抗整联蛋白抗体及其用途的制作方法

抗整联蛋白抗体及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年4月8日提交的美国临时申请号62/830,961的权益，所述临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
3.本发明总体上涉及抗整联蛋白抗体(例如，与整联蛋白的rgd亚家族的一个或多个成员结合的抗体)及其用途。


背景技术：

4.整联蛋白是在发育和病理过程中起重要作用的细胞粘附受体。整联蛋白被广泛表达，并且体内的每个有核细胞都具有特定的整联蛋白特征。这些受体由非共价缔合的阿尔法(α)链和贝塔(β)链组成，这些链组合以提供多种具有不同的细胞和粘附特异性的异二聚体蛋白。整联蛋白家族由24个αβ异二聚体成员组成，所述成员介导细胞与细胞外基质(ecm)的附着，也参与专门的细胞-细胞相互作用。α亚基和β亚基彼此之间没有显示同源性，但是不同的α亚基本身之间具有相似性，并且在不同的整联蛋白β亚基中存在保守区。整联蛋白的一个亚类(24个中的8个)识别天然配体中的rgd序列(精氨酸(r)、甘氨酸(g)和天冬氨酸(d))，并且也被称为rgd结合整联蛋白，其包括αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3整联蛋白。整联蛋白涉及包括细胞粘附、迁移、侵袭、分化、增殖、凋亡和基因表达的多种细胞过程的调节。因此，需要开发可用于治疗诸如纤维化疾病、眼科疾病和癌症的参与整联蛋白途径的疾病的抗整联蛋白抗体。


技术实现要素：

5.一方面，本公开的特征在于一种抗体，其与αvβ1整联蛋白特异性结合但不与其他整联蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体不结合其他含αv或β1的整联蛋白异二聚体。在一些实施方案中，所述抗αvβ1抗体不结合其他rgd整联蛋白(例如，αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3整联蛋白)。在一些实施方案中，所述抗体与包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的参考抗αvβ1整联蛋白抗体竞争和/或结合相同的表位，其中所述参考抗体的vh和vl包含：(i)分别地在seq id no:11中示出的氨基酸序列和在seq id no:12中示出的氨基酸序列；(ii)分别地在seq id no:21中示出的氨基酸序列和在seq id no:22中示出的氨基酸序列；(iii)分别地在seq id no:27中示出的氨基酸序列和在seq id no:28中示出的氨基酸序列；(iv)分别地在seq id no:30中示出的氨基酸序列和在seq id no:12中示出的氨基酸序列；(v)分别地在seq id no:35中示出的氨基酸序列和在seq id no:22中示出的氨基酸序列；(vi)分别地在seq id no:44中示出的氨基酸序列和在seq id no:45中示出的氨基酸序列；(vii)分别地在seq id no:49中示出的氨基酸序列和在seq id no:50中示出的氨基酸序列；(viii)分别地在seq id no:57中示出的氨基酸序列和在seq id no:58中示出的氨基酸序列；(ix)分别地在seq id no:61中示出的氨基酸序列和在seq id no:58中
示出的氨基酸序列；或(x)分别地在seq id no:64中示出的氨基酸序列和在seq id no:58中示出的氨基酸序列。
6.另一方面，本公开的特征在于一种抗体，其与αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白两者特异性结合但不与其他整联蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体不结合其他含αv、β1或β6的整联蛋白异二聚体。在一些情况下，所述抗体不与除αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白以外的rgd结合整联蛋白(例如αvβ3、αvβ5、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3)结合。在一些实施方案中，所述抗体与结合αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白两者且包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的参考抗体竞争和/或结合相同的表位，其中所述参考抗体的vh和vl包含：(i)分别地在seq id no:44中示出的氨基酸序列和在seq id no:68中示出的氨基酸序列；(ii)分别地在seq id no:44中示出的氨基酸序列和在seq id no:70中示出的氨基酸序列；(iii)分别地在seq id no:49中示出的氨基酸序列和在seq id no:72中示出的氨基酸序列；或(iv)分别地在seq id no:76中示出的氨基酸序列和在seq id no:77中示出的氨基酸序列。
7.另一方面，本公开的特征在于一种抗体，其与αvβ1以及一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的整联蛋白特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体结合αvβ1和αvβ8。在一些实施方案中，所述抗体结合αvβ1和αvβ3。在一些实施方案中，所述抗体结合αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6和αvβ8。在一些实施方案中，所述抗体不与除rgd结合整联蛋白中的一种或多种以外的整联蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体与包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的参考抗体竞争和/或结合相同的表位，其中所述参考抗体的vh和vl包含：(i)分别地在seq id no:82中示出的氨基酸序列和在seq id no:83中示出的氨基酸序列；(ii)分别地在seq id no:92中示出的氨基酸序列和在seq id no:93中示出的氨基酸序列；(iii)分别地在seq id no:92中示出的氨基酸序列和在seq id no:95中示出的氨基酸序列；(iv)分别地在seq id no:100中示出的氨基酸序列和在seq id no:28中示出的氨基酸序列；(v)分别地在seq id no:21中示出的氨基酸序列和在seq id no:104中示出的氨基酸序列；或(vi)分别地在seq id no:49中示出的氨基酸序列和在seq id no:107中示出的氨基酸序列。
8.另一方面，本公开的特征在于一种抗体，其与人αvβ1特异性结合且具有以下特性中的一种或多种(例如，1、2、3、4或5种)：(i)与人αvβ1以kd≤20nm的高亲和力(二价亲和力)结合；(ii)阻断αvβ1与其配体(例如，lap和纤连蛋白)的相互作用；(iii)对于与人αvβ1的结合是阳离子依赖性的(例如，钙和镁；或锰)或阳离子非依赖性的；(iv)与成纤维细胞上的αvβ1结合；和(v)抑制成纤维细胞tgfβ响应(例如，如通过lpa诱导的pai-1测定所评估)。在一些实施方案中，所述抗体是内化的。在一些实施方案中，所述抗体与食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ1结合。在一些实施方案中，所述抗体包含示例性抗体1-10的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3。在一些实施方案中，所述抗体包含示例性抗体1-10的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3。在一些实施方案中，所述抗体与包含示例性抗体1-10的vh和vl的参考抗αvβ1整联蛋白抗体竞争和/或结合相同的表位。
9.另一方面，本公开的特征在于一种抗体，其与人αvβ1和人αvβ6两者特异性结合且具有以下特性中的一种或多种(例如，1、2、3、4或5种)：(i)与人αvβ1以kd≤20nm的高亲和力(二价亲和力)结合且与人αvβ6以100nm的亲和力(二价亲和力)结合；(ii)阻断αvβ1和/或αvβ6与其配体(例如，lap和纤连蛋白)的相互作用；(iii)对于与人αvβ1和/或αvβ6的结合是阳
离子依赖性的(例如，钙和镁；或锰)；(iv)与成纤维细胞上的αvβ1结合；和(v)抑制成纤维细胞tgfβ响应(例如，如通过lpa诱导的pai-1测定所评估)。在一些实施方案中，所述抗体包含示例性抗体11-14的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3。在一些实施方案中，所述抗体包含示例性抗体11-14的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3。在一些实施方案中，所述抗体与结合αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白两者且包含示例性抗体11-14的vh和vl的参考抗体竞争和/或结合相同的表位。
10.另一方面，本公开的特征在于一种抗体，其与人αvβ1和其他rgd结合整联蛋白中的一种或多种特异性结合且具有以下特性中的一种或多种(例如，1、2、3、4或5种)：(i)其与人αvβ1以kd≤20nm的高亲和力(二价亲和力)结合且与其他rgd结合整联蛋白以100nm的亲和力(二价亲和力)结合；(ii)阻断αvβ1和/或rgd家族整联蛋白与其配体(例如，lap和纤连蛋白)的相互作用；(iii)对于与人αvβ1和/或rgd结合整联蛋白的结合是阳离子依赖性的(例如，钙和镁；或锰)或阳离子非依赖性的；(iv)与成纤维细胞上的αvβ1和/或rgd结合整联蛋白结合；和(v)抑制成纤维细胞tgfβ响应(例如，如通过lpa诱导的pai-1测定所评估)。在一些实施方案中，所述抗体是内化的。在一些实施方案中，所述抗体与食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ1结合。在一些实施方案中，所述抗体包含示例性抗体15-20的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3。
11.在一些实施方案中，所述抗体包含示例性抗体15-20的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3。在一些实施方案中，所述抗体与包含示例性抗体15-20的vh和vl的参考抗体竞争和/或结合相同的表位。
12.另一方面，本公开的特征在于一种抗体，其与人αvβ1和/或其他rgd结合整联蛋白中的一种或多种特异性结合且具有以下特性中的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6或7种)：(i)其与人αvβ1以kd≤20nm的高亲和力(二价亲和力)结合且(如果其还结合其他rgd家族整联蛋白)与其他rgd结合整联蛋白以100nm的亲和力(二价亲和力)结合；(ii)阻断αvβ1和/或rgd家族整联蛋白与其配体(例如，lap和纤连蛋白)的相互作用；(iii)对于与人αvβ1和/或rgd结合整联蛋白的结合是阳离子依赖性的(例如，钙和镁；或锰)或阳离子非依赖性的；(iv)与αvβ1和/或成纤维细胞上的rgd结合整联蛋白结合；(v)抑制成纤维细胞tgfβ响应(例如，如通过lpa诱导的pai-1测定所评估)；(vi)是内化的；(vii)与食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ1结合。
13.另一方面，本公开的特征在于一种抗体，其与αvβ1整联蛋白结合但不与其他整联蛋白(例如，其他rgd家族整联蛋白)结合。所述抗体含有包含vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3的vh以及包含vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3的vl，其中vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3包含(i)分别地seq id no:4、6、7、8、9和10；(ii)分别地seq id no:14、16、17、18、19和20；(iii)分别地seq id no:4、6、23、24、25和26；(iv)分别地seq id no:29、6、7、8、9和10；(v)分别地seq id no:32、34、17、18、19和20；(vi)分别地seq id no:37、39、40、41、42和43；(vii)分别地seq id no:37、39、46、18、47和48；(viii)分别地seq id no:52、54、55、18、19和56；(ix)分别地seq id no:60、39、55、18、19和56；或(x)分别地seq id no:63、54、55、18、19和56。
