马拉色菌的检测组合物、试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种马拉色菌的检测组合物、试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.马拉色菌相关疾病（themalasseziagenusinskinandsystemicdiseases）是一组由常见真菌感染引起的疾病，如：花斑糠疹（pityriasisversicolor）、马拉色菌毛囊炎（malasseziafolliculitis）、脂溢性皮炎（seborrheicdermatitis）、特应性皮炎（atopicdermatitis）、银屑病（psoriasis）等均与马拉色菌有着密切关联。上述疾病不仅仅危害各年龄层人群的身心健康，在各级医院中易出现误诊，为患者、社会及国家医保带来巨大的经济负担。以特应性皮炎、银屑病为例，据美国国家疾病控制中心公布数据，特应性皮炎平均自然人群患病率为10%，仅2015年美国特应性皮炎诊治成本保守估计为52.97亿美元。银屑病是一种常见慢性皮肤病，自然人群患病率约为3%，约有740万成年人患有银屑病，该疾病每年诊治费用支出估计为352亿美元。因此，马拉色菌相关疾病的防控关系着国家的公共卫生安全，早期快速、精准鉴定马拉色菌是及时诊断治疗马拉色菌感染疾病的关键。
3.目前真菌感染性疾病的诊断主要依赖于对致病病原体的实验室检验，传统实验室诊断方法有：真菌显微镜检（koh法、荧光染色法）、真菌分离培养、组织病理检查。其中，真菌分离培养及组织病理检查作为诊断真菌感染性疾病的金标准，同样适用于马拉色菌感染，但真菌分离培养往往有着鉴定周期长、阳性率低及形态学鉴定难度高等缺点；因此，如何实现更加快速、简便、准确的检测，是致病病原体检测的未来发展方向。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一种马拉色菌的检测组合物、试剂盒及其检测方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
5.本发明的第一方面在于提供了crrna。所述crrna包括靠近5’端的锚定序列片段和靠近3’端的向导序列片段，所述向导序列片段的核苷酸序列如表1所示：表1crrna的向导序列
所述向导序列片段与马拉色菌的its序列特异性结合，能够准确实现糠秕马拉色菌（malasseziafurfur）、钝形马拉色菌(malasseziaobtusa)、球形马拉色菌（malasseziaglobosa）、合轴马拉色菌（malasseziasympodialis）、厚皮马拉色菌（malasseziapachydermatis）这五种不同种类的常见马拉色菌的识别鉴定。
6.进一步，所述锚定序列片段的核苷酸序列为5
’‑
uaauuucuacuaaguguagau-3’（seqidno.11）。即具体的crrna的序列如表2所示：表2crrna的序列
端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
9.进一步，所述荧光报告基团选自fam、vic、hex、rox、joe、cy3、cy5中的一种；所述荧光淬灭基团选自tamra、bhq-1、bhq-2、bhq-3中的一种。
10.进一步，所述crispr/cas检测体系还包括其他所需的试剂成分，如neb buffer。
11.进一步，所述试剂盒还包括rpa（recombinase polymerase amplification，重组酶聚合酶扩增）扩增体系，包括上游引物和下游引物， 上游引物：5
’‑
gcagaattccgtgaatcatcgaatctttgaac-3’（seq id no.27）； 下游引物：5
’‑
acacacagcaaatgacgtatcatgccatgc-3’（seq id no.28）。所述引物对用于特异性扩增马拉色菌的its序列。引入rpa扩增体系能够无需特设设备地在常温下完成样本的扩增，使得crispr/cas检测体系的灵敏度大幅提升。
12.进一步，所述rpa扩增体系还包括其他所需的试剂成分，如rpa酶预混液、激活剂、ddh2o等，所述rpa酶预混液包括磷酸肌酸、肌酸激酶、dntps、atp、dtt、醋酸钾、重组酶uvsx、重组酶uvsy、单链结合蛋白、bsu聚合酶。
