一种新型人参皂苷在制备抗心肌纤维化药物中的应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及20(r)-25羟基-达玛烷型-3β,12β,20三醇在制备抗心肌纤维化药物中的应用。


背景技术：

2.心肌纤维化是多种心血管疾病发生发展的终末病理改变。由中重度的冠状动脉粥样硬化性狭窄引起心肌纤维持续性和反复加重的心肌缺血缺氧所产生的结果，导致逐渐发展为心力衰竭的慢性缺血性心脏病。近几年来，抗心肌纤维化的西药在临床应用的安全性不断被质疑，很多药物本身存在局限性及副作用。因此，纯天然、毒副作用小的中医药治疗心肌纤维化的独特优势越来越被人们重视。
3.20(r)-25羟基-达玛烷型-3β,12β,20三醇(ad2)是从人参中发现和提取的具有高活性的新型原人参二醇。现已证明，ad2可抑制胰腺癌、肺癌、乳腺癌等癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，具有抗癌特性。此外，ad2还可通过抑制氧化应激损伤保护高糖条件下的肾小球系膜细胞。然而，目前关于ad2抗心肌纤维化的相关研究还未见报道。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明的目的是提供了20(r)-25羟基-达玛烷型-3β,12β,20三醇在制备抗心肌纤维化药物中的应用。
5.本发明目的是通过以下方式实现：
6.本发明提供20(r)-25羟基-达玛烷型-3β,12β,20三醇在制备抗心肌纤维化药物中的应用。
7.进一步的，所述的药物包括有效量的20(r)-25羟基-达玛烷型-3β,12β,20三醇和药学上可接受的载体。
8.进一步的，所述的药学上可接受的载体包括填充剂、稀释剂、粘合剂、崩解剂、乳化剂和无毒副作用的载药载体。
9.进一步的，所述的药物被制备成药学上允许的剂型。
10.进一步的，所述的剂型包括片剂、滴剂、注射制剂、胶囊制剂。
11.进一步的，所述的药物以单剂量药物形式制备。
12.进一步的，所述的单剂量药物包含1-1000mg 20(r)-25羟基-达玛烷型-3β,12β,20三醇。
13.进一步的，所述的药物能够下调心肌纤维化受试者collageni、collageniii、pdgfr、ho-1和timp-1的mrna表达水平。
14.进一步的，所述的药物能够降低心肌纤维化受试者ros的生成。
15.进一步的，所述的药物能够下调心肌纤维化受试者的pai-1和α-sma蛋白表达。
16.本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
17.目前心肌纤维化的治疗药物主要是西药，但西药存在局限性及副作用，本发明研
究发现ad2具有减缓心肌纤维化的功能，为探索低毒、高效、多靶点的抗心肌纤维化中药单体提供理论依据，对治疗心肌纤维化具有重要的临床意义。这将为心肌纤维化的临床治疗提供新的药物治疗靶点及全新的治疗策略，也为开发具有自主知识产权的创新药物奠定理论和实验基础。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
19.图1为人参皂苷ad2的化学结构式。
20.图2为人参皂苷ad2对小鼠心脏重量、体重以及心肌纤维胶原蛋白沉积程度的影响；a为实验结束后各实验组小鼠的心脏图片，b-e分别为con组、iso组、iso ad2组和iso pro组小鼠的心脏重量，体重，心脏体重比值以及心肌切片的masson三色染色。
21.图3为人参皂苷ad2对心肌纤维化相关基因和蛋白表达的影响；a-d分别为con组、iso组、iso ad2组、ad2组小鼠心肌纤维化指标i/iii型胶原蛋白、timp-1、pdgfr的mrna表达水平，e为con组、iso组、iso ad2组、ad2组和iso pro组小鼠心肌纤维化相关i型胶原蛋白表达水平。
