多价多特异性抗体的制作方法

1.本技术涉及多价多特异性抗体，尤其涉及包括与受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)和cd3特异性结合的四价双特异性抗体。本技术还涉及编码所述抗体的多核苷酸，包含所述多核苷酸的宿主细胞，所述抗体的制备方法及其治疗用途。


背景技术：

2.cd3双特异性t细胞衔接子是研发有效癌症治疗领域中最有前景的双特异性抗体平台之一。抗体的一部分与肿瘤抗原结合，另一部分与tcr的cd3结合，使t细胞参与杀死癌细胞。肿瘤重定向t细胞杀伤是一种不存在于用于制备t细胞衔接子抗体的亲本抗体中的新功能，t细胞衔接子抗体的功能不能被两种亲本抗体的混合物所取代，因此它被称为强制性双特异性抗体(bispecific antibodies:labrijn af,a mechanistic review of the pipeline.janmaat ml,reichert jm,parren pwhi.nat rev drug discov.2019 aug；18(8):585-608)(t cell engaging bispecific antibody(t-bsab):from technology to therapeutics.wu z,cheung nv.pharmacol ther.2018 feb；182:161-175)。
3.cd3 t细胞衔接子开发的主要瓶颈之一是在较高的有疗效的剂量水平上由于细胞因子的高释放而可能产生的毒性。另一个瓶颈是大多数肿瘤抗原也在正常组织/细胞上表达，尽管表达水平较低，这也会导致一定的目标毒性。与抗原表达较低的正常细胞相比，开发多价(例如四价)肿瘤抗原结合分子将更有针对性地加强对抗原表达较高的肿瘤细胞的结合进而提升治疗指标。多价(优选地，四价)肿瘤细胞结合可以是(1)对同一目标抗原的相同表位，(2)对同一目标抗原的不同的、不重叠的表位(双互补表位)，或(3)对不同的目标抗原(双靶向)。
4.受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)是由ror1和ror2组成的ror家族的一员。它包含两个不同的富含半胱氨酸的胞外结构域和一个跨膜结构域。在细胞内部分，ror1拥有一个酪氨酸激酶结构域，两个富含丝氨酸/苏氨酸的结构域和一个富含脯氨酸的结构域。与ror1的生理功能非常相似，ror1在癌症中也可以具有激酶活性依赖性或非依赖性功能，这可能是共受体或效应蛋白的组织特定表达的结果。ror1敲除诱导细胞凋亡、egfr信号增效和ror1介导的上皮-间质转化(emt)基因的上调支持ror1在癌症进展中发挥重要作用的观点。在另一个机制中，ror1在肿瘤细胞上的表达激活了wnt5a信号，这是一条对肿瘤细胞增殖、迁移和生存很重要的通路。ror1的上调通常在血液瘤和实体瘤中被检测到，这引起了科学界对探索靶向癌细胞中ror1表达的功能优势作为一种治疗策略的高度兴趣。各种研究开发了针对ror1的单克隆抗体，并显示直接通过adcc或cdc获得疗效，而对ror1阴性细胞系的凋亡没有任何影响。还有多项研究涉及用ror1嵌合抗原受体(car)转导患者的t细胞。ror1-car t细胞可以识别肿瘤细胞并裂解原发性肿瘤细胞。目前正在进行不同阶段的临床研究以评估靶向ror1的治疗效果。
5.claudin蛋白家族在哺乳动物中至少有27个成员分子(furuse m.et al.j cell biol.,1998,141,1539)。这些紧密连接分子是脊椎动物上皮细胞片中的细胞旁屏障所不可
缺少的。claudin 18分子是一个完整的跨膜蛋白，含有四个跨膜疏水区和两个细胞外环。claudin 18存在两种不同的剪接变体。亚型1(claudin 18.1或cldn 18.1)选择性地表达在正常肺组织的细胞上，亚型2(claudin 18.2或cldn 18.2)被认为是癌症相关的剪接变体(sanada y.et al.j pathol.,2006,208,633)。
6.claudin 18.2是一种类似cd20的分化蛋白，在非小细胞肺癌(nsclcs；25％)、胃癌(70％)、胰腺癌(50％)和食管癌(30％)中过度表达。该蛋白的表达受患者的种族背景影响。例如，与白种人患者相比，日本患者的表达水平更高。claudin 18.2在卵巢癌、乳腺癌和头颈部肿瘤中也有异位表达(sahin u.et al.clin cancer res.2008,14,7624)。claudin 18.2可以在胃癌的淋巴结和远处转移中检测到。它在正常组织中的表达严格限制在胃粘膜的短时分化上皮细胞中。
