一种基于点扫描策略的超分辨显微成像方法与流程

：
1.本发明属于光学显微镜领域，尤其涉及一种基于点扫描策略的超分辨显微成像方法。


背景技术：

2.经过二十多年的发展，超分辨显微镜已经成为生物学和化学研究的核心仪器设备。为获得衍射极限以下样品的空间结构信息，目前，市场上主流的超分辨仪器可分为三大类，分别是结构光照明显微术(sim)，受激辐射损耗显微术(sted)和单分子定位显微术(palm、storm)。
3.结构光照明显微镜的主要原理是使用条纹状的激发光照射样品，然后从获得的图像中解析出样品的超分辨细节。然而产生这种条纹状的激发光需要复杂的光路，既增加了成本又提高了技术复杂度，后续还需要特殊的软件重构获得超分辨图像，稍有不慎便产生假象，并且由于条纹状的激发光也同样受衍射极限的限制，sim的最终分辨率也只有100nm。
4.受激辐射损耗显微镜的基本原理是使用环形的光束将共聚焦光斑周围的荧光关闭，从而获得比较高分辨的点扩散函数，最终获得超分辨图像。环形光束的产生需要特殊的光学器件(螺旋相位板或空间光调制器)，获得能够关闭荧光信号的环形光需要非常高(数毫瓦至上百毫瓦)的激光功率。sted显微镜的激发光和损耗光的双光路配置大大增加了仪器的复杂度和成本，同时所使用的高功率激光也会对样品造成严重的不可逆的损伤，这极大地限制了sted显微镜在活细胞研究中的应用。
5.单分子定位显微镜，如随机光学重构显微镜(storm)，光活化定位显微镜(palm)等，使用随机单分子闪烁的荧光探针，在时间上将样品的空间信息分开并记录为视频，然后使用软件从每一帧中提取单分子的定位信息，将定位信息使用软件叠加获得超分辨图像。单分子定位显微术本质上是使用时间分辨率换取空间分辨率，这导致了单分子定位技术无法用于成像动态的生物或者化学过程。另外，单分子定位显微术获得超分辨信息需要使用比较复杂的定位算法和漂移矫正算法。
6.综上所述，在主流的超分辨显微镜中，无论是哪一种技术方案，都需要特殊的光学组件、复杂的图像后处理软件或者高功率激光中的一项或者几项，这大大提高了超分辨显微镜的技术难度和购置成本，无形之中在用户和仪器之间形成了一道壁垒。
7.在所有的衍射限制的显微镜当中，共聚焦显微镜由于其全面且相对较高的性能，因而成为大量生物学、化学、医学和光学实验室的标配设备，在各个实验室中有大量的存量。为进一步提升共聚焦显微镜的分辨能力，目前的主要技术方案首先是从物理上对共聚焦显微镜的光路进行改进，非线性焦点调制显微镜就是这类技术的代表(参见【zhao g,zheng c,kuang c,et al.nonlinear focal modulation microscopy[j].physical review letters,2018,120(19):193901】)。这类技术使用光场调制的方式在共聚焦激发光斑上添加额外的空间频率，使用类似sim(结构光照明显微成像)的方式获得超分辨图像。然而，这种技术需要在共聚焦显微镜的特定部位添加特殊的光学组件，这无疑又增加了改装
的技术门槛，并且这种方案同样需要复杂的软件解析出最终的超分辨图像。因此非线性调制显微镜的仍然需要购置特定仪器，这又会增加仪器的购置成本和使用成本。
[0008]
若不对光路进行改造，使用具有特殊光物理效应的无机纳米颗粒作为荧光探针标记样品(nat.commun.10,3695(2019),nature volume 589,pages230
–
235(2021))也是一条行之有效的道路。目前利用荧光探针的非线性效应如特定的激发阈值、多光子效应、光子雪崩效应等，获取样品的高分辨细节也已经被大量确认。主要原理便是利用这些非线性效应压缩共聚焦光斑的点扩散函数，在荧光的响应的非线性区收集荧光信号，从而在衍射极限以下获得样品的空间细节。然而相对较大的物理尺寸和复杂的表面化学使得这些无机纳米颗粒比较难修饰，不能保证其靶向性和标记密度，因而极大限制了这种方案在超分辨领域的应用。
[0009]
