一种亚麻籽油的指纹图谱检测方法及其应用与流程

1.本发明属于检测分析技术领域，具体涉及一种亚麻籽油的指纹图谱检测方法及其应用。


背景技术：

2.亚麻，是我国重要的特种油料作物之一，主要分布在东北、华北及西北地区。由于高原特有的地理、气候特征，青海亚麻成为了一种具有栽培价值的油料作物。亚麻籽油因其合理的脂肪酸组成、丰富的营养物质以及医药保健作用而成为许多家庭的食用油首选，其较高的价格也助长了亚麻籽油的掺假现象，因此必须开发亚麻籽油掺假鉴定方法以对产品质量进行控制。
3.不同植物油主要根据其脂肪酸组成来区分。然而，向植物油中掺入其他少量廉价植物油也会存在脂肪酸组成合格的情况。因此，仅依靠脂肪酸组成来判断植物油是否纯正则存在一定漏洞，给不法商家掺假提供了可乘之机。除脂肪酸外，植物油中还存在维生素e、植物甾醇、角鲨烯、类胡萝卜素等微量营养成分。其中，植物甾醇作为一种重要的代谢产物，几乎存在于所有的动植物油脂中，植物甾醇的含量和组成主要取决于植物种类，也随品种、地理、气候条件以及加工技术而变化。相对于脂肪酸等其他成分而言，甾醇特征性更强，可以表征油脂的真实性，是亚麻籽油真实性鉴别的有力工具。
4.目前，文献报道的植物油中甾醇测定方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法，国内外学者运用色谱技术结合化学计量学对植物油掺伪识别展开了研究。xu等(characterization and authentication of four important edible oils using free phytosterol profiles established by gc－gc－tof/ms[j].analmethod,2014,6(17):12-19.)等经固相萃取从花生油、菜籽油、大豆油和葵花籽油中提取植物甾醇，采用多维气相色谱串联飞行时间质谱测定后结合主成分分析、分级聚类分析以及随机森林的统计方法对4种食用植物油进行区分，且以游离植物甾醇为指标可以识别出5％的大豆油掺伪花生油。al-ismail等(detection of olive oil adulteration with some plant oils by glc analysis of sterols using polar column[j].food chemistry,2010,121(4):1255-1259.)依据掺伪前后菜油甾醇和豆甾醇含量总和的变化，能够鉴定5％的大豆油、玉米油、葵花籽油掺入橄榄油。但上述方法对掺假样品的识别方式较为单一，应用范围有限，而指纹图谱技术可有效表征天然物质复杂成分与其质量的关系，可以对食品等复杂物质体系的整体情况进行有效研究，实现产品质量及真实性的全面评估，因此被广泛用于食品掺假鉴定研究中。
[0005]
喻凤香等(基于指纹图谱相似度的玉米胚芽油掺伪检测技术研究[j].湖南农业科学,2019(08).)采用气相色谱法建立了玉米油的脂肪酸指纹图谱，通过相似度分析对玉米油中掺入植物油进行检测；林晨等(气相色谱结合化学计量学分析4种食用植物油的指纹图谱[j].分析测试学报,2016,35(04).)采用气相色谱法测定了4类植物油(橄榄油、花生油、菜籽油和大豆油)的脂肪酸组成和含量，构建植物油的色谱指纹图谱并结合模式识别方法
对4类植物油分类、鉴别。上述方法均是依靠脂肪酸组成来判断植物油是否纯正，准确度不高。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一种亚麻籽油的指纹图谱检测方法及其应用，该方法可用于不同品种亚麻籽油的区别与鉴定，尤其适用于亚麻籽油中掺入菜籽油、花生油、葵花油浓度20％以上、掺入芝麻油浓度30％以上时掺伪油种类的识别鉴定，能够实现亚麻籽油的快速、有效鉴别。
[0007]
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008]
一种亚麻籽油的指纹图谱检测方法，其特征在于，使用指纹图谱进行检测，所述检测方法包括如下步骤：(1)采用气相色谱-质谱联用法构建不同品种亚麻籽油的植物甾醇对照指纹图谱；所述气相色谱的检测条件包括：
[0009]
色谱柱：5％苯基-95％甲基聚硅氧烷柱；
