RDR蛋白在肿瘤治疗中的应用的制作方法

rdr蛋白在肿瘤治疗中的应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学和肿瘤治疗领域。具体涉及rdr蛋白及其编码基因用于抗肿瘤的用途及其作为治疗肿瘤药物或者肿瘤辅助治疗药物的应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤(癌症)是一种典型的由细胞异常增殖而导致的疾病，现今已经成为影响人类健康的最大威胁。已知有超过100种癌症影响人类，每年约有1410万新发病例(不包括黑色素瘤以外的皮肤癌)，并造成约880万人死亡(占总死亡人数的15.7％)。目前，人类对恶性肿瘤已经尝试的治疗方法主要包括手术，化疗，放射治疗，激素治疗和靶向治疗等等。然而，很多癌症的重要特征是化学敏感性(如非小细胞肺癌，胰腺癌)，随后是化疗耐药性的迅速出现。national cancer institute将很多顽固性癌症定义为具有高死亡率和缺乏治疗选择，以强调对新治疗选择的需求。除去现有治疗手段对耐药性束手无策，很多化疗药物和靶向药物往往具有副作用大和针对单一通路的特点，使得其在临床应用时存在很大的局限性。


技术实现要素：

3.发明人意外的发现，rna依赖性rna聚合酶(rna-dependent rna polymerase,rdr)，能够抑制细胞的过度增殖，特别是肿瘤细胞的增殖和生长，因此可以作为一种有效的肿瘤治疗药物。
4.具体地，本发明的第一个方面提供了rdr或其功能性变体在制备用于治疗或预防细胞增殖性疾病的药物中的用途。
5.在一个实施方案中，所述细胞增殖性疾病为肿瘤，更具体地，所述肿瘤可以是良性肿瘤或者恶性肿瘤(或者癌症)，优选地，所述恶性肿瘤包括实体瘤、淋巴瘤或血液瘤，例如白血病、乳腺癌、皮肤癌、骨癌、肝癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、直肠癌、甲状旁腺癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、溃疡和乳头状鳞状细胞癌、肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰岛细胞瘤、原发性脑肿瘤、急性或慢性淋巴细胞或粒细胞瘤、毛细胞瘤、腺瘤、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经细胞癌、肠道神经节细胞瘤、增生性角膜神经肿瘤、精原细胞瘤、平滑肌瘤、宫颈癌、结直肠癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、恶性高钙血症、多形性胶质母细胞瘤、黑色素瘤或表皮样癌。
6.在又一个实施方案中，所述rdr是rdr1，rdr2或rdr6，优选为rdr1；进一步优选地，所述rdr来源于植物，还优选地，所述植物例如单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥、水稻、烟草、毛果杨、大豆、葡萄、番茄、马铃薯、大麦、短柄草、玉米、高粱、可可树、水稻、矮牵牛、棉花或黄瓜。
7.在又一个实施方案中，所述rdr是能够编码rdr蛋白的核酸序列，例如基因组序列、cdna或者cds序列，优选地，所述核酸序列位于载体中，例如质粒载体或者病毒载体，所述病毒载体优选为逆转录病毒载体、慢病毒载体或者腺病毒载体；或者所述功能性变体是rdr保
留rdrp结构域的截短体，例如，所述功能性变体是rdrp结构域。
8.本发明的第二个方面提供了一种用于治疗或预防细胞增殖性疾病的药物组合物，其包含rdr和药学上可接受的载体。
9.本发明的第三个方面提供了一种抑制细胞增殖的方法，其包括在体外将rdr导入目标细胞中，所述目标细胞为具有正常功能的细胞或者具有异常增殖特性的细胞，例如肿瘤细胞。
10.本发明的第四个方面提供了一种抑制肿瘤生长和/或转移的方法，其包括针对有需要的个体施用治疗有效量的rdr蛋白、能够表达rdr蛋白的核酸分子或者前述第二个方面的所述药物组合物的步骤。
11.在一个实施方案中，本发明提供了一种rdr蛋白在制备抑制肿瘤生长和/或转移的试剂/药物/组合物/试剂盒中的应用。
12.本发明的第五个方面提供了一种增加细胞中mirna稳定性或者提高细胞中mirna表达量的方法，其包括将rdr与目标细胞接触或者将rdr导入目标细胞的步骤。优选地，所述目标细胞为具有正常功能的细胞或者具有异常增殖特性的细胞，例如肿瘤细胞或者癌细胞。
13.在一个实施方案中，本发明提供了一种rdr蛋白在制备抑制增加动物细胞mirna稳定性或者提高动物细胞中mirna表达量的试剂/药物/组合物/试剂盒中的应用。优选地，所述目标细胞为具有正常功能的细胞或者具有异常增殖特性的细胞，例如肿瘤细胞或者癌细胞。
14.本发明的第七个方面提供了一种调节细胞周期的方法，其包括将rdr与目标细胞接触或者将rdr导入目标细胞的步骤，优选地，所述目标细胞为具有正常功能的细胞或者具有异常增殖特性的细胞，例如肿瘤细胞或者癌细胞。
15.在一个实施方案中，本发明提供了一种rdr蛋白在制备抑制肿瘤生长和/或转移的试剂/药物/组合物/试剂盒中的应用。
16.本发明的第八个方面提供了一种提高肿瘤细胞中低表达mirna的表达量的方法，其包括将rdr与肿瘤细胞接触或者将rdr导入肿瘤细胞的步骤。
17.在一个实施方案中，本发明提供了一种rdr蛋白在制备提高肿瘤细胞中低表达mirna的表达量的试剂/药物/组合物/试剂盒中的应用。
18.本发明的第九个方面提供了一种降低肿瘤细胞中细胞周期相关基因的表达量的方法，其包括将rdr与肿瘤细胞接触或者将rdr导入肿瘤细胞的步骤。
19.在一个实施方案中，本发明提供了一种rdr蛋白在制备降低肿瘤细胞中细胞周期相关基因的表达量的试剂/药物/组合物/试剂盒中的应用。
20.根据前述任一方面，其中所述rdr是rdr1，rdr2或rdr6，优选为rdr1；进一步优选地，所述rdr来源于植物，还优选地，所述植物选自拟南芥、水稻、烟草、毛果杨、大豆、葡萄、番茄、马铃薯、大麦、短柄草、玉米、高粱、可可树、水稻、矮牵牛、棉花或黄瓜。
21.根据前述任一方面，其中所述rdr是rdr的活性蛋白或者能够编码rdr蛋白的核酸序列。
22.根据前述任一方面，其中所述个体或细胞优选是或者来源于人或动物，所述动物例如非人哺乳动物，例如牛，猪，马，鸡，猫或狗等。
23.本发明所提供的rdr蛋白(例如植物rdr1)，能够有效的抑制癌细胞。其作用机制是通过在mirna末端加尾来广泛上调在癌症细胞中降低的mirna，而在正常细胞(组织)中存在反馈机制使得mirna水平维持稳定，因此rdr过表达并不会引起正常细胞增殖受到抑制并且mirna水平也不会上调，从而降低了临床使用时可能存在的副作用。相比于传统的化学药物，rdr靶向肿瘤细胞的特异性更好，并且能够广谱的抑制多种类型的癌症。
24.此外，本发明也验证了，rdr对于癌症的靶点并非仅涉及单一靶点，而是会涉及到多个基因的表达调节，通过不同癌症细胞rna-seq的数据，可以看到共同显著下调的靶基因在60-70个左右，gsea分析显示这些靶基因针对于细胞增殖和黏着斑(癌症侵袭相关)的不同通路。这也意味着这一潜在疗法很难因为癌细胞出现少量基因突变而产生耐药性。因此具有极高的临床应用前景。
附图说明
25.图1显示了rdr1基因序列的生物信息学分析结果。其中显示了不同物种的rdr1之间在关键结构域rdrp的序列具有很强的保守性。
26.图2为在癌细胞中过表达rdr1的实验流程图。
27.图3显示了western blot检测癌症细胞中rdr1的表达。其中，在高浓度dox诱导三天后(4μg/ml),western-blot检测到flag-osrdr1/atrdr1在所有细胞系中均具有较高的表达量，而不加dox的对照细胞中难以检测到rdr1的本底表达。
28.图4显示了dox诱导rdr1表达后癌细胞的增殖情况。相较于不加dox的对照组细胞，在加入dox稳定诱导rdr1表达后，癌细胞生长从第4天开始受到明显抑制，并且这种抑制作用一直持续到第6天实验结束，而正常细胞的生长和数量基本没有变化。
29.图5显示了osrdr1/atrdr1稳定细胞系的细胞侵袭实验结果。在加入高dox连续诱导5天后，再转移至小室中放置24小时，可以发现rdr1诱导使得成功侵袭透过小室的癌细胞数量大大减少。
