一种高效抑制幽门螺杆菌的牙膏及其制备方法和其应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效抑制幽门螺杆菌的牙膏及其制备方法和其应用。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(h.pylori)属于革兰氏阴性杆菌，其感染率高，可引起胃炎、胃溃疡甚至胃癌。仅有小部分被感染者会出现临床症状，而大部分无症状携带者常被忽视，间接导致了幽门螺杆菌在人群中广泛传播。因此，开发新的预防及治疗h.pylori感染的生物制品是十分必要的。
3.cn110507583a公开了一种防控幽门螺杆菌清新口气牙膏，包含水合硅石、纤维素胶、月桂醇硫酸酯钠、幽门螺杆菌型igy、辣木叶提取物、山梨(糖)醇、苯甲酸钠、糖精钠、薄荷脑、食用香精、纯净水等成分，可防控口腔幽门螺杆菌、去除口腔异味，同时对肝和胃具有一定的保护作用。而该申请中以幽门螺杆菌菌株作为免疫原制备igy抗体，由于幽门螺杆菌对生长条件要求十分苛刻，大规模培养存在难度，不利于igy抗体的大规模生产。且辣木主要在热带地区种植，辣木叶成本较高。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种高效抑制幽门螺杆菌的牙膏，活性成分包括蛋黄球蛋白粉、大麦嫩苗汁粉、桑叶汁粉、碳酸氢钠。
5.本发明的优选技术方案中，所述牙膏中还包括摩擦剂、保湿剂、粘合剂、洁净剂、甜味剂、香料、防腐剂、ph调节剂、水中的任一种或其组合。
6.本发明的优选技术方案中，所述摩擦剂选自碳酸钙、焦磷酸钙、磷酸氢钙、氢氧化铝、二氧化硅、硅酸盐、水合硅石中的任一种或其组合。
7.本发明的优选技术方案中，所述保湿剂选自山梨糖醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、聚乙醇中的任一种或其组合。
8.本发明的优选技术方案中，所述粘合剂选自羧甲基纤维素钠、果胶、羟乙基纤维素、黄原胶、瓜尔胶、角叉胶、海藻酸钠、纤维素胶、卡波姆中的任一种或其组合。
9.本发明的优选技术方案中，所述洁净剂选自月桂醇硫酸酯钠、2-酰氧基键磺酸钠、月桂酰肌氨酸钠、椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油酰甘氨酸钠、椰油酰甘氨酸钾中的任一种或其组合。
10.本发明的优选技术方案中，所述甜味剂选自甘油、环己胺磺酸钠、糖精钠中的任一种或其组合。
11.本发明的优选技术方案中，所述香料选自薄荷、留兰香、冬青油、茴香油中的任一种或其组合。
12.本发明的优选技术方案中，所述防腐剂选自苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯中的
一种或其组合。
13.本发明的优选技术方案中，所述ph调节剂选自焦磷酸四钠、焦磷酸二氢二钠、naoh、koh、盐酸、硫酸、氯酸、硝酸、氢溴酸、氢氟酸、磷酸、磺酸、苹果酸、富马酸、枸橼酸、羧酸、羟基酸、酮酸、醋酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、丙二酸、丁二酸、丙酮酸、谷氨酸、酒石酸、乳酸、衣康酸、抗坏血酸、延胡索酸、α-酮戊二酸、果酸中的任一种或其组合。
14.本发明的优选技术方案中，所述蛋黄球蛋白粉的制备方法包括：采用单表位抗原肽或树状表位肽免疫禽类动物，制得卵黄抗体。
15.本发明的优选技术方案中，所述单表位抗原肽包含knligdkans(seq id no：1)，lpalkenngtvn(seq id no：2)，qainpdnltgs(seq id no：3)，rsryselgnty(seq id no：4)中的任一种或其组合。
16.本发明的优选技术方案中，所述树状表位肽具有式i所示结构：
[0017][0018]
其中，x为碱性氨基酸，z为所述幽门螺杆菌单表位抗原肽。
[0019]
本发明的优选技术方案中，所述的碱性氨基酸选自精氨酸(r)、赖氨酸(k)、组氨酸(h)的任一种。
[0020]
本发明的优选技术方案中，所述禽类动物选自鸡、鸭、鹅、鸟中的任一种或其组合。
[0021]
本发明的优选技术方案中，所述方法包括如下步骤：s1：采用所述单表位抗原肽或树状表位肽免疫禽类动物，制得卵黄抗体；
[0022]