传统的超分辨显微术需要在特定的仪器上实现，而这些仪器价格昂贵、光毒性大、技术方案复杂。经过数十年的发展激光共聚焦显微镜已经成为大量的生物学或者化学实验室的标配仪器，在各地的实验室中拥有极大的存量。将传统的共聚焦显微镜进行微改装，使其具有超分辨成像能力，能够最大限度地节约仪器成本和操作门槛。同时，由于实验室需求的多样性，在进行微改装的同时还需要保证不损伤共聚焦显微镜的通用性，最大限度地适应多种成像需求。在此基础之上，目前的主流方案是使用具有特定光物理响应的纳米颗粒标记细胞，但是这种方案又不能保证标记的靶向性和标记密度，最终导致极差的成像效果和极其有限的使用场景。
[0010]
参考文献
[0011]
[1]denkova,d.,ploschner,m.,das,m.et al.3d sub-diffraction imaging in a conventional confocal configuration by exploiting super-linear emitters.nat commun 10,3695(2019).https://doi.org/10.1038/s41467-019-11603-0
[0012]
[2]guangyuan zhao,cheng zheng,cuifangkuang,renjie zhou,mohammad m.kabir,kimani c.toussaint,jr.,wensheng wang,liang xu,haifeng li,peng xiu,and xu liu.nonlinear focal modulation microscopy.phys.rev.lett.120,193901(2018).即，https://doi.org/10.1103/physrevlett.120.193901


技术实现要素：

[0013]
本发明的目的在于提供一种基于点扫描策略的超分辨显微成像方法，以实现待测样品的超分辨显微成像。
[0014]
为了实现上述目的，本发明提供一种基于点扫描策略的超分辨显微成像方法，包括：
[0015]
s0：获取扫描关闭显微镜的理想点扩散函数，并得到所述理想点扩散函数所对应的激光功率；其中，所述扫描关闭显微镜的结构与共聚焦显微镜相同且其激光功率大于共聚焦显微镜；所述理想点扩散函数所对应的激光功率为使得共聚焦显微镜的所成图像为共聚焦光斑的小半部分时的激光功率；
[0016]
s1：利用荧光探针对待测样品进行标记；
[0017]
s2：利用所述理想点扩散函数所对应的激光功率在共聚焦显微镜上获取待测样品的原始测量图像；
[0018]
s3：对所述步骤s2获取的待测样品的原始测量图像进行处理，以得到待测样品的最终的超分辨图像。
[0019]
所述步骤s0包括：将标准样品放置在共聚焦显微镜上，按照共聚焦显微镜的操作说明书调整共聚焦显微镜的扫描速度、扫描步长、针孔大小、接收带宽、探测器增益的测量参数，以观察所成图像；同时，从共聚焦显微镜的荧光聚焦透镜所在的成像端看到所成图像中的共聚焦光斑比较圆时所对应的共聚焦显微镜的激光功率开始，等间隔不断递增地调节共聚焦显微镜的激光功率并再次观察所成图像，直到所成图像中的光斑变为原本的共聚焦光斑的小半部分，此时得到的激光功率是扫描关闭显微镜的理想点扩散函数所对应的激光功率，用于将共聚焦显微镜调整为扫描关闭显微镜，并且此时的所成图像为扫描关闭显微镜的理想点扩散函数。
[0020]
所述标准样品为直径小于50nm的荧光微球。
[0021]
所述待测样品为生物样品；待测样品的荧光探针是荧光染料分子，利用荧光探针对待测样品进行标记是指对待测样品进行免疫荧光染色；且在所述步骤s2中，待测样品的原始测量图像是指待测样品在一个维度上的超分辨图像。
[0022]
所述待测样品为生物样品；待测样品的荧光探针是具有开关效应的荧光蛋白，利用荧光探针对待测样品进行标记是指对待测样品进行开关蛋白转染；且在所述步骤s2中，待测样品的原始测量图像是指待测样品在一个维度或者两个维度上的超分辨图像。
[0023]
所述步骤s2包括：将待测样品放置在共聚焦显微镜上，按照共聚焦显微镜的操作说明书调整共聚焦显微镜的扫描速度、扫描步长、针孔大小、接收带宽、探测器增益的测量参数，而激光功率则调整至步骤s1中的理想点扩散函数所对应的激光功率，以将共聚焦显微镜用作扫描关闭显微镜；随后，在待测样品处于荧光态的情况下利用扫描关闭显微镜测量获取待测样品的原始测量图像。