7.claudin 18.2很可能在肿瘤发生和维持肿瘤微环境中发挥复杂的作用。研究发现，egfr/erk信号诱导胆管肿瘤相关的claudin 18表达，参与体内的细胞增殖、侵袭和致瘤性(kumi,t.,cancer lett.,2017,403,66)。也有报道称，claudin-18通过抑制pi3k/pdk1/akt信号通路而抑制了肺上皮细胞的异常增殖和运动(shun,s.et al.bio bioph acta(bba)-mole cell res,2016,1863,1170)。在claudin 18.2基因敲除的小鼠中，细胞旁屏障受损，导致胃壁细胞分泌的h 离子穿过胃上皮层漏入胃腔，随后胃的ph值下降。基因敲除小鼠的慢性胃炎导致了高水平的炎症细胞和表达痉挛多肽的化生(spem)细胞。炎症细胞导致的炎症特征是各种促炎症标志物的更高表达，如il-1β和tnf-α(hayashi,d.gastroenterology,2012,142,292)。
8.尽管claudin 18.2在肿瘤发生和肿瘤微环境中的生物学功能还不确定，但很明显，claudin 18.2在胃癌转化中存在表达，并在多种肿瘤中被异常激活，包括食道癌、胰腺癌和胆管癌(micke,p.et al.,intl j cancer,2014,135,2206)。claudin 18.2暴露的细胞外环可供单克隆抗体结合，与肿瘤细胞表面的claudin 18.2结合的适当抗体可通过抗体依赖的细胞毒性(adcc)效应和补体依赖的细胞毒性(cdc)效应杀死肿瘤细胞。抗claudin 18.2化合物还可以诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖。当与化疗相结合时，它们可能会增强t细胞的浸润并诱导促炎症细胞因子。
9.因此，claudin 18.2是预防和/或治疗几种原发性肿瘤的宝贵靶点，例如，胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌如非小细胞肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌及其转移，特别是胃癌转移，如库肯勃氏瘤、腹膜转移和淋巴结转移。
10.本技术的目的在于提供一种新的多价多特异性抗体，具有特别有利的特性，如改进的结合亲和力和改进的细胞毒性效力。


技术实现要素：

11.本发明提供了新的多价多特异性抗体，具有特别有利的特性，如改进的结合亲和力和改进的细胞毒性效力。
12.在一个方面，本发明提供的多价多特异性抗体，包括两条重链、两条轻链以及第五和第六抗原结合片段，
13.(1)其中每个所述重链包括第一和第二抗原结合片段和重链恒定区，其中第一和第二抗原结合片段直接或间接连接到ch1结构域的n端；以及
14.(2)其中每个所述轻链包括第三和第四抗原结合片段和轻链恒定区(诸如c
κ
或c
λ
)，其中第三和第四抗原结合片段直接或间接连接到所述轻链恒定区的n端；以及
15.(3)其中第五和第六抗原结合片段中的每个直接或间接地连接到所述轻链恒定区的c端。
16.在本发明另一个方面，所述重链上的第一和第二抗原结合片段以及轻链上的第三和第四抗原结合片段与抗原的相同表位结合。
17.在本发明另一个方面，所述重链上的第一和第二抗原结合片段与抗原的一个表位结合，并且所述轻链上的第三和第四抗原结合片段与所述抗原的另一个表位结合。
18.在本发明另一个方面，所述重链上的第一抗原结合片段与抗原的第一表位结合，重链上的第二抗原结合片段与所述抗原的第二表位结合，轻链上的第三抗原结合片段与所述抗原的第三表位结合，并且轻链上的第四抗原结合片段与所述抗原的第四表位结合。
19.在本发明另一个方面，所述第一抗原结合片段与第一抗原结合，第二抗原结合片段与第二抗原结合，第三抗原结合片段与第三抗原结合，第四抗原结合片段与第四抗原结合。
20.在本发明另一个方面，所述重链上的第一和第二抗原结合片段与第一抗原结合，并且轻链上的第三和第四抗原结合片段与第二抗原结合。
21.在本发明另一个方面，所述该抗原选自血液瘤和实体瘤的肿瘤靶抗原。
22.在本发明另一个方面，所述该抗原cea、claudin 18.2、gpc3、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、cd38、her2、cd19、cd20、cd22、bcma、caix、cd446、cd133、egfr、egfrviii、epcam、gd2、epha2、her1、her2、icam-1、il13ra2、mesothelin、muc1、muc16、nkg2d、psca、ny-eso-1、mart-1、wt1、mage-a10、mage-a3、mage-a4、ebv、nkg2d、pd1、pd-l1、cd25、il-2和cd3中的一种或多种。
23.在本发明另一个方面，所述重链上的第一和第二抗原结合片段以及轻链上的第三和第四抗原结合片段与ror1结合。
24.在本发明另一个方面，所述重链上的第一和第二抗原结合片段与ror1的一个表位结合，并且轻链上的第三和第四抗原结合片段与ror1的另一个表位结合。
25.在本发明另一个方面，所述重链上的第一和第二抗原结合片段与ror1结合，轻链上的第三和第四抗原结合片段与claudin 18.2结合。
26.在本发明另一个方面，所述重链上的第一和第二抗原结合片段与claudin 18.2结合，并且轻链上的第三和第四抗原结合片段与ror1结合。
27.在本发明另一个方面，所述ror1是人ror1。
28.在本发明另一个方面，所述所述claudin 18.2是人claudin 18.2。
