一种覆盆子发酵乳酸菌及富含多酚覆盆子发酵饮料的制备的制作方法

1.本发明属于饮料加工技术领域，具体涉及一种覆盆子发酵乳酸菌及富含多酚覆盆子发酵饮料的制备。


背景技术：

2.覆盆子(rubus idaeus l.)，也叫树莓，味甘，性温，果实中含有大量的多酚类物质、有机酸，氨基酸，维生素，微量元素以及超氧化物歧化酶等抗氧化活性成分，有补肾固精、助阳缩尿的功能，用于治疗肾虚遗精、阳萎、遗尿和尿频等病症。由于其富含超氧化物歧化酶(sod)成分，所以覆盆子的抗衰老、抗癌和抗辐射的能力很强，此外，覆盆子中含有大量具有生物活性的多酚类物质，如鞣花酸、花青素等，具有抗氧化、祛黄褐斑的作用。可见，覆盆子是一种既有高营养又具备药理作用的“药食同源”的水果，具有重要的开发潜力。
3.目前，对覆盆子产品的开发主要集中在药用以及功能成分(如多酚、多糖和鞣花酸等)的提取方面，面对的消费人群的范围比较小，而乳酸菌发酵制备的覆盆子饮料口感风味良好，比较适合爱美人士以及中老年人饮用，对人体具有一定的保健养生功效，符合人们对健康生活的追求。但当前针对覆盆子发酵饮料方面的研究和产品开发鲜有报道，特别是在开发针对覆盆子原料的适制性乳酸菌发酵菌株(生长良好、产酸能力强、促进覆盆子游离多酚的释放以及提高抗氧化等)的方面尚未有报道。因此，开发适合于覆盆子的乳酸菌发酵菌株，并基于该菌株制备一种富含多酚和益生菌，且具有抗氧化功能的覆盆子发酵饮料，更能满足现代人的对健康食品的需求。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的不足，本发明一方面筛选得到了一种能够适应覆盆子原料发酵环境的戊糖乳杆菌p-1，另一方面利用该菌能够将覆盆子发酵饮料中的总多酚含量提高到较高的水平，进而提升了覆盆子发酵饮料的抗氧化能力。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
6.本发明提供了一种覆盆子发酵乳酸菌，所述乳酸菌为戊糖乳杆菌p-1(lactobacillus pentosus p-1)，已于2021年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:61941。
7.本发明还提供了上述的覆盆子发酵乳酸菌在发酵制备覆盆子饮料中的应用。
8.本发明还提供了一种富含多酚覆盆子发酵饮料的制备方法，该方法包括以下步骤：
9.s1、将覆盆子粉碎成果粉，用水溶解后加入果胶酶进行酶解，酶解后加入白砂糖，并调节ph至5.5-6.5，最后经灭菌制备得到覆盆子溶液；
10.s2、将权利要求1所述的覆盆子发酵乳酸菌接种至液体培养基中，培养至菌株到对数生长后期，除去培养基后用水稀释至od
600
值为108，得到用于发酵的乳酸菌发酵剂；
11.s3、将步骤s2的乳酸菌发酵剂接种于步骤s1的覆盆子溶液中，经发酵后制备得到
富含多酚覆盆子发酵饮料。
12.本发明从泡菜、豆豉、腐乳等材料中筛选得到一种适合覆盆子原料发酵的戊糖乳杆菌p-1菌株，该菌在发酵制备覆盆子饮料的过程中生长延至期短，对数生长期较长，活菌数可以达到较高水平(约109cuf/ml)。并利用该菌建立了一种新的覆盆子发酵工艺，能够显著提高覆盆子饮料中的多酚含量，含量达到4.79g/l，使制备得到的覆盆子发酵饮料的抗氧化能力显著提高，从而提高其保健养生功效。
13.优选地，步骤s3中，乳酸菌发酵剂的接种量为覆盆子溶液总体积的2％-4％。进一步地，乳酸菌发酵剂的接种量为覆盆子溶液总体积的3％。
14.优选地，骤s3中，发酵的温度为37℃，发酵的时间不少于24h。
15.优选地，骤s1中，覆盆子果粉的大小为10-50目。进一步地，覆盆子果粉的大小为40目。
16.优选地，骤s1中，覆盆子果粉与水的料液比1mg：20ml。
17.优选地，骤s1中，果胶酶的加入量为覆盆子水溶液总重量的1％-3％。进一步地，果胶酶的加入量为覆盆子水溶液总重量的2％。
18.优选地，骤s1中，白砂糖的加入量为覆盆子水溶液总重量的7％-15％。进一步地，白砂糖的加入量为覆盆子水溶液总重量的10％。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