[0010]
分流比：38～43:1；
[0011]
升温程序：初始温度160～200℃，保持0.5～2min，以1～8℃/min升温至280～320℃，保持20～30min。
[0012]
在本发明的具体实施方式中，所述气相色谱的检测条件包括：
[0013]
色谱柱：5％苯基-95％甲基聚硅氧烷柱；
[0014]
分流比：40:1；
[0015]
升温程序：初始温度180℃，保持1min，以4℃/min升温至300℃，保持25min。
[0016]
进一步地，所述气相色谱的检测条件还包括以下的i～
ⅴ
中的一项或多项：
[0017]
i色谱柱规格：20～60m
×
0.10～0.32mm
×
0.18～0.50μm；
[0018]
ii载气：惰性气体；
[0019]
ⅲ
流速：0.5～1.5ml/min；
[0020]
ⅳ
进样口温度：300℃～335℃；
[0021]
ⅴ
进样量：0.5～2μl。
[0022]
在本发明的具体实施方式中，所述气相色谱的检测条件还包括以下的i～
ⅴ
中的一项或多项：
[0023]
i色谱柱规格：30m
×
0.32mm
×
0.50μm；
[0024]
ii载气：氦气；
[0025]
ⅲ
流速：1ml/min；
[0026]
ⅳ
进样口温度：320℃；
[0027]
ⅴ
进样量：1μl。
[0028]
进一步地，所述质谱条件包括以下的i～
ⅴ
中的一项或多项：
[0029]
i电离源：ei离子源；
[0030]
ii电子能量：65～75ev，优选为70ev；
[0031]
ⅲ
离子源温度：240～260℃，优选为250℃；
[0032]
ⅳ
传输线温度：290～320℃，优选为300℃；
[0033]
ⅴ
离子扫描范围：30～700amu。
[0034]
在本发明的具体实施方式中，所述质谱条件包括以下的i～
ⅴ
中的一项或多项：
[0035]
i电离源：ei离子源；
[0036]
ii电子能量：70ev；
[0037]
ⅲ
离子源温度：250℃；
[0038]
ⅳ
传输线温度：300℃；
[0039]
ⅴ
离子扫描范围：50～650amu。
[0040]
进一步地，所述亚麻籽油的指纹图谱检测方法还包括如下步骤：
[0041]
(2)通过相似度分析确定亚麻籽油及其对照指纹图谱的相似度阈值；
[0042]
(3)将待测亚麻籽油样品的指纹图谱与其植物甾醇的对照指纹图谱进行相似度分析，通过对该亚麻籽油样品与其对照指纹图谱的相似度阈值比较进行亚麻籽油鉴伪。
[0043]
进一步地，所述植物甾醇包括菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、环阿屯醇中的一种或几种；
[0044]
进一步地，所述掺假为菜籽油、花生油、葵花油、芝麻油中的一种或几种。
[0045]
本发明还提供了一种亚麻籽油掺假的鉴定方法，采用上述检测方法进行检测，并通过结合化学计量法进行掺假鉴定；所述化学计量法包括聚类分析、判别分析中的一种。
[0046]
进一步地，所述判别分析可以识别掺假浓度为20％以上的菜籽油、花生油、葵花油，浓度30％以上的芝麻油中的一种或几种。
[0047]
本发明具有如下有益效果：
[0048]
(1)本发明鉴定方法精密度、重复性、稳定性好；通过对亚麻籽油植物甾醇组成进行分析，发现亚麻籽油40种亚麻籽油均含有菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇及环阿屯醇4种单体，不同产地亚麻籽油中均以β-谷甾醇含量最高，其次是环阿屯醇，豆甾醇含量最低，根据亚麻籽油中不同甾醇的含量的特点，从而实现对亚麻籽油的掺假识别。
[0049]
(2)本发明方法简单易行、适用性广泛、结果可靠，能够实现亚麻籽油的快速、有效鉴别，从而规范食用油市场秩序，保护消费者利益和身体健康，具有明显的经济效益和社会效益。
附图说明
[0050]
图1为混合标准溶液不同检测条件得到的色谱图；
[0051]
图2为不同植物油植物甾醇色谱图；
[0052]
图3为青海亚麻籽油植物甾醇叠加图；
[0053]
图4为青海亚麻籽油植物甾醇标准指纹图谱；
[0054]
图5为亚麻籽油样品与掺假样品聚类分析树状图；
[0055]
图6为典型判别分析图。
