 t细胞的募集。
[0778]
实施例8：静脉内或鼻内接种后的组织驻留记忆t细胞反应
[0779]
为了更好地表征本文公开的工程化外来体诱导循环和/或组织驻留记忆t细胞的能力，将如实施例2所述向动物施用py-ova-exosting。施用后一周，将处理和分析肺(来自接受鼻内施用的动物)和/或肝(来自接受静脉内施用的动物)的循环和/或组织驻留记忆t细胞。
[0780]
实施例9：针对人疱疹病毒2(hsv2)的治疗性疫苗接种
[0781]
将用以下物质之一鼻内治疗hsv2感染的小鼠模型(其中动物患有生殖器hsv2感染)：(i)表达与支架y连接的hsv2抗原并装载有sting激动剂的外来体("py-hsv2-exosting"),(ii)表达与支架y连接的ova抗原并装载有sting激动剂的外来体("py-ova-exosting")，或acyclovir
tm
。py-hsv2-exosting构建体将表达两至三种不同的hsv2抗原。终
点将测量1个或2个(每两周一次)剂量的不同治疗方案后的病毒脱落和瘫痪情况。
[0782]
实施例10：针对人疱疹病毒2(hsv2)的预防性疫苗接种
[0783]
使用实施例9中描述的外来体构建体，给首次接触实验的小鼠鼻内接种一次或两次(每两周一次)疫苗，并在最终施用后一周用hsv2阴道内攻击所述小鼠。终点将包括测量攻击后整个三周内的病毒脱落和瘫痪情况。
[0784]
实施例11：针对荷有eg7-ova肿瘤的小鼠的治疗性疫苗接种
[0785]
将用eg7-ova肿瘤皮下接种小鼠。当肿瘤达到50mm3时，将用py-ova-exosting(参见实施例2)或适当的对照鼻内、静脉内或皮下接种小鼠。终点将是测量表示为肿瘤生长抑制(tgi)的肿瘤生长。
[0786]
实施例12：cd40l-px:py-ova-exosting与py-ova-exosting相比的疫苗接种
[0787]
将py-ova-exosting(参见实施例2)诱导免疫反应的能力直接与表达(i)与支架x连接的cd40l、(ii)与支架y连接的ova并(iii)装载有sting激动剂的外来体("cd40l-px:py-ova-exosting")的所述能力进行比较。向首次接触实验的动物施用所述外来体，然后如实施例2所述，在施用后大约一周，将在各种组织中评估ova特异性t细胞反应。
[0788]
实施例13：利用抗clec9a病毒(例如，外来体)的疫苗接种
[0789]
还将在动物模型中评估装载有sting激动剂并表达抗clec9a部分(“抗clec9a ev”)的表达ova的ev(例如，外来体)诱导免疫反应的能力。图6提供了提议的实验设计的示意图。动物将用以下物质之一进行治疗：(i)装载有sting激动剂并表达对照同种型抗体的表达ova的ev(例如，外来体)；(ii)仅表达对照同种型抗体的表达ova的ev(例如，外来体)；(iii)装载有sting激动剂并表达抗clec9a靶向部分的表达ova的ev(例如，外来体)；(iv)表达抗clec9a靶向部分但未装载有sting激动剂的表达ova的ev(例如，外来体)；和(v)单独表达ova的ev(例如，外来体)。将鼻内施用不同的治疗方案。然后，将处死一些动物，并在脾和肺中评估ova特异性t细胞反应。一些动物将在首次施用后大约14天接受ev(例如，外来体)的第二次施用。将在加强后进一步评估ova特异性t细胞反应。
[0790]
实施例14：利用抗ebv bzlf1 ev(例如，外来体)的疫苗接种
[0791]
将根据上述方法和实验设计(例如，用bzlf1代替上述抗原)在动物模型中评估装载有爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)bzlf1抗原的ev(例如，外来体)诱导免疫反应的能力。图8显示了ev(例如，外来体)的示意图，所述ev包含附接至ev膜的腔表面的bzlf1抗原。
[0792]
实施例15：工程化外来体诱导效应t细胞和记忆t细胞的功效(脾)
[0793]