22.图4为人参皂苷ad2对nrf2核转移、ho-1基因表达以及心脏组织中ros含量的影响；a为ad2时间梯度处理原代心肌成纤维细胞(mcfs)后ho-1蛋白表达水平，b为ad2与iso共同处理后ho-1蛋白表达水平的改变，c为利用ad2时间梯度处理mcfs对nrf2核转移的影响，d-e分别为在动物实验con组、iso组、iso ad2组、ad2组、iso pro组心脏组织中ho-1的mrna表达，f为各组心脏组织中ros含量，g-h分别为用iso和ad2处理mcfs细胞后pai-1和α-sma蛋白表达水平的改变。
23.图5为ho-1抑制剂znpp对人参皂苷ad2抗心肌纤维化作用的影响；a-c分别为con组、iso组、iso ad2组iso ad2 znpp组小鼠心脏组织masson三色染色、dcfh-da染色和collagenⅰ的蛋白水平。
具体实施方式
24.下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
25.实施例1
26.体内实验：将50只雄性8周龄c57bl/6小鼠随机分为5组：(1)实验对照组(con)：自由饮水饮食；(2)心肌纤维化模型组(异丙肾上腺素(iso))：给予小鼠iso(10mg/kg)腹腔注射14天诱导心肌纤维化；(3)药物处理组(iso ad2)：每两天对小鼠灌胃ad2(20mg/kg)，预处理5天后腹腔注射iso(10mg/kg)，持续14天，在诱导心肌纤维化期间每隔一天给予ad2(20mg/kg)；(4)阳性对照组(iso 普萘洛尔pro)：给予小鼠iso(10mg/kg)一小时后腹腔注射普萘洛尔(40mg/kg)，持续14天；(5)ho-1抑制剂组(iso ad2 锌原卟啉znpp)组：每两天对小鼠灌胃ad2(20mg/kg)，并腹腔注射znpp(5mg/kg)，预处理5天后腹腔注射iso(10mg/kg)，持续14天诱导心肌纤维化。
27.14天后各组小鼠称重，处死小鼠，取出心脏并称重，各组小鼠的心脏重量、体重、心
脏体重比值如图2所示；取上述实验组处死小鼠的心脏组织进行masson三色染色，检测胶原蛋白沉积程度，具体操作步骤为：对上述麻醉状态下的小鼠取其心脏，放入组织固定液中，对心脏组织进行石蜡包埋，切片后行石蜡切片脱蜡水化，通过苏木素染色，分化液分化，用masson代丽春红酸性复红液染色后，再用2％冰醋酸水溶液浸洗。用1％磷钼酸水溶液分化，然后直接用苯胺蓝染色。然后以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片子后，进行脱水，透明和封片，最后在显微镜下观察小鼠心肌组织纤维化程度。
28.由图2可以看出，iso组显示心脏体积明显增大，给予ad2或普萘洛尔(pro)后心脏体积变小，iso组显示心脏重量、心脏体重比值均显著升高，给予ad2或pro后明显降低，不同实验组之间的体重并无明显变化，masson三色染色显示iso组心脏组织大量胶原沉积，而给予ad2后胶原沉积明显减少。由此可见，人参皂苷ad2可缓解心肌纤维化的病理改变。
29.采用实时荧光定量qrt-pcr技术检测上述实验组处死小鼠的心肌组织中collageni/iii、timp-1、pdgfr和ho-1的mrna表达水平，具体操作步骤为：(1)引物设计：遵循一般的引物设计原则；(2)提取rna：按照试剂盒说明书操作即可；(3)反转录：1.去除基因组dna反应：按试剂盒说明书将试剂置于冰上配制反应混合液；2.反转录反应：反应液配制在冰上进行，试剂轻柔混匀后立即进行反转录反应；(4)加样：根据试剂盒以及样品数量配制collageni/iii、timp-1、pdgfr、ho-1和gapdh预混液，随后按照体系将样本及预混液按顺序加入96孔pcr板中，封口离心；(5)上机测定：打开软件，将pcr板放入bio-rad real-time system机器检测区，设置相应温度时间循环模板、样本名称及检测因子，点击开始等待结果数据并制图。