[0024]
所述扫描关闭显微镜工作在高速模式或者高分辨模式下；在高速模式下，线扫描速度调整至400hz，扫描步长调整至12nm，针孔大小调整为3艾里斑，激光功率调整至236μw；在高分辨模式下，线扫描速度调整至10hz或100hz，扫描步长调整至12nm，针孔大小调整为3艾里斑，激光功率调整至136μw。
[0025]
所述步骤s3包括：
[0026]
s31：将步骤s2获取的待测样品的原始测量图像输入到图像处理软件，调整图像上采样系数以获得第一扩展图像，进而扩展图像的逻辑分辨率；
[0027]
s32：使用图像处理软件将步骤s1获取的扫描关闭显微镜的理想点扩散函数的主瓣和旁瓣拆分开，得到理想点扩散函数的主瓣和旁瓣的函数表达式；
[0028]
s33：根据理想点扩散函数的主瓣和旁瓣的函数表达式和旁瓣权重因子δ，来重构得到去旁瓣点扩散函数，使得去旁瓣点扩散函数的主瓣的函数表达式为正值且其旁瓣的函数表达式为负值，再将重构的去旁瓣点扩散函数与步骤s31获得的第一扩展图像进行卷积，得到卷积结果；随后，不断调整旁瓣权重因子δ，并重复执行得到去旁瓣点扩散函数以及进行卷积的步骤，直至卷积结果为无旁瓣的图像，此时得到的卷积结果为去旁瓣图像；
[0029]
所述去旁瓣点扩散函数为：
[0030]hlin
(r)＝h
main
(r) δh
side
(r)(-1《δ《0)，
[0031]
其中，h
lin
(r)代表去旁瓣点扩散函数，δ为旁瓣的权重因子。
[0032]
当待测样品的原始测量图像是指待测样品在两个维度上的超分辨图像时，所述步骤s3还包括：
[0033]
s34：对待测样品在两个维度上的超分辨图像所分别处理得到的两个去旁瓣图像执行漂移矫正步骤和图像合成步骤，以将两个去旁瓣图像相互叠加并将频率域信息和空间域信息整合到一起，输出并存储最终的超分辨图像。
[0034]
所述漂移矫正步骤包括：
[0035]
s341：将步骤s33获取得到的两个去旁瓣图像再次进行双立方插值以得到第二扩展图像，进而扩展其图像分辨率。
[0036]
s342：计算两个去旁瓣图像之间的相关性图谱，找到所述相关性图谱中相关性最强的点的位置；
[0037]
s343：根据相关性最强的点的位置，将两个去旁瓣图像叠加到一起，以使得两个去旁瓣图像的各个像素点的空间位置对齐；
[0038]
所述图像合成步骤具体包括：
[0039]
s341’：通过傅里叶变换,在频率域获得两个去旁瓣图像的空间频率信息；
[0040]
s342’：将两个去旁瓣图像中每个像素点的空间频率进行对比,提取两个去旁瓣图像中每个像素点的空间频率相对较大的值整合为新的频率域图像，以将两个去旁瓣图像的高频信息整合到一起；
[0041]
s343’：对新的频率域图像进行逆傅里叶变换，获得频率域合成图像；
[0042]
s344’：将两个去旁瓣图像中每个像素点相对较小的值提取并整合为空间域合成图像；
[0043]
s345’：将空间域合成图像与频率域合成图像的各个像素点的值相乘，得到最终的超分辨图像。
[0044]
本发明基于点扫描策略的超分辨显微成像方法的图像获取是在现有的共聚焦显微镜的基础上进行的，显微镜硬件方面无任何改进，仅仅需要对用于激发的激光功率进行提高以获得荧光关闭效应，获取一个方向的高分辨图像，通过多次扫描获取多个方向的超分辨信息后，通过配套的软件重建超分辨图像。
[0045]
本发明基于点扫描策略的超分辨显微成像方法的图像处理通过使用配套的图像处理软件来执行，因此技术原理简单，操作简便，兼容性好，图像处理软件既可以单独运行，又可以以共聚焦超分辨插件的形式集成在实验室已有的共聚焦显微镜上，能够大大降低仪器的购置成本和操作成本。
[0046]
本发明基于点扫描策略的超分辨显微成像方法的样品制备只需要传统的荧光标记方法(比如开关蛋白转染和免疫荧光染色)，能够适用各种研究场景，兼容各种细胞制样技术，无需借助特殊的荧光探针，能够在免疫荧光染色细胞样品和开关蛋白转染细胞样品上实现超分辨成像。
[0047]
本发明有两种模式，即高分辨模式和高速模式，能够适用于结构和功能表征又能够适用于时间序列分析，高分辨模式的最高分辨率能够达到100nm，高速模式线扫描速度能够达到400hz。