30.图6显示了osrdr1/atrdr1稳定细胞系的细胞凋亡实验结果。相比于癌症细胞hepg2、h1299以及正常细胞nih/3t3，各实验组凋亡细胞的比例均处于正常的范围内，即osrdr1/atrdr1稳定表达细胞系在经过诱导后并未产生细胞凋亡的改变。
31.图7显示了rdr1突变体的模式图及其在癌细胞中的表达。图7a显示了将通过保守结构域的分析确定得三个潜在的活性位点分别进行突变(d429a，d431a，d433a)。图7b显示了突变的osrdr1与野生型对照蛋白表达量的western检测结果，二者不存在显著差距。
32.图8显示了dox诱导rdr1-mut表达的癌细胞的增殖情况，结果显示高dox处理osrdr1-mut癌细胞并未对细胞增殖带来影响。
33.图9显示了rdr1截短体的示意图(图9a)，rdr1截短体在细胞中的表达情况(图9b)细胞表达和对于癌症细胞增殖(图9c)的影响。
34.图10显示了a549luc-osrdr1的小鼠荷瘤模型实验，图10a、b和c显示过表达rdr1可以显著降低荷瘤的体积和瘤重；图10d表明rdr1降低了a549荷瘤luciferase的表达强度。
35.图11显示了rdr1稳定细胞系的rna-seq分析结果。
36.图12为rdr1稳定细胞系的gsea细胞周期分析结果。
37.图13显示了osrdr1稳定细胞系的细胞周期实验。rdr1蛋白过表达6天后的癌症细
胞，相较于野生型细胞(未使用病毒侵染)和未经过dox诱导的细胞系(rdr1未过表达)，细胞周期被大部分阻滞在g1期，s期比例显著下降，g2期也出现了一定的阻滞。
38.图14显示了rna-seq分析中rdr1可能的靶基因及相关实验验证。图14a显示了rdr1所调节的基因类型，其中细胞周期类基因最多；图14b显示了通过go分析注释靶基因中的原癌基因，发现这些原癌基因基因的功能主要有两类，分别是调控细胞周期和调控细胞种群增殖；图14c显示了western blot检测标记基因在癌症细胞中的表达情况。
39.图15显示了rdr1蛋白可以恢复癌细胞中广泛降低表达的mirna以及mirna-靶基因互作网络。
40.图16显示了rdr1蛋白在癌细胞中可以通过特异性加尾上调mirna表达。
41.图17显示了rdr1蛋白在细胞中的定位。
具体实施方式
42.还可进一步通过实施例来理解本发明，然而，要理解的是，这些实施例的目的不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。
43.rdr
44.rdr，即rna依赖性rna聚合酶(rna-dependent rna polymerase,rdr)。1963年，研究者们在噬菌体中发现了一种能以rna为模版合成rna的酶，被认为是噬菌体编码的一种rna依赖的rna聚合酶，用来合成噬菌体的基因组rna。直到1971年，真核生物的rdr才第一次在中国卷心菜中被报道。至今为止，在rna病毒、植物、真菌、原生动物和低等动物体内都发现了rdr，但是在高等动物中，包括果蝇(drosophila)、小鼠和人类体内则没有发现。
45.rdr最基础的特征之一在于催化以rna为模板复制rna，在没有dna的rna病毒中，rdr是必需的编码蛋白。rdr介导的rna复制可以通过不依赖引物(从头合成)或依赖引物的机制在rna模板的3'末端或附近开始进行。通过3'-oh端不断的添加ntp(nucleoside triphosphate，三磷酸核苷)，实现互补链的合成从而将单链rna转换为双链rna。更重要的是，sirna通路上游必要的一环就是rdr介导的双链合成，因此rdr在具有sirna通路的物种中是必要且必需的。总的来说，rdr通过介导产生和扩增sirna以此调控发育，维持基因组的完整性、以及抗病毒免疫。
46.从进化角度上看，真核祖先中存在三个rdr的拷贝：rdrα,rdrβ和rdrγ。其中rdrβ和rdrγ这两个分支出现了明显的分歧：在植物中只存在rdrγ分支，原生生物和无脊椎动物中只有rdrβ分支。以植物为例，在模式植物拟南芥，被报道功能明确的三个rdr成员分别是atrdr1，atrdr2和atrdr6，他们都属于rdrα家族的成员。而植物特有的rdrγ分支在模式植物拟南芥中对应的是atrdr3，atrdr4和atrdr5，他们的生物学功能还没有被明确鉴定。与此同时，相对于双子叶的模式植物拟南芥，单子叶植物的代表水稻中，同样存在着5个rdr家族的成员，其中共有的osrdr1，osrdr2和osrdr6均属于rdrα家族，而osrdr3a和osrdr3b属于植物特有的rdrγ分支。
47.植物rdr主要有两种生化活性：rna聚合酶活性和末端转移酶活性，都具有非常保守的结构域。例如拟南芥中rdrα分支的rdr1,rdr2和rdr6在c末端具有典型的dldgd催化motif，而且在许多其他植物中的rdr中也都发现具有同样的motif。而这些rdr的功能一开
始是同抗病毒联系到一起的，后来发现rdr2和rdr6还分别参与植物内源染色体的结构调控和内源tasirna通路。以rdr1为例，rdr1是植物中最早被发现的基因沉默通路的元件之一，并且是最早报道的具有抗病毒活性的基因沉默通路的元件。通过小rna测序分析，已经证明rdr1直接参与病毒sirna的合成。除此之外，rdr1能够识别没有帽子结构的mrna,并以之作为模版合成双链的rna，诱导拟南芥体内的sirna通路，广泛的降低植物体内的基本的生理活动，减少病毒复制需要的能量和原料的供应，从而限制病毒的复制和传播。不过，目前尚未有任何关于rdr与肿瘤相关研究的报道。
48.更具体而言，结构生物学分析表明(poch o,sauvaget i,delarue m,et al.identification of four conserved motifs among the rna-dependent polymerase encoding elements[j].the embo journal,1989,8(12):3867-3874.)：rdr具有一个关键结构域——rdrp，其具有呈右手状的立体构象，包含三个子功能域——1个手指(fingers)亚结构域、1个手掌(palm)亚结构域和1个拇指(thumb)亚结构域。在所有的rdr中，手掌亚结构域是高度保守的。在rdrp中，手掌亚结构域具有两个保守的天冬氨酸残基，可与两个二价金属离子相互作用，从而促进亲核攻击，帮助新rna链的合成。除此之外，rdrp具有六个保守的结构基序(a
–
f)，大部分位于手掌亚结构域(a
–
e)中，而f基序位于手指亚结构域中，已经证明所有这些基序与核苷酸的正确掺入和重组的过程有关。
[0049]
通过序列比对等生物信息学分析表明，真核rdrp结构域共有活性保守基序位点“dxdgd”(x代表任何氨基酸)(如前述植物中的“dldgd”)，通过37个不同真菌物种rdr的氨基酸序列的保守性分析，发现上述位点所存在的不同物种中rdr的非催化n末端显示出极低的保守评分。将dydgd基序的一个突变(867位的天冬氨酸被突变为丙氨酸)引入atrdr6，可以直接缺失rdr6的以ssrna为底物的rna聚合酶活性以及不依赖于模板的3’末端核苷酸转移酶的活性(curaba j,chen x.biochemical activities ofarabidopsis rna-dependent rna polymerase 6[j].journal of biological chemistry,2008,283(6):3059-3066.)。
[0050]
以上表明了rdr家族均具有结构功能高度相似的rdrp序列，而如后文所将要展示的那样，本发明实施例中验证了单独的rdrp序列也能够产生与全长rdr1产生类似的效果，因此本领域技术人员可以预期，不仅限于实施例具体选用的rdr1，而是rdr家族的所有成员用于在本发明中时均能够产生类似的技术效果。
[0051]