14.在上述方面的一些实施方案中，抗αvβ1抗体包含(i)与seq id no:11中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:12中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(ii)与seq id no:21中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:22中示出的氨基酸序列示出75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(iii)与seq id no:27中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:28中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(iv)与seq id no:30中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:12中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(v)与seq id no:35中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:22中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(vi)与seq id no:44中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:45中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(vii)与seq id no:49中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:50中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(viii)与seq id no:57中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:58中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(ix)与seq id no:61中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:58中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(x)与seq id no:64中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:58中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同或相同的vl。
15.在上述方面的一些实施方案中，抗αvβ1抗体包含(i)在seq id no:11中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:12中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(ii)在seq id no:21中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:22中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(iii)在seq id no:27中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:28中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、
11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(iv)在seq id no:30中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:12中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(v)在seq id no:35中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:22中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(vi)在seq id no:44中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:45中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(vii)在seq id no:49中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:50中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(viii)在seq id no:57中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:58中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(ix)在seq id no:61中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:58中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(x)在seq id no:64中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:58中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl。
16.另一方面，本公开的特征在于一种抗体，其与αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白两者结合但不与其他整联蛋白(例如，其他rgd家族整联蛋白)结合，其中所述抗体含有包含vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3的vh以及含vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3的vl，其中vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3包含：(i)分别地seq id no:37、39、40、65、66和67；(ii)分别地seq id no:37、39、40、65、66和69；(iii)分别地seq id no:37、39、46、18、47和71；或(iv)分别地seq id no:37、39、73、74、42和75。
17.在上述方面的一些实施方案中，与αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白两者结合但不与其他整联蛋白结合的抗体包含(i)与seq id no:44中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:68中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(ii)与seq id no:44中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:70中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(iii)与seq id no:49中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％相同的vh和与seq id no:72中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(iv)与seq id no:76中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:77中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl。
18.在上述方面的一些实施方案中，与αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白两者结合但不与其他整联蛋白结合的抗体包含(i)在seq id no:44中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:68中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(ii)在seq id no:44中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:70中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(iii)在seq id no:49中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:72中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(iv)在seq id no:76中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:77中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl。
19.另一方面，本公开的特征在于一种抗体，其与αvβ1以及选自由αvβ6、αvβ3、αvβ5、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的一种或多种整联蛋白结合，其中所述抗体含有包含vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3的vh以及包含vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3的vl，其中vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3包含：(i)分别地seq id no:4、6、78、79、80和81；(ii)分别地seq id no:85、87、88、89、90和91；(iii)分别地seq id no:85、87、88、89、90和94；(iv)分别地seq id no:97、99、23、24、25和26；(v)分别地seq id no:14、16、17、101、102和103；或(vi)分别地seq id no:37、39、46、105、80和106。
20.在上述方面的一些实施方案中，与αvβ1以及选自由αvβ6、αvβ3、αvβ5、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的一种或多种整联蛋白结合的抗体包含(i)与seq id no:82中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:83中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(ii)与seq id no:92中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:93中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(iii)与seq id no:92中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:95中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(iv)与seq id no:100中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:28中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(v)与seq id no:21中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:104中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl；(vi)与seq id no:49中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vh和与seq id no:107中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的vl。
21.在上述方面的一些实施方案中，与αvβ1以及选自由αvβ6、αvβ3、αvβ5、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的一种或多种整联蛋白结合的抗体包含(i)在seq id no:82中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:83中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(ii)在seq id no:92中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:93中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(iii)在seq id no:92中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:95中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(iv)在seq id no:100中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:28中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(v)在seq id no:21中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:104中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl；(vi)在seq id no:49中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vh，和在seq id no:107中示出的氨基酸序列中包含20个或更少(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)取代、插入或缺失的vl。