29.在本发明另一个方面，所述轻链上的第五和第六抗原结合片段与cd3结合。
30.在本发明另一个方面，所述cd3是人cd3。
31.在本发明另一个方面，所述每个重链恒定区包括ch1,ch2和ch3，或ch1,ch2,ch3和ch4。
32.在本发明另一个方面，所述轻链恒定区是c
κ
或c
λ
型。
33.在本发明另一个方面，所述第一、第二、第三、第四、第五和第六抗原结合片段选自scfv片段、fv片段、f(ab’)2片段、fab'片段、vhh、v
nar
或sd(单域)。
34.在本发明另一个方面，所述第一、第二、第三和第四抗原结合片段是vhh。
35.在本发明另一个方面，所述第五和第六抗原结合片段是scfv。
36.在本发明另一个方面，所述第五和第六抗原结合片段是scfv，并通过连接子与轻链恒定区的c端连接。
37.在本发明另一个方面，所述该连接子是(g4s)3连接子。
38.在本发明另一个方面，所述第一、第二、第三和第四抗原结合片段是与人ror1特异性结合的相同的vhh，所述vhh具有seq id no:18-20所示的cdr1-cdr3；更优选的，所述vhh包括与seq id no:3的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
39.在本发明另一个方面，所述第三和第四抗原结合片段是与人claudin 18.2特异性结合的相同的sd(单结构域)，其中sd包括seq id no:21-23所示的cdr1-cdr3；优选的，所述sd包括与seq id no:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
40.在本发明另一个方面，所述第一和第二抗原结合片段是与人ror1特异性结合的相同的vhh，并且其中vhh具有seq id no:18-20所示的cdr1-cdr3；更优选的，所述vhh包括与seq id no:3的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其中第三和第四抗原结合片段是与人claudin 18.2特异性结合的相同的sd(单域)，并且其中sd包括seq id no:21-23所示的cdr1-cdr3；优选的，所述sd包括与seq id no.4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
41.在本发明另一个方面，所述第一和第二抗原结合片段是与人claudin 18.2特异性结合的相同的sd(单结构域)，并且其中sd包括seq id no:21-23所示的cdr1-cdr3；优选的，所述sd包括与seq id no:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
42.在本发明另一个方面，所述第一和第二抗原结合片段是与人claudin 18.2特异性结合的相同的sd(单结构域)，并且其中sd包括seq id no:21-23所示的cdr1-cdr3；优选的，所述sd包括与seq id no:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且其中第三和第四抗原结合片段是与人ror1特异性结合的相同的vhh，并且其中vhh具有seq id no:18-20所示的cdr1-cdr3；更优选的，所述vhh包括与seq id no:3的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
43.在本发明另一个方面，所述第一、第二、第三和第四抗原结合片段是与人claudin 18.2特异性结合的相同的sd(单结构域)，并且其中sd包括seq id no:21-23所示的cdr1-cdr3；优选的，所述sd包括与seq id no:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
44.在本发明另一个方面，所述第五和第六抗原结合片段是scfvs，且各自包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括seq id no:15-17所示的cdr1-cdr3；优选的，所述轻链可变区包括与seq id no:2的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，和/或所述重链可变区包括seq id no:12-14所示的cdr1-cdr3；优选的，所述轻链可变区包括与seq id no:1的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
45.在本发明另一个方面，所述第五和第六抗原结合片段是scfvs，且各自包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括与seq id no:7的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，和/或所述重链可变区包括seq id no:1的修饰版本，