在没有特别指定的情况下，本发明单独述及“rdr”时可以指代rdr蛋白，也可以指代rdr蛋白的编码基因或者编码核酸序列。本发明所述的rdr基因或者蛋白可以来源于任何物种，只要该物种如前所述的中含有rdr基因。例如本发明所述的rdr可以来源于植物，更具体例如拟南芥、水稻、烟草、毛果杨、大豆、葡萄、番茄、马铃薯、大麦、短柄草、玉米、高粱、可可树、水稻、矮牵牛、棉花或黄瓜等单子叶植物或者双子叶植物。或者与上述植物例如拟南芥或水稻rdr具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的相似性，例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性并且具有相同的功能。
[0052]
本发明所述的rdr可以是rdr1、rdr2、rdr3、rdr4、rdr5或rdr6。并且，rdr1-rdr6包含部分亚家族成员，例如卷柏中的rdr1a和rdr1b。除此之外，还包括细胞中已经明确生化鉴定的来自粗糙脉孢菌中的qde-1和裂殖酵母中的rdp-1，以及秀丽隐杆线虫中的ego-1。值得注意的是，拟南芥中的rdr6同样被称为sgs2和sde1，同样在本发明的保护范围中。
[0053]
本技术还可以使用rdr的功能性变体，所述功能性变体是指具有或者基本具有或者能够表现出与野生型rdr具有相同或相近功能的rdr序列。在一些实施方案中，所述rdr包含rdr的功能性变体；所述变体可以是rdr的全部或部分的c末端或n末端或内部片段融合的异源多肽；在一些实施方案中，所述rdr功能性变体是保留了rdrp结构域的截短体或者截短融合体；在另一些实施方案中，所述rdr变体仅包含rdrp结构域或者仅由rdrp结构域组成。
[0054]
在一些实施方案中，所述rdr的功能性变体可以通过提供功能等同分子的取代，添加或缺失来改变rdr序列来制备。
[0055]
由于核苷酸编码序列的简并性，可以在实践中使用编码与rdr基因基本相同的氨基酸序列的其他dna序列。本发明的rdr变体包括但不限于含有rdr蛋白的全部或部分氨基酸序列作为一级氨基酸序列的那些，包括其中功能等同的氨基酸残基被取代的改变的序列。序列内的一个或多个氨基酸残基可以被具有相似极性的另一个氨基酸取代，其起到功能等同物的作用，导致沉默改变。序列内氨基酸的替代物可以选自氨基酸所属类别的其他成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。变体可以在蛋白质的n-末端包含指导蛋白质转移的信号序列(或前导序列)，结合翻译或翻译后。多肽还可以与接头或其他序列缀合，以简化多肽(例如，聚-his)的合成，纯化或鉴定，或增强多肽与固体支持物的结合。例如，多肽可以与免疫球蛋白的fc区缀合。
[0056]
药物组合物和治疗
[0057]
本发明的药物组合物可以仅包括本发明的rdr蛋白或者编码rdr蛋白的核酸分子，也可以进一步包括药学上可接受的载体，以便于在患者中施用。
[0058]“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油，动物，植物或合成来源的那些，例如花生油，大豆油，矿物油，芝麻油，橄榄油，凝胶(例如，水凝胶)，等等。当静脉内施用药物组合物时，盐水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。
[0059]
合适的药物赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，大米，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸钠，甘油单硬脂酸酯，滑石，氯化钠，脱脂乳，甘油，丙烯，乙二醇，水，乙醇，等等。如果需要，该组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。这些组合物可以采用溶液，悬浮液，乳液，片剂，丸剂，胶囊，粉末，缓释制剂等形式。口服制剂可包括标准载体，例如药物级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。
[0060]
下面就本发明提供的rdr治疗、预防或控制肿瘤的方法或药物组合物做详细说明。其中实施例中具体以常见植物中的rdr1作为rdr的代表，本领域技术人员能够理解的是，如上所述，其它物种的rdr1以及rdr家族的其它rdr也适用，并且这些内容被认为是在本发明的范围内。
[0061]
实施例1制备过表达拟南芥或水稻rdr1蛋白的癌细胞系
[0062]
首先，对rdr1的序列进行了生物信息学分析。通过将拟南芥的rdr1的序列在数据库中进行blast检索，与14种植物和6种微生物的rdr1序列进行比较分析发现，尽管不同物种在形态上差异很大，但是rdr1中rna依赖的rna聚合酶结构域(rdrp)具有高度相似的序列
和基序(*号所示)，这也暗示了不同物种rdr1之间功能具有极大的相似性(图1)。
[0063]
为了在不同的癌细胞中过表达植物rdr1(rna-dependent rna polymerase 1)蛋白，首先从模式植物拟南芥和日本晴水稻中克隆rdr1基因。提取拟南芥和日本晴水稻的基因组rna，使用superscript iv反转录得到cdna(complementary dna),以该cdna为模板使用atrdr1_sal1_f引物(seq id no：8)和atrdr1_bamh1_r引物(seq id no：9)扩增得到atrdr1(arabidopsis thaliana rdr1)；同样地，以该cdna作为模板使用osrdr1_sal1_f引物(seq id no：10)和osrdr1_bamh1_r引物(seq id no：11)扩增得到osrdr1，后将上述两pcr片段回收纯化。之后，通过使用plenti_atrdr1_cds_f引物(seq id no：12),plenti_atrdr1_cds_r引物(seq id no：13)和plenti_atrdr1_t2a-egfp_f引物(seq id no：14),plenti_atrdr1_t2a-egfp_r引物(seq id no：15)将纯化的atrdr1和t2a-egfp片段共同连接到慢病毒载体上，测序验证无误。同理，通过使用plenti_osrdr1_cds_f引物(seq id no：16),plenti_osrdr1_cds_r引物(seq id no：17)和plenti_osrdr1_t2a-egfp_f引物(seq id no：18),plenti_osrdr1_t2a-egfp_r引物(seq id no：19)将纯化的osrdr1(oryza sativa.rdr1)和t2a-egfp片段共同连接到慢病毒载体上。
[0064]
随后准备293t细胞，传至p2代，进行病毒包装实验。使用转染试剂lipofectamine 3000，按照说明书配制管a(500ul optimem 31ul lipo3000)和管b(500ul optimem 40ul p3000 pos/atrdr1-t2a-egfp 10ug pmd2g 2.5ug pspax27.5ug)，混匀后，室温放置15min，沿皿壁缓慢加入10cm 293t细胞中(密度90％)，摇匀。6小时后，更换正常培养基。48小时后，收获上清病毒液，1500rpm离心5分钟，去除细胞碎片，分装，-80℃保存。同理包装另一种辅助病毒teton-3g。
[0065]
随后，将osrdr1/atrdr1病毒和teton-3g病毒按照1：1混合，加入6ug/ml的polybrene，侵染目的细胞。侵染12小时后，更换含有低dox的正常培养基(100ng/ml)，诱导24小时后流式分选阳性egfp细胞(图2)。待分选的阳性细胞扩增到一定规模时，加入高dox(4ug/ml)诱导rdr1表达约72小时，随后收获细胞使用ripa细胞裂解液和pmsf处理细胞，离心后取上清，western blot检测目的蛋白rdr1在癌症细胞中的表达情况(图3)。
[0066]
如图3所示，在慢病毒侵染后经过facs分选得到的不同癌症细胞系(包括非小细胞肺癌a549luc、h1299，结直肠癌hct116，宫颈癌hela，肝癌hepg2，慢性骨髓性白血病k562，成骨肉瘤u2-os)和健康细胞系(小鼠胚胎成纤维细胞nih/3t3，人视网膜色素上皮细胞rpe-1)，加入高dox诱导后可以明显的过表达植物中的rdr1蛋白。这表明已经成功制备了分别能够通过dox诱导产生水稻rdr1(osrdr1)和拟南芥(atrdr1)蛋白的细胞系。
[0067]
