尼拉帕尼及其衍生物的新用途的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，尤其涉及尼拉帕尼及其衍生物的新用途。


背景技术：

2.尼拉帕尼，又名为zejula，mk-4827，niraparib，则乐，尼拉帕利；cas： 1038915-60-4；化学名dis 2-{4-[(3s)-piperidin-3-yl]phenyl}-2hindazole7-carboxamide 4-methylbenzenesulfonate水合物(1:1:1)。是一种有机物，化学式 为c26h30n4o5s，白色至米白色，不吸水晶体。其分子量为510.61amu。结 构式如图9中所示。
[0003]
尼拉帕尼在目前已有的研究中主要作为一种聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑 制剂(parp inhibitor，简称parp抑制剂)，即选择性的parp1/2抑制剂。 niraparib通过高度选择性与parp1和/或parp2的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nicotinamide adenine dinucleotide ,nad )结合，阻止parp与dna的分 离，导致癌细胞无法进行后续的dna修复，肿瘤细胞里聚集大量的基因组损 害(genomic damage)，使肿瘤细胞得以自毁(self-destruct)，最终达到治疗肿 瘤的目的。体外研究曽显示niraparib-诱导细胞毒性可能涉及parp酶活性的 抑制作用和增加parp-dna复合物的形成导致dna损伤，凋亡和细胞死亡。 在brca1/2有或无缺陷肿瘤细胞系中观察到增加niraparib-诱导的细胞毒性。 在brca1/2有缺陷小鼠肿瘤细胞的异种移植模型和在人有同源重组有或突变 或野生型brca1/2缺乏患者-衍生移植瘤模型niraparib减低肿瘤生长。因此 上述药物均被广泛应用于复发性表皮卵巢，输卵管，或原发性腹膜癌患者对 基于铂化疗是一个完全或部分缓解成年患者的维持治疗。
[0004]
近年来，我国冠心病的发病率呈上升趋势。冠心病是以动脉粥样硬化导 致的血管狭窄为主要病理过程的血管性疾病。介入治疗和冠状动脉旁路移植 术有效地改善了多种复杂和危重型冠心病的临床症状，然而血管病变部位的 再狭窄仍然是目前困扰临床的主要问题之一。在动脉粥样硬化和血管成形术 后再狭窄的病理过程中，内皮细胞在压力和炎症等因素的作用下发生损伤， 引起血管平滑肌细胞异常增殖并由收缩型平滑肌细胞向分泌型平滑肌细胞转 变，进而导致血管壁增厚和管腔狭窄。在高血压等病理状态下，血管平滑肌 受到不同的剪切力也会发生表型转化，进而导致血管重塑。
[0005]
血管平滑肌细胞表型转化是介导血管中膜钙化的重要病理生理学过程。 在正常的血管组织中，血管平滑肌细胞(vsmc)呈收缩表型，为高度分化的 细胞，主要功能是维持血管的形态及调节血管收缩和张力，具有低增殖、低 迁移和低分泌的特征。主要标志性蛋白如平滑肌α肌动蛋白(smooth musclealpha actin，smαactin)、平滑肌22α、平滑肌肌球蛋白重链等。各类心血管危 险因素成为驱动血管平滑肌细胞(vsmc)表型转分化的诱因，可诱导平滑肌 细胞由收缩型(分化型)向合成表型(去分化型)转分化，该型细胞具有高 增殖、高迁移和高蛋白分泌的特征。研究发现，vsmcs表型转换是动脉粥样 硬化、高血压及血管成形术后再狭窄等众多血管疾病发生、发展的关键步骤。
[0006]
血管再狭窄是一个复杂的病理过程，有效地解决血管再狭窄这类临床问 题，能够