为了进一步表征用本文公开的外来体免疫后观察到的t细胞反应(参见实施例2)，在小鼠中观察到外来体诱导效应t细胞和记忆t细胞的能力。简言之，给小鼠皮下施用表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的工程化外来体(“py-ova exovacc”)。对照动物接受以下物质之一：(i)可溶性ova(“ova”)、(ii)可溶性ova cl656(“ova sting”)、(iii)仅表达ova-支架y融合蛋白(“pyova”)的外来体、(iv)仅表达ova-支架y融合蛋白 可溶性cl656(即，sting激动剂未加载到外来体中)(“pyova sting”)的外来体和(v)可溶性ova 明矾佐剂(“ova 明矾”)。
[0794]
施用后两周，处死一些动物，并使用ifn-γelispot测定法评估脾中ova特异性t细胞(cd4 t细胞和cd4 t细胞两者)的频率。为了诱导ifn-γ的产生，在体外用对cd4 t细胞和cd8 t细胞特异的ova肽刺激脾细胞。用相同的治疗方案对剩余的动物进行加强(即，
再次免疫)。然后，在初始免疫后第28天(或增强后第14天)，处死动物，并使用ifn-γelispot测定法评估脾中ova特异性t细胞(cd4 t细胞和cd4 t细胞两者)的频率。
[0795]
如图9a和图9b所示，在单次皮下施用后，接受py-ova exovacc外来体的动物的脾脏中的ova特异性cd4 t细胞和cd8 t细胞的数量最多。在接受py-ova exovacc外来体的动物中，cd4 t细胞和cd8 t细胞数量的该增加在加强后进一步增加。
[0796]
上述数据与实施例2的结果一致，并进一步证明本文公开的外来体(例如，表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的工程化外来体)即使在皮下施用时，也可用于诱导针对目标抗原(例如，肿瘤或微生物抗原)的强健的效应t细胞和记忆t细胞。
[0797]
实施例16：工程化外来体诱导效应t细胞和记t细胞的功效(肺)
[0798]
为了评估来自实施例15的结果是否也在其它组织(例如粘膜组织)中观察到，通过鼻内施用向小鼠施用表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656("py-ova exovacc")的工程化外来体。在免疫后第7天，处死一些动物，并使用流式细胞术评估肺中ova特异性cd8 t细胞的频率。通过第二次施用py-ova exovacc来对剩下的小鼠进行增强。一周后(即，初始免疫后第14天)处死这些动物，并使用流式细胞术评估肺中ova特异性cd8 t细胞的频率。在这两个时间点，ova特异性cd8 t细胞被进一步分类为效应记忆(cd44 和cd62l-)t细胞或驻留记忆(cd44 、cd62l-和cd103 )t细胞。
[0799]
如图10所示，在单次鼻内施用py-ova exovacc后，在所处理的动物的肺中观察到强健的ova特异性效应记忆cd8 t细胞。在增强后，ova特异性cd8 t细胞的数量进一步增加，产生了强健的效应和记忆cd8 t细胞。
[0800]
为了评估本文公开的ev(例如，外来体)是否也能产生强健的驻留记忆cd4 t细胞，通过鼻内施用向小鼠施用以下物质之一：(i)可溶性ova(“ova”)、(ii)仅表达ova-支架y融合蛋白(“pyova”)的外来体、(iii)表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的外来体(“py-ova exovacc”)、(iv)可溶性ova 可溶性poly i:c(“ova poly i:c”)，以及(v)仅表达ova-支架y融合蛋白 可溶性poly i:c的外来体(“pyova poly i:c”)。在初始免疫后第7天，动物接受相同治疗的第二次施用。一周后(即，初始免疫后第14天)处死动物，并使用流式细胞术评估肺中ova特异性cd8 t细胞的频率。
[0801]
与上述结果一致，用py-ova exovacc处理的动物在肺中表现出强健的驻留记忆cd8 t细胞(图13a、图13b和图13c)。对于驻留记忆cd4 t细胞也观察到类似的结果。
[0802]
总的来说，上述数据进一步证明了本文公开的外来体(例如，表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的工程化外来体)诱导(包括在粘膜组织(例如，肺)中)强健的效应和记忆t细胞(cd8 和cd4 两者)的有效性。