其中，osrdr1的基因序列如下所示：
[0068]
atgatggattggtttatgtctacagtgtatttttatggacctgagattaatgtctccaatcgtgtggtgcggaatttttcttctgacatagagaatttccttcgcatttcatttgttgacgaggactgcgagaagctccgtgcaactgatttatccccccgttctgcttcaggacatgatgcaaacagaactgctctgtataagagagttctgtcagtcctttcagatggcatcactattggtggcaagaactttgagtttcttgctttttcttcaagccagctccgagataactctgcatggatgtttgcttctcgccagggattagctgctagcgacattaggacatggatgggggatttccgtaacatcagaaatgtagcaaaatatgctgcaagacttggtcagtcttttagttcctcaaccgaaacattaaaggttcagaagtatgaggtggaagaaatctcagatataaaaaatggtacacagcatgtgttctctgatgggattggaaagatatcatctgcttttgctaatgaagtggccatgaagtgcaacctgaaacgctttgctccttctgcttttcaaataaggtatggt
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[0069]
atrdr1的基因序列如下所示：
[0070]
atggggaagacaattcaagtgtttggattccctaatggtgtgagcgcagaagaagttaagaagtttcttgaaagactcactggttcaggcactgtttacgcaatcaaagttagacaaccaaagaaaggtggtccaagagtctatgccattgttcaattcacatctgagagacatacgaggctgatcatcactgcggcagcagaacgtctttactatggaagatcttatctcaaggcttttgaagttgaacaagacattgttccaaagccaagagcttcattacacaccatctctggtttaaagatgttctttggatgtcaagtctcgactaagaagtttttaactctatggagtgctcaagatgtttgtgtctcgtttggaattgggatgaggaaactgcatttttcgttttcttggtatcaaaaggattatcgtcttgagctttcgtatgagaatatatggcagattgatttgcattctccgcaaggacgatcatcgaagtttcttgtgattcaggtgattggtgctcctaaaatatttgagaaagaggatcaacctatcaatcttttgtttggaataatggatttttacagtgatgggtctgatgagcaatggattagaactacagatttcacttcatcttcttgtattggtcaatcaacagcgttttgtttagagcttcctgttcatcttaatgttcctgatttcagagagaattttgccaactatgcagagcacagagccagctcttttctcattgaatctggttctagctattcatctaatgctaacacacttgttcctgttgttgatcctcctccagggtttagtttgccttttgagatcttgtttaaacttaacacattggtgcagaacgcgtgtctctccgggccagctcttgatcttgacttttatcggttgcttaatcagaaaaaatatgatagagctctcatagatcactgtcttgaaaaactctttcaccttggagaatgttgctatgagcctgctcattggcttcgcgatgagtacaagaagtggatatcgaaaggaaagcttccactgtctcctacaatatctcttgatgatggacttgtttatatgtatcgcgttcaagttacaccagcaagagtctatttctctggaccggaggtgaatgtttctaatcgtgtgcttcgacattactccaagtatatcaacaacttcctcag
ggtctcatttgttgatgaagatcttgaaaaggttcgttccatggatctatctccacgctcttctactcaaagaagaaccaagttatacgacaggatatattctgttcttcgcgatgggattgtcataggcgataagaagtttgagtttctcgccttttcttccagccagttgcgggagaactctgcttggatgtttgcaccaatagatcggattacagcagcacatatcagagcttggatgggtgattttgaccatataagaaatgtagctaaatatgctgcaaggcttggtcaatcttttagctcttcaagagagacacttaatgttaggagtgatgagattgaagtgattcctgatgttgagattatatctttagggacacgctatgtgttttccgatggaataggaaagatatcagctgaatttgctagaaaggtagcgaggaaatgtggtcttacagagttttctccatctgcttttcaaatccgttatggcggttataaaggagtggtggctgttgatccaaactcatcaaagaaactgtctctgaggaagagtatgagcaaattcgaatcggagaacaccaagcttgatgttctggcgtggagcaagtaccaaccttgttatatgaacagacaactgattacacttttgtctactcttggagttacggacagtgtgtttgagaagaaacaaagggaagttgtggatcgtctcgacgcaatcttgactcatcctttggaagctcacgaggctcttggtttaatggctccaggggaaaacacaaatattctcaaggcattgatcttgtgtggctataaacctgacgctgaacctttcctttcaatgatgcttcagaatttcagggcatctaagttgttggaactacggacaaaaacaaggattttcatttctggtggaagatctatgatgggatgcctagacgagaccagaacactggagtatggtcaggtagtagtgcagtattcagatcccatgaggccgggaaggcgattcatcatcaccggacctgttgttgttgccaaaaacccatgcctgcatcctggtgacgtgcgtgttcttcaagctgtcaatgtcccagctttaaatcatatggtggactgcgttgtgttcccgcaaaagggcttgaggccacacccaaatgaatgttctgggagtgatttagatggagatatttactttgtatgttgggatcaagaattggttccgccaagaacgtctgaaccaatggactacactcctgaaccaactcaaatcttggatcatgatgtcacaattgaggaagttgaagagtactttgcgaactacattgtgaatgatagtttagggatcatcgcgaatgctcataccgcctttgcggataaggaaccactcaaggcgtttagtgacccatgcattgagcttgcaaagaagttttcaactgcggtagatttcccaaaaactggtgttgcagctgtgataccgcaacatctttacgtgaaagagtatcctgatttcatggagaaaccggataagccaacatatgagtcgaagaacgtgattggtaagctttttagagaggtaaaagagcgagctccaccgttgatctcgatcaaatcattcacgcttgatgtggcctcaaagtcttatgataaagacatggaagttgacggatttgaggagtatgttgatgaagctttctaccagaaggcgaattatgatttcaagttaggtaatttgatggattactatgggattaagactgaggctgagattcttagtggtggtataatgaggatgtcaaagtcattcaccaagagacgagatgcagaatcgattggaagagcggttcgggcgttgaggaaagaaactttgtcgttgttcaatgcttctgaagaagaagaaaatgagtcagcaaaggcttcggcttggtatcatgtaacgtaccactcaagttactggggactttataatgagggtttgaatcgtgaccatttcttaagttttgcgtggtgcgtttatgataagcttgtgaggatcaagaagaccaatcttgggaggcgtcagcggcaggagacgctcgagcggttagaccatgttctgcgtttcggttga(seq id no:2)
