一种微生物气溶胶DNA提取方法与流程

一种微生物气溶胶dna提取方法
技术领域
1.本发明涉及dna提取技术领域，尤其涉及一种微生物气溶胶dna提取方法。


背景技术：

2.微生物气溶胶是指悬浮于大气或附着于大气颗粒物表面的细菌、真菌、放线菌、病毒、原生动物等有生命的活体所形成的胶体体系。城市污水处理厂的污水与污泥中含有大量的致病菌及病毒，在处理过程中受到环境、机械运作和曝气充氧等条件的影响，这些微生物极易扩散到空气中，形成微生物气溶胶。空气中的致病菌被人体摄入后可能会引起过敏性疾病或肠道疾病，严重影响了污水处理厂工作人员的身体健康。因此探究微生物气溶胶群落结构，确定致病菌种类及含量对控制微生物气溶胶的形成以及在污水处理过程中减少微生物气溶胶的释放具有重要意义。
3.随着分子生物学的发展，高通量测序法已越来越受到学术界的关注，能够实现一次对几十万到上千万条dna序列进行并列测序。首先提取样本细菌或真菌的dna，然后进行pcr扩增，最后通过高通量测序鉴定出微生物群落结构和多样性。高通量测序技术在微生物气溶胶中的应用面临的一项主要挑战是空气中微生物含量过低以至于难以得到测序所需要的dna量。
4.目前，污水处理厂微生物气溶胶研究中一般使用dna提取试剂盒中提供的药剂提取样本中dna。因为空气中生物量较低，这种提取方法的失败率较高，对后续研究进度有影响。此外，也有研究利用dna试剂盒与核酸纯化试剂盒相结合来提取dna，虽然此方法能够有较高的提取成功率，但也存在步骤繁琐，成本高的缺点。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种微生物气溶胶dna提取方法，为后续分子生物学研究提供了基础。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种微生物气溶胶dna提取方法，包括如下步骤：将收集的样品用pbs缓冲液洗脱后，抽滤到pes滤膜上，用试剂盒提取dna。
8.作为优选，收集样品时采用总悬浮颗粒物采样器，收集样品时的采样流量为90～110l
·
min
‑1，所述收集样品的时间为22～26h。
9.作为优选，所述洗脱的方法为：将携带有收集样品的载体和pbs缓冲液混合，3～5℃条件下190～210g离心2～4h。
10.作为优选，所述抽滤前将洗脱后的样品涡旋4～6min。
11.作为优选，所述抽滤后将pes滤膜风干并剪碎。
12.作为优选，所述pes滤膜剪碎后每片的大小为0.15～0.25cm2。
13.作为优选，所述试剂盒为mo
‑
bio powersoil dna isolation kit和fastdna spin kit for soil。
14.本发明提供了一种微生物气溶胶dna提取方法，包括如下步骤：将收集的样品用pbs缓冲液洗脱后，抽滤到pes滤膜上，用试剂盒提取dna。本发明与以往空气微生物dna提取方法相比，方法更加简单、快捷、成本低，并成功克服了空气样品dna提取浓纯度差的问题。运用本方法所提取的空气微生物dna样本纯度高、pcr扩增后电泳胶图清晰明显。为后续分子生物学研究提供了基础。
附图说明
15.图1为本发明实施例中dna样品的质检报告结果；
16.图2为本发明实施例中dna样品的细菌pcr电泳胶图。
具体实施方式
17.本发明提供了一种微生物气溶胶dna提取方法，包括如下步骤：将收集的样品用pbs缓冲液洗脱后，抽滤到pes滤膜上，用试剂盒提取dna。
18.在本发明中，收集样品时优选采用总悬浮颗粒物采样器。
19.在本发明中，所述总悬浮颗粒物采样器优选为青岛聚创环保公司生产的jch
‑
120f智能中流量便携式总悬浮颗粒物采样器，配备tsp颗粒物切割器。
20.在本发明中，所述总悬浮颗粒物采样器中所用的采样膜优选为90mm的玻璃纤维滤膜。
21.在本发明中，收集样品时将90mm的玻璃纤维滤膜放入tsp颗粒物切割器内，再将tsp颗粒物切割器安装至总悬浮颗粒物采样器上。
22.在本发明中，收集样品时的采样流量优选为90～110l
·
min
‑1，进一步优选为95～105l
·
min
‑1，再进一步优选为100l
·
min
‑1。
23.在本发明中，所述收集样品的时间优选为22～26h，进一步优选为23～25h，再进一步优选为24h。
24.在本发明中，所述洗脱的方法优选为：将携带有收集样品的载体和pbs缓冲液混合，3～5℃条件下190～210g离心2～4h。
25.在本发明中，所述洗脱的温度优选为4℃。
26.在本发明中，所述离心时的离心力优选为195～205g，进一步优选为200g。
27.在本发明中，所述离心的时间优选为3h。
28.在本发明中，所述抽滤前优选将洗脱后的样品涡旋4～6min，进一步优选为5min。
29.在本发明中，所述涡旋时优选采用涡旋仪。
30.在本发明中，所述抽滤后优选将pes滤膜风干并剪碎。
31.在本发明中，所述pes滤膜剪碎后每片的大小优选为0.15～0.25cm2，进一步优选为0.2cm2。
32.在本发明中，所述试剂盒优选为mo
‑
bio powersoil dna isolation kit和fastdna spin kit for soil。
33.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
34.实施例1
35.一种空气微生物dna提取方法，包括以下步骤：
36.(1)大气颗粒物采样器及配件的准备，将所使用到的实验器材(剪刀、镊子、玻璃培养皿)在高压蒸汽灭菌锅内进行高压灭菌处理30min(103.43kpa,121℃)，放置于无菌箱中待用。将90mm的玻璃纤维滤膜放入500℃马弗炉中烘烤5h灭菌，取出后放入已消毒的铝膜中加密封袋保存；