46.优选地，所述seq id no:1的修饰版本具有选自n30s、k31t、f98w、k52bn和y58t的一个或多个突变；优选的，所述修饰版本具有以下1)到3)中任一个：1)n30s、k31t和f98w突变；2)n30s、k31t、f98w和k52bn突变；3)n30s、k31t、f98w和y58t突变,编号系统为kabat编号系统；或者
47.所述seq id no:1的修饰版本具有选自q13k、k83r和l108t的一个或多个突变；优选的，所述修饰版本具有q13k、k83r和l108t突变,编号系统为kabat编号系统；
48.更优选的，所述第五和第六抗原结合片段的重链可变区包括与seq id no.8或seq id no.9或seq id no.10或seq id no.11的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
49.在本发明另一个方面，提供一种纳米抗体(vhh)，包括seq id no:18-20所示的cdr1-cdr3；优选的，所述纳米抗体包括与seq id no:3的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
50.在本发明另一个方面，提供一种单域(sd)结合片段，包括seq id no:21-23所示的cdr1-cdr3；优选的，所述单域结合片段包括与seq id no:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
51.在本发明另一个方面，提供一种多核苷酸，编码所述的多价多特异性抗体或所述的纳米抗体或所述的单域(sd)结合片段。
52.在本发明另一个方面，提供一种载体，包含所述的多核苷酸。
53.在本发明另一个方面，提供一种宿主细胞，包含所述的多价多特异性抗体，所述的纳米抗体，所述的单域(sd)结合片段，所述的多核苷酸，或所述的载体。
54.在本发明另一个方面，所述宿主细胞是哺乳动物细胞、真菌细胞、植物细胞或细菌。
55.在本发明另一个方面，所述宿主细胞是人类细胞。
56.在本发明另一个方面，提供一种药物组合物，包括所述的多价多特异性抗体，所述的纳米抗体，所述的单域(sd)结合片段，所述的多核苷酸，所述的载体，或所述的宿主细胞。
57.在本发明另一个方面，所述药物组合物进一步包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。
58.在本发明另一个方面，提供所述多价多特异性抗体，所述的纳米抗体，所述的单域(sd)结合片段，所述的多核苷酸，所述的载体，或所述的宿主细胞在制备治疗受试者的癌症的药物中的应用。
59.在本发明另一个方面，提供一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向该受试者施用所述多价多特异性抗体，所述的纳米抗体，所述的单域(sd)结合片段，所述的多核苷酸，所述的载体，或所述的宿主细胞。
60.在本发明另一个方面，该癌症是血液瘤或实体瘤。
61.在本发明另一个方面，所述癌症是ror1阳性或claudin 18.2阳性的癌症。
62.在本发明另一个方面，其中所述癌症选自卵巢癌、胰腺癌、结肠癌、大肠癌、淋巴瘤、食道癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌中的一种或多种。
63.本发明方案具有以下优点：
64.1)本发明提供的四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)与人ror1蛋白或表达ror1蛋白的肿瘤细胞系的结合亲和力显著高于二价抗ror1抗体(115-二价)的亲和力。
65.2)本发明提供的四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)，能够通过衔接t细胞有效地杀死肿瘤细胞，相比于115-二价抗以及115/hc-841/lc-sp34抗体，具有显著提高的肿瘤细胞杀伤力。
66.3)相比二价-cd3抗体即二价841-sp34双特异性抗体，四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)具有更高的对肿瘤靶点的亲和力，并导致更有效地溶解肿瘤细胞。
67.4)在本发明提供的四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)中采用突变抗cd3抗原结合片段时，可降低抗体对cd3亲和力，减少细胞因子的释放。
附图说明
68.本技术的新颖特点在所附的权利要求中作了具体阐述。为使本技术的特点和优点的更好理解，将在下面的实施例和实例中详细说明本技术。
69.图1a显示了本技术的四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)的示意图；图1b显示了所述四价抗ror1-cd3双特异性抗体重链和轻链的从n端到c端的详细结构。