[0071]
osrdr1的氨基酸序列如下所示：
[0072]
mmdwfmstvyfygpeinvsnrvvrnfssdienflrisfvdedceklratdlsprsasghdanrtalykrvlsvlsdgitiggknfeflafsssqlrdnsawmfasrqglaasdirtwmgdfrnirnvakyaarlgqsfssstetlkvqkyeveeisdikngtqhvfsdgigkissafanevamkcnlkrfapsafqiryggykgvvavdptsrwklslrksmlkfqsdnitvdvlayskyqpgflnrqlitllstlgvrdsvfeqkqeeavnqlnkmvtdpqaaieaielmpmgeitnavkelllcgyqpddepylsmllqtfraskllelktksrilipkgrammgcldetrtlkygqvfiratsgvndndrftvtgkvviaknpclhpgdirilhavdvpvlhhmfncvvfpqqgprphpnecsgsdldgdiyfvswdpslipprmvtpmdytpaptetldhdvtieeveeyftnyivneslgmianahvvfadkedlkaesspcielaklfsiavdfpktgvpalippelhvkeypdfmekldkvtyeskgvigklyreikkhtphikhftrevarrsydtdmivdgyedyiteamalkdeydfklgnlmdhygikseaeiisgcilkmaknftkksdadairlavrslrkearsrfsemslddnghghdaseakasawyhvtyhpefwgcynegyerphfisfpwciyekllrikqrrkfvrkmqpelfslhnlri(seq id no:3)
[0073]
atrdr1的氨基酸序列如下所示：
[0074]
mgktiqvfgfpngvsaeevkkflerltgsgtvyaikvrqpkkggprvyaivqftserhtrliitaaaerlyygrsylkafeveqdivpkpraslhtisglkmffgcqvstkkfltlwsaqdvcvsfgigmrklhfsfswyqkdyrlelsyeniwqidlhspqgrsskflviqvigapkifekedqpinllfgimdfysdgsdeqwirttdftssscigqstafclelpvhlnvpdfrenfanyaehrassfliesgssyssnantlvpvvdpppgfslpfeilfklntlvqnaclsgpaldldfyrllnqkkydralidhcleklfhlgeccyepahwlrdeykkwiskgklplsptislddglvymyrvqvtparvyfsgpevnvsnrvlrhyskyinnflrvsfvdedlekvrsmdlsprsstqrrtklydriysvlrdgivigdkkfeflafsssqlrensawmfapidritaahirawmgdfdhirnvakyaarlgqsfsssretlnvrsdeievipdveiislgtryvfsdgigkisaefarkvarkcgltefspsafqiryggykgvvavdpnsskklslrksmskfesentkldvlawskyqpcymnrqlitllstlgvtdsvfekkqrevvdrldailthpleahealglmapgentnilkalilcgykpdaepflsmmlqnfraskllelrtktrifisggrsmmgcldetrtleygqvvvqysdpmrpgrrfiitgpvvvaknpclhpgdvrvlqavnvpalnhmvdcvvfpqkglrphpnecsgsdldgdiyfvcwdqelvpprtsepmdytpeptqildhdvtieeveeyfanyivndslgiianahtafadkeplkafsdpcielakkfstavdfpktgvaavipqhlyvkeypdfmekpdkptyesknvigklfrevkerapplisiksftldvasksydkdmevdgfeeyvdeafyqkanydfklgnlmdyygikteaeilsggimrmsksftkrrdaesigravralrketlslfnaseeeenesakasawyhvtyhssywglyneglnrdhflsfawcvydklvrikktnlgrrqrqetlerldhvlrfg(seq id no:4)
[0075]
实施例2 rdr1蛋白能够抑制癌细胞的增殖
[0076]
在获得诱导型表达rdr1蛋白的稳定细胞系后，进一步研究了rdr1对于癌细胞增殖的影响。首先在在24孔板或12孔板中铺10000个细胞，设置一个实验组为高dox(4ug/ml)组，以及分别不加dox和转入空载的细胞系为对照组，进行三次重复，连续6天进行台盼蓝染色计数。结果显示，不论是水稻rdr1还是拟南芥rdr1均能够有效抑制不同组织来源的癌症细胞系的增殖，如来源于宫颈、肺部、肝部等的癌症细胞生长显著变慢，但对正常细胞系的增殖基本不产生影响(图4)。
[0077]
实施例3 rdr1蛋白能够抑制癌细胞的侵袭
[0078]
接下来测试了rdr1对于癌细胞侵袭能力的影响。本实施例选择了实施例1构建得到的a549luc-osrdr1和h1299-atrdr1细胞系，其中a549luc和h1299具有显著的侵袭能力。按照制造商的说明，使用biocoat matrigel invasion chamber(corning)测量细胞侵袭。在加入dox诱导5天后，进行侵袭实验，并于24小时后观察拍照计数，结果显示，osrdr1或atrdr1都大大减少了侵袭透过小室的癌细胞数量，这表明rdr1可以显著的抑制癌症细胞的侵袭能力(图5)。
[0079]
实施例4 rdr1蛋白并不影响癌细胞的凋亡
[0080]
进一步研究了转入osrdr1或atrdr1的稳定癌细胞系中细胞凋亡的变化。在6孔板中铺10000个细胞，加入高浓度dox(4ug/ml)为实验组，不添加dox的为对照组，进行三次重复，6天后遵循annexin v-pe/7-aad apoptosis detection kit(vazyme)的说明书进行实验，胰酶消化细胞，pbs洗涤后分别染色7-aad和pe，使用facs分析实验结果。如图6a和b所示，在加入dox诱导rdr1表达6天后，肿瘤细胞并没有发生明显的凋亡，这也意味着rdr1过表达引起的增殖变慢并不是通过诱导细胞凋亡发生的。
[0081]
实施例5 rdr1突变导致抑制癌症功能的丧失
[0082]
为了进一步验证rdr1蛋白的功能，本实施例制备了功能缺失的rdr1突变体。首先，
在ncbi和uniprot上搜寻植物、微生物等物种中rdr1基因的序列，下载后通过dnaman进行序列比对，鉴定得到的保守结构域如图1所示。随后通过q5 site-directed mutagenesis kit(neb)，遵循说明书设计pcr引物mut_rdr1_f(seq id no：20)和mut_rdr1_r(seq id no：21)以进行实验，测序验证无误，按照4.1中的方法包装病毒osrdr1-mut(图7a)。完成包装后，侵染不同的癌症细胞系，低dox(100ng/ml)诱导24小时后流式分选阳性细胞，扩繁起来后使用western blot检测osrdr1-mut的表达情况，并同野生型rdr1蛋白表达做对比，以排除突变体功能丧失是因为突变蛋白因降解造成的(图7b)。