13.进一步，所述rpa扩增体系的反应温度为37~42℃。经过15~20min的rpa扩增，能够富集样本中马拉色菌的its序列，然后直接加入所述crispr/cas检测体系的各组分进行检测反应，即可利用荧光检测设备读取检测信号。所述荧光检测设备可以是实时荧光定量pcr仪或者酶标仪。
14.具体的试剂盒使用方法包括以下步骤：（1）扩增：以待检测样本中提取纯化得到的dna作为模板进行rpa扩增，所述rpa扩增体系如下：rpa酶预混液20μl、上游引物(10μm)和下游引物（10μm）各2.5μl、待检测样本 1μl、激活剂2μl以及ddh2o22μl。反应温度37℃，反应时长20min。
15.（2）检测：取扩增产物，加入相应的crrna、信号报告探针、cas蛋白进行crispr反应检测，利用荧光检测设备读取检测信号。
16.（3）结果判读：可以利用实时荧光pcr仪或酶标仪，进行荧光信号读取。当使用实时荧光pcr仪进行荧光检测时，若为阳性反应，则荧光信号显著增强，超过阈值线；若为阴性反应，则荧光信号无显著增强，低于阈值线。当使用酶标仪进行荧光检测时，设置激发波长为485nm，发射波长为520nm，若荧光信号值高于阴性信号值2倍时即判定为阳性。
17.前述的crrna、引物对或试剂盒可以应用于非疾病诊断目的马拉色菌种属鉴别。
18.本发明包括以下有益效果：本发明所提供的马拉色菌检测引物组及试剂盒，结合了rpa高效扩增与crispr/cas检测技术的特异靶向性优势，具有扩增效率高、特异性强、操作简单等特点，与念珠菌、霉菌、孢子丝菌等其他常见致病性真菌及人类基因组dna均无交叉反应。本发明提供的试剂盒所有检测步骤不依赖温度变化、无需昂贵pcr仪或复杂的变温条件，因此反应速度更快、成本更低。本发明提供的试剂盒可直接用于检测临床病原性真菌样本，无需培养，满足临床早期快速精准诊断需求，同时有助于快速鉴定常规形态学或组织病理学难以鉴别的菌株。
附图说明
19.图1是实施例1中测试rpa扩增引物效率的电泳图；图2是实施例2中测试crrna检测效率的荧光信号柱状图；
图3是实施例3中鉴别不同种属马拉色菌的荧光信号曲线图；图4是实施例4中特异性测试的荧光信号曲线图；图5是实施例6中临床检测的荧光信号曲线图，图中标号1为待测样本的荧光信号曲线，标号2为阴性对照的荧光信号曲线；图6是实施例6中临床检测的样本培养镜检图。
具体实施方式
20.下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.实施例1，rpa扩增体系的引物设计与测试从embl-ebi、ncbi、ddbj等公共数据库收集马拉色菌的its序列、β-tubulin基因序列、翻译延伸因子（translationelongationfactor，tef）、肌动蛋白(actin)基因、线粒体细胞色素b基因等分子标记序列，最终筛选出种属特异性较好的its区域序列作为具有种属特异性的马拉色菌属的检测靶标序列。
22.针对上述马拉色菌检测靶标序列设计用于rpa的扩增引物。由于现有技术缺乏有效的rpa扩增引物设计软件，且引物对的扩增效果难以提前预估，因此需要分别设计多条上、下游引物，进行不同组合的配对筛选，候选的引物如表3所示：表3rpa引物序列
具体地，标准待检模板采用大肠杆菌工程菌携带的插入有糠秕马拉色菌its基因序列的质粒，该质粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其浓度为10cobies/μl。rpa扩增体系的扩增流程按照rpa基础型恒温扩增试剂盒的操作说明书进行。
23.rpa扩增体系为50μl：其中rpa酶预混液20μl、浓度为10μm的上游引物和浓度为10μm的下游引物各2.5μl、标准待检模板 1μl、乙酸镁激活剂2μl以及ddh2o 22μl。上述rpa酶预混液中含有：磷酸肌酸、肌酸激酶、dntps、atp、dtt、醋酸钾、重组酶uvsx、uvsy、单链结合蛋白、bsu聚合酶。将rpa扩增体系加入pcr管中后短暂离心，迅速放入恒温孵育系统进行恒温扩增反应，设置反应条件为：37~42℃，15-20min。
24.反应结束后，将每个反应管内加入体积比为1:1的酚/氯仿混合液50μl，充分震荡均匀，12000rpm离心1min，吸取10μl上清进行琼脂糖凝胶电泳检测。