37.(2)微生物气溶胶现场采样：选取一城市污水处理厂的格栅间、初沉池、二沉池为采样点，将jch
‑
120f智能中流量便携式总悬浮颗粒物采样器分别置于格栅设备、初沉池边、二沉池边水平0.5m处，垂直高度1.5m处。将灭菌的直径90mm的玻璃纤维滤膜放入tsp颗粒物切割器内，再将切割器安装至采样器上，采样流量为100l
·
min
‑1，采样时间24h；
38.(3)采样完毕，用无菌镊子取出滤膜，保存在无菌锡箔纸内，尽快转运到实验室称取立即处理，或者冻存于
‑
80℃冰箱内；
39.(4)用75％乙醇清洁含有颗粒物样本的自封塑料袋外表面后放入无菌操作台，用无菌镊子取出滤膜。
40.(5)用消毒过的剪刀将滤膜剪碎，放入50ml离心管中，向试管中加入50ml超纯1
×
pbs缓冲液，洗脱颗粒物，拧紧盖子，4℃200g离心3h；
41.(6)用灭菌后的镊子取出0.2μm的pes滤膜，把它放在抽滤装置上；
42.(7)样品离心后，涡旋5min，将悬浮液倒入抽滤漏斗中，开始抽滤；
43.(8)抽滤后用无菌镊子将pes滤膜放入无菌培养皿中，让滤膜自然风干。风干后用无菌剪刀将pes滤膜剪成小片(每片0.20cm2)放入mo
‑
bio powersoil试剂盒中的powerbeadtube中，
44.将60μl的c1溶液加入到含盛有膜碎片的powerbead tube中，65℃水浴加热15min。水浴加热后涡旋powerbeadtube 15min；
45.在室温下，14000g离心15min。将上清液转移到mo
‑
bio powersoil试剂盒中2ml的powersoil collection tubes中；
46.向每个离心管中加入250μl的c2溶液，涡旋5秒，4℃静置5min后，14000g离心1min。将上清液从每个管转移到新的2ml的powersoil collection tubes中；
47.向盛有上清液的2ml离心管中各加入200μl的c3溶液，涡旋5s，4℃静置5min后，14000g离心1min，观察到奶白色或白色沉淀，将上清液移入干净的4ml离心管中；
48.在4ml离心管中分别加入fastdna spin kit for soil试剂盒中1ml的binding matrix溶液。盖好管盖后，上下颠倒混匀2min，静置10min后用移液枪吹吸混匀，移取600μl到fastdna spin kit for soil试剂盒的spin filter中，14000g离心1min，弃下清液，再移600μl重复上述操作，直到液体全部移完为止；
49.在spin filter中加入500μl已事先与乙醇混匀的sew
‑
s溶液，用移液枪吹吸混匀后，14000g离心1min，弃滤液，重复该步骤2遍；
50.将spin filter 14000g离心2min，然后将spin filter放入新的1.5ml离心管中，开盖放置5min；
51.向spin filter中加入50μl的mo
‑
bio powersoil dna试剂盒c6溶液，并用枪头混匀，55℃水浴5min；
52.水浴后将spin filter 14000g离心2min，将spin filter弃掉，dna提取完成。
53.(注：c1、c2、c3、c6均为试剂盒内药剂)
54.(9)样品dna的质检，取1μl的dna溶液，用nano drop one仪器检测dna的浓度、od260/280、od260/230。所得结果如图1所示。结果显示，样品od260/280值在1.47～1.54，说明dna纯度较高。
55.(10)pcr扩增与检测，细菌16s rrna扩增采用引物338f/806r(5
’‑
a ctcctacgggaggcagcag
‑3’
/5
’‑
ggactachvgggtwtctaat
‑3’
)，pc r实验采用transgen ap221
‑
02：transstart fastpfu dna polymerase；
56.20μl反应体系如下：5
×
fastpfu buffer 4μl，2.5mm dntps 2μl，fo rward primer(5μm)0.8μl，reverse primer(5μm)0.8μl，fastpfu polym erase 0.4μl，bsa 0.2μl，template dna 10ng，补ddh2o至20μl；
57.pcr仪：abi9700型；
58.pcr反应参数：a.1
×
(3minutes at 95℃)，b.循环数(30seconds at95℃；30seconds at退火温度℃；45seconds at 72℃)，c.10minutes at 72℃，10℃until halted by user；
59.pcr扩增结果鉴定胶图如图2所示，结果显示，pcr产物目的条带大小正确，条带单一明亮。说明dna浓度合适，可进行后续分子生物学实验。
60.由以上实施例可知，本发明提供了一种微生物气溶胶dna提取方法，包括如下步骤：将收集的样品用pbs缓冲液洗脱后，抽滤到pes滤膜上，用试剂盒提取dna。本发明与以往空气微生物dna提取方法相比，方法更加简单、快捷、成本低，并成功克服了空气样品dna提取浓纯度差的问题。运用本方法所提取的空气微生物dna样本纯度高、pcr扩增后电泳胶图清晰明显。为后续分子生物学研究提供了基础。
61.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。