s2：卵黄抗体的提取及纯化。
[0023]
本发明的优选技术方案中，s1包括下述步骤：
[0024]
(1-1)选取雌性禽类动物，将所述单表位抗原肽或树状表位肽与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，以1ml/只的免疫剂量在动物体的胸肌及大腿根部进行多点注射；
[0025]
(1-2)每隔两周，采用所述单表位抗原肽或树状表位肽与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化后的免疫原加强免疫一次，免疫剂量为1ml/只，优选加强免疫至少3次；
[0026]
(1-3)末次加强免疫后2周收集蛋，优选收集蛋至少2个月。
[0027]
本发明的优选技术方案中，收集未免疫蛋作为阴性对照品。
[0028]
本发明的优选技术方案中，s2包括下述步骤：
[0029]
(2-1)取消毒完毕的蛋，收集卵黄并刺破，量取10ml蛋黄液，加10倍双蒸水稀释，混匀后，调ph4-5，-20℃过夜，室温解冻，4℃下12000rpm离心30min，将上清液用滤纸过滤除脂，收集上清液，加入硫酸铵，使其终浓度为20％，静置1h后，4℃下12000rpm离心15min，收集沉淀；
[0030]
(2-2)将沉淀溶于20ml 0.01m ph7.4的pbs中，加入硫酸铵，使其终浓度为14％，静置1h后，4℃下12000rpm离心15min，将收集的沉淀溶于2ml 0.01m ph7.4的pbs中；置于双蒸水中搅拌透析，1h后，更换透析液1次，透析过夜后，收集透析上清液，以0.22μm滤膜过滤除菌后，无菌ep管盛装，-20℃保存。
[0031]
本发明的优选技术方案中，更换透析液2-5次，优选为3-4次。
[0032]
本发明的优选技术方案中，所述大麦嫩苗汁粉的制备方法包括：将新鲜大麦苗清洗、沥干后，采用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，预冷冻温度-50-40℃，冷阱温度-45-30℃，升华温度10-30℃，真空度150-200pa；将冻干产物粉碎，过100目筛；称取适量样品置于锥形瓶中，加入95％(v/v)乙醇溶液进行浸提，料液比为20-40:1，用封口膜将锥形瓶密封并置于摇床中，37℃、100rpm条件下浸提60min；提取完成后将提取液于4℃下10000rpm离心10min，取上清，即得。
[0033]
本发明的优选技术方案中，所述桑叶汁粉的制备方法包括：将新鲜桑叶清洗、干燥后，剪碎，按料液比1:20-50加入纯净水，混合均匀，进行超声处理，超声功率300-800w，超声时间10-60min；超声处理后加入等体积无水乙醇进行浸提，在50℃、180rpm条件下浸提120min；提取液于4℃下12000rpm离心8min，取上清，即得。
[0034]
本发明的优选技术方案中，所述蛋黄球蛋白粉的重量比为1-10％，优选3-5％。
[0035]
本发明的优选技术方案中，所述大麦嫩苗汁粉的重量比为1-10％，优选3-5％。
[0036]
本发明的优选技术方案中，所述桑叶汁粉的重量比为1-10％，优选3-5％。
[0037]
本发明的优选技术方案中，所述摩擦剂的重量比为10-60％，优选10-40％，更优选10-20％。
[0038]
本发明的优选技术方案中，所述保湿剂的重量比为20-40％，优选20-30％。
[0039]
本发明的优选技术方案中，所述粘合剂的重量比为1-5％，优选为1-2％。
[0040]
本发明的优选技术方案中，所述洁净剂占比为1-5％，优选为2-3％。
[0041]
本发明的优选技术方案中，所述甜味剂占比0.1-2％，优选为0.5-1％。
[0042]
本发明的优选技术方案中，所述香料占比0.1-2％，优选为0.1-1％。
[0043]
本发明的优选技术方案中，所述防腐剂占比0.1-2％，优选为0.1-1％。
[0044]
本发明的优选技术方案中，所述ph调节剂占比0.1-2％，优选为0.5-1％。
[0045]
本发明的优选技术方案中，所述牙膏的组成包括：按重量百分比计，山梨糖醇10-20％，碳酸钙10-20％，聚乙醇10-20％，碳酸氢钠3-5％，月桂醇硫酸酯钠2-3％，蛋黄球蛋白粉3-5％，大麦嫩苗汁粉3-5％，桑叶汁粉3-5％，香料0.1-1％，防腐剂0.1-1％，水45-55％。
