维生素B12在制备抗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的用途的制作方法

维生素b12在制备抗新型冠状病毒sars-cov-2药物中的用途
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，涉及维生素b12在制药中的新用途，具体涉及维生素b12在制备抗新型冠状病毒sars-cov-2药物中的应用。


背景技术：

2.现有技术公开了新型冠状病毒病(corona virus disease 2019，covid-19)，又称为新型冠状病毒肺炎，是一种严重的急性呼吸系统传染病。该病感染性强，致死率高。引起新型冠状病毒病的病原体是新型冠状病毒，2020年1月2日被世界卫生组织命名为2019-ncov，2020年2月11日被国际病毒分类委员会命名为sars-cov-2。sars-cov-2和已知的严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)同属于冠状病毒科的β冠状病毒属。
3.研究显示，人感染了sars-cov-2后常见症状有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于sars-cov-2所致疾病尚无特异治疗方法。有研究表明瑞德西韦和羟氯喹在体外研究中对sars-cov-2的复制有明显的抑制效果，但临床研究发现，羟氯喹未显现明显的治疗效果，而瑞德西韦曾有治愈1个病例的报道，另外，瑞德西韦在同情用药情况下治疗53例重症患者的试验结果显示，68％的重症患者在使用瑞德西韦后症状有所缓解，但死亡率仍有13％，且60％的患者报告了副作用，且来自同情用药的数据存在很大的局限性。在中国进行的随机对照的瑞德西韦临床试验结果未见对改善重症率和死亡率有明显帮助。随着sars-cov-2在全球范围内广泛传播，寻找新的针对sars-cov-2的药物十分必要。
4.维生素b12，中文别名：钴胺素，英文名称：vitamin b12，cyanocobalamin。维生素b12是一种含有3价钴的多环系化合物，也是唯一含金属元素的维生素。人体主要从膳食中获得维生素b12，其来源主要为动物性食品，例如动物内脏、肉类、蛋类，人体肠道细菌也可以合成一部分；患维生素b12缺乏症的患者可通过口服维生素b12进行补充。在医疗方面，维生素b12主要用于预防和治疗多种原因引起的贫血，以及用于补充因消耗性疾病、甲状腺机能亢进、妊娠、哺乳等造成的维生素b12需求增加，此外还用于神经炎、神经痛等的非特异性治疗；尚未见到维生素b12在抑制冠状病毒特别是新型冠状病毒感染和复制中的应用。
5.基于现有技术的现状，本技术的发明人拟提供维生素b12在制药中的新用途，具体涉及维生素b12在制备抗新型冠状病毒sars-cov-2药物中的应用。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于，基于现有相关技术的上述问题和/或其他问题，提供维生素b12在制药中的新用途，具体涉及维生素b12在制备抗新型冠状病毒sars-cov-2药物中的应用。
7.本发明主要通过体外实验评价了维生素b12抗sars-cov-2的活性。体外实验主要包括维生素b12抑制sars-cov-2感染的测定、药物的细胞毒性的测定等。本发明旨在解决目
前亟需有效的抗sars-cov-2药物的问题，提供了维生素b12在抗sars-cov-2药物中的新用途。
8.本发明的技术方案为：
9.本发明提供了一种维生素b12抗sars-cov-2的新用途。
10.另一方面，本发明提供了一种包含维生素b12的抗新型冠状病毒药物。
11.本发明中涉及的维生素b12，其英文名称为cyanocobalamin，分子式为c
63h88
con
14o14
p，具体分子结构如图1所示。
12.基于现有技术中在医疗方面，维生素b12主要用于预防和治疗维生素b12缺乏症、多种原因引起的贫血，以及用于补充因消耗性疾病、甲状腺机能亢进、妊娠、哺乳等造成的维生素b12需求增加，此外还用于神经炎、神经痛等的非特异性治疗，本发明经实验证实，维生素b12与抗sars-cov-2药物的具有关联性。
13.本发明的一个具体实施方案中提供了维生素b12在制备抗sars-cov-2药物中的应用。
14.在本发明的一个优选实施方案中，维生素b12用于制备抗sars-cov-2药物和治疗因抗sars-cov-2引起的新型冠状病毒病药物。
15.本发明提供了“维生素b12”在治疗新型冠状病毒病的新用途，本领域技术人员在获知该启示的基础上，可进一步开发出以维生素b12为药物前体的其他抗新冠病毒病的新药，以及维生素b12与药学上可接受载体的组合物等。
16.本发明具有以下有益效果：
17.本发明是对维生素b12提供一种作为抗sars-cov-2药物的新用途，实验表明，维生素b12在体外培养的vero-e6(非洲绿猴肾细胞)上能抑制sars-cov-2的感染。
附图说明
18.图1为维生素b12的分子结构式；
19.图2为通过实时定量pcr(qrt-pcr)方法检测vero-e6细胞上清病毒拷贝数验证维生素b12对sars-cov-2的感染的抑制作用；
20.图3为不同浓度的维生素b12对vero-e6细胞的毒性作用。
具体实施方式