附图说明
[0048]
图1为本发明的基本光路原理图。其中，1-连续光激光器；2-扫描振镜；3-二向色镜；4-成像物镜(放大倍数63
×
/数值孔径1.4)；5-荧光聚焦透镜；6-点探测器(光电倍增管、雪崩二极管等)；
[0049]
图2为本发明获得的理想点扩散函数图，图中清晰显示在一个维度上分辨率的提升以及因此产生的旁瓣。
[0050]
图3为本发明的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法的图像处理步骤的流程图。
[0051]
图4为本发明的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法获取的免疫荧光染色微管样品的超分辨图像以及与传统共聚焦显微镜获取的同区域样品图像的对比图。
[0052]
图5为本发明获取的开关蛋白转染的波形蛋白细胞超分辨图像。
具体实施方式
[0053]
本发明提供了一种通过扫描关闭显微镜实现的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法，所述扫描关闭显微镜基于现有的共聚焦显微镜。
[0054]
相应地，本发明还提供了一种扫描关闭显微镜，该扫描关闭显微镜基于现有的共聚焦显微镜且被配置为执行本发明的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法。具体来说，扫描关闭显微镜没有改变现有的共聚焦显微镜的任何硬件配置，扫描关闭显微镜通过执行本发明的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法，所实现的与现有的共聚焦显微镜的区别点主要在于：1.所使用的激光功率相对于传统的共聚焦显微镜更高；2.扫描关闭显微镜的物理基础不是共聚焦显微镜的线性激发，其物理基础在于标记探针的荧光关闭效应；3.扫描关闭显微镜每次扫描只能获取一个维度的超分辨图像，需要后续的数据合成；4.扫描关闭显微镜的分辨率能达到100nm，属于超分辨显微镜，比传统共聚焦显微镜高一倍。
[0055]
具体来说，本发明的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法的物理基础在于标记探针的荧光关闭效应。所述荧光关闭效应包括荧光漂白、荧光开关的关闭过程等，荧光关闭效应是一种广泛存在的非线性光学响应，其意味着待测样品的荧光会随着激光功率提高至某个程度而关闭，从而提高空间分辨率。这种荧光关闭效应通过非线性光学响应使得光强超过设定值的荧光分子被关闭，因此能够将超分辨空间结构信息编码进共聚焦光斑的点扩散函数中，从而获得待测样品的空间结构细节。本发明将这种荧光关闭效应与扫描共聚焦显微术相结合，因此激光扫描时得到的共聚焦光斑的既是荧光的激发光又是关闭光，调整合适扫描光速度和功率，使得荧光分子只能在小半部分的共聚焦光斑内发荧光(例如，仅仅使得共聚焦光斑的最上部的小半部分发光以提高其分辨率)，从而压缩点扩散函数，达到提高分辨率的目的。目前传统的共聚焦显微镜是线性的,扫有共聚焦激发光斑内都能发荧光,成像光斑是一个高斯光斑(该光斑为圆形),我们的技术激光功率相对较高,荧光分子只能在小半部分的共聚焦光斑内发射荧光,这样可以压缩点扩散函数,提高分辨率。
[0056]
此外，扫描光斑的既是激发光又是关闭光，因此，本发明不需要额外设置光源，不用购置新的仪器，可以借用共聚焦显微镜的基本框架,直接通过提高共聚焦显微镜的激光功率从而将其用作扫描关闭显微镜，将扫描关闭显微镜的分辨率提高至100nm。
[0057]
如图1所示，现有的共聚焦透镜包括在第一光轴上依次排布的连续光激光器1和扫
描振镜2，以及在第二光轴上依次排布的成像物镜4、二向色镜3、荧光聚焦透镜5和点探测器6。所述扫描振镜2设置为通过其镜面将连续光激光器1发射的光反射至二向色镜3，并通过扫描振镜2的镜面摆动实现光束扫描。所述二向色镜3设置为将来自扫描振镜2的光反射至成像物镜4，并将来自成像物镜4的荧光和激光分离以仅仅使荧光透过。所述成像物镜4设置为将来自二向色镜3聚焦到待测样品上，并收集来自待测样品的荧光。荧光聚焦透镜5设置为将收集的荧光信号聚焦到点探测器6。点探测器6设置为将荧光信号光电转换为电信号。