70.图2a显示了二价抗ror1抗体(115-二价)的构建体的示意图；图2b-2d显示了四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)、二价抗ror1抗体(115-二价)与人ror1和人cd3e elisa结合。
71.图3a-3c显示了四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)、二价抗ror1抗体(115-二价)与不同的肿瘤细胞系中的细胞上的ror1结合情况。
72.图4a显示了同型对照抗ic/sp34双特异性抗体的示意图；图4b-4d显示了四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)对表达ror1的肿瘤细胞的杀伤试验。
73.图5a显示了115/hc-841/lc-sp34抗体的示意图；图5b显示了二价841-sp34双特异性抗体的示意图；图5c显示了四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)、二价841-sp34双特异性抗体、115/hc-841/lc-sp34抗体与人ror1的结合比较；图5d显示了四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)、二价841-sp34双特异性抗体、115/hc-841/lc-sp34抗体与人cd3e结合比较。
74.图6a显示了四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)、115/hc-841/lc-sp34抗体、115-二价抗体对ror1阳性的mda-mb-231细胞的杀伤活性；图6b显示了四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)、115/hc-841/lc-sp34抗体、115-二价抗体对ror1阳性的ht-29细胞的杀伤活性；图6c显示了四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)、115/hc-841/lc-sp34抗体、115-二价抗体对mda-mb-231细胞和ht-29细胞的杀伤活性。
具体实施方式
75.应理解，所公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的特定需要而定制。还应理解，本文使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方案的目的，而不是限制性的。
76.除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本发明所属的技术中普遍使用的含义相同。为了解释本说明书的目的，以下定义将适用，在适当的时候，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。在这里和所附的权利要求中，单数形式的"a"、"an"和"the"也指复数形式，除非上下文有明确规定，例如，提到"一个宿主细胞"包括多个这样的宿主细胞。
77.本技术序列的详细描述
78.表1(斜体为cdr区,鉴定系统为imgt系统)
79.80.81.[0082][0083]
实施例1
[0084]
四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3,或称115-四价-sp34)、二价抗ror1抗体(115-二价)的产生
[0085]
本技术中的四价抗ror1-cd3双特异性抗体的构建体被设计为在抗体的ch1和cl域的n端上连接特异性结合肿瘤细胞上表达的ror1抗原的抗原结合片段(vhh)，并且在所述抗体的cl域的c端连接抗cd3的单链抗体(scfv)，如图1a所示；所述四价抗ror1-cd3双特异性抗体重链和轻链从n端到c端的详细结构如图1b所示。
[0086]
二价抗ror1抗体(115-二价)的构建体被设计为在抗体的ch1域的n端上连接特异性结合肿瘤细胞上表达的ror1抗原的抗原结合片段(vhh)，并且不含有轻链，所述二价抗ror1抗体(115-二价)的构型如图2a所示。
[0087]
针对ror1的vhh抗体，即纳米抗体，用全长人ror1(np_001077061.1)抗原免疫羊驼后，利用噬菌体显示技术平台从羊驼身上用全长人ror1蛋白筛选并分离获得。筛选出的vhh序列如表2所示。抗cd3单链抗体(scfv)的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)来源于人源化igg抗体sp34，vh和vl序列如表2所示。vh和vl序列由geneart ag(thermo fisher scientific，regensburg，德国)通过基因合成生成。
[0088]