[0803]
实施例17：表达抗clec9a的ev(例如，外来体)的向性分析
[0804]
除了上述实施例13之外，ev(例如，外来体)被工程化成表达与其表面上的支架x蛋白连接的抗clec9a抗体片段(“抗clec9a ev”)。如前面的实施例中一样，抗clec9a ev装载有sting激动剂cl656。
[0805]
向小鼠施用抗clec9a ev，并评估其细胞特异性向性。对照动物接受单独的pbs(“pbs”)或仅表达支架x蛋白的外来体(“prx ev”)。如图11a所示，脾内的常规树突状细胞1(“cdc1”)群体优先摄取抗clec9a ev。在所分析的另外的树突状细胞(即，常规dc2(“cdc 2”)和浆细胞样dc(“pdc”))当中，与对照外来体(prx ev)相比，抗clec9aev的摄取没有明显
差异。
[0806]
接下来，为了进一步评估抗clec9a ev对cdc1的增强向性的效果，用抗clec9a ev在体外刺激脾树突状细胞(从野生型小鼠中分离的)，并评估dc内的sting活性。将dc用不同浓度的抗clec9a ev(即，0.4nm、1nm或4nm)刺激。对照组中的dc用下列物质之一刺激：(i)可溶性sting激动剂(“游离sting”)、(ii)仅表达支架x蛋白(即，无抗clec9a抗体片段)并装载有sting激动剂(“prx-sting”)的ev(例如，外来体)和(iii)表达非相关抗体并装载有sting激动剂(“同种型-sting”)的ev(例如，外来体)。通过测量不同dc产生的il-12的量来评估sting活性。如图11b所示，用抗clec9a ev处理的分离的dc产生的il-12的量比其他的组(包括用prx-sting处理的dc)多得多。
[0807]
上述结果表明，表达抗clec9a靶向部分的ev(例如，外来体)可以优先靶向表达clec9a的细胞，诸如cdc1，并且这种增强的向性有助于增加树突状细胞的活化。如本公开所述，此类能力在疫苗接种的情况下是有用的。
[0808]
实施例18：施用途径对诱导免疫反应的影响
[0809]
除了上面提供的实施例6以外，还进一步评估了施用途径对本文公开的ev(例如，外来体)诱导免疫反应能力的影响。简言之，通过以下施用途径之一向小鼠施用了表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的工程化外来体(“py-ova exovacc”)(1μg ova)：(i)静脉内(“iv”)，(ii)鼻内(“in”)和(iii)皮下(“sq”)。作为比较，一些小鼠接受了商购可得的制剂(addavax
tm
,inviogen)中的可溶性ova(“subq av”)的皮下施用。免疫后第7天，处死所有动物，分离脾细胞，以及通过流式细胞术评估ova特异性效应记忆cd8 t细胞(cd44 和cd62l-)的频率。
[0810]
如图12a和图12b所示，无论施用途径如何，py-ova exovacc都能在动物体内诱导出强健的ova特异性效应记忆cd8 t细胞，尤其是在与使用商购可得的制剂递送的ova相比时。这些结果进一步证实了本文公开的ev(例如，外来体)的功效，并证明了无论施用途径如何，ev都可用于诱导强健的免疫反应。
[0811]
实施例19：py-ova exovacc ev(例如，外来体)的抗肿瘤作用
[0812]
除了上面提供的实施例11之外，在小鼠模型中评估了本文公开的ev(例如，外来体)诱导抗肿瘤免疫反应的能力。简言之，用以下物质之一处理小鼠：(i)经由鼻内施用(“exovacc(in)”)的表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的外来体(“py-ova exovacc”)、(ii)经由皮下施用("exovacc(sq)")的表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的外来体(py-ova exovacc)、(iii)经由鼻内施用的可溶性ova 可溶性poly i:c(“ova poly i:c(in)”)，和(iv)经由皮下施用的可溶性ova 可溶性poly i:c(“ova poly i:c(in)”)。参见图14a。未经处理或仅用pbs处理的动物用作对照。然后，在免疫后第7天，将eg7-ova肿瘤细胞皮下植入所有动物。然后，在至少30天的过程中监测动物的肿瘤体积和存活率。