20.本发明提供了一种覆盆子发酵乳酸菌，所述乳酸菌为戊糖乳杆菌p-1(lactobacillus pentosus p-1)，已于2021年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:61941。利用该菌发酵制备覆盆子饮料，生长延至期短，对数生长期较长，活菌数可以达到较高水平(约109cuf/ml)，且能够将覆盆子发酵饮料中的总多酚含量提高到较高的水平，进而提升了覆盆子发酵饮料的抗氧化能力，提高其保健养生功效。
附图说明
21.图1为戊糖乳杆菌p-1与商用菌株(植物乳杆菌p-115和p-8)在覆盆子饮料中的生长曲线对比图；
22.图2为分别利用戊糖乳杆菌p-1、植物乳杆菌p-115和p-8制备覆盆子饮料的产酸能力对比图；
23.图3为不同乳酸菌制备的覆盆子饮料中的总酚含量统计图(dc：分离自豆豉样品的乳酸菌；lb：分离自泡菜的乳酸菌；df：分离自腐乳及豆腐酸浆水的乳酸菌)；
24.图4为戊糖乳杆菌p-1发酵覆盆子饮料的总酚含量变化情况；
25.图5为分别利用戊糖乳杆菌p-1、植物乳杆菌lp-115和p-8制备的覆盆子饮料的dpph清除能力对比图；
26.图6为戊糖乳杆菌p-1、植物乳杆菌lp-115和p-8制备的覆盆子饮料的羟自由基清除能力对比图。
具体实施方式
27.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明
各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
28.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
29.实施例1覆盆子发酵乳酸菌的筛选
30.表1筛选乳酸菌所采用的样品及其来源
[0031][0032][0033]
(1)筛选方法：吸取5ml样品液到20ml mrs液体培养基中，于37℃下增菌培养24h，然后用生理盐水进行梯度稀释，取合适稀释度(稀释度为10-6
)的菌液0.1ml涂布于含有1.5％caco3(质量比)的mrs琼脂平板上，并于37℃下培养24h。挑取平板上有明显溶钙圈且表面湿润的单菌落，于mrs平板上反复划线纯化，将纯化后的菌株于37℃下进行液体培养，培养24h后吸取700μl的菌液与300μl 50％甘油进行混合，混匀后放于-80℃冰箱中进行保存。
[0034]
(2)筛选结果：如表2所示，从泡菜、豆豉、腐乳等样品中共分离得到103株乳酸菌。然后利用这103株乳酸菌(分离自泡菜、豆豉、腐乳等)对覆盆子原料进行发酵(具体发酵方法同实施例2)，发现乳酸菌p-1制备的覆盆子发酵液中多酚含量最高，经过16s rdna分子生物学鉴定方法，将该菌鉴定为戊糖乳杆菌p-1(lactobacilluspentosus p-1)，并对该菌进行了保藏，保藏信息如下：
[0035]
保藏时间：2021年9月18日；
[0036]
保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；
[0037]
保藏编号：gdmcc no:61941；
[0038]
保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；
[0039]
分类命名：lactobacilluspentosus。
[0040]
表2筛选所得的乳酸菌及其命名
[0041][0042][0043]
实施例2富含多酚覆盆子发酵饮料的制备
[0044]
1、制备工艺
[0045]
制备工艺包括以下步骤
[0046]
(1)粉碎：将覆盆子果干用高速粉碎机进以25000r/min的转速粉碎10秒钟，使其呈粉状，并将干果粉过40目筛，未过筛的果粉放进粉碎机再粉碎4秒钟，再次过40目筛，如此反复，直至全部过筛。
[0047]
(2)加水溶解：称取一定量的覆盆子果粉，按照1：20的料液比(mg:ml)加入饮用水进行溶解。
[0048]
(3)酶解：加入2％(覆盆子溶液重量的2％)的果胶酶，于43℃下恒温水浴酶解3h；
[0049]
(4)成分调整：加入10％(覆盆子溶液重量的10％)的白砂糖，充分溶解后再加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节ph至6.0。
[0050]
(5)巴氏灭菌：成分调整后将样品放进水浴锅中，63℃、下恒温加热灭菌15min，制备得到覆盆子溶液，备用。
[0051]