30.应用western blot免疫印迹法检测上述实验组处死小鼠的心肌组织中ⅰ型胶原蛋白表达，具体操作步骤为：采用bca蛋白质浓度检测试剂盒来测定各组蛋白浓度，并计算上样量。提取的蛋白加入loading buffer在100℃沸水中煮10min使其变性。然后将各组蛋白质样本加入至提前做好的sds-page胶中进行电泳；采用pvdf膜转膜成功后，将转染成功的膜放入5％的脱脂牛奶中，在摇床上封闭20min；将封闭的pvdf膜分别与一抗兔抗colleagenⅰ(1∶1000)和兔抗β-actin(1∶1000)4℃孵育过夜。第2天将孵育一抗的pvdf膜用pbst洗涤后，再放入配制的羊抗兔的二抗(1:5000)中在室温下孵育1h；最后用ecl上机曝光显影。
31.由图3可以看出，给予小鼠ad2 20mg/kg对iso所致的collageni/iii、pdgfr和timp-1的mrna水平升高均具有缓解作用；给予小鼠ad2 20mg/kg对iso所致的1型胶原蛋白水平升高具有明显的缓解作用，由此可知，人参皂苷ad2可下调心肌纤维化相关基因和蛋白的表达。
32.体外实验：体外培养小鼠原代心肌成纤维细胞，选用ad2(20μm)依照时间依赖性(0，3，6，9h)处理细胞，利用核质分离技术检测细胞核内nrf2的蛋白含量，用20μm ad2预处理细胞，9小时后给予15μm的iso诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，利用western免疫印迹法检测细胞内α-sma、ho-1、pai-1蛋白含量，并使用dcfda荧光探针观察上述实验组处死小鼠的心肌组织内ros的含量，western免疫印迹法的具体操作步骤为：首先用磷酸盐缓冲液(pbs)收集细胞，离心后弃掉上清，加入细胞裂解液，在4℃条件下裂解细胞20min,期间振荡器震荡细胞5次，然后采用低温高速离心机离心15min后收集上清。采用bca蛋白质浓度检测试剂盒来测定各组蛋白浓度，并计算上样量。提取的蛋白加入loading buffer在100℃沸水中煮10min使其变性。然后将各组蛋白质样本加入至提前做好的sds-page胶中进行电泳；
采用pvdf膜转膜成功后，将转染成功的膜放入5％脱脂牛奶中，在摇床上封闭20min；将封闭的pvdf膜分别与一抗兔抗-sma、一抗兔抗-ho-1、一抗兔抗-pai-1(稀释比均为1∶1000)和兔抗β-actin(1∶1000)4℃孵育过夜，第2天将孵育一抗的pvdf膜用pbst洗涤后，再放入配制的羊抗兔的二抗(1:5000)中在室温下孵育1h；最后用ecl上机曝光显影。
33.dcfda荧光探针检测法的具体步骤：心脏组织切片滴加ros染液，孵育30min，滴加dapi染色液以染核，充分覆盖组织，室温避光5min后pbs液冲洗3次，每次5min，滴加适量抗荧光淬灭剂后封片，荧光显微镜下观察心脏组织ros表达。
34.由图4可以看出，ad2能够时间依赖性增加ho-1蛋白水平，ad2还能够增加iso处理后mcfs中ho-1的蛋白水平，ad2能够促进nrf2的核转移，单独ad2处理能够增加心脏组织中ho-1的mrna水平，ad2还能够增加iso处理后小鼠心脏组织中ho-1的mrna水平，ad2能够显著减少iso诱导的氧化应激反应，ad2能够下调iso诱导增加的pai-1和α-sma的蛋白水平。由此可知，人参皂苷ad2可促进nrf2核转移上调ho-1基因表达，减少iso诱导的氧化应激反应。
35.通过添加ho-1抑制剂znpp考察抑制剂对ad2抗胶原沉积作用的影响，由图5可以看出，ho-1抑制剂znpp可削减ad2抗胶原沉积作用(通过masson染色观察胶原沉积，通过wb观察胶原蛋白i的表达水平)及抗氧化作用(通过dcfh-da染色观察ros的含量)，由此可知，ho-1抑制剂可削减人参皂苷ad2对iso的抗心肌纤维化作用。
36.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。