[0813]
如图14b、图14c、图14d和图14f所示，未经处理或用ova poly i:c(鼻内和皮下施用)处理的动物未能控制肿瘤，并在肿瘤植入后约30天死于该疾病。然而，在接受exovacc施用的动物中，观察到抗肿瘤免疫反应的改善。对于exovacc(sq)组，25％的动物有效控制了肿瘤，并存活到实验结束(图14b和图14e)。对于exovacc(in)组，50％的动物对eg7-肿瘤细胞产生了有效的抗肿瘤免疫反应(图14b和图14g)。如图14h所示，抗肿瘤免疫反应的改善与
肿瘤生长速率的降低相关。在单独的独立实验中，来自exovacc(sq)组和exovacc(in)组的更大百分比的动物控制了肿瘤生长，并在整个实验持续时间期间存活(参见图14l、图14m和图14n)。
[0814]
上述结果表明，本文公开的ev(例如，外来体)可用作治疗某些癌症的疫苗。
[0815]
实施例20：鼻内施用后，py-ova exovacc ev(例如，外来体)在肠系膜淋巴结中诱导抗原特异性t细胞的能力
[0816]
为了进一步评估本文公开的ev(例如，外来体)诱导粘膜免疫反应的能力，在鼻内施用py-ova exovacc(即,表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的工程化外来体)后，评估肠系膜淋巴结(即，肠引流淋巴结)中抗原特异性t细胞的频率(参见图15a中的“组5”)。对照动物接受下列物质之一：(i)仅表达支架y的空(即，无ova抗原)外来体(“组1”)；(ii)可溶性ova(“组2”)；(iii)可溶性ova 可溶性sting激动剂(“组3”)；或(iv)仅表达ova-支架y融合蛋白的外来体(“组4”)。接种后第7天，处死动物，并用ifn-γelispot和/或流式细胞术评估ova特异性cd8 t细胞的频率。
[0817]
如图15b、图15c、图15e和图15f所示(并与早期结果一致
–
参见，例如实施例2)，与对照动物(例如，组1和组4)相比，接受py-ova exovacc的鼻内施用的动物在脾和肺中均具有明显更多的ova特异性cd4 t细胞和ova特异性cd8 t细胞。在肠系膜淋巴结中，在不同处理组之间对于cd4 t细胞未观察到显著差异(参见图15d，每个组中的左条块)。然而，在用py-ova exovacc处理的动物的肠系膜淋巴结中观察到ova特异性cd8 t细胞的数量显著增加(参见图15d，每个组中的右条块)。这些结果证实，当鼻内施用时，本文公开的ev(例如，外来体)(例如，包含ova-支架y并装载有sting激动剂)可用于诱导强健的粘膜免疫反应。
[0818]
实施例21：包含抗原和sting激动剂的支架x-工程化ev(例如，外来体)在诱导抗原特异性t细胞反应方面的功效
[0819]
为了进一步评估本文公开的ev(例如，外来体)诱导免疫反应的能力，产生了过表达支架x的工程化ev(例如，外来体)(“支架x-工程化ev”)(参见例如，实施例1)。使含有马来酰亚胺接头的cd8肽(lama4)和/或cd4肽(itgb1)与在工程化ev的表面上表达的支架x交联。cd8肽具有以下结构：(马来酰亚胺接头)-qkisffdgfevgf nfrtlqpngllfyyt(seq id no:379)。带下划线的氨基酸表示突变。粗体残基代表cd8 t细胞表位。cd4肽具有以下结构：(马来酰亚胺接头)-wfyftysvngyneaivhvvetpd(seq id no:380)。带下划线的氨基酸表示突变。cd4 t细胞表位未知。支架x-工程化ev还装载有sting激动剂(cl656)。然后如图16a所示，向小鼠施用支架x-工程化ev。简言之，所述动物接受了以下物质之一：(i)仅pbs(即，无ev)(组1)；(ii)仅表达cd8肽(lama4)的支架x工程化ev(组2)；(iii)仅表达cd4肽(itgb1)的支架x工程化ev(组3)；和(iv)表达cd4肽和cd8肽两者的支架x-工程化ev。以将导致动物接受相同量的sting激动剂的剂量，经由皮下施用向动物施用了支架x-工程化ev。每只动物总共接受两次剂量(剂量之间间隔一周)的相关治疗方案。第二次施用后第7天，处死动物，并使用ifn-γeli spot评估脾脏中抗原特异性cd4 t细胞和cd8 t细胞的频率。