21.本发明的发明人在抗sars-cov-2药物筛选的过程中，发现已知化学物质“维生素b12”对sars-cov-2在vero-e6细胞上的感染有明显抑制作用，可以应用于制备抗sars-cov-2药物和治疗sars-cov-2引起的新型冠状病毒病。
22.关于维生素b12，其英文名称为cyanocobalamin，分子式为c
63h88
con
14o14
p，具体分子结构如图1所示。
23.本发明的一个具体实施方案中提供了维生素b12在制备抗sars-cov-2药物中的应用。
24.在本发明的一个优选实施方案中，维生素b12用于制备抗sars-cov-2药物和治疗因抗sars-cov-2引起的新型冠状病毒病药物。
25.以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方
式。
26.除非另有描述，本发明的实施将采用细胞生物学等常规技术，这些均是本领域技术人员所熟知的。这些技术在诸如brucealberts《细胞分子生物学》第5版(2002)等工具书中均有完整的描述，或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
27.实施例1
28.实时定量pcr(qrt-pcr)方法检测vero-e6细胞上清病毒拷贝数验证维生素b12对sars-cov-2的感染的抑制作用：
29.1.在96孔板中接种vero-e6细胞悬液(4
×
104个/孔),将培养板放在培养箱中预培养12小时，细胞贴壁生长；
30.2.加入相应浓度的维生素b12提前处理1小时，溶剂对照加入dmso，阴性对照不加药物；
31.3.之后除阴性对照之外的每孔加入200pfu sars-cov-2病毒(genbank:mt121215.1)，感染12小时后，pbs洗两次，加入新的含维生素b12的培养基，37℃培养48小时后显微镜观察细胞病变。
32.4. 48小时后，收集细胞上清进行rna提取。
33.rna抽提
34.1.细胞上清100μl加入到300μltrizol裂解液中，充分混匀裂解；
35.2.加入200μl氯仿剧烈震荡，静置2-3分钟后，4℃，12000g离心15分钟；
36.3.吸取上清，加入500μl异丙醇，静置10分钟后，4℃，12000g离心10分钟；
37.4.加入1ml 75％的乙醇洗涤rna沉淀；4℃，7500g离心5分钟；
38.5.弃去75％乙醇，干燥后加入20-50μl水溶解rna沉淀；
39.rna逆转录
40.rna逆转录采用天根fastking一步法合成cdna(tiangen,kr118)。20μl反应体系中加入4μl 5
×
fastking-rt supermix，20-2μg rna，42℃反应15分钟后，95℃反应3分钟。
41.实时定量pcr(qrt-pcr)
42.实时定量pcr采用天根sybr green i嵌合荧光法进行(tiangen,fp205)。20μl反应体系中加入10μl 2
×
superreal premix plus，引物(10μm)各1μl，模板cdna 1μl，使用水补齐至20μl。反应条件如下：预变性：95℃15分钟；扩增40个循环：94℃10秒，55℃20秒；72℃20秒；进行熔解曲线分析。扩增引物采用针对sars-cov-2n蛋白基因的特异性引物：上游引物：5
’-
ggggaacttctcctgctagaat-3’；下游引物：5
’-
cagacattttgctctcaagctg-3’。
43.结果如图2所示，随着维生素b12药物浓度的增加，感染sars-cov-2的vero-e6细胞上清中病毒rna水平明显降低，半数有效浓度(median effective concentration；ec50)为1.71μm，说明维生素b12对sars-cov-2的感染有明显的抑制作用。
44.实施例2
45.检测维生素b12对vero-e6细胞的毒性作用：
46.1.在96孔板中接种vero-e6细胞悬液(1
×
104个/孔)，将培养板放在培养箱中培养12小时；
47.2.向培养孔加入不同浓度的待测药物，对照组为溶剂dmso；
48.3. 48小时后检测药物对细胞增殖的影响。使用同仁cck-8终点法试剂盒(ck04)。
弃掉孔内多余培养基，每孔加入100μl含有10％cck8溶液的无血清培养基；
49.4.将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
50.5.随后使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
51.实验结果如图3所示，
52.维生素b12在作用浓度320μm以下，对vero-e6细胞没有细胞毒性；其半数细胞毒性浓度(cc50)高于640μm。
53.综上所述，本发明的实验结果显示了维生素b12可以抑制sars-cov-2对vero-e6细胞的感染；经低浓度维生素b12的处理后，sars-cov-2rna水平明显下降，为维生素b12的应用提供了抗病毒新应用；并由此可开发维生素b12在预防和治疗sars-cov-2感染的新功能，为新型冠状病毒病的新药研发提供了新的思路和方法。
54.应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
55.上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。