具体实施方式
[0056]
下面结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0057]
实施例1
[0058]
1材料与方法
[0059]
1.1材料与试剂
[0060]
40种亚麻籽、油菜籽、花生、葵花籽、芝麻(产地信息见表1)；植物油料经清理、除杂后于160～180℃下焙炒20min，采用螺旋压榨法制得亚麻籽油、菜籽油、花生油、葵花油、芝麻油，4500r/min离心15min后于-4℃保存。
[0061]
标准品：5α-胆甾烷-3β-醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、环阿屯醇对照品(纯度≥98％)
[0062]
乙酸乙酯、正己烷为色谱纯、氢氧化钾、无水乙醇、碱性氧化铝为分析纯。
[0063]
表1样品产地信息
[0064][0065]
1.2仪器与设备
[0066]
qp 2020nx gc-ms联用仪：日本岛津公司；磁力加热搅拌装置：美国supelco；ja1003电子天平：上海良平仪器仪表有限公司；lktc-b1-t数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；
[0067]
1.3实验方法
[0068]
1.3.1溶液配制
[0069]
准确称取豆甾醇、β谷甾醇、环阿屯醇各10mg，菜油甾醇、二氢胆固醇各20mg于10ml的棕色容量瓶中，加入乙酸乙酯定容至刻度，即配成1mg/ml的豆甾醇、β-谷甾醇、环阿屯醇及2mg/ml的菜油甾醇、内标二氢胆固醇的单标储备液。
[0070]
移取适量的单标储备液，用乙酸乙酯逐级稀释成适合质量浓度的甾醇混合标准液，置于4℃冰箱保存。
[0071]
1.3.2样品前处理
[0072]
参考国标方法并稍作修改，精密称取0.5
±
0.001g油样于磨口三角瓶中，加入8ml 0.5mol/ml koh-乙醇溶液及0.5ml 0.5mg/ml内标溶液，于80℃下磁力搅拌冷凝回流15min，反应完成后趁热加入8ml无水乙醇稀释样品溶液。在20ml乙醇中加入10g氧化铝，并将悬浮液倒入玻璃柱中，使氧化铝自然沉降，打开活塞放出溶剂，使液面到达氧化铝顶层时加入制
cz5，hs1-hs5，kh1-kh5，zm1-zm5，混合均匀后低温保存。
[0089]
1.3.6数据处理
[0090]
所有数据均为3组平行实验数据取平均值，采用spss 23.0软件进行差异性分析，采用origin 2018作图。
[0091]
2结果与分析
[0092]
2.1青海亚麻籽油甾醇定性与定量分析
[0093]
按1.3.3色谱条件进样分析，混合标准品中各植物甾醇化合物可以达到较好地分析效果(图1)，根据各组分的出峰顺序及保留时间对亚麻籽油中植物甾醇进行定性，可确定亚麻籽油植物甾醇由菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、环阿屯醇组成。
[0094]
采用内标法对样品中植物甾醇进行定量分析，以对照品与内标物的质量浓度比为横坐标(x)，对照品与内标物峰面积比为纵坐标(y)绘制标准曲线，结果见表2。
[0095]
表2混标溶液工作液各组分线性回归方程及相关系数
[0096][0097]
四种植物甾醇选取qh-32(海东民和6)进行植物甾醇方法学评价。将样品预处理后的待测液，按1.2.4条件连续进样6次，检测油样中各甾醇组分峰面积与内标峰面积，用于考察精密度。按照1.3.2方法平行制备6组样品待测液，进样分析，用于考察重复性。将制备的油样在室温下分别放置0、2、4、8、12、24h后进样分析，计算不同时间点各甾醇峰面积与内标峰面积比值的rsd，用于考察方法稳定性。结果见表3。
[0098]
由表3可见，样品的精密度rsd为0.73％～1.76％，重复性rsd为0.63％～3.32％，稳定性rsd为1.46％～4.01％，表明该实验所用气相色谱质谱仪精密度良好，且方法重复性、稳定性良好，满足要求。
[0099]
表3亚麻籽油植物甾醇精密度试验结果
[0100][0101]
2.2五种植物油植物甾醇组成分析
[0102]