极大地扩展血管成形术的应用，从而更好的将血流重运术用于血管 增生性疾病等患者身上，维护人类健康。目前应用于科研中的抑制血管损伤 后再狭窄的药物有数种，其中最为常见的有：抗炎症药物(如地塞米松、雌 激素)、抗细胞增殖剂(如雷帕霉素、西罗莫司、紫杉醇)、血管紧张素转换 酶(简写为ace)抑制剂西拉普利和螺普利，药物涂层支架(des)使用的 涂层药物[如抗栓剂(如水蛭素、肝素)等]。已有的研究表明niraparib可以 通过促进细胞凋亡，在肿瘤疾病中发挥治疗作用，其在血管损伤后再狭窄中 的作用尚无研究。


技术实现要素：

[0007]
针对上述问题，本发明提供尼拉帕尼及其衍生物的新用途，主要针对平 滑肌异变提供了新的治疗方案，也开发了尼拉帕尼新的用途，拓展了其应用 前景。
[0008]
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
[0009]
尼拉帕尼或其衍生物在制备抑制pdgfrβ表达和/或pdgfrβ下游信号 通路制剂中的应用。
[0010]
尼拉帕尼或其衍生物在制备抑制平滑肌表型转换制剂中的应用。
[0011]
一些方式中，所述平滑肌表型转换为收缩型向合成表型转换。
[0012]
尼拉帕尼或其衍生物在制备防治血管疾病药物中的应用。
[0013]
一些方式中，血管疾病包括血管中膜钙化、动脉粥样硬化、高血压、血 管损伤引发的内皮细胞过度增殖和血管再狭窄。
[0014]
一些方式中，血管再狭窄包括血管损伤后再狭窄。
[0015]
一些方式中，血管损伤后再狭窄包括pci再狭窄、支架内再狭窄、旁路 移植后再狭窄。
[0016]
一些方式中，所述防治血管疾病药物中尼拉帕尼作用浓度为0.5-5μm或 5-20mg/kg/d；优选的，所用浓度为0.5μm或20mg/kg/d。
[0017]
抑制pdgfrβ表达和/或pdgfrβ下游信号通路的制剂，含有有效成分尼 拉帕尼或其衍生物。
[0018]
尼拉帕尼或其衍生物在制备促进αsma基因表达制剂中的应用。
[0019]
本发明的有益效果是：
[0020]
尼拉帕尼对pdgfrβ有抑制作用，因此niraparib可以抑制平滑肌表型转 换，从而预防和/或治疗血管损伤后再狭窄。此外，尼拉帕尼并无通常心血管 药物或其他平滑肌表型转换抑制剂的细胞毒作用，因此可以预期其安全性。 其可以作为治疗平滑肌参与的相关疾病如血管再狭窄、肿瘤等疾病的药物而 广泛应用。
附图说明
[0021]
图1中a为假手术 载体处理组，b为结扎 载体处理组，c为结扎 尼拉 帕尼处理组处理后，利用油红-苏木精(he)染色实验检测大鼠颈动脉结扎后 的血管形态；
[0022]
图2为不同浓度的niraparib和载体(dmso)利用edu实验检测vsmc 细胞增殖情况；
[0023]
图3为vsmc细胞给予pdgf-bb处理后，分别给予niraparib(0.5,1,5μm) 和载体(dmso)刺激。图中为不同浓度的niraparib及载体后利用pcr实验 检测细胞周期蛋白和抑癌蛋白的表达，vsmc细胞给予pdgf-bb处理后，细 胞周期蛋白表达上升，抑癌蛋白表达下
降；给予niraparib刺激后，细胞周期 蛋白表达下降，抑癌蛋白表达上升；
[0024]
图4为vsmc细胞给予pdgf-bb处理后，分别给予niraparib(0.5,1,5μm) 和载体(dmso)刺激。图中为不同浓度的niraparib及载体检测caspase 3表 达及活性，未见明显变化；
[0025]
图5为vsmc细胞给予pdgf-bb处理后，分别给予niraparib(0.5,1,5μm) 和载体(dmso)刺激。图中为不同浓度的niraparib利用transwell实验检测 细胞迁移情况；