[0083]
最后对osrdr1-mut的细胞系进行了细胞增殖实验，实验方法同实施例2的描述。结果显示，在对rdr1蛋白进行突变后，即使加入高dox诱导rdr1-mut在癌细胞中过表达，但是突变体rdr1无法抑制癌细胞的增殖(图8)。本实施例的结果验证了此前实施例中证实的rdr1对于癌细胞的作用确实是因为rdr1本身而非其他非特异性因素。
[0084]
osrdr1-mut的氨基酸序列如下所示：
[0085]
mmdwfmstvyfygpeinvsnrvvrnfssdienflrisfvdedceklratdlsprsasghdanrtalykrvlsvlsdgitiggknfeflafsssqlrdnsawmfasrqglaasdirtwmgdfrnirnvakyaarlgqsfssstetlkvqkyeveeisdikngtqhvfsdgigkissafanevamkcnlkrfapsafqiryggykgvvavdptsrwklslrksmlkfqsdnitvdvlayskyqpgflnrqlitllstlgvrdsvfeqkqeeavnqlnkmvtdpqaaieaielmpmgeitnavkelllcgyqpddepylsmllqtfraskllelktksrilipkgrammgcldetrtlkygqvfiratsgvndndrftvtgkvviaknpclhpgdirilhavdvpvlhhmfncvvfpqqgprphpnecsgsalagaiyfvswdpslipprmvtpmdytpaptetldhdvtieeveeyftnyivneslgmianahvvfadkedlkaesspcielaklfsiavdfpktgvpalippelhvkeypdfmekldkvtyeskgvigklyreikkhtphikhftrevarrsydtdmivdgyedyiteamalkdeydfklgnlmdhygikseaeiisgcilkmaknftkksdadairlavrslrkearsrfsemslddnghghdaseakasawyhvtyhpefwgcynegyerphfisfpwciyekllrikqrrkfvrkmqpelfslhnlri(seq id no:5)
[0086]
实施例6rdr1截短体同样能够有效抑制癌细胞增殖
[0087]
在实施例5突变的基础上，本实施例对osrdr1和atrdr1进行了截短。一方面进一步验证rdr蛋白对于癌症的抑制功能是否由其关键的酶结构域介导的；另一方面考虑到rdrp结构域的保守性，尝试研究只利用rdr的关键结构域抑制细胞增殖。
[0088]
首先通过在smart数据库中检索获得osrdr1和atrdr1的结构域信息，随后使用q5 site-directed mutagenesis kit(neb)，遵循说明书设计pcr引物osrdrp_f(seq id no：26)和osrdrp_r(seq id no：27)以获得截短的rdr1序列，测序验证无误，示意图如图9a所示。本实施例中针对osrdr1截短了c端无明确功能结构域的部分，针对atrdr1则主要截短了rrm(rna识别基序)和atrdrp之间的部分以及c端无明确功能结构域的部分。随后我们通过lipo3000介导的瞬时转染方法，将含有flag-osrdr1δ和atrdr1δ片段的载体分别转入肝癌细胞hepg2和非小细胞肺癌细胞h1299，84小时后收集细胞，计数检测细胞增殖情况，并使用western blot检测osrdr1δ和atrdr1δ的表达情况，并与瞬时转染野生型rdr1全长蛋白的对照细胞进行表达量对比。
[0089]
结果显示，脂质体介导瞬时转染后，癌细胞中可以有效表达osrdr1δ和atrdr1δ这两个只包含rdrp结构域的截短体；但在瞬时转染全长蛋白的细胞中，并未检测到表达的全长蛋白(图9b)。其原因推测可能是蛋白长度过长，或者是在rdrp结构域外含有促进蛋白降解的位点(图9b)。
[0090]
osrdr1δ的氨基酸序列如下：
[0091]
mmdwfmstvyfygpeinvsnrvvrnfssdienflrisfvdedceklratdlsprsasghdanrtalykrvlsvlsdgitiggknfeflafsssqlrdnsawmfasrqglaasdirtwmgdfrnirnvakyaarlgqsfssstetlkvqkyeveeisdikngtqhvfsdgigkissafanevamkcnlkrfapsafqiryggykgvvavdptsrwklslrksmlkfqsdnitvdvlayskyqpgflnrqlitllstlgvrdsvfeqkqeeavnqlnkmvtdpqaaieaielmpmgeitnavkelllcgyqpddepylsmllqtfraskllelktksrilipkgrammgcldetrtlkygqvfiratsgvndndrftvtgkvviaknpclhpgdirilhavdvpvlhhmfncvvfpqqgprphpnecsgsdldgdiyfvswdpslipprmvtpmdytpaptetldhdvtieeveeyftnyivneslgmianahvvfadkedlkaesspcielaklfsiavdfpktgvpalippelhvkeypdfmekldkvtyeskgvigklyrei(seq id no:6)
[0092]
atrdr1δ的氨基酸序列如下：
[0093]
mgkiqvfgfpngvsaeevkkflerltgsgtvyaikvrqpkkggprvyaivqftserhtrliitaaaerlyygrsylvtparvyfsgpevnvsnrvlrhyskyinnflrvsfvdedlekvrsmdlsprsstqrrtklydriysvlrdgivigdkkfeflafsssqlrensawmfapidritaahirawmgdfdhirnvakyaarlgqsfsssretlnvrsdeievipdveiislgtryvfsdgigkisaefarkvarkcgltefspsafqiryggykgvvavdpnsskklslrksmskfesentkldvlawskyqpcymnrqlitllstlgvtdsvfekkqrevvdrldailthpleahealglmapgentnilkalilcgykpdaepflsmmlqnfraskllelrtktrifisggrsmmgcldetrtleygqvvvqysdpmrpgrrfiitgpvvvaknpclhpgdvrvlqavnvpalnhmvdcvvfpqkglrphpnecsgsdldgdiyfvcwdqelvpprtsepmdytpeptqildhdvtieeveeyfanyivndslgiianahtafadkeplkafsdpcielakkfstavdfpktgvaavipqhlyvkeypdfmekpdkptyesknvigklfrev(seq id no:7)
[0094]
此外，细胞计数的结果显示，与转入空载体和转入携带ago2的载体的对照细胞相比，分别转入osrdr1δ和atrdr1δ约3.5天后，细胞的增殖明显减少，这意味着rdr1蛋白对于癌症的抑制功能是依靠其rdrp结构域介导的，而且只需要单独的rdrp结构域即可实现抑制肿瘤细胞增殖的目的(图9c)。
[0095]
本实施例的意义在于：结合本技术在前文中所提到的，在各不同物种的所有rdr基因中(不限于rdr1)rdrp是非常保守的，因此在仅使用rdrp即可实现本发明目的的情况下，可以推知使用各物种rdr家族的基因均能够产生类似的技术效果；同时，通过使用更短的rdrp结构域取代全长蛋白，提高了蛋白的稳定性，并且降低了未来药物开发时的成药难度，具有极高的临床应用价值。
[0096]
实施例7 rdr1蛋白可抑制荷瘤模型小鼠体内的肿瘤生长
[0097]