[0820]
如图16b和图16c所示，分别在来自组2(即，接受仅表达cd8肽的支架x-工程化ev)和组3(即，接受仅表达cd4肽的支架x-工程化ev)的动物中检测到强健的itgb1特异性cd8 t细胞和lama4特异性cd4 t细胞。类似地，向动物施用表达cd4肽和cd8肽两者的支架x-工程化ev导致强抗原特异性cd8 t细胞和cd4 t细胞免疫反应。
[0821]
该结果进一步证实，本文公开的ev(例如，外来体)可用于诱导针对目标抗原(例如，肿瘤)的强健的免疫反应。所述结果还证明了本文公开的ev(例如，外来体)例如通过在ev上表达多种抗原来诱导针对多种抗原的免疫反应的能力。
[0822]
实施例22：包含抗原和cpg佐剂的支架x-工程化ev(例如，外来体)在诱导抗原特异性t细胞反应方面的功效
[0823]
为了进一步评估本文公开的ev(例如，外来体)的疫苗能力，再次产生过表达支架x的工程化ev(例如，外来体)(“支架x-工程化ev”)(参见例如，实施例1)。如实施例21所述，将含有马来酰亚胺接头的cd8肽(lama4)和/或cd4肽(itgb1)再次与在工程化ev的表面表达的支架x交联。在本实施例中，支架x-工程化ev还装载有cpg(即，tlr9激动剂)而不是sting激动剂。然后如图17a所示，向小鼠施用了支架x-工程化ev。简言之，所述动物接受了以下物质之一：(i)对照ev(即，仅表达支架x的ev)(“空prx exos”)(组1)；(ii)仅表达cd8肽(lama4)的支架x-工程化ev(“exolama4-cpg”)(组2)；和(iii)表达cd8肽(lama4)和cd4肽(itgb1)两者(“exoitgb1-lama 4-cpg”)的支架x-工程化ev(组3)。每只动物接受两次剂量(剂量之间间隔一周)的相关治疗方案。并且，在第二次施用后第7天，处死动物，并使用ifn-γelispot评估脾脏中抗原特异性cd4 t细胞和cd8 t细胞的频率。
[0824]
如图17b和图17c所示，用仅表达lama4的支架x-工程化ev(“exolama4-cpg”)处理动物，导致对lama4特异的强cd8 t细胞反应的诱导(参见图17c)但不导致对itgb1肽特异的强cd8 t细胞反应的诱导(参见图17b)。这一结果证明了支架x-工程化ev诱导的cd8 t细胞反应的特异性。并且，与实施例21中提供的结果一致，表达lama4和itgb1两者的支架x-工程化ev能够诱导针对这两种抗原的强健的t细胞反应。这些结果进一步表明，本文公开的ev(例如，外来体)可用于诱导针对多种抗原的免疫反应。
[0825]
实施例23：hpv抗原在表面工程化ev(例如，外来体)中的表达
[0826]
为了进一步评估在本公开的ev(例如，外来体)中表达不同抗原的能力，转染293sf细胞以表达hpv16或hpv18的e6和/或e7蛋白。简言之，用编码以下全长蛋白质之一的质粒转染细胞：(i)hpv16e6,(ii)hpv16 e7,(iii)hpv16 e6/e7,(iv)hpv18 e6,(v)hpv18 e7和(vi)hpv18 e6/e7。更换培养基后约72小时，收获细胞，并从每个转染组中制备裂解物。未转染的细胞用作阴性对照。然后，将约5μl的每种裂解物装载在page凝胶上，并用下列抗体进行印迹：(i)hpv16/18抗e6(abcam，目录号ab70)、(ii)hpv16抗e7(abcam，目录号1b30731)和(iii)hpv18抗e7(abcam，目录号ab100953)。
[0827]
图18a至图18f提供了结果。如所显示的，除了可能用编码hpv18 e7蛋白的质粒转染的细胞外，如通过蛋白质印迹所测量的，转染的细胞不能表达全长hpv16或hpv18蛋白。这一结果表明，至少全长hpv16 e6、hpv16和hpv18 e6不瞬时表达。
[0828]