[0026]
图6为vsmc细胞给予pdgf-bb处理后，分别给予niraparib(0.5,1,5μm) 和载体(dmso)刺激。图中为不同浓度的niraparib利用划痕实验检测细胞 增殖迁移情况；
[0027]
图7中大鼠颈动脉结扎后，分别给予大鼠载体和20mg/kg
·
dniraparib处 理，图中为不同浓度的niraparib利用免疫荧光实验检测收缩基因αsma表达 情况；
[0028]
图8为vsmc细胞给予pdgf-bb处理后，分别给予niraparib(0.5,1，5 μm)和载体(dmso)刺激。图中为不同浓度的niraparib利用蛋白印迹实验 检测pdgfrβ表达水平情况；图9为尼拉帕尼结构式。
具体实施方式
[0029]
名词释义：
[0030]
术语“尼拉帕尼衍生物”为与尼拉帕尼区别在于部分位置结构、官能团变化 的化合物，但这些位置的结构、官能团变化保持尼拉帕尼衍生物依然与尼拉 帕尼具有针对本发明涉及病症起到相同相近防治调节作用的衍生物。比如， 尼拉帕尼部分-h或官能团-nh2变化后形成的衍生物，只要针对本发明涉及病 症具有调节作用，就应当在本发明范围内。在下述介绍的一些方面中，尼拉 帕尼衍生物只要起到与尼拉帕尼针对相同病症治疗起到基本相同效果的均应 等同在本发明范围内，当然，其中涉及的治疗机理也基本相同时直接落入相 应权利要求范围内。
[0031]
术语“防治”是指对患者进行的意图治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状 况或障碍的医疗管理。该术语包括积极治疗，即治疗特别指向疾病、病理状 况或障碍的改善，并且还包括病因治疗，即治疗指向去除相关疾病、病理状 况或障碍的病因。此外，该术语还包括姑息治疗，即为减轻症状而不是治愈 疾病、病理状况或障碍而设计的治疗；预防性治疗，即旨在尽量最小化或者 部分或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍发展的治疗；和支持治疗，即用 于补充指向相关疾病、病理状况或障碍的改善的另一种特定疗法的治疗。同 时，在商业活动中，如果生产了含有与本发明相同组分的产品，产品说明书 未记载与本发明相同相近用途，但其给出了将相应产品用于实现与本发明相 同相近目的提示时，也应当视为应用。
[0032]
前述名词定义作为参考释义，除有特殊说明外，其余可参考领域内一般 意义理解。在没有反例的前提下，不做缩小型解释，也即，除存在反例证据 的实例，其余均应落入范围内。
[0033]
下面对本发明作进一步说明：
[0034]
本部分第一方面涉及：
[0035]
尼拉帕尼或其衍生物在制备抑制pdgfrβ表达和/或pdgfrβ下游信号 通路制剂中的应用。
[0036]
抑制pdgfrβ表达的目的主要是为了使其保持正常水平，防止其异常变 化导致病变。抑制pdgfrβ下游通路表达的目的也是为了使其保持正常水平， 防止其异常变化导致病变。其中，本段所述正常水平在医学上表现为医学参 考值，当表达超高时将其进行抑制降低。但是，如果是将其用于做某些极端 用途时，也应当落入本发明范围内。比如在一些环境中需要控制pdgfrβ表 达极大降低、最大程度控制pdgfrβ下游通路表达时；又如，防止pdgfrβ 表达增高使其保持一定水平、pdgfrβ下游通路表达维持一定水平时。
[0037]
当其用于其他途径中时，也可直接添加于待调节物质中，比如在商业性 研究实验中，将其作为pdgfrβ表达和/或pdgfrβ下游通路表达调节试剂使 用时，可直接添加于相关细胞液中起到于本发明基础目的相同的，都应当在 本发明范围内。