22.在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含人igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。在上述方面的一些实施方案中，所述抗体经修饰以降低或消除效应子功能。在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含非糖基化人恒定区。在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含higg1agly fc、higg2 saa fc、higg4(s228p)fc或higg4(s228p)/g1 agly fc。在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含人κ或人λ轻链恒定区。在上述方面的一些实施方案中，所述抗体是完整抗体、单结构域抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、fv、scfv、scfv-fc、scfv-ch3、sc(fv)2、sc(fv)2-fc、sc(fv)2-ch3、双抗体、纳米抗体、fab和f(ab’)2。在上述方面的一些实施方案中，所述抗体还包含半衰期延长部分。在上述方面的一
些实施方案中，所述抗体还包含可检测标记(例如，荧光标记)。在上述方面的一些实施方案中，所述抗体还包含治疗剂。在上述方面的一些实施方案中，所述抗体还包含放疗剂。在上述方面的一些实施方案中，所述抗体还包含化疗剂
23.另一方面，本文提供了一种包含上述方面中任一项的抗体的药物组合物。另一方面，本文提供了一种或多种编码上述方面中任一项的抗体的多核苷酸。所述多核苷酸可以编码与其rgd家族整联蛋白(例如，αvβ1、αvβ6、αvβ1 其他rgd家族整联蛋白)结合的抗体，并且包含编码示例性抗体1至20中的任一个的三个vh cdr或vh的核酸。在其他情况下，所述多核苷酸可以编码与其rgd家族整联蛋白(例如，αvβ1、αvβ6、αvβ1 其他rgd家族整联蛋白)结合的抗体，并且包含编码示例性抗体1至20中的任一个的三个vl cdr或vl的核酸。在一些情况下，所述多核苷酸可以编码与其rgd家族整联蛋白(例如，αvβ1、αvβ6、αvβ1 其他rgd家族整联蛋白)结合的抗体，并且包含编码示例性抗体1至20中的任一个的三个vh cdr和三个vl cdr的核酸。在又其他情况下，所述多核苷酸可以编码与其rgd家族整联蛋白(例如，αvβ1、αvβ6、αvβ1 其他rgd家族整联蛋白)结合的抗体，并且包含编码示例性抗体1至20中的任一个的vh和vl的核酸。另一方面，本文提供了一种或多种包含上述方面的一种或多种多核苷酸的载体(例如，一种或多种表达载体)。另一方面，本文提供了一种包含上述方面的一种或多种多核苷酸或上述方面的一种或多种载体(例如，一种或多种表达载体)的宿主细胞。
24.另一方面，本文提供了一种制备抗整联蛋白抗体的方法，所述方法包括：(a)在允许所述抗体的表达的条件下培养所述宿主细胞；和(b)分离所述抗体。在上述方面的一些实施方案中，所述方法还包括将所述抗体配制为适合施用于人的无菌制剂。
25.另一方面，本文提供了一种治疗或预防有需要的人受试者的纤维化的方法，所述方法包括向所述人受试者施用治疗有效量的本文所述的抗整联蛋白抗体(例如示例性抗体1-20)。在上述方面的一些实施方案中，所述纤维化选自由肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、心肌纤维化、关节纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、肾原性系统性纤维化、佩罗尼氏病(peyronie’s disease)、进行性块状纤维化、小气道纤维化、与慢性阻塞性肺病相关联的纤维化和腹膜后纤维化组成的组。在一些实施方案中，所述纤维化是肝纤维化。在一些实施方案中，所述纤维化是特发性肺纤维化。在一些实施方案中，所述纤维化是硬皮病/系统性硬化症。
26.另一方面，本文提供了一种治疗或预防有需要的人受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述人受试者施用治疗有效量的本文所述的抗整联蛋白抗体(例如示例性抗体1-20)。在上述方面的一些实施方案中，所述癌症是上皮来源的，并且任选地其中所述上皮来源的癌症是鳞状细胞癌、腺癌、移行细胞癌或基底细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症选自由胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、脑和中枢神经系统肿瘤以及成胶质细胞瘤组成的组。
27.另一方面，本文提供了一种抑制有需要的人受试者的血小板聚集的方法，所述方法包括向所述人受试者施用治疗有效量的本文所述的抗整联蛋白抗体(例如示例性抗体1-20)。在上述方面的一些实施方案中，所述抑制是用于治疗急性冠状动脉综合征。
28.另一方面，本文提供了一种治疗或预防有需要的人受试者的眼科疾病或病症的方法，所述方法包括向所述人受试者施用治疗有效量的本文所述的抗整联蛋白抗体(例如示例性抗体1-20)。在上述方面的一些实施方案中，所述眼科疾病或病症选自由年龄相关性黄
斑变性(amd)、湿性amd、黄斑水肿和糖尿病性视网膜病组成的组。
29.另一方面，本文提供了一种治疗或预防有需要的人受试者的急性肾损伤、急性肺损伤或急性肝损伤的方法，所述方法包括向所述人受试者施用治疗有效量的本文所述的抗整联蛋白抗体(例如示例性抗体1-20)。
30.另一方面，本文提供了一种治疗或预防有需要的人受试者的非酒精性脂肪肝病(nafld)的方法，所述方法包括向所述人受试者施用治疗有效量的本文所述的抗整联蛋白抗体的抗体(例如示例性抗体1-20中的任一种或多种)。在一些实施方案中，所述nafld为非酒精性脂肪性肝炎(nash)。
31.另一方面，本文提供了一种鉴定与αvβ1整联蛋白特异性结合但不与来自抗体群的其他整联蛋白结合的抗体的方法，所述方法包括使用指导抗体进行的指导选择来选择所述抗体，所述指导抗体是本文所述的任何抗整联蛋白抗体(例如，示例性抗体1-20)。在一些实施方案中，所述指导抗体包含示例性抗体5、11和12中的任一个的六个cdr。在一些实施方案中，所述指导抗体包含示例性抗体5、11和12中的任一个的vh和/或vl。在一些实施方案中，所述抗体群包含在原核细胞的表面上表达的抗体文库。在一些实施方案中，所述抗体群包含在真核细胞的表面上表达的抗体文库。在一些实施方案中，所述抗体群包含在酵母细胞的表面上表达的抗体文库。在一些实施方案中，所述方法包括选择与包含αv和β1的胞外结构域的一种或多种多肽结合的抗体的步骤，任选地其中所述步骤在不存在阳离子、存在钙和镁或存在锰的情况下进行，并且还任选地，其中所述选择通过macs和/或facs进行。在一些实施方案中，所述方法还包括消耗与一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和α4β1组成的组的整联蛋白结合的抗体。在一些实施方案中，所述方法还包括通过选择与αvβ1整联蛋白结合的抗体来富集与αvβ1整联蛋白特异性结合的抗体。所述选择可以进行一轮或多轮(例如，一、二、三、四或五轮)。在一些实施方案中，所述方法还包括使所选的抗体亲和力成熟。
32.另一方面，本文提供了一种从抗体群中鉴定抗体的方法，其中所述抗体与αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白两者特异性结合，所述方法包括使用指导抗体进行的指导选择来选择所述抗体，所述指导抗体是本文所述的抗整联蛋白抗体(例如，示例性抗体1-20中的任一个或多个)。在一些实施方案中，所述指导抗体包含示例性抗体5、11和12中的任一个的六个cdr。在一些实施方案中，所述指导抗体包含示例性抗体5、11和12中的任一个的vh和/或vl。在一些实施方案中，所述抗体群包含在原核细胞的表面上表达的抗体文库。在一些实施方案中，所述抗体群包含在真核细胞的表面上表达的抗体文库。在一些实施方案中，所述抗体群包含在酵母细胞的表面上表达的抗体文库。在一些实施方案中，所述方法包括选择与包含αv和β1的胞外结构域和/或αv和β6的胞外结构域的一种或多种多肽结合的抗体的步骤，任选地其中所述步骤在不存在阳离子、存在钙和镁或存在锰的情况下进行，并且还任选地，其中所述选择通过macs和/或facs进行。在一些实施方案中，所述方法还包括消耗与一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ8、α5β1、α8β1和α4β1组成的组的整联蛋白结合的抗体。在一些实施方案中，所述方法还包括通过选择与αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白结合的抗体来富集与αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白特异性结合的抗体。所述选择可以进行一轮或多轮(例如，一、二、三、四或五轮)。在一些实施方案中，所述方法还包括使所选的抗体亲和力成熟。
33.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的
translational medicine,7(288):288ra79(2015)；wilkinson等,eur.j pharmacol.,842(2019)239-247)。事实上，在本领域中还没有描述过此类抗αvβ1整联蛋白特异性抗体。
48.αvβ6整联蛋白是rgd结合整联蛋白的成员。虽然αv亚基可以与多种β亚基(βl、β3、β5、β6和β8)形成异二聚体，但β6亚基可以仅作为与αv亚基的异二聚体表达。β6亚基的胞外结构域和胞质结构域介导不同的细胞活性：已经表明胞外结构域和跨膜结构域介导tgf-β激活和粘附；而β6亚基的胞质结构域含有独特的11氨基酸序列，所述序列在介导αvβ6调节的细胞增殖、mmp产生、迁移方面是很重要的，并且促进存活。
49.整联蛋白αv亚基也被称为itgav、cd51、msk8、vnra、vtnr、玻连蛋白受体或整联蛋白亚基αv。人整联蛋白αv蛋白的氨基酸序列(uniprot登录号p06756-1)如下所示。
[0050][0051]
整联蛋白β1亚基也被称为itgb1、cd29、fnrb、gpiia、mdf2、msk12、vla-beta、vlab或整联蛋白亚基β1。人整联蛋白β1蛋白的氨基酸序列(uniprot登录号p05556-1)如下所示。
[0052][0053]
整联蛋白β6亚基也被称为itgb6、al1h或整联蛋白亚基β6。人整联蛋白β6蛋白的氨基酸序列(登录号np_000879.2)如下所示。
[0054][0055]
人整联蛋白β3蛋白的示例性氨基酸序列可以在登录号np_000203.2中找到。人整联蛋白β5蛋白的示例性氨基酸序列可以在登录号np_002204.2中找到。人整联蛋白β8蛋白的示例性氨基酸序列可以在登录号np_002205.1中找到。人整联蛋白α5蛋白的示例性氨基酸序列可以在登录号np_002196.4中找到。人整联蛋白α8蛋白的示例性氨基酸序列可以在登录号np_001278423.1中找到。人整联蛋白αiib蛋白的示例性氨基酸序列可以在登录号np_000410.2中找到。
[0056]
整联蛋白亚基αv的胞外区对应于seq id no:1的氨基酸31-993。整联蛋白亚基β1的胞外区对应于seq id no:2的氨基酸21-728。
[0057]
抗整联蛋白抗体
[0058]
本公开的所有抗整联蛋白抗体都与αvβ1结合。在一些情况下，所述抗体对αvβ1具有特异性，并且不结合其他整联蛋白。在一些情况下，所述抗体也结合αvβ6，但不结合其他整联蛋白。在又其他情况下，所述抗体与一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的rgd结合整联蛋白结合。
[0059]
在一些情况下，本公开的抗体阻断与抗体结合的整联蛋白与其配体的相互作用。例如，抗整联蛋白抗体阻断αvβ1与其配体(例如，lap和纤连蛋白)的相互作用。在某些情况下，抗整联蛋白抗体阻断αvβ6与其配体(例如，lap和纤连蛋白)的相互作用。在一些情况下，本公开的抗体对于结合其靶标是阳离子依赖性的(例如，钙和镁；或锰)。此类抗体的实例是示例性抗体1、2、4-14、16、17、19和20。在一些情况下，本公开的抗体对于结合其靶标不是阳离子依赖性的。此类抗体的实例是示例性抗体3、15和18。
[0060]
在一些情况下，本公开的抗体结合其在成纤维细胞上的靶整联蛋白(例如，αvβ1、αvβ6)。成纤维细胞是负责纤维化疾病中细胞外基质沉积的细胞类型。
[0061]
在一些情况下，本公开的抗体抑制成纤维细胞tgfβ响应。
[0062]
在一些情况下，本公开的抗体中的一种或多种是内化的。此类抗体的实例是示例性抗体4、5、17和19。内化的抗体可以用于递送需要递送至细胞中的剂(例如小分子或胞内抗体)。
[0063]
在一些情况下，本公开的抗体中的一种或多种与食蟹猴、小鼠或大鼠αvβ1结合。此类抗体的实例是示例性抗体4、5、17和19。
[0064]
在某些情况下，本公开的特征在于一种抗体，其与人αvβ1特异性结合且具有以下特性中的一种或多种(例如，1、2、3、4或5种)：(i)与人αvβ1以kd≤20nm的高亲和力(二价亲