植物甾醇是食用油中不皂化物的主要部分，也是一种非常重要的天然活性成分，广泛存在于各种植物油、坚果和植物种子中，在降低血液胆固醇、抑制肿瘤、调节免疫力以及维持机体健康方面均具有重要作用。对40批亚麻籽油中植物甾醇组成及含量进行测定，结果见表4。分析发现，亚麻籽油植物甾醇含量丰富，40种亚麻籽油均含有菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇及环阿屯醇4种单体。不同产地亚麻籽油中均以β-谷甾醇含量最高，其含量高达101.62～152.38mg/100g，约占总甾醇的近50％，其次是环阿屯醇，含量为78.98～137.81mg/100g，菜油甾醇含量范围为55.09～81.55mg/100g，豆甾醇含量最低，仅为12.75～24.36mg/100g。
[0103]
40种亚麻籽油总植物甾醇含量范围为267.02～370.83mg/100g，平均含量为316.42mg/100g。此外，qh-40(海东循化2)具有最高的植物甾醇含量(370.83mg/100g)，qh-8(西宁湟中6)含量最低(267.02mg/100g)，表明亚麻籽品种及产地均对不皂化物含量有较大影响。从易于人体吸收的菜油甾醇和β-谷甾醇含量分析，qh-40(海东循化2)中菜油甾醇、β-谷甾醇含量均显著高于其他亚麻籽油，利于人体有效吸收利用。除了遗传背景引起的植物甾醇含量的差异外，收获成熟期也对亚麻籽中植物甾醇的富集有一定影响。
[0104]
表4亚麻籽油中植物甾醇含量
[0105]
[0106][0107]
将5种植物油按照1.3.2方法处理后，gc-ms进样分析得到5种植物油植物甾醇色谱图(图2)，内标法定量植物油中甾醇并进行差异性分析，结果见表5。菜油甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇是五种食用植物油的主要共有成分，在含量上，β-谷甾醇在植物油中占比最高，其百分含量在40.0％～80.4％之间，其次是菜油甾醇和豆甾醇。
[0108]
由于不同油料作物所属的植物种属不同，各甾醇单体的含量存在较大差异，除共有的三种植物甾醇(菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇)，亚麻籽油中还存在其他植物油中不常见的环阿屯醇，与其他几种植物油差异显著(p《0.05)。环阿屯醇属于4，4'-双甲基甾醇，研究表明可以将其作为亚麻籽油的标志性甾醇从而鉴定油脂的品质，以防油脂掺假。此外，β-谷甾醇、菜油甾醇均以菜籽油及芝麻油中含量最高，其中β-谷甾醇含量占该两种植物油中总甾醇含量的50％以上，测定结果与文献(钟冬莲,莫润宏,王蕤,等.反相聚合物固相萃取-气相色谱-质谱法测定植物油中角鲨烯和四种植物甾醇[j].食品与发酵工业,2021,47(04):231-236.)报道一致。在总量上，芝麻油含量最高，为516.35mg/100g，而花生油含量最低，仅为157.95mg/100g，说明原料种类是影响植物油中植物甾醇含量和比例的关键因素，因此可以根据各植物甾醇的含量及比例实现对亚麻籽油以及菜籽油、大豆油等植物油的有效区分。
[0109]
表5 5种植物油植物甾醇组成及含量
[0110][0111]
注：大写字母表示同一植物油不同植物甾醇多重比较结果，小写字母表示不同植物油植物甾醇多重比较结果。
[0112]
2.3青海亚麻籽油甾醇标准指纹图谱构建及应用
[0113]
对40批亚麻籽油样品依次进样测定，记录色谱图。将所得色谱图信号导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，得到亚麻籽油植物甾醇原始图谱叠加图(图3)，选定s1色谱图作为参照图谱，设定时间窗宽度为0.1，采用平均矢量法对指纹图谱进行拟合，经多点校正以及色谱峰匹配、生成对照等步骤得到40批亚麻籽油指纹图谱的共有模式(即对照指纹图谱r)，对照指纹图谱中各植物甾醇峰通过对照品保留时间予以指认，结果见图4。采用夹角余弦法，分别计算相似度，40个样品的相似度在0.982～1之间，本发明建立的亚麻籽油对照指纹图谱及标定的4个峰可以反映亚麻籽油植物甾醇指纹特征，具有鉴定评价意义。
[0114]