[0038]
本方面涉及的pdgfrβ下游通路表达抑制剂不限定其具体的应用方式， 在制备治疗一些涉及如pdgfrβ下游通路过表达引发病症时，也属于本方面 相关内容。
[0039]
部分方式中，所述抑制pdgfrβ表达和/或pdgfrβ下游通路表达制剂作 用浓度为0.5-5μm或5-20mg/kg/d；优选的，所用浓度为0.5μm或20mg/kg/d。 其中，作用浓度为以治疗为目的的使用，具体的浓度参数(含量指标)参考 合规的药物中有效成分浓度，其可制成制剂或药物颗粒等，使用方式为口服 或注射。
[0040]
本部分第二方面涉及：
[0041]
尼拉帕尼或其衍生物在制备抑制平滑肌表型转换制剂中的应用。
[0042]
一些方式中，所述平滑肌表型转换为收缩型向合成表型转换。
[0043]
血管平滑肌细胞能否维持收缩表型是决定血管稳态和重构的关键环节。 抑制平滑肌向其他表型不合理转换会引起一些病变。
[0044]
部分方式中，所述平滑肌表型转换包括由收缩型向分泌型转换。通过尼 拉帕尼尤其是尼拉帕尼抑制收缩型向分泌型转换转换。
[0045]
本部分第三方面涉及：
[0046]
尼拉帕尼或其衍生物在制备防治血管疾病药物中的应用。
[0047]
一些方式中，血管疾病包括血管中膜钙化、动脉粥样硬化、高血压、血 管损伤引发的内皮细胞过度增殖和血管再狭窄，针对其他相近致病机理导致 的心血管病症也应当在本发明范围内。
[0048]
一些方式中，血管再狭窄包括血管损伤后再狭窄。
[0049]
一些方式中，血管损伤后再狭窄包括pci再狭窄、支架内再狭窄、旁路 移植后再狭窄等，以及其他具有相似致病机理的病症。
[0050]
可以实现预防、治疗血管损伤后再狭窄疾病。如针对一些做了冠脉支架 手术等患者，尼拉帕尼也能起到后续辅助治疗的作用，进一步起到防止血管 再狭窄；类似于这类的辅助治疗制剂也应当在本发明的范围内。
[0051]
一些方式中，所述防治血管疾病药物中尼拉帕尼作用浓度为0.5-5μm或 5-20mg/kg/d；优选的，所用浓度为0.5μm或20mg/kg/d。
[0052]
本部分第四方面涉及：
[0053]
抑制pdgfrβ表达和/或pdgfrβ下游信号通路的制剂，其特征在于，含 有有效成分尼拉帕尼。
[0054]
其中，尼拉帕尼衍生物表示与尼拉帕尼相比仅在部分官能团、碳链长度 变化的化
合物。
[0055]
抑制剂为一种混合物，含有尼拉帕尼和其他药物；其中，尼拉帕尼在抑 制剂中对相应机理的有效作用浓度为0.5μm或20mg/kg/d。
[0056]
以尼拉帕尼或其衍生物为例，抑制剂含有尼拉帕尼或其衍生物中至少一 种：
[0057]
其中之一，抑制剂含有有效成分尼拉帕尼以及其他辅助药物，由此形成 一种新的针对pdgfrβ表达和/或pdgfrβ下游通路表达具有抑制作用的药 剂组合物。
[0058]
其中之二，抑制剂含有有效成分尼拉帕尼衍生物以及其他辅助药物，由 此形成一种新的针对pdgfrβ表达和/或pdgfrβ下游通路表达具有抑制作 用的药剂组合物。
[0059]
由此，使得尼拉帕尼或其衍生物与其他组分混合形成一种新的用于防治 相关疾病的制剂、药物。
[0060]
本部分第五方面涉及：
[0061]
尼拉帕尼或其衍生物在制备促进αsma基因表达制剂中的应用。其促进 作用主要根据治疗目的确定，可以表现为超出正常水平，也可表现为维持正 常水平。
[0062]
本部分第六方面结合具体的项目说明：
[0063]
本实施例测试使用的niraparib购自selleck公司，目录号：s2741别名： mk-4827。分别采用下述步骤中的方法检测如下实验中vsmc的表型转换情 况。
[0064]