25.经过实验测试验证，36组rpa恒温扩增引物对中有相当一部分效果不佳得不到扩增产物，部分效果尚可、能够得到扩增产物的引物组合有6对，具体为f1-r3、f2-r2、f2-r3、f4-r6、f6-r1、f6-r2。进一步地，对初筛的6组引物对的扩增效率进行平行比较，得出结果如图1所示，其中引物对组合f6-r1扩增得到的产物条带最为明亮，说明扩增效率比较高，确定上游引物选用f6（seq id no.27）、下游引物选用r1（seq id no.28）为优选的扩增引物对。
26.实施例2， crispr/cas检测体系的建立从马拉色菌的its区域挑选种间多变区，以包含cas12a蛋白识别序列的区域为靶标，设计长度范围为20-24bp、与靶标同源的单链crrna，所述crrna如seq id no.12至seq id no.21所示。
27.将crrna与cas12a蛋白按照2:3摩尔比例置于2
×
neb buffer中孵育10分钟，孵育温度为25℃中，以助于cas12a与crrna结合形成复合物。再在检测体系中加入rpa扩增产物、信号报告探针及检测体系的其余试剂，于37℃条件下反应30min，通过实时荧光pcr仪进行实时读取信号。
28.本实施例中的信号报告探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如seq id no.34所示：5
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6-fam-tttttattttt-bhq1-3’；cas12a蛋白在crrna的引导下，识别具有靶向序列的双链dna后，反向切割活性被激活，进而降解带有信号报告探针的dna，使荧光信号基团与淬灭基团分离，从而释放荧光信号。
29.crrna效果测试结果如图2所示，图中纵坐标为荧光信号强度，最终挑选出crrna1-malassezia furfur、crrna1-malassezia obtusa、crrna2-malassezia globosa、crrna1-malassezia sympodialis、crrna2-malassezia pachydermatis作为优选的5条crrna。
30.实施例3 ，鉴别不同种属马拉色菌的试验由于crrna具有精准的特异性靶标指向作用，能够引导cas12a蛋白识别对应的靶标序列，并被进一步激活其非特异性切割活性，因此利用实施例2中优选得到的5条crrna分别建立精准识别糠秕马拉色菌（malassezia furfur）、钝形马拉色菌(malassezia obtusa)、球形马拉色菌（malassezia globosa）、合轴马拉色菌（malassezia sympodialis）、厚皮马拉色菌（malassezia pachydermatis）的检测体系。
31.在本实施例中，利用本发明建立的检测体系进行不同种类马拉色菌的鉴别验证实验。具体地，利用吸附柱法基因组提取试剂盒分别提取糠秕马拉色菌（malassezia furfur）、钝形马拉色菌(malassezia obtusa)、球形马拉色菌（malassezia globosa）、合轴
马拉色菌（malassezia sympodialis）、厚皮马拉色菌（malassezia pachydermatis）的标准基因组dna，进行crispr/cas检测，利用实时荧光定量pcr仪进行实时荧光信号的读取。
32.实验结果如图3所示。在滴加了糠秕马拉色菌样品的鉴别验证实验中，仅有crrna1-malassezia furfur的反应体系出现了荧光信号曲线，其余反应体系未检测到阳性信号，因此证明实施例1提供的检测体系能够识别鉴定出糠秕马拉色菌、同时对其他类型马拉色菌不会发生交叉反应。在滴加了钝形马拉色菌样品的鉴别验证实验中，仅有crrna1-malassezia obtusa的反应体系出现了荧光信号曲线，其余反应体系未检测到阳性信号，因此证明实施例1提供的检测体系能够识别鉴定出钝形马拉色菌、同时对其他类型马拉色菌不会发生交叉反应。在滴加了球形马拉色菌样品的鉴别验证实验中，仅有crrna2-malassezia globosa的反应体系出现了荧光信号曲线，其余反应体系未检测到阳性信号，因此证明实施例1提供的检测体系能够识别鉴定出球形马拉色菌、同时对其他类型马拉色菌不会发生交叉反应。在滴加了合轴马拉色菌样品的鉴别验证实验中，仅有crrna1-malassezia sympodialis的反应体系出现了荧光信号曲线，其余反应体系未检测到阳性信号，因此证明实施例1提供的检测体系能够识别鉴定出合轴马拉色菌、同时对其他类型马拉色菌不会发生交叉反应。在滴加了厚皮马拉色菌样品的鉴别验证实验中，仅有crrna2-malassezia pachydermatis的反应体系出现了荧光信号曲线，其余反应体系未检测到阳性信号，因此证明实施例1提供的检测体系能够识别鉴定出厚皮马拉色菌、同时对其他类型马拉色菌不会发生交叉反应。