(6)菌种活化：在超净工作台中，吸取100μl保存在-80℃的戊糖乳杆菌p-1，(菌株p-1经过分离纯化后，用mrs液体培养基进行培养，培养24h后，吸取700μl的菌液与300μl 50％甘油进行混合，混匀后放置-80℃冰箱保存。活化时只需要从冰箱中取出，放于4℃冰箱进行解冻，解冻后即可进行活化)并以植物乳杆菌lp-115和p-8(购买自广东微生物研究所菌种保藏中心)为对照菌株，分别接种于10mlmrs液体培养基中，在37℃的培养箱中培养24-36h，然后将培养所得菌液在mrs琼脂培养基上进行划线，挑取表面呈乳白色且光滑湿润的单菌落到mrs液体培养基中培养16h-24h，直至菌株到对数生长后期，对菌液进行离心，用无菌水清洗2次，去除菌体中残余的培养基，将菌液的od
600
值调至108左右，得到活化后的戊糖乳杆菌。
[0052]
将得到的戊糖乳杆菌经过离心后倒掉培养基，然后加入相同体积的无菌水重悬，再离心，再重悬，并在600nm下测量吸光值，保证通过无菌水稀释得到的发酵剂的吸光值基
本保持不变(即108左右)，即可得到用于发酵的乳酸菌发酵剂。
[0053]
(8)发酵：按3％(覆盆子溶液体积的3％)的接种量往灭菌后的覆盆子溶液中接入活化后的乳酸菌发酵剂，在37℃的恒温培养箱中发酵24h，每隔4h取样测定样品的中微生物、酸度值、总酚含量和抗氧化性能。
[0054]
2、实验结果
[0055]
(1)生长曲线(生长能力)的绘制
[0056]
每隔4小时取样，对样品中戊糖乳杆菌p-1的活菌数进行测定，将样液进行合适的梯度稀释后，取1ml稀释样液加入到空平板中，然后采用倾注法将45℃的mrs琼脂培养基加入到含有稀释样液的平板中，摇匀，凝固后放到37℃培养箱中进行培养，24小时后对生长菌落进行计数，每次计数做三个平行。
[0057]
图1的生长曲线的结果显示，戊糖乳杆菌p-1能够很好的适应覆盆子的发酵环境，延至期较短只有4h，对数生长期有12h，微生物活菌数最高可以达到109cfu/ml，而商用菌株lp-115和p-8的延至期都为8h，对数生长期4-6h，微生物活菌数为108cfu/ml，因此戊糖乳杆菌p-1对数生长期较长且菌含量较高，该菌株运用于发酵覆盆子饮料的实际生产中可节约生产成本。
[0058]
(2)产酸能力
[0059]
每隔8h从发酵覆盆子饮料中取样并测定其酸度值，酸度值测定方法参考国标gb5413.34—2010，先精确吸取10ml酸浆水样品，再添加20ml不含co2的蒸馏水，移液枪吸取0.5ml酚酞指示剂加入酸浆水中并搅拌混匀后，用0.1mol/l的naoh标准溶液进行滴定至酸浆水溶液变红，并且在30s内不发生褪色，观察并记录滴定前后氢氧化钠的体积v，酸度的计算按照如下所示的公式进行：
[0060]
x＝(c
×v×
100)/(m
×
0.1)；
[0061]
x——酸浆水样品的酸度值(ot)；
[0062]
c——氢氧化钠的浓度(mol/l)；
[0063]
v——氢氧化钠标液滴定的体积(ml)；
[0064]
m——样品的质量(g)。
[0065]
图2的研究结果显示，随着发酵时间的延长，3株菌制备的发酵液中的酸度值均不断增加，其中，戊糖乳杆菌p-1能更好的适应覆盆子的发酵环境，其酸度值在发酵8h,16h和24h时都要显著高于商用菌株植物乳杆菌lp-115和p-8，因此戊糖乳杆菌p-1能够快速的利用发酵体系中的碳源，并将其转化成乳酸，使覆盆子发酵饮料酸甜可口，并可缩短发酵时间，节约生产成本。
[0066]
(3)总酚
[0067]
利用不同来源的乳酸菌(从泡菜中筛选得到的菌株p-1、lb2、lb3、lb4、从豆豉中筛选得到的菌株dc1、dc2、dc3、dc4、dc5、从腐乳中筛选得到的菌株df1、df2、df3、df4、df5、df6以及植物乳杆菌lp-115及p-8)对覆盆子饮料进行发酵，经过24h发酵后，对覆盆子饮料中的总酚含量进行测定，测定方法参照孙淑夷公开的福林-酚法来进行(孙淑夷.荔枝汁混菌发酵工艺及其功能活性成分研究[d].华南农业大学,2016.)。总酚的含量以没食子酸为标准物质计，结果表示为mg/l。以没食子酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，并以未发酵的样品作为空白对照。
[0068]
对不同来源乳酸菌制备的覆盆子发酵饮料中的总酚含量进行测定，图3的结果显示，经过乳酸菌发酵的覆盆子饮料，其总多酚含量都有显著增加，其中以戊糖乳杆菌p-1发酵样品中的多酚含量最高，达到4.79g/l，高于植物乳杆菌lp-115和p-8对照样品中多酚的含量。