实验一
[0065]
对c57bl/6大鼠行颈动脉结扎损伤或假手术损伤后，分别腹腔注射 niraparib(20mg/kg
·
d)和载体(dmso)。14天后，老鼠被安乐死，对受伤的 血管进行血管切除手术。用质量浓度为4％的甲醛固定石蜡包埋后，将血管切 段。图1分别为假手术 载体处理组、结扎 载体处理组、结扎 尼拉帕尼处理 组处理后，利用油红-苏木精(he)染色实验检测大鼠颈动脉结扎后的血管形 态。结果如图1所示。其中图1从左至右分别为假手术 载体处理组、结扎 载体处理组、结扎 尼拉帕尼处理组大鼠颈动脉平均厚度统计图。由图1可知， 与假手术 载体处理组相比，大鼠行颈动脉结扎后，颈动脉厚度增长，即血管 损伤导致血管内皮细胞过度增殖；而尼拉帕尼可抑制血管损伤导致的血管内 皮细胞过度增殖。
[0066]
实验二
[0067]
vsmc细胞给予pdgf-bb(30ng/ml)处理后，分别给予不同浓度的 niraparib(0.5μm,1μm,5μm)和载体dmso刺激。图2为不同浓度的niraparib 利用edu实验检测vsmc细胞增殖情况。图2中第一列为dapi染色细胞核， 第二列为edu染色细胞核，第三列为前两列的融合图；而第一行为载体处理 组，第二行为pdgf-bb和载体处理组，第三行为pdgf-bb和0.5μm的 niraparib处理组，第四行为pdgf-bb和1μm的niraparib处理组，第五行为 pdgf-bb和5μm的niraparib处理组。由图2可知，pdgf-bb处理vsmc 细胞后，edu阳性的细胞增多，进一步用niraparib处理后，edu阳性的细胞 减少，且随着niraparib浓度增大，edu阳性的细胞量减少。综上，pdgf-bb 处理vsmc细胞后，可促进vsmc细胞的增殖，而niraparib可抑制pdgf-bb 引起的细胞增殖，且随着niraparib的浓度增大，抑制作用增强。
[0068]
edu细胞增殖实验：将大鼠来源的原代细胞(vsmc)接种于96孔板中， 分别使用不同浓度(0.5μm,1μm,5μm)的niraparib和载体dmso处理细胞4 h。48h后，以上四组处理用pdgf-bb(30ng/ml)刺激48h(对照组为等体积 的dsmo)，edu的掺入分析按照制造商的说明进行，结果用olympus cellsensentry拍摄。
[0069]
实验三
[0070]
vsmc细胞给予pdgf-bb(30ng/ml)处理后，分别给予不同浓度的 niraparib(0.5μm,1μm,5μm)和载体dmso进行刺激，收集细胞，提取蛋白 后，利用聚合酶链式反应技术(pcr)实验检测细胞周期蛋白和抑癌蛋白的表达， 结果如图3所示。vsmc细胞在不同处理下，细胞周期蛋白(pcna、cyclind1) 和抑癌蛋白(p27、p21)的表达。由图3可知，给予pdgf-bb处理后，vsmc 细胞中细胞周期蛋白表达上升，抑癌蛋白表达下降；给予niraparib刺激后， 细胞周期蛋白表达下降，抑癌蛋白表达上升；而细胞凋亡有关的蛋白表达量 无明显变化。
[0071]
实验四
[0072]
vsmc细胞给予pdgf-bb(30ng/ml)处理后，分别给予不同浓度的 niraparib(0.5μm,1μm，5μm)和载体dmso进行刺激，收集细胞，提取蛋 白后，利用caspase 3表达及活性试剂盒(biomol)实验检测细胞凋亡水平， 结果如图4所示。由图4可知，不同浓度的niraparib对细胞凋亡无明显影响。
[0073]
实验五
[0074]