为了进一步研究rdr1对于癌细胞的抑制作用，本实施例选择了a549luc细胞系进行了荷瘤模型实验。将等量的野生型a549luc细胞和转入水稻rdr1的a549luc-osrdr1细胞接种于npg小鼠(n＝5)，两者均给予dox饮水，持续使用卡尺测量肿瘤体积。待对照组肿瘤体积增至700-800mm3时，取瘤称重。结果如图10a，b和c显示，过表达rdr1可以显著降低a549luc-osrdr1细胞所成荷瘤的体积和瘤重，同时由于两组细胞同时被给予了dox饮水，这也排除了dox抑制可能荷瘤生长的可能性。图10d则表明rdr1降低了a549荷瘤luciferase的表达强度。并且，可以看到在21天成瘤后，rdr1的抑制作用一直非常的显著。从生长趋势来看，肿瘤增长呈不断放缓的趋势，甚至在实验结束时接近不再生长的状态。这些结果表明rdr1能够显著且持续的抑制体内肿瘤的生长。
[0098]
实施例8表达rdr1蛋白的癌细胞中的rna表达分析
[0099]
为了进一步研究rdr1抑制癌细胞增殖的机制，本实施例进一步研究了连续诱导rdr1表达6天的不同细胞系，使用trizol提取rna后，按照illumina公司的rna-seq试剂盒说明书进行建库，随后进行ngs测序，下机数据进行处理后实行比对，得到细胞系中每个基因的表达量。
[0100]
随后在转录组水平观察不同癌症细胞系中诱导rdr1稳定表达所带来的基因表达水平的变化，以正常细胞系作为对照，以2倍作为判断基因表达显著性变化的标准。在同一细胞系中，以野生型或没有dox诱导的结果作为参考。结果表明rdr1显著改变了癌细胞的转录组整体表达水平(图11a)，但在正常的细胞系nih/3t3和rpe-1中，转录组的变化较小，这也与此前观察到的rdr1能够特异性的抑制癌细胞而不影响正常细胞的结果相一致。同时还可以观察到，在各类癌细胞中，下调的基因数目往往大于上调的基因数目，这也与此前发现的rdr1对癌细胞具有的抑制作用的现象相吻合。
[0101]
为了进一步研究rdr1蛋白抑制癌症细胞增殖涉及哪些通路的作用，本实施例进一步采用gsea全基因组数据进行聚类分析。选用kegg的基因集作为gsea分析的参考基因集，按照说明将基因表达列表和数据集导入软件，以gsea官方文档中建议的fdr《0.25，p《0.05筛选显著变化的通路。图11b中展示了不同癌细胞中表达rdr1后显著下调的通路。其中细胞周期(cell cycle)通路在所有的癌症细胞系中均显著下调，但在正常细胞系中没有呈现出明显下调的趋势；同时dna复制(dna replication)通路也在大部分癌症细胞系被观察到明显下调，值得注意的是，这两个通路通常被认为与肿瘤细胞增殖具有密切关系。
[0102]
进一步的，对实施例7中kegg分析的源文件中单独找到细胞周期通路的分析结果，单独进行汇总分析。图12展示了在多种癌症细胞系中，包括非小细胞肺癌a549luc和h1299，宫颈癌hela，肝癌hepg2，慢性髓性白血病k562中，无论是osrdr1还是atrdr1，都可以细胞周期相关基因的表达整体显著下调(黑线在整体上聚集在右端)。而在正常细胞系中，基因的表达没有呈现出较为明显的上下调倾向(黑线在整体上聚集在左端)。这进一步说明rdr1不影响正常细胞的细胞周期，而特异靶向癌细胞中异常激活的癌细胞基因。
[0103]
实施例9 rdr1能够改变癌细胞的细胞周期
[0104]
采用前述6孔板中诱导的方法，dox诱导6天后，胰酶消化细胞，4％多聚甲醛固定后，使用0.3％triton-x破膜，按照试剂盒beyoclick edu-488(beyotime)的说明书染色，随后立即通过流式细胞分析仪进行细胞周期分析。结果表明发现过表达rdr1蛋白6天后的癌症细胞，包括非小细胞肺癌h1299，肝癌hepg2和结直肠癌hct116，相较于野生型细胞(未使用病毒侵染)和未经过dox诱导的细胞系(rdr1未过表达)，其细胞周期被大部分阻滞在g1或g2/m期，s期细胞比例显著下降，g1期的细胞类群比例大幅增加，并且g2期也出现了一定的阻滞。但是，rdr1对于正常细胞nih/3t3则没有显著的作用。这说明，rdr1蛋白能够特异并广泛抑制癌症的机制之一主要是通过抑制癌症细胞中异常表达的细胞周期基因，从而将癌症细胞阻滞在g1期和g2/m期以降低处于分裂s期的细胞比例所实现的。
[0105]
实施例10 rdr1能够改变癌细胞的原癌基因表达及相关实验验证
[0106]
前述实施例结果表明，在多个癌症细胞系中导入rdr1蛋白并诱导表达后，一些与癌症发生相关的通路整体表达水平下调较为明显，这意味着在这些通路里，可能存在着一些共同下调的基因，这些基因对于表型的影响可能具有重要作用。为了这样的基因，利用k-means聚类方法，在多个细胞系的基因表达谱的热图中寻找共同下调的基因，并利用
reactome内置的聚类分析工具实现聚类。图14a展示了共同下调的基因的聚类结果。reactome是一个开源数据库，包括信号通路和代谢分子及其参与的生物途径和过程。分析结果显示，在在496个下调的基因被显著富集到的通路中，p值最低的8条通路主要是细胞周期通路及其子通路，其中包括了ckd6，myc等已知原癌基因或调节细胞增殖的重要基因。可见，不同癌细胞中rdr1共同靶向下调的基因均属于细胞周期通路，这与gsea分析的结果吻合，进一步印证了rdr1通过调控细胞周期基因的表达进而抑制癌症细胞的异常增殖
[0107]
进一步，通过文献检索和数据库检索，在496个普遍下调的基因中确定了49个原癌基因。通过go分析注释靶基因中的原癌基因，发现这部分基因主要分为两类，分别是调控细胞周期的原癌基因和调控细胞种群增殖的原癌基因(图14b)。
[0108]
从共同显著下调的癌基因热图中，挑选效应相对显著、通路研究较多的癌基因进行western blot验证。在6孔板中铺10000个细胞起始，加高浓度dox(4ug/ml)为实验组，不加dox的细胞系为对照组，连续诱导rdr1过表达6天，随后收获细胞使用ripa细胞裂解液和pmsf处理细胞，离心后取上清，western blot检测挑选的marker gene在癌症细胞中的表达情况(图14c)。在dox诱导rdr1过表达6天后，发现egfr表皮生长因子和调控细胞周期的致癌基因plk1均在蛋白水平上有一定程度的下调，这也与前述rna-seq数据直接对应，进一步证明了rdr1蛋白的过表达能够抑制癌症细胞中异常表达的致癌基因和细胞周期相关的基因。
[0109]
实施例11 rdr1能够上调在癌细胞中被调低表达的mirna
[0110]
在植物细胞中，rdr1作为核心的植物免疫蛋白通过介导小rna的产生实现植物天然免疫的功能。为了进一步研究在动物细胞中rdr1对小rna通路可能的影响，本实施例对rdr1蛋白的癌症细胞进行了小rna-seq，以研究rdr1蛋白是否影响了癌细胞内的小rna通路，并且在此基础上实现了对癌细胞增殖和侵袭的抑制。
[0111]
首先收集了非小细胞肺癌a549luc-osrdr1/atrdr1和正常细胞nih3t3-atrdr1连续诱导表达6天的细胞，以及宫颈癌hela-osrdr1和肝癌hepg2-atrdr1的以24h固定时间间隔(从第一天开始加入含有dox的诱导培养基，每隔24h在固定时间收取细胞，以不含dox培养的细胞作为对照)收取的细胞，提取rna。在15％tbe-尿素凝胶(invitrogen)上分离得到总rna 30μg，并从凝胶中回收长度为15-50nt的小rna，然后使用小rna文库制备试剂盒(neb)建文库。随后构建好的文库进行ngs测序，下机数据进行去接头和比对等步骤，进行进一步的分析。
[0112]
对各组细胞的small rna-seq数据进行分析发现，在多种癌症细胞系表达rdr1后，癌症细胞中mirna的水平整体上调，其中在hela-osrdr1和hepg2-atrdr1中结果更加明显(在5天的时间间隔过程中，mirna的表达相较于对照稳定震荡上升)，然而在正常细胞nih/3t3中没有显著的变化(图15a-c)。这也意味着，rdr1对于这些mirna失衡的癌细胞，可以恢复其中的mirna表达，然而正常细胞中有着严格调控mirna产生的机制，从而避免了对于正常细胞的“误伤”。
[0113]
选取在a549-atrdr1、a549-osrdr1、hela-osrdr1和hepg2-atrdr1中三组数据相比于相应对照组显著上调(至少达到对照组的2倍)的成熟mirna作为选定的集合，利用mirwalk工具进行靶基因的预测。并将实施例10中得到的原癌基因与利用mirwalk工具预测的基因取交集。图15d展示了rdr1靶基因所对应的mirna，而这些mirna因为rdr1的作用而表达量显著上调，从增强对靶基因的调控作用。