[0069]
此外，测定了不同发酵时间下采用戊糖乳杆菌p-1制备的覆盆子发酵饮料中多酚的含量(图4)，发现随着时间的延长，覆盆子中总多酚的含量有较为显著的增加，尤其是在发酵前16h，达到了4.68g/l，说明戊糖乳杆菌p-1能够促进覆盆子中游离多酚的不断释放，显著提高覆盆子发酵饮料中的总酚含量。
[0070]
(4)抗氧化
[0071]
1)dpph清除率的测定
[0072]
测定方法参考刘力公开的方法(刘力,李理.酸浆水中3种菌株的产酸能力及抗氧化活性[j].食品与机械,2015,31(02):11-15.)，取样品待测样液2.0ml(稀释了10倍)，随后加入0.2mmol/ldpph溶液2.0ml，摇匀，静置一定时间，并以无水乙醇作空白，于517nm处测定吸光度(a样品)。测定517nm处样品待测液2.0ml和无水乙醇2.0ml混合液的吸光度(a对照)，再于517nm波长处测定2.0mldpph溶液与2.0ml无水乙醇混合液的吸光度(a空白)。
[0073]
然后按照下列的dpph自由基清除率的计算公式计算出dpph清除率：
[0074]
清除率s(％)＝[1-(a样品
–
a对照)/a空白]
×
100％。
[0075]
由图5可知，在发酵前16h戊糖乳杆菌p-1、植物乳杆菌p-115和p-8发酵的覆盆子饮料对dpph自由基的清除率伴随着发酵的进行而呈现逐步上升的趋势，并在覆盆子发酵液发酵16h时，戊糖乳杆菌p-1发酵液的dpph自由基清除率达到最大值，清除率为90.12％，显著高于植物乳杆菌lp-115和p-8的dpph样品的自由基清除率，比发酵初时高了30.94％。同时，在发酵24h时，戊糖乳杆菌p-1样品对dpph自由基的清除率虽然有所降低，但与对照组没有明显差异。此外，戊糖乳杆菌p-1发酵覆盆子饮料的dpph自由基清除率变化趋势与其多酚变化趋势较为一致，运用correl函数进行相关性分析，发现总酚含量与dpph自由基清除率的相关性达到0.97，具有较强的正相关性(r值》0.8，说明两者具有强相关性)，由于多酚具有较高的抗氧化活性(贾仕杰,张海华,张焕,等.东北6种红树梅酚类化合物的鉴定及抗氧化活性分析[j].食品科学,2019.)，说明多酚的释放显著提高覆盆子饮料的抗dpph自由基清除率。
[0076]
2)羟自由基清除能力测定
[0077]
采用fenton法进行羟自由基清除能力的测定：
[0078]
往对照管(aj)和测定管(ai)中均依次加入1ml浓度为6mmol/l的硫酸铁溶液，1ml待测样品液，并在测定管中加入1ml浓度为6mmol/l的过氧化氢溶液，而在对照管中加入1ml去离子水；另外依次在空白管(a0)中加入1ml浓度为6mmol/l的硫酸铁溶液，1ml蒸馏水，1ml浓度为6mmol/l的过氧化氢溶液，混合均匀后放置10min，再往测定管和空白管中加入1ml浓度为6mmol/l的水杨酸溶液，对照管则加入1ml蒸馏水替代，混匀，室温静置30min，于510nm处测定。
[0079]
最后按照下列的计算公式计算羟自由基清除率：
[0080]
清除率s(％)＝[1-(ai-aj)/ao]
×
100％。
[0081]
由图6可知，戊糖乳杆菌p-1、p-115和p-8发酵覆盆子饮料对羟自由基的清除率伴
随着发酵时间的延长而呈现逐步上升的趋势，在覆盆子发酵液发酵16h后，戊糖乳杆菌p-1发酵液的羟自由基清除率达到最大值，清除率为89.45％，显著高于植物乳杆菌lp-115和p-8的dpph样品的自由基清除率。同时，戊糖乳杆菌p-1样品对对羟自由基的清除率在发酵24h后没有显著降低，且高于其他两组。此外，戊糖乳杆菌p-1发酵覆盆子饮料的羟自由基清除率变化趋势与其多酚变化趋势较为一致，运用correl函数进行相关性分析，发现其总酚含量与dpph自由基清除率的相关性达到0.95，具有较强的正相关性，由于多酚具有较高的抗氧化活性，说明多酚的释放显著提高了覆盆子饮料的抗羟自由基清除率。
[0082]
综上所述可见，戊糖乳杆菌p-1能够通过发酵释放覆盆子饮料中的多酚，从而提高发酵饮料的抗氧化能力，并且戊糖乳杆菌p-1样品的总体抗氧化能力要显著高于对照组植物乳杆菌p-115和p-8的抗氧化能力。
[0083]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。