transl med.,7:288(2015))。本发明人已经成功地生产了此类抗αvβ1整联蛋白特异性抗体。
[0072]
因此，本公开提供了与αvβ1整联蛋白特异性结合且不与其他整联蛋白结合的抗体。在一些情况下，所述抗体不结合其他含αv或β1的整联蛋白异二聚体。在一些情况下，抗αvβ1抗体不结合其他rgd整联蛋白(例如，αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3整联蛋白)。这些抗体都结合人αvβ1整联蛋白。此类抗体包括示例性抗体1-10，其与人αvβ1以kd≤20nm的高亲和力(二价亲和力)结合。
[0073]
示例性抗体1
[0074]
示例性抗体1特异性结合人αvβ1。下面提供了示例性抗体1的互补决定区(cdr)以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0075][0076]
重链可变区(vh)：
[0077][0078]
轻链可变区(vl)：
[0079][0080]
在一些情况下，抗αvβ1抗体含有示例性抗体1的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。这些cdr可以例如通过使用aby sis数据库(www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)来确定。
[0081]
在一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:4中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:6中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:7中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:8中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:9中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:
10中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:3中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:5中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:7中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:8中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:9中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:10中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0082]
在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:11中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:12中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:11中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:12中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:11中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:12中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:11中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:12中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0083]
在某些情况下，与αvβ1结合的本公开的抗体是与包含具有seq id no:11中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:12中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0084]
示例性抗体2
[0085]
示例性抗体2特异性结合人αvβ1。下面提供了示例性抗体2的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0086]
[0087][0088]
在一些情况下，抗αvβ1抗体含有示例性抗体2的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。这些cdr可以例如通过使用abysis数据库来确定。
[0089]
在一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:14中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:16中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:17中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:18中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:19中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:20中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:13中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:15中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:17中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:18中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:19中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:20中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0090]
在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:21中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:22中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:21中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:22中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:21中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:22中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:21中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:22中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0091]
在某些情况下，与αvβ1结合的本公开的抗体是与包含具有seq id no:21中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:22中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0092]
示例性抗体3
[0093]
示例性抗体3特异性结合人αvβ1。所述抗体示出与其靶标的阳离子非依赖性结合。下面提供了示例性抗体3的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0094][0095][0096]
在一些情况下，抗αvβ1抗体含有示例性抗体3的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。这些cdr可以例如通过使用abysis数据库来确定。
[0097]
在一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:4中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:6中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:23中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:24中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:25中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:26中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:3中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:5中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:23中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:24中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:25中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:26中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0098]
在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:27中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:28中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:27中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:28中示出的
氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:27中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:28中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:27中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:28中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0099]
在某些情况下，与αvβ1结合的本公开的抗体是与包含具有seq id no:27中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:28中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0100]
示例性抗体4
[0101]
示例性抗体4特异性结合人αvβ1，并且也与食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ1结合。示例性抗体4是内化的。下面提供了示例性抗体4的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0102][0103][0104]
在一些情况下，抗αvβ1抗体含有示例性抗体4的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。这些cdr可以例如通过使用abysis数据库来确定。
[0105]
在一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:29中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:6中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:7中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:8中示出的
氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:9中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:10中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:3中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:5中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:7中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:8中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:9中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:10中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0106]
在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:30中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:12中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:30中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:12中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:30中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:12中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:30中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:12中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0107]
在某些情况下，与αvβ1结合的本公开的抗体是与包含具有seq id no:30中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:12中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0108]
示例性抗体5
[0109]
示例性抗体5特异性结合人αvβ1，并且也与食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ1结合。示例性抗体5是内化的。下面提供了示例性抗体5的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0110][0111]
[0112][0113]
在一些情况下，抗αvβ1抗体含有示例性抗体5的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。这些cdr可以例如通过使用abysis数据库来确定。
[0114]
在一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:32中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:34中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:17中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:18中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:19中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:20中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:31中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:33中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:17中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:18中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:19中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:20中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0115]
在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:35中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:22中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:35中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:22中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:35中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:22中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:35中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:22中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0116]
在某些情况下，与αvβ1结合的本公开的抗体是与包含具有seq id no:35中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:22中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0117]
示例性抗体6
[0118]
示例性抗体6特异性结合人αvβ1。下面提供了示例性抗体6的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0119][0120][0121]
在一些情况下，抗αvβ1抗体含有示例性抗体6的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。这些cdr可以例如通过使用abysis数据库来确定。
[0122]
在一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:37中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:39中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:40中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:41中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:42中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:43中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:36中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:38中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:40中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:41中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:42中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:43中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0123]
在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:44中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:45中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:44中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:45中示出的
氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:44中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:45中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:44中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:45中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0124]
在某些情况下，与αvβ1结合的本公开的抗体是与包含具有seq id no:44中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:45中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0125]
示例性抗体7
[0126]
示例性抗体7特异性结合人αvβ1。下面提供了示例性抗体7的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0127][0128][0129]
在一些情况下，抗αvβ1抗体含有示例性抗体7的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。这些cdr可以例如通过使用abysis数据库来确定。
[0130]
在一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:37中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:39中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:46中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:18中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:47中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:48中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所
述vh含有包含seq id no:36中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:38中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:46中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:18中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:47中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:48中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0131]
在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:49中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:50中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:49中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:50中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:49中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:50中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:49中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:50中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0132]
在某些情况下，与αvβ1结合的本公开的抗体是与包含具有seq id no:49中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:50中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0133]
示例性抗体8
[0134]
示例性抗体8特异性结合人αvβ1。下面提供了示例性抗体8的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0135][0136]