[0058]
其中，根据本发明的技术原理，共聚焦显微镜的配置如下：不小于10mw的连续光激光器，数值孔径为1.4的大数值孔径物镜，采用线扫描速度为10-1400hz的快速扫描振镜，接收探测器为点探测器，可改变光场的扫描方向。本发明设计方案的硬件光路部分如图1所示，要求物镜前焦面的辐照度达到300mj cm-2
，针孔在1-5艾里斑可调。
[0059]
由此，激光是由连续光激光器1发射，经过扫描振镜2、二向色镜3到成像物镜4，照射到待测样品上，并通过扫描振镜2扫描；随后，由成像物镜4收集荧光信号返回经过二向色镜3、荧光聚焦透镜5、最后被点探测器6探测到。
[0060]
本发明的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法可以用于各种待测样品(例如生物样品)的成像。本发明的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法主要分为三大步，分别是样品制备、图像获取和图像后处理。其中，在图像获取的过程中使用了比较高的激光功率，从而在具有荧光关闭效应的待测样品上获得非线性效应，以最终通过图像获取的单次扫描获得一个维度的超分辨图像。由于本发明原理的限制，每次扫描待测样品只能获得一个方向的超分辨图像，如果要获得两个维度的超分辨图像，图像获取的步骤中必须通过多次(至少两次)扫描待测样品获得其他方向的高空间频率信息。另外，由于待测样品每被扫描一次，激发光斑会将待测样品的荧光全部关闭，因此要求标记待测样品的荧光探针能够被反复开关(有荧光能够被激发定义为开,反之为关)，以便获得待测样品多个方向的高分辨信息。因此，图像后处理是用于获得两个维度的超分辨图像后，提取各个方向的超分辨信息，合成超分辨图像并输出超分辨图像。
[0061]
具体来说，本发明的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法利用一个扫描关闭显微镜来实现，该扫描关闭显微镜的结构与现有的共聚焦显微镜相同且其激光功率大于共聚焦显微镜，所述成像方法具体包括以下步骤：
[0062]
步骤s0：获取扫描关闭显微镜的理想点扩散函数，并得到所述理想点扩散函数所对应的激光功率；
[0063]
在具体使用扫描关闭显微镜对待测样品进行实验之前，需要对扫描关闭显微镜的理想点扩散函数进行测量。获取扫描关闭显微镜的点扩散函数的步骤是现有技术。获取扫描关闭显微镜的理想点扩散函数是指在扫描关闭显微镜上获得标准样品的原始图像，也就是说，测量点扩散函数就是指拿尺寸非常小的点去做扫描关闭显微镜成像，使得之后步骤在对待测样品成像时，待测样品所成的像是多个上述的点扩散函数的叠加。
[0064]
所述理想点扩散函数所对应的激光功率为使得共聚焦显微镜的所成图像为共聚焦光斑的小半部分时的激光功率。
[0065]
所述步骤s0具体包括：将标准样品放置在共聚焦显微镜上，按照共聚焦显微镜的操作说明书调整共聚焦显微镜的扫描速度、扫描步长、针孔大小、接收带宽、探测器增益等测量参数，从而根据需要调整至比较好的信噪比，以观察所成图像；同时，从共聚焦显微镜
的荧光聚焦透镜所在的成像端看到所成图像中的共聚焦光斑比较圆时所对应的共聚焦显微镜的激光功率开始，等间隔不断递增地调节共聚焦显微镜的激光功率并再次观察所成图像，直到所成图像中的光斑变为原本的共聚焦光斑的小半部分，此时得到的激光功率是扫描关闭显微镜的理想点扩散函数所对应的激光功率，用于将共聚焦显微镜调整为扫描关闭显微镜，并且此时的所成图像为扫描关闭显微镜的理想点扩散函数。原本的共聚焦光斑的小半部分例如图2所示，仅仅包括原本的共聚焦光斑的上部的小半部分。
[0066]
步骤s0的标准样品具备荧光关闭效应，但是发生荧光关闭效应并相应成像之后，其荧光不能恢复，因此每次调节共聚焦显微镜的激光功率之后并再次观察所成图像时，需要相应地更换标准样品的成像视野。在本实施例中，最高的物镜后焦面功率(即激光功率)是300微瓦。