本实施例中的四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)和二价抗ror1抗体(115-二价)使用的各序列如表2所示；所述四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)与二价抗ror1抗体(115-二价)由geneart ag(thermo fisher scientific，regensburg，德国)根据表2中的序列通过基因合成生成。
[0089]
表2
[0090]
[0091][0092]
实施例2
[0093]
四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)与二价抗ror1抗体(115-二价)相比对人ror1和cd3ε(即人cd3e)蛋白具有更高的结合亲和力。
[0094]
为了评估构建体115-二价抗体和115-四价-cd3抗体对人ror1和cd3ε蛋白的结合活性，进行了基于蛋白质的elisa检测。96孔的elisa板涂布100μl的1μg/ml人-ror1-his(acro biosystems)或0.5μg/ml人-cd3 epsilon-his蛋白(acro biosystems)，4℃过夜。在室温下用2％bsa/pbs封板1小时，随后用连续稀释的测试抗体：四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)或二价抗ror1抗体(115-二价)在室温下孵育1小时。用pbs-t洗涤板后，再用100μl过氧化物酶affini pure山羊抗人igg(peroxidase affinipure goat anti-human igg)，fcγ片段特异性(pbst中1∶5000稀释)室温孵育板30分钟。加入elisa底物tmb(bd biosciences)，用2n h2so4停止反应。用spectramax平板阅读器在450nm处读取吸光度。
[0095]
该检测结果如图2b-2d所示，四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)与人ror1的结合亲和力约为二价抗ror1抗体(115-二价)的12倍。对于人cd3ε(即人cd3e)，只观察到四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)的结合。
[0096]
实施例3
[0097]
四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)、二价抗ror1抗体(115-二价)与表达ror1的肿瘤细胞系上的ror1结合
[0098]
荧光激活细胞分选(facs)测定，进一步确认四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)、二价抗ror1抗体(115-二价)与表达ror1的肿瘤细胞系上的ror1结合。
[0099]
将具有不同ror1表达水平的目标肿瘤细胞(hpac、ht-29或jeko1)以1x105的浓度种在96孔非粘附组织培养板中。将连续稀释的抗体(115-四价-cd3或115-二价)加入孔中，在4℃下孵育1小时。用facs洗涤缓冲液洗涤板后，用pe共轭山羊抗人igg fc片段特异性抗体(1:200在facs洗涤缓冲液中稀释)在4℃下孵育板20分钟。流式细胞仪测量平均荧光强度(mfi)，使用graphpad prism软件分析结果。
[0100]
本实验结果显示，相比二价抗ror1抗体(115-二价)与肿瘤细胞系上ror1的中等程度的结合，四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)与这些肿瘤细胞系上的ror1有更高的结合力，结果如图3a-3c所示。
[0101]
实施例4
[0102]
四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)对表达ror1的肿瘤细胞的t细胞参与和介导的细胞毒作用
[0103]
在激活的人外周血单核细胞(pbmcs)杀伤试验中，研究了t细胞参与和抗原特异性肿瘤细胞杀伤的情况。从健康供体的白细胞(leukopak)中新鲜分离出人pbmcs，用抗cd3/cd28包被的珠子培养6天后激活t细胞。随后将活化的t细胞(e/t比10:1)与具有不同ror1表达水平的肿瘤靶细胞系(hpac或ht29，每孔10000个细胞)在四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)或同型对照抗ic/sp34双特异性抗体(与ic和cd3结合，图4a显示了同型对照抗ic/sp34双特异性抗体的构型，抗ic的vh和vl的序列示于表3，与非肿瘤细胞表面的抗原ic结合)的存在下共同孵育。在37℃和5％co2下孵育48小时后，通过评估基于每个样品孔的平均相对光单位(rlu)的荧光素酶信号来评估四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)或同型对照抗ic/sp34双特异性抗体对靶细胞的杀伤力。通过在没有双特异性抗体(即只有靶细胞和活化的t细胞)的情况下孵育靶细胞实现靶细胞的最大荧光素酶信号(本实施例使靶细胞本身产生荧光素酶信号，在无抗体的情况下，靶细胞不被杀伤，荧光素酶信号最大，存活率为100％)。存活率(percentage of viability)按照rlu(抗体)/rlu(无抗体对照)