[0137]
在一些情况下，抗αvβ1抗体含有示例性抗体8的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。这些cdr可以例如通过使用abysis数据库来确定。
[0138]
在一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:52中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:54中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:55中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:18中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:19中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:56中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:51中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:53中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:55中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:18中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:19中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:56中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0139]
在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:57中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:58中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:57中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:58中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:57中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:58中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:57中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:58中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0140]
在某些情况下，与αvβ1结合的本公开的抗体是与包含具有seq id no:57中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:58中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0141]
示例性抗体9
[0142]
示例性抗体9特异性结合人αvβ1。下面提供了示例性抗体9的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0143]
[0144][0145]
在一些情况下，抗αvβ1抗体含有示例性抗体9的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。这些cdr可以例如通过使用abysis数据库来确定。
[0146]
在一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:60中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:39中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:55中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:18中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:19中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:56中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:59中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:38中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:55中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:18中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:19中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:56中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0147]
在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:61中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:58中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:61中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:58中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:61中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:58中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:61中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:58中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0148]
在某些情况下，与αvβ1结合的本公开的抗体是与包含具有seq id no:61中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:58中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0149]
示例性抗体10
[0150]
示例性抗体10特异性结合人αvβ1。下面提供了示例性抗体10的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0151][0152][0153][0154]
在一些情况下，抗αvβ1抗体含有示例性抗体10的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。这些cdr可以例如通过使用abysis数据库来确定。
[0155]
在一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:63中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:54中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:55中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:18中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:19中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:56中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，本公开的抗αvβ1抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:62中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:53中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:55中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:18中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:19中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:56中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0156]
在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:64中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:58中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，抗αvβ1抗体
包含与seq id no:64中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:58中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:64中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:58中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，抗αvβ1抗体包含与seq id no:64中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:58中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0157]
在某些情况下，与αvβ1结合的本公开的抗体是与包含具有seq id no:64中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:58中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0158]
b.第ii组(与αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白两者结合但不与其他整联蛋白结合的抗体)
[0159]
本公开还提供了与αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白两者结合的抗体。在一些情况下，所述抗体不与其他整联蛋白结合。在一些情况下，所述抗体不与除αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白以外的rgd结合整联蛋白(例如αvβ3、αvβ5、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3)结合。第ii组的抗体都与人αvβ1整联蛋白和人αvβ6整联蛋白结合。此类抗体包含示例性抗体11-14的序列，其与人αvβ1以kd≤20nm的高亲和力(二价亲和力)结合，并与人αvβ6以100nm的亲和力(二价亲和力)结合。
[0160]
示例性抗体11
[0161]
示例性抗体11与人αvβ1和αvβ6特异性结合，但不与其他整联蛋白(例如，其他rgd家族的整联蛋白)结合。下面提供了示例性抗体11的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0162]
[0163][0164]
在一些情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体含有示例性抗体11的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。这些cdr可以例如通过使用abysis数据库来确定。
[0165]
在一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:37中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:39中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:40中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:65中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:66中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:67中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:36中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:38中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:40中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:65中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:66中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:67中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0166]