[0067]
其中，该标准样品不是免疫染色样品也不是蛋白转染样品，仅仅是尺寸非常小、具备荧光关闭效应的荧光球，用于测定出扫描关闭显微镜的理想点扩散函数。优选地，使用直径小于50nm的荧光微球作为标准样品。
[0068]
步骤s1：进行待测样品制备，即，利用荧光探针对待测样品进行标记；
[0069]
在本实施例中，待测样品为生物样品，待测样品的荧光探针是常规的荧光染料分子或者具有开关效应的荧光蛋白，因此，利用荧光探针对待测样品进行标记主要是指对待测样品进行免疫荧光染色和/或开关蛋白转染。其中，免疫荧光染色是指对待测样品的抗体分子进行荧光染色，开关蛋白转染是指对开关蛋白(即具有开关效应的荧光蛋白)进行转染。
[0070]
需要说明的是，目前的免疫荧光染色只能是利用荧光关闭效应中的荧光漂白成像原理,其荧光探针不能反复开关而会被直接漂白，因此只能进行一个维度的超分辨成像。而目前的开关蛋白转染样品,能够反复开关,可以进行两个维度的成像，具体来说，能够反复开关是这种开关蛋白的固有属性,开关蛋白在荧光态时能够在波长488nm的激光照射下发出荧光,但是荧光信号会随着照射时间的加长而衰减直至荧光信号消失，此时开关蛋白处于荧光关闭态，但是该开关蛋白再经过405nm的激光照射又会重新恢复到荧光态，即能够重新在波长488nm的激光照射下发出荧光。
[0071]
优选地，对待测样品进行免疫荧光染色的具体步骤可以参考文献【sci china chem,2016,59:1519
–
1524】。优选地，对于本发明中描述的免疫荧光染色技术，荧光探针采用吸收光谱在蓝紫光波段的荧光染料分子更容易实现超分辨效果，alexa405、dylight405、atto488、cy3等荧光染料都能够作为荧光探针比较容易地实现超分辨成像。而荧光探针采用吸收光谱在红光波段的荧光染料分子，如cy5、alexa647等不容易实现超分辨成像，虽然能够实现本发明的超分辨效果，但是所需的实验条件更高。
[0072]
在进行开关蛋白转染时，优选的，本发明采用lipofectamine 3000转染试剂来进行转染，荧光蛋白采用dronpa开关蛋白。
[0073]
步骤s2：利用所述理想点扩散函数所对应的激光功率，在共聚焦显微镜上获取待测样品的原始测量图像；
[0074]
其中，待测样品的原始测量图像是指待测样品在一个维度或者两个维度上的超分辨图像。
[0075]
所述步骤s2具体包括：将待测样品放置在共聚焦显微镜上，按照共聚焦显微镜的
操作说明书调整共聚焦显微镜的扫描速度、扫描步长、针孔大小、接收带宽、探测器增益等测量参数，而激光功率则调整至步骤s1中的理想点扩散函数所对应的激光功率，以将共聚焦显微镜用作扫描关闭显微镜；随后，在待测样品处于荧光态的情况下利用扫描关闭显微镜测量获取待测样品在一个维度或者两个维度上的超分辨图像，作为待测样品的原始测量图像。
[0076]
优选地，所述扫描关闭显微镜工作在高速模式或者高分辨模式下，高速模式下，线扫描速度调整至400hz，扫描步长调整至12nm，针孔大小调整为3艾里斑，激光功率调整至236μw；高分辨模式下，线扫描速度调整至10hz或100hz，扫描步长调整至12nm，针孔大小调整为3艾里斑，激光功率调整至136μw。需要说明的是，扫描关闭显微镜不能保证每次都能拍出超分辨图像，此处的参数是根据经验设置的，这两种设置比较容易获得超分辨图像。
[0077]
接收带宽和探测器增益根据荧光分子的发射波长和信号强度选择，荧光分子的信号强度则是根据电脑显示的图像的对比度来确定的。其他参数比如扫描视野、扫描场大小、图像的逻辑尺寸同样根据实验需要作出相应调整。
[0078]
其中，当待测样品的荧光探针是荧光染料分子时，由于荧光探针不能反复开关，因此，只能在待测样品处于荧光态的情况下利用扫描关闭显微镜测量获取待测样品在一个维度上的超分辨测量图像。即，只能获得x方向的超分辨图像或者y方向的超分辨图像。
[0079]