[0114]
通过靶mirna的分析，可以看出不同癌症细胞中共同显著上调的mirna与rdr1共同靶向的癌基因具有很好的相关性和对应性(图15d-e)，因此rdr1在这些癌细胞中的表达可能通过增强这些mirna的表达水平进而靶向过度活化的原癌基因，通过“rdr1-mirna-proto oncogenes-cell cycle”轴实现对癌细胞增殖的抑制。
[0115]
实施例12 rdr1给癌细胞mirna加尾以上调被调低表达的mirna
[0116]
在癌症细胞中表达rdr1后，通过小rna测序发现，rdr1似乎恢复了癌细胞中下调的mirna水平，然而rdr1如何上调靶基因的mirna尚不清楚。与此同时，rdr1作为一种rna依赖的rna聚合酶，其生化机制也仍需进一步解析。一项对于rdr6蛋白的研究表明，rdr6存在着3’核苷酸转移酶的活性和以单链rna为模板合成rna的活性。由于在植物中，没有报道称其以mirna为模板合成mirna。一种可能的机制是rdr1的3’核苷酸转移酶对mirna行使了加尾功能，这种加尾可能促使mirna加工成熟。
[0117]
为了研究mirna的加尾现象，本实施例进一步参考对于small rna-seq的处理方式，对加尾现象较为明显的a549luc和hepg2细胞系进行统计。图16a的数据表明，加尾的比例在各个癌症细胞系中随时间上升。联系实施例11的结果，rdr1使癌细胞中被降低的mirna整体表达水平升高。事实上，相对于本底表达的上升，加尾部分上升的幅度更大，因此图16a中加尾部分的mirna占据了更高的比例。
[0118]
为了观察加尾的变化是否有核苷酸的偏好性，对四种的单核苷酸的加尾进行了统计，并与不加尾的部分进行比较。图16b展现了在a549，hepg2和nih/3t3中四种核苷酸加尾的统计结果。
[0119]
结果表明，在hepg2-atrdr1中四种加尾类型的比例都相对提高，对于a尾和g尾体现出了较为明显的偏好性,加尾的mirna升高倍数明显大于不加尾的mirna升高倍数。在a549luc-osrdr1中，加单尾和不加尾的成熟mirna上升幅度比之在a549luc-atrdr1中稍小，加a尾和加g尾相比于其他两种加尾类型上升略明显；而在hela-osrdr1中，则倾向于在mirna后加u尾和c尾；值得注意的是，对于所有的加尾类型，在nih/3t3中加单尾和不加尾都没有明显的变化(图16b)。在图16c中，我们展示了一些表达量相对较高并已经明确鉴定的mirna的末端加尾情况，同时再次印证了图15和图16b中整体的分析，即rdr1给癌细胞mirna加尾以上调被调低表达的mirna。
[0120]
实施例13 rdr1给癌细胞mirna加尾
[0121]
为了验证smallrna-seq分析的结论，接下来构建了osrdr1-mcherry融合蛋白的细胞系，明确rdr1蛋白在细胞中的定位。利用引物location_osrdr1_mcherry_f(seq id no：22)、location_osrdr1_mcherry_r(seq id no：23)、location_t2a-egfp_f(seq id no：24)和location_t2a-egfp_r(seq id no：25)将mcherry的序列融合在osrdr1的c端终止密码子前，连同t2a-egfp序列连接到慢病毒载体上，测序验证无误后，包装osrdr1-mcherry的病毒，和teton-3g病毒一起侵染癌症细胞后，加入低浓度dox(100ng/ml)诱导培养24小时后进行流式细胞分选，分选出egfp和mcherry的双阳性细胞。扩繁起来后取10000个细胞铺于专用的成像皿上，加入高浓度dox(4ug/ml)诱导48h后，再加入1:100稀释的hoechst染料对细胞核细胞核染色半小时，pbs洗涤，拍照记录。结果显示，不论是在正常细胞还是在癌细胞中，rdr1均特异定位在细胞质中，而非细胞核(图17)。这暗示了rdr1蛋白通过在mirna后加a尾或g尾以广泛上调mirna水平是在细胞质中发生的。
[0122]
接下来，本实施例进一步探索了rdr1蛋白在癌症细胞中通过对mirna加尾从而上调mirna水平是依赖自身核酸转移酶活性而直接实现的，还是通过与其他已知蛋白互作而间接实现的。整体而言，可以利用连接于rdr1前的flag标签，进行flag-ip(immunoprecipitation)后，将洗脱的包含rdr1蛋白和可能互作蛋白的上清液进行ms(mass spectrometry)分析，鉴定可能的互作蛋白。具体而言，首先收获高浓度dox诱导rdr1过表达的15cm培养皿中的hela和hepg2-osrdr1/atrdr1细胞各两盘，pbs洗涤后，加入1ml配制的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，刮取细胞后冰上裂解30分钟，离心取上清，加入洗涤处理好的anti-flag m2 agarose beads(sigma-aldrich)，4摄氏度结合过夜，第二天加入配制的1
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flag peptide(sigma-aldrich)竞争性洗脱，取15ug总蛋白的洗脱液送公司进行ms分析。结果显示，在上述实验鉴定出的与rdr1相互作用的蛋白均为内参蛋白，而未发现任何与mirna生成加工通路相关的蛋白(表1)。由此可见，rdr1蛋白通过自身的核酸转移酶活性，实现了在mirna的3'末端添加一个或多个核苷酸。
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在这里，通过rdr1-ip后的质谱分析和rdr1的胞内定位实验，确认了rdr1蛋白通过在mirna后加a尾或g尾以广泛上调mirna水平是在细胞质中独立进行的生物学过程，并不依赖于其他mirna生成或修饰途径的元件(图17，表1)，这与小rna分析的结论吻合。
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以上结果确立了rdr1抑制癌症细胞增殖，治疗细胞增殖性疾病的模型：导入癌症细胞后，rdr1通过其3’核苷酸转移酶的活性，对于mirna进行广谱性加尾。这些加尾有利于mirna的稳定和加工成熟，从而使得癌症中的mirna呈现出广谱性地升高。而由于正常细胞中mirna生成的反馈机制，rdr1并不能显著改变正常细胞中的mirna水平。由于在癌症细胞中，mirna由于多种原因从而生成受到了整体的抑制，同时癌症细胞系中部分基因(尤其是细胞增殖相关的基因)过度活化，表现出旺盛的代谢活动和增殖活动。rdr1导致的mirna表达水平升高将会对一些在癌症细胞中显著上调的基因进行靶向抑制，其中包括了许多与细胞周期相关的基因和细胞种群增殖的基因，从而达成特异并广泛抑制癌症的目的。
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表1质谱分析rdr1在细胞中的可能互作蛋白
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hela-osrdr1( )dox
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hela-atrdr1( )dox
[0130][0131]
hepg2-osrdr1( )dox
[0132][0133]
hepg2-atrdr1( )dox
[0134]
[0135][0136]
表2实施例中所使用的所有引物序列
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表3实施例所使用的实验材料
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[0141][0142]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。