vsmc细胞给予pdgf-bb(30ng/ml)处理后，分别给予不同浓度的 niraparib(0.5μm,1μm，5μm)和载体dmso进行刺激，利用transwell实验 检测细胞迁移情况。结果如图5所示。由图5可知，pdgf-bb促进细胞的迁 移，而niraparib抑制了细胞的迁移，且随着浓度的增加，抑制作用增强。
[0075]
transwell法测定细胞迁移：vsmc经过niraparib预处理4h，播种到上 气室，500l dmem和体积浓度比为10％的胎牛血清和pdgf-bb(30ng/ml) 放置到下气室中。24h后，下气室用质量浓度为4％的甲醛固定细胞20分钟， 质量浓度为0.1％的结晶紫染色20分钟。使用olympus cellsens通道对迁移的 细胞进行拍照。
[0076]
实验六
[0077]
vsmc细胞给予pdgf-bb处理后(30ng/ml)，分别给予不同浓度的niraparib(0.5μm,1μm，5μm)和载体dmso进行刺激，利用划痕实验检测 细胞增殖迁移情况，结果如图6所示。由图6可知，pdgf-bb促进细胞划痕 的闭合率，而niraparib抑制了该促进作用，且随着niraparib浓度的增加，对 细胞划痕的闭合的抑制作用增强。
[0078]
细胞划痕实验：将vsmc接种于6孔板中，培养至80％密度。细胞单层 用1ml的移液管尖端划伤。细胞与不同浓度的niraparib预孵育4h后，用 pdgf-bb(30ng/ml)刺激48h(对照组为等体积的dsmo)，然后在含有体积浓 度比为10％的胎牛血清的dmem中培养。使用olympus cellsens entry观察细 胞，使用image j程序测量伤口闭合率。
[0079]
实验七
[0080]
分别对大鼠颈动脉结扎后，给予大鼠载体dmso和20mg/kg
·
dniraparib 处理，利用免疫荧光实验检测收缩基因αsma表达情况，组织切片用smα-actin 一抗(体积比为1：100)4℃孵育过夜，然后用fitc结合的荧光二抗37℃ 孵育2h。核酸用dapi 37℃染色15min。切片最终用olympus cellsens entry 观察成像。观察颈动脉形态，结果如图7所示。图7中第一列为假手术加空 载处理组，第二列为手术加空载处理组，第三列为手术加niraparib处理组， 而第一行为颈动脉αsma的免疫荧光染色，第二行为dapi对颈动脉的细胞核 进行染色，第三行为前两行的融合图。由图7可知，大鼠行颈动脉结扎后， 颈动脉壁加厚，而颈动脉中收缩基因αsma的表达量下降；进一步用niraparib 处理后，颈动脉壁厚度下降，收缩基
因αsma的表达量上升。血管损伤后， 血管壁增厚，收缩基因αsma的表达量下降。
[0081]
实验八
[0082]
vsmc细胞给予pdgf-bb处理后，分别给予不同浓度的niraparib(0.5μm, 1μm,5μm)和载体dmso进行刺激，利用蛋白印迹实验检测pdgfrβ蛋白水 平情况后，结果如图8所示。由图8可知vsmc细胞给予pdgf-bb处理后， 进一步使用niraparib处理后，随着niraparib浓度的增加，pdgfrβ蛋白水平 下降。因此，niraparib抑制了pdgfrβ的蛋白表达，且随着niraparib浓度 的增加，该抑制作用加强。
[0083]
综上实验结果可知，尼拉帕尼能够直接抑制vsmc的表型转换。
[0084]
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情 形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之 内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。