当待测样品的荧光探针是具有开关效应的荧光蛋白时，由于荧光探针能反复开关，因此，在待测样品处于荧光态的情况下利用扫描关闭显微镜测量获取待测样品在一个维度上的超分辨测量图像；或者，在待测样品处于荧光态的情况下利用扫描关闭显微镜和用于激发荧光的激光先获取待测样品在一个维度(如x方向)上的超分辨测量图像，再通过第二种激光将待测样品恢复至荧光态，随后将扫描方向旋转90度，以利用扫描关闭显微镜和用于激发荧光的激光获取待测样品在另一个维度上(如y方向)的超分辨测量图像，至此，得到待测样品在两个维度(如x方向和y方向)上的超分辨图像，作为待测样品的原始测量图像，用以后续合成二维超分辨图像。
[0080]
步骤s3：如图3所示，图像处理软件的使用，即，对所述步骤s2获取的待测样品的原始测量图像进行处理，以得到待测样品的最终的超分辨图像。
[0081]
需要说明的是，所述步骤s3通过使用配套的图像处理软件来执行，图像处理软件可以作为工具包运行在共聚焦显微镜上，或者独立运行。也就是说，本发明的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法的技术原理简单，操作简便，兼容性好，图像处理软件既可以单独运行，又可以以共聚焦超分辨插件的形式集成在实验室已有的共聚焦显微镜上，能够大大降低仪器的购置成本和操作成本。
[0082]
其中，当待测样品的原始测量图像是指待测样品在一个维度上的超分辨图像时，所述步骤s3包括：
[0083]
步骤s31：将步骤s2获取的待测样品的原始测量图像输入到图像处理软件，调整图像上采样系数以获得第一扩展图像，进而扩展图像的逻辑分辨率；
[0084]
由此，可以扩大图像，从而可以相对于原来的图像进行亚像素点的操作。
[0085]
其中，待测样品的原始测量图像被输入到配套的图像处理软件中。图像的上采样系数的设置范围很宽，在电脑内存够用或者计算时间允许的前提下可以任意设置，这个数值就是把图像扩大多少倍的意思，比如512
×
512的图，上采样系数为2，上采样后就是1024
×
1024。优选地，图像的上采样系数设置为2。在本实施例中，通过进行双立方插值，来对图像进行上采样。
[0086]
步骤s32：使用图像处理软件(如photoshop、画图等等)将步骤s1获取的扫描关闭显微镜的理想点扩散函数的主瓣(图2中所示相对较亮的部分)和旁瓣(图2中所示除主瓣之外的部分)拆分开，得到理想点扩散函数的主瓣和旁瓣的函数表达式。其中，主瓣的函数表达式为h
main
(r)，旁瓣的函数表达式为h
side
(r)。
[0087]
其中，将扫描关闭显微镜的理想点扩散函数的主瓣(图2中所示的最下部的相对较亮的部分光斑)和旁瓣(图2中所示除主瓣之外的部分)拆分开所采用的图像处理软件可以是任意的可视化的图像处理软件，如photoshop、画图等等，从而通过人为分辨来将主瓣和旁瓣拆分开。
[0088]
理想点扩散函数的主瓣和旁瓣的函数表达式用于重构得到去旁瓣点扩散函数，为后一步的去除旁瓣做准备。
[0089]
步骤s33：进行旁瓣去除。即，根据理想点扩散函数的主瓣和旁瓣的函数表达式和旁瓣权重因子δ，来重构得到去旁瓣点扩散函数，使得去旁瓣点扩散函数的主瓣的函数表达式为正值且其旁瓣的函数表达式为负值，再将重构的去旁瓣点扩散函数与步骤s31获得的第一扩展图像进行卷积，得到卷积结果；随后，不断调整旁瓣权重因子δ，并重复执行得到去旁瓣点扩散函数以及进行卷积的步骤，直至卷积结果为无旁瓣的图像，此时得到的卷积结果为去旁瓣图像。去旁瓣图像可以用于下一步的图像处理，或者直接作为步骤s3的图像处理结果输出。
[0090]
也就是说，旁瓣权重因子δ的值是不断通过人为设置调整的，当看到卷积得到的结果中，旁瓣基本被去除，又不损失图像的细节，此时得到的旁瓣权重因子δ就是最终确定的旁瓣权重因子δ。
[0091]
在本实施例中，去旁瓣点扩散函数用于线性去卷积，其可由公式(1)表示：
[0092]hlin
(r)＝h
main
(r) δh
side
(r)(-1《δ《0)(1)
[0093]
式中，h
lin
(r)代表去旁瓣点扩散函数，δ为旁瓣的权重因子，归一化后再0到1之间取值。
[0094]
将上式中描述的去旁瓣点扩散函数h
lin
(r)与需要处理的第一扩展图像ia相卷积时，卷积结果为：
[0095][0096]
其中，ia表示第一扩展图像，代表卷积运算，ia′