为了解决上述问题，使用了分裂蛋白表达策略。简言之，将158个氨基酸长的hpv e6蛋白在中间的非结构区域处分成两半。这产生了两个肽片段：(i)n端ne6(1-88aa)和(ii)c端ce6(89-158aa)。编码ne6和ce6肽片段的经密码子优化的dna序列用于组装构建体，所述构建体分别表达在n端或c端与支架x(例如，ptgfrn)融合以及在c端与支架y融合的分裂hpv e6。产生以下质粒，其用于转染293sf细胞：(i)puc57-kan-aavs1hr-caggs-ptgfrn-flag-cohpv16ne6("pcb-2014")，(ii)puc57-kan-aavs1hr-caggs-ptgfrn-flag-cohpv16ce6("pcb-2015")，(iii)puc57-kan-aavs1hr-caggs-cohpv16ne6-flag-ptgfrn("pcb-2016")，
(iv)puc57-kan-aavs1hr-caggs-cohpv16ce6-flag-ptgfrn("pcb-2017")，(v)puc57-kan-aavs1hr-caggs-pry-flag-cohpv16ne6("pcb-2018")和(vi)puc57-kan-aavs1hr-caggs-pry-flag-cohpv16ce6("pcb-2019")。(参见下表11)。然后，通过蛋白质印迹(如上所述)并使用抗flag抗体来评估hpv16和hpv18的e6和e7蛋白的表达。
[0829]
表11.hpv质粒的描述
[0830][0831]
如图18g至图18l所示，通过采用分裂蛋白表达策略，每一种测试的hpv蛋白(即，hpv16 e6、hpv16 e7、hpv18 e6和hpv18 e7)都在瞬时和稳定细胞裂解物中表达。
[0832]
这些结果进一步证实了本文公开的ev(例如，外来体)可以被工程化成表达广泛的抗原，包括不同hpv蛋白。
[0833]
实施例24：包含抗clec9a靶向部分的支架x-工程化ev(例如，外来体)在诱导抗原特异性免疫反应方面的功效
[0834]
除了上述实施例13和17，在动物模型中评估了aclec9a-px-ova exovacc诱导抗原特异性免疫反应的能力。aclec9a-px-ova exovacc是装载了sting激动剂并经工程化表达以下物质的ev(例如，外来体)：(i)aclec9a-px(即，与支架x连接的抗clec9a抗体片段)和(ii)ova-py(即，与支架y连接的ova)。简言之，如图19a所示，小鼠接受了以下物质之一：(i)装载有sting激动剂并表达对照同种型抗体的表达ova的ev(例如，外来体)(“igg-px-ova exovacc”)(组1)，(ii)aclec9a-px-ova exovacc(组2)，和(iii)装载有sting激动剂(即，不表达支架x)的表达ova的ev(例如，外来体)("pyova exovacc")(组3)。一些动物接受了单次剂量，并一周后被处死。其它动物接受第二次剂量(第一剂后一周)，然后在第二次剂量后一周处死。从处死的动物中收获脾细胞，然后使用流式细胞术分析ova特异性cd8 t细胞。
[0835]
如图19b所示，在单次施用ev后，脾脏中ova特异性cd8 效应记忆t细胞的数量没有显著差异。然而，在第二次剂量后，在用aclec9a-px-ova exovacc处理的动物中，脾脏中ova特异性cd8 效应记忆t细胞的数量显著更高(参见图19c)。该结果强调了在设计用于治疗疾
病和病症的ev(例如，外来体)中表达靶向部分(例如，抗clec9a抗体片段)的益处。
[0836]
实施例25：工程化ev(例如，外来体)诱导抗原特异性抗体反应的功效
[0837]
为了确定本文公开的ev(例如，外来体)是否也能够诱导强健的体液免疫反应，在小鼠中观察到ev(例如，外来体)诱导抗原特异性抗体的能力。简言之，给小鼠鼻内施用表达ova-支架y并装载有sting激动剂cl656的工程化外来体(“py-ova exovacc”)。对照动物接受以下物质之一：(i)可溶性ova(“ova”)(鼻内)，(ii)可溶性ova cl656(“ova sting”)(鼻内)，(iii)仅表达ova-支架y融合蛋白(“pyova”)的外来体(鼻内)，(iv)仅表达ova-支架y融合蛋白 可溶性cl656的外来体(即，sting激动剂未装载到外来体中)(“pyova sting”)(鼻内)，以及(v)可溶性ova 明矾佐剂(“ova 明矾”)(皮下)(参见图20a)。对每个处理方案总共施用两次剂量(剂量之间间隔两周)。然后，在最后一次施用后两周，从动物中收集血清，并使用elisa测定来测定ova特异性igg1和iga抗体的量。