×
100计算。如图4b-4d所示，四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)对表达ror1的hpac和ht29肿瘤细胞系具有较高的细胞毒性效力，ec50分别为1.04nm和0.29nm。
[0104]
表3
[0105][0106]
实施例5
[0107]
与二价841-sp34双特异性抗体相比，四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3,或称115-四价-sp34)的结合亲和力更高
[0108]
预期相比二价-cd3抗体即二价841-sp34双特异性抗体，四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)应潜在地具有更高的对肿瘤靶点的亲和力，并导致更有效地溶解肿瘤细胞。
[0109]
为了验证这一预期，利用claudin 18.2特异性的单域抗体(单域抗体sd的序列为seq id no.4，表4，其从与claudin 18.2结合的vh-vl复合体中设计出抗claudin 18.2抗体(克隆841)的单域抗体)来取代四价抗ror1-cd3双特异性抗体轻链上的115-vhh，获得115/hc-841/lc-sp34抗体，构型如图5a所示，该构建体也以类似于实施例1中描述的方式获得。
[0110]
构建二价841-sp34双特异性抗体，其为抗claudin 18.2/cd3双特异性抗体，被设计为在抗体的ch1和cl域的n端上连接抗claudin 18.2的vh，vl序列(vh和vl序列见seq id no.5-6，表4)，并且在所述抗体的cl域的c端连接抗cd3单链抗体(scfv)(抗cd3单链抗体(scfv)中的vh和vl序列见seq id no:1-2)，构型如图5b所示。
[0111]
为了评估与人ror1或人cd3e蛋白的结合活性，如实施例2中提供基于蛋白质的
elisa测定。如预期的那样，四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)比115/hc-841/lc-sp34抗体对人ror1的结合亲和力高4倍，二价841-sp34双特异性抗体没有显示出与人ror1的任何结合(图5c)。出乎意料的是，相比于四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)，115/hc-841/lc-sp34抗体对人cd3e结合亲和力有一定程度的减小(图5d)。
[0112]
表4
[0113][0114]
实施例6
[0115]
四价与更高的肿瘤细胞杀伤力有关
[0116]
为了进一步证实抗体的115-四价是否与杀伤力直接相关，我们在两个ror1阳性细胞系(mda-mb-231和ht-29细胞系)中进行标准细胞毒性测定，如实施例4所述。抗体介导的细胞毒性由活的mda-mb-231或ht-29luc细胞在抗体(四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)、115/hc-841/lc-sp34抗体、115-二价抗体)的连续稀释液中孵育48小时后的荧光素酶评估。如图6a、6b和6c所示，四价抗ror1-cd3双特异性抗体(115-四价-cd3)抗体以剂量依赖的方式增强了ror1表达的肿瘤细胞的t细胞重定向细胞毒性，ec50为0.027nm(使用mda-mb-231细胞系)和0.32(使用低ror1表达细胞系ht-29)。然而在115/hc-841/lc-sp34抗体的处理中观察到效力降低，ec50为3.74nm(使用mda-mb-231细胞系)，与115-四价-cd3抗体相比，杀伤力低100多倍。我们没有观察到使用115-二价抗体对ht-29细胞有明显的杀伤力。该数据表明115-四价-cd3抗体分子的细胞毒性效力高于115-二价抗体以及115/hc-841/lc-sp34抗体。
[0117]
应当理解的是，虽然已经结合其详细描述对本公开内容进行了描述，但上述描述旨在说明而不是限制本公开内容的范围，本公开内容由所附权利要求的范围界定。其他方面、优点和修改都在所附权利要求的范围内。
[0118]
上面描述的各种实施方案可以组合起来，以提供进一步的实施方案。本说明书中提到的和/或应用数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物都通过引用全部纳入本文。如有必要，可对实施例的各个方面进行修改，以采用各种专利、申请和出版物的概念，提供进一步的实施例。
[0119]
根据上述详细描述，可以对本发明的实施方案进行这些和其他修改。一般来说，在以下权利要求中，所使用的术语不应解释为将权利要求限制在说明书和权利要求中披露的具体实施方案，而应解释为包括所有可能的实施方案，以及这些权利要求有权获得的全部等同物的范围。因此，权利要求不受公开内容的限制。