33.实施例4，特异性测试使用实施例2提供的crispr/cas检测体系进行特异性测试。待测的基因组dna模板分别来自白色念珠菌、热带念珠菌、黄曲霉、黑曲霉、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、球形孢子丝菌标准菌株。对标准真菌株基因组dna进行提取纯化，分别将得到的产物稀释至50ng/μl，按照等体积混合后，取2μl作为样本。
34.按照实施例3提供的检测方法对白色念珠菌、热带念珠菌、黄曲霉、黑曲霉、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、球形孢子丝菌标准基因组dna混合物进行扩增检测，同时以相应的马拉色菌dna作为阳性对照，测试所述马拉色菌检测试剂盒的特异性。
35.在本实施例中，使用qpcr仪对反应体系进行实时荧光信号的收集检测。实验结果如图4显示，只有对应的马拉色菌阳性对照dna能够被特异性检出，其它真菌dna混合物并没有明显信号，说明本发明构建的马拉色菌检测试剂盒具有很强的特异性。
36.实施例5，马拉色菌检测试剂盒及检测方法1）试剂盒的组成rpa扩增体系： 上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no.27和seq id no.28所示； rpa酶预混液（含有磷酸肌酸、肌酸激酶、dntps、atp、dtt、醋酸钾、重组酶uvsx、uvsy、单链结合蛋白、bsu聚合酶等组分）； 激活剂；crispr/cas检测体系：针对五种常见马拉色菌的crrna（核苷酸序列如seq id no.12、seq id no.14 、seq id no.17、seq id no.18、seq id no.21所示）；信号报告探针（核苷酸序列如 seq id no.34所示，其5’端标记有6-fam，3’端标记有bhq1）cas12a蛋白；2×
neb buffer；阳性对照为糠秕马拉色菌、钝形马拉色菌、球形马拉色菌、合轴马拉色菌、厚皮马拉色菌标准dna；2）试剂盒使用方法（1）提取待检样本的dna，取0.01-1ng作为模板加入rpa扩增体系中，所述rpa扩增体系如下：rpa酶预混液20μl、浓度为10μm的上游引物和浓度为10μm的下游引物各2.5μl、模板1μl、激活剂2μl以及ddh2o 22μl，所述rpa扩增体系的反应温度为37℃，扩增时间为20min。
37.（2）将上述得到的rpa扩增产物与对应单一种属马拉色菌的crrna，以及cas12a蛋白、2
×
neb buffer及信号报告探针等按照表4所示配制crispr/cas检测体系。
38.表4（3）将crispr/cas检测体系置于实时荧光定量pcr仪中，设置反应程序为37℃、30s（收集荧光），30-40个循环。
39.（4）若为阳性反应，则荧光信号显著增强，超过阈值线；若为阴性反应，则荧光信号无显著增强，低于阈值线。
40.实施例6，临床样品检测收集20份临床上花斑糠疹、溢脂性皮炎等受试者的微量皮屑样本，样本来源于中山大学附属第三医院皮肤科。受试者已签署知情同意书。
41.采用酚/氯仿法提取获得待检样本dna，利用上述实施例5提供的试剂盒进行检测，具体实验方法按照实施例5描述进行。将检测结果与待检培养物的双脱氧链终止法（sanger）测序结果进行比较，一致率为100%（如表5所示）。
42.表5 本发明建立检测方法与测序结果符合率比较取其中1例临床样本的检测结果进行加以具体说明。利用本发明建立方法对该例临床样本的检测结果如图5所示，在合轴马拉色菌的反应孔中检测到荧光反应，鉴定结果是合轴马拉色菌。该例样本培养物镜检结果如图6所示，与马拉色菌的形态学描述相符。同时，该例样本的sanger测序结果如seq id no.35所示，分析确定为合轴马拉色菌。镜检结果与测序结果均与试剂盒的检测结果一致，说明所述马拉色菌检测试剂盒具有较高的准确性。
43.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在
不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。