在一些情况下，与人αvβ1和人αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:44中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:68中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:44中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:68中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:44中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:68中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:44中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:68中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0167]
在某些情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体是与包含具有seq id no:44中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:68中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0168]
示例性抗体12
[0169]
示例性抗体12与人αvβ1和αvβ6特异性结合，但不与其他整联蛋白(例如，其他rgd家族的整联蛋白)结合。下面提供了示例性抗体12的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区
的氨基酸序列。
[0170][0171][0172]
在一些情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体含有示例性抗体12的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。
[0173]
在一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:37中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:39中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:40中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:65中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:66中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:69中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:36中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:38中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:40中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:65中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:66中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:69中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0174]
在一些情况下，与人αvβ1和人αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:44中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:70中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:44中
示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:70中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:44中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:70中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:44中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:70中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0175]
在某些情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体是与包含具有seq id no:44中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:70中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0176]
示例性抗体13
[0177]
示例性抗体13与人αvβ1和αvβ6特异性结合，但不与其他整联蛋白(例如，其他rgd家族的整联蛋白)结合。下面提供了示例性抗体13的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0178][0179][0180]
在一些情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体含有示例性抗体13的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。
[0181]
在一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:37中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:39中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:46中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:18中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:47中示出的氨基酸序列的vlcdr2和
包含seq id no:71中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:36中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:38中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:46中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:18中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:47中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:71中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0182]
在一些情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:49中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:72中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:49中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:72中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:49中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:72中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:49中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:72中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0183]
在某些情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体是与包含具有seq id no:49中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:72中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0184]
示例性抗体14
[0185]
示例性抗体14与人αvβ1和αvβ6特异性结合，但不与其他整联蛋白(例如，其他rgd家族的整联蛋白)结合。下面提供了示例性抗体14的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0186][0187]
[0188][0189]
在一些情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体含有示例性抗体14的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。
[0190]
在一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:37中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:39中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:73中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:74中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:42中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:75中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:36中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:38中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:73中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:74中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:42中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:75中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0191]
在一些情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:76中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:77中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:76中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:77中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:76中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:77中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体包含与seq id no:76中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:77中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0192]