为卷积结果。
[0097]
其中，当待测样品的原始测量图像是指待测样品在两个维度上的超分辨图像时，所述步骤s3除了包括上述的步骤s31-步骤s33，还包括：
[0098]
步骤s34：对待测样品在两个维度上的超分辨图像所分别处理得到的两个去旁瓣图像执行漂移矫正步骤和图像合成步骤，以两个去旁瓣图像相互叠加并将两者的频率域和空间域信息合成到一起，输出并存储超分辨图像。
[0099]
此步骤s34可全自动执行，无需调整任何参数。
[0100]
1)漂移矫正步骤。由于在本发明中每一张超分辨图像只是获得一个维度的超分辨图像，因此需要横向扫描一次，纵向扫描一次，才能得到待测样品在两个维度上的超分辨图
像,但是这样两张超分辨图像的空间位置会有一点错位,因此需要执行漂移矫正步骤,就是把这种错位补偿回来，矫正两个去旁瓣图像空间位置，让两个去旁瓣图像在空间上重合。本发明使用的漂移矫正步骤基于图像互相关算法，漂移矫正步骤例如通过计算两个维度的超分辨图像所分别处理得到的两个去旁瓣图像之间的相关性图谱来执行。
[0101]
因此，所述漂移矫正步骤包括：
[0102]
步骤s341：将步骤s33获取得到的两个去旁瓣图像再次进行双立方插值以得到第二扩展图像，进而扩展其图像分辨率。
[0103]
步骤s342：计算两个去旁瓣图像之间的相关性图谱，找到所述相关性图谱中相关性最强的点的位置；
[0104]
步骤s343：根据相关性最强的点的位置，将两个去旁瓣图像叠加到一起，以使得两个去旁瓣图像的各个像素点的空间位置对齐。
[0105]
2)图像合成步骤。本发明的图像合成步骤所采取的图像合成算法为频率域和空间域双重合成算法。
[0106]
因此，所述图像合成步骤具体包括：
[0107]
步骤s341’：通过傅里叶变换,在频率域获得两个去旁瓣图像的空间频率信息；
[0108]
其中，图像经过傅里叶变换后的获得的是图像空间频率信息,高频空间频率信息代表高空间分辨率，空间频率指的是图像里面所包含的空间信息在傅里叶变换后的表现。
[0109]
步骤s342’：将两个去旁瓣图像中每个像素点的空间频率进行对比,提取两个去旁瓣图像中每个像素点的空间频率相对较大的值整合为新的频率域图像，以将两个去旁瓣图像的高频信息整合到一起；
[0110]
步骤s343’：对新的频率域图像进行逆傅里叶变换，获得频率域合成图像；
[0111]
其中，上面说的频率域图像是经过傅里叶变换后的图像，此处的频率域合成图像则是经过逆傅里叶变换后的空间域图像，也就是二维图像。
[0112]
步骤s344’：将两个去旁瓣图像中每个像素点相对较小的值提取(舍弃相对较大的值)并整合为空间域合成图像；
[0113]
由于两个去旁瓣图像本身就是空间域图像，因此整合得到的空间域合成图像也是空间域图像。
[0114]
步骤s345’：将空间域合成图像与频率域合成图像的各个像素点的值相乘，得到最终的超分辨图像。
[0115]
这种设计能够抵消第一步去旁瓣操作引起的分辨率降低。整个图像合成步骤的数学原理为：
[0116][0117]
和分辨代表傅里叶变换和逆傅里叶变换，i
′b为与ia′
超分辨信息相互正交的去旁瓣后的图像。
[0118]
综上，本发明通过步骤s3实现了数据处理，所述数据处理具有去旁瓣，亚像素点级的漂移矫正，图像合成等功能。按照数据处理流程，配套的数据处理软件能够读取从显微镜获取的具有单一维度超分辨信息的图像，能够去除成像过程中形成的旁瓣，能够在亚像素点的尺度上对图像的漂移进行矫正，能够不损失分辨率的获得最终的超分辨图像。
[0119]
其中，图4为本发明的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法获取的免疫荧光染色微管样品的超分辨图像(右侧)以及与传统共聚焦显微镜获取的同区域样品图像(左侧)的对比，其示出了利用atto488荧光染料分子对待测样品进行免疫染色后得到的微管的超分辨结果。
[0120]
图5为利用本发明的方法所得到的dronpa蛋白转染的波形蛋白的超分辨成像结果。
[0121]
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。