[0838]
如在图20a和图20b中所见，包含ova-支架y(即，抗原)和sting激动剂(即，佐剂)的ev(例如，外来体)能够在血清中诱导抗原特异性igg1和iga。该结果表明，本文公开的ev(例如，外来体)在施用后能够诱导抗原特异性细胞介导的和抗体介导的免疫反应。
[0839]
实施例26：包含lpa-1抑制剂的表面工程化ev(例如，外来体)
[0840]
如本文所述，本公开的ev(例如，外来体)可被工程化以在ev表面上表达lpa-1抑制剂。可用于本公开的lpa-1抑制剂的非限制性实例包括am152和am095。am152和am095的化学结构如图21所示。该图示出了含马来酰亚胺的试剂可以与am152的羧酸和/或氨基甲酸酯基团缀合。同样的方法可用于衍生am095，因为相同的反应性基团存在于am095中。
[0841]
可使用本文公开的方法将诸如am095和am152等lpa-1抑制剂与ev(例如，外来体)的表面缀合。结果将是在ev表面上包含多种抑制剂的ev(例如，外来体)。参见图22。
[0842]
图23示出了马来酰亚胺反应性基团可如何通过酸基团添加至am152的实例。所述实例显示马来酰亚胺基团是复合物的一部分，该复合物包含介于马来酰亚胺基团与羧酸反应性氯甲基苯基团之间的ala-val可裂解的接头。图24示出了可用于衍生am152的两种示例性试剂。顶部试剂包含(i)可与am152的羧酸基团反应的氯甲基苯基团和(ii)马来酰亚胺基团；并且介于它们之间的是可裂解的cit-val二肽和c5间隔子。底部试剂包含(i)可与am152的羧酸基团反应的氯甲基苯基团和(ii)马来酰亚胺基团，并且介于它们之间的是可裂解的ala-val二肽和c5间隔子。马来酰亚胺基团随后将用于将am152(或am095)例如直接或通过一个或多个间隔子或接头(例如，本文所公开的)间接与支架部分连接。
[0843]
图25示出了裂解缀合产物中的cit-val或ala-val二肽(例如，通过组织蛋白酶b)产生的产物。所述产物，即am152苯胺酯，可通过内源酯酶进一步加工，产生游离酸am152产物。
[0844]
图26示出了几种包含游离马来酰亚胺基团和不同间隔子组合的am152衍生物。其它衍生物如图27所示。
[0845]
图28示出了在保护羧酸基团后，可能使用用于衍生羧酸基团的同一试剂在其氨基甲酸酯基团处衍生am152。随后将所得产物去保护以释放羧酸基团。
[0846]
图29说明了其中具有马来酰亚胺基团的复合物通过接头附接至am152的氨基甲酸酯基团的实例。合适的接头包括本说明书中公开的任何接头。
[0847]
该实施例中公开的方法涉及产生包含游离马来酰亚胺反应性基团的am152或
am095衍生物，所述衍生物随后可经由一个或多个间隔子或接头直接或间接与支架部分反应。结果，am152或am095将附接至ev(例如，外来体)的外表面。
[0848]
然而，本发明也可通过首先例如用包含马来酰亚胺的双官能基团衍生锚定部分，然后使衍生的锚定部分(例如，具有游离氯甲基苯基团)与am152的羧酸或氨基甲酸酯基团反应来实施，如图30所示。
[0849]
在一些方面，将am152(或am095)与ev(例如，外来体)的表面缀合提高了未缀合的am152(或am095)的至少一种有益性质并且/或者降低了未缀合的am152或am095的至少一种有害性质(例如，毒性，诸如胆囊毒性和/或肝毒性)。在一些方面，将am152(或am095)与ev(例如，外来体)缀合提高了am512或am095(与游离am152或游离am095相比)在治疗纤维化疾病(例如，肺纤维化，诸如ipf)方面的功效。
[0850]
通过引用并入
[0851]
在本技术中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文件出于所有目的特此通过引用整体并入，其并入程度如同每个单独出版物、专利或专利申请或其它文件被单独地指示出于所有目的通过引用并入一般。
[0852]
等同物
[0853]
虽然已经示出和描述了各种具体方面，但上述说明不是限制性的。应当理解，在不脱离所述一项或多项发明的精神和范围的情况下，可进行各种改变。通过阅读本说明书，许多变化对于本领域技术人员来说将变得显而易见。