在指纹图谱应用于真伪鉴定的评价中，通常采用不同样品与对照指纹图谱相似度的平均值或最小值作为阈值。在该研究中，40批亚麻籽油样品与对照指纹图谱相似度平均值为0.995，因此可以确定0.995为青海亚麻籽油相似度阈值，相似度低于0.995则被认为是掺假亚麻籽油。
[0115]
应用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对掺假油样进行相似度分析，结果见表6。低价植物油掺假浓度越大，掺假样品与青海纯亚麻籽油对照指纹图谱的相似度越低，且均低于青海亚麻籽油相似度阈值(0.995)，因此可以将掺假油样与纯亚麻籽油区分开，从而实现对掺伪亚麻籽油样品的鉴别。
[0116]
表6掺假样品与亚麻籽油对照指纹图谱的相似度
[0117][0118]
2.4植物甾醇组成结合化学计量学进行亚麻籽油掺伪识别
[0119]
2.4.1聚类分析判别纯亚麻籽油与非亚麻籽油
[0120]
运用spss 23.0软件，采用组间连接对40个亚麻籽油样品及20种掺假样品进行聚类分析，以平方欧氏距离为度量标准得到油样植物甾醇组成的聚类谱系图。图5可以看出，当欧氏距离为6时，所有油样聚为6类，40个亚麻籽油样品单独聚为一类，20个掺伪亚麻籽油
样品分别聚为不同的五类，此时40个纯亚麻籽油样品可以与20种掺假样品全部区分开。
[0121]
2.4.2判别分析识别掺假植物油种类
[0122]
判别分析是一种常用的分类方法，在食品真伪鉴别中得到广泛应用。将40批纯亚麻籽油命名为种类1(ymz1-ymz40)，掺有不同比例菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油、芝麻油的掺假亚麻籽油分别命名为种类2(cz1-cz5)、种类3(hs1-hs5)、种类4(kh1-kh5)、种类5(zm1-zm5)，利用spss 23.0对5类食用油样品的植物甾醇指标进行判别分析，结果见图6和表7。
[0123]
表7判别分析分类结果
[0124][0125]
由典型判别函数获得的分类散点图(见图6)可知，40个纯亚麻籽油与掺假亚麻籽油样品存在部分重叠。40个纯亚麻籽油中有6个样品出现误判，其鉴别准确率为85％，掺有不同比例菜籽油、花生油、葵花油、芝麻油的掺伪亚麻籽油样品间鉴别准确率分别为75％、77％、69％、59％。进一步分析发现，出现误判的油样的掺假浓度主要集中在10％和20％，在较高的掺假浓度下，菜籽油、花生油、葵花油的鉴别准确率分别为89.5％、89.5％、85.5％和96％、97.5％、96.5％，而芝麻油掺假浓度为30％时的鉴别准确率仍较低，为78.5％，出现误判的油样主要被识别为亚麻籽油中掺入了葵花籽油，而掺假浓度为40％时的鉴别准确率为100％，因此，该判别分析可以识别在亚麻籽油中掺入浓度为20％以上菜籽油、花生油、葵花油，而当芝麻油的掺入浓度达到30％以上时才能准确识别植物油类型。
[0126]
综上，本发明采用固相萃取结合gc-ms分析青海亚麻籽油植物甾醇组成及含量，亚麻籽油中共检测出菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、环阿屯醇这四种植物甾醇，其中环阿屯醇是亚麻籽油标志性甾醇。在模拟掺假亚麻籽油的鉴别中，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件，建立了亚麻籽油植物甾醇指纹图谱，结合相似度评价、聚类分析、判别分析3种方法对亚麻籽油样品和掺假样品植物甾醇指纹图谱进行模式识别。相似度评价结果表明，40批不同品种、不同产地的亚麻籽油的指纹图谱具有很好的一致性，掺假样品与对照指纹图谱的相似度均低于青海亚麻籽油相似度阈值(0.995)，相似度评价和聚类分析均可实现纯亚麻籽油样品与掺假样品的区分。当亚麻籽油中掺入菜籽油、花生油、葵花油比例为20％以上、掺入芝麻油比例达30％以上时，判别分析模型可以准确识别出掺假植物油的种类。因此，植物甾醇指纹图谱结合化学计量学分析，可用于青海亚麻籽油掺假鉴定和质量控制。
[0127]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以
理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。