[0046]
本发明的优选技术方案中，所述牙膏的组成包括：按重量百分比计，山梨糖醇10％，碳酸钙10％，聚乙醇10％，碳酸氢钠5％，月桂醇硫酸酯钠3％，蛋黄球蛋白粉5％，大麦嫩苗汁粉3.8％，桑叶汁粉3％，香料0.1％，防腐剂0.1％，水50％。
[0047]
本发明的优选技术方案中，所述牙膏的组成包括：按重量百分比计，山梨糖醇
13％，碳酸钙12％，聚乙醇10％，碳酸氢钠3％，月桂醇硫酸酯钠2％，蛋黄球蛋白粉3.5％，大麦嫩苗汁粉3％，桑叶汁粉3％，香料0.3％，防腐剂0.2％，水50％。
[0048]
本发明的优选技术方案中，所述牙膏的组成包括：按重量百分比计，山梨糖醇15％，碳酸钙10％，聚乙醇10％，碳酸氢钠5％，月桂醇硫酸酯钠2％，蛋黄球蛋白粉4％，大麦嫩苗汁粉4％，桑叶汁粉4％，香料0.5％，防腐剂0.5％，水45％。
[0049]
本发明的牙膏采用常规的牙膏制备方法制备，在搅拌条件下将各种原料加入到去离子水中，制得牙膏膏体；将膏体置于制膏罐中，抽真空，灌装，即得。
[0050]
本发明的另一目的在于提供所述牙膏在预防和/或治疗幽门螺杆菌感染相关疾病中的应用。
[0051]
本发明的优选技术方案中，所述疾病选自急性胃炎、慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、萎缩性胃炎、胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤中的任一种或其组合。
[0052]
本发明的优选技术方案中，所述消化性溃疡选自胃溃疡、十二指肠溃疡、食管溃疡、胃空肠吻合口溃疡、胃粘膜meckel憩室溃疡中的任一种或其组合。
[0053]
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
[0054]
1.在牙膏中添加了幽门螺杆菌特异性卵黄蛋白及天然植物提取物，在清洁牙齿的同时具有更强的抗菌作用。
[0055]
2.以幽门螺杆菌高免疫原性抗原肽作为免疫原制备igy抗体，获得的抗体特异性更高，且有利于igy抗体的大规模生产。
[0056]
3.采用了成本更加低廉的桑叶提取物，不仅具有优异的抗菌功效，也能够节约生产成本，利于产业推广。
具体实施方式
[0057]
以下结合具体实施方案对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0058]
实施例1蛋黄球蛋白粉的制备
[0059]
选取20周龄母鸡，将seq id no：2所示的单表位抗原肽分别与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，以1ml/只的剂量在母鸡的胸肌及大腿根部进行多点注射；每隔两周，采用所述单表位抗原肽或树状表位肽与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化后的免疫原加强免疫一次，免疫剂量1ml/只，共加强免疫3次；末次加强免疫后2周收集鸡蛋，同时收集未免疫蛋作为阴性对照品。
[0060]
取消毒完毕的鸡蛋，收集卵黄并刺破，量取10ml蛋黄液，加10倍双蒸水稀释，混匀后，调ph值为4-5，-20℃过夜，室温解冻，4℃下12000rpm离心30min，将上清液用滤纸过滤除脂，收集上清液，加入硫酸铵，使其终浓度为20％，静置1h后，4℃下12000rpm离心15min，收集沉淀；将沉淀溶于20ml 0.01m ph7.4的pbs中，再加入硫酸铵，使其终浓度为14％，静置1h后，4℃下12000rpm离心15min，将收集的沉淀溶于2ml 0.01m ph7.4的pbs中；置于双蒸水中搅拌透析，1h后更换透析液1次，共4-5次，透析过夜后，收集透析液，以0.22μm滤膜过滤除菌后，无菌ep管盛装，-20℃保存。采用elisa法测定所获得的卵黄抗体的效价，为1:1024。
[0061]
实施例2大麦嫩苗汁粉的制备
[0062]
将新鲜大麦苗清洗、沥干后，采用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，预冷冻温度-45
℃，冷阱温度-37℃，升华温度25℃，真空度170pa；将冻干产物粉碎，过100目筛；称取5.0g样品置于250ml锥形瓶中，加入95％(v/v)乙醇溶液进行浸提，料液比为25:1，用封口膜将锥形瓶密封并置于摇床中，37℃、100rpm条件下浸提60min；提取完成后将提取液于4℃下10000rpm离心10min，取上清，即得。
[0063]
实施例3桑叶汁粉的制备
[0064]
将新鲜桑叶清洗、干燥后，剪碎，按料液比1:30加入纯净水，混合均匀，进行超声处理，超声功率500w，超声时间20-30min；超声处理后加入等体积无水乙醇进行浸提，在50℃、180rpm条件下浸提120min；提取液于4℃下12000rpm离心8min，取上清，即得。
[0065]
实施例4牙膏抑菌效果验证
[0066]
按本领域的常规方法制备下述牙膏1-3。
[0067]
牙膏1：按重量百分比计，山梨糖醇10％，碳酸钙10％，聚乙醇10％，碳酸氢钠5％，月桂醇硫酸酯钠3％，蛋黄球蛋白粉5％，大麦嫩苗汁粉3.8％，桑叶汁粉3％，香料0.1％，防腐剂0.1％，水50％。
[0068]
牙膏2：按重量百分比计，山梨糖醇13％，碳酸钙12％，聚乙醇10％，碳酸氢钠3％，月桂醇硫酸酯钠2％，蛋黄球蛋白粉3.5％，大麦嫩苗汁粉3％，桑叶汁粉3％，香料0.3％，防腐剂0.2％，水50％。
[0069]
牙膏3：按重量百分比计，山梨糖醇15％，碳酸钙10％，聚乙醇10％，碳酸氢钠5％，月桂醇硫酸酯钠2％，蛋黄球蛋白粉4％，大麦嫩苗汁粉4％，桑叶汁粉4％，香料0.5％，防腐剂0.5％，水45％。
[0070]
(1)幽门螺杆菌抑菌试验
[0071]
将幽门螺杆菌(h.pylori)ss1菌株接种于装有bhi培养液的试管中，在三气培养箱(o
2 5％，co
2 15％，n
2 85％)中，37℃培养72h，菌落浓度达到109个/ml后，分别取0.5g牙膏1-3加入到试管中，混匀后孵育1h后，将菌液涂布在bhi琼脂培养基上，上述条件下培养48h进行菌落计数，并计算抑制率。
[0072]
以0.5g无菌水代替牙膏用作空白对照，结果见表1。
[0073]
表1
[0074]
组别菌体抑制率(％)空白组0牙膏190％牙膏284％牙膏386％
[0075]
(2)大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌试验
[0076]
依照qb 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》中7.3记载的方法，对上述牙膏对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制效果进行了检测。具体方法如下：
[0077]
1)采用0.05m pbs缓冲液，配制菌体浓度1
×
10
4-9
×
104cfu/ml的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌菌液；
[0078]
2)采用无菌水将牙膏1-3稀释成0.1g/ml的溶液，作为样品溶液；
[0079]
3)吸取样品溶液5ml放入灭菌试管中，20℃恒温5min；
[0080]
4)吸取步骤2)制备的菌液各0.1ml加入到含5ml样品的试管中，迅速混匀，并立即计时；
[0081]
5)作用5min后，取步骤4)的菌液与样品混合液0.5ml，加入到含4.5ml经灭菌的pbs试管中，充分混匀；
[0082]
6)放置10min后，吸取样液1ml，置于灭菌平板内，每个样液接种两个灭菌平皿，用凉至40℃-45℃的营养琼脂培养基(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)或沙氏琼脂培养基(白色念珠菌)15ml作倾注，转动平皿，使其充分混匀，琼脂凝固后翻转平皿，37℃培养48h(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)或72h(白色念珠菌)后，做活菌菌落计数；
[0083]
7)以pbs代替试验样品，同时按以上步骤操作，作为对照样品；
[0084]
8)试验重复3次，求其平均值。
[0085]
抑菌率按以下公式计算：
[0086]
式中，i为对照样品平均菌落数，ii为试验样品平均菌落数。
[0087]
表2
[0088][0089]
以上所述仅为本发明较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。