在某些情况下，与人αvβ1和αvβ6两者结合的抗体是与包含具有seq id no:76中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:77中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0193]
c.第iii组(与αvβ1整联蛋白以及一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3整联蛋白组成的组的整联蛋白结合的抗体)
[0194]
本公开的特征还在于与αvβ1整联蛋白以及一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的整联蛋白结合的抗体。在一些情况下，所述抗体不与除
rgd结合整联蛋白以外的整联蛋白结合。此类抗体包含示例性抗体15-20的序列，其与人αvβ1以kd≤20nm的高亲和力(二价亲和力)结合，并与其他rgd结合整联蛋白以100nm的亲和力(二价亲和力)结合。
[0195]
示例性抗体15
[0196]
示例性抗体15与人αvβ1和至少一种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种)其他rgd家族整联蛋白(例如，αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3)特异性结合。所述抗体示出与其靶标的阳离子非依赖性结合。下面提供了示例性抗体15的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0197][0198][0199]
在一些情况下，第iii组的抗体(即，与αvβ1整联蛋白以及一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的整联蛋白结合的抗体)含有示例性抗体15的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。
[0200]
在一种情况下，第iii组的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:4中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:6中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:78中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:79中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:80中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:81中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，第iii组的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含
seq id no:3中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:5中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:78中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:79中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:80中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:81中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0201]
在一些情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:82中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:83中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:82中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:83中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:82中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:83中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:82中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:83中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0202]
在某些情况下，第iii组的抗体是与包含具有seq id no:82中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:83中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0203]
示例性抗体16
[0204]
示例性抗体16与人αvβ1和至少一种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种)其他rgd家族整联蛋白(例如，αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3)特异性结合。下面提供了示例性抗体16的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0205]
[0206][0207]
在一些情况下，第iii组的抗体(即，与αvβ1整联蛋白以及一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的整联蛋白结合的抗体)含有示例性抗体16的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。
[0208]
在一种情况下，第iii组的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:85中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:87中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:88中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:89中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:90中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:91中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，第iii组的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:84中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:86中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:88中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:89中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:90中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:91中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0209]
在一些情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:92中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:93中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:92中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:93中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:92中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:93中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:92中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:93中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0210]
在某些情况下，第iii组的抗体是与包含具有seq id no:92中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:93中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0211]
示例性抗体17
[0212]
示例性抗体17与人αvβ1和至少一种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种)其他rgd家族整联蛋白(例如，αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3)特异性结合。示例性抗体17也与食蟹猴、小鼠α和大鼠αvβ1结合。示例性抗体17是内化的。在一些情况下，此抗体与αvβ1和αvβ3特异性结合。下面提供了示例性抗体17的cdr以及成熟重链可变区和
no:23中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:24中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:25中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:26中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，第iii组的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:96中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:98中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:23中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:24中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:25中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:26中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0225]
在一些情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:100中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:28中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:100中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:28中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:100中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:28中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:100中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:28中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0226]
在某些情况下，第iii组的抗体是与包含具有seq id no:100中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:28中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0227]
示例性抗体19
[0228]
示例性抗体19与人αvβ1和至少一种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种)其他rgd家族整联蛋白(例如，αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3)特异性结合。示例性抗体19也与食蟹猴、小鼠α和大鼠αvβ1结合。示例性抗体19是内化的。在一些情况下，此抗体与αvβ1和αvβ8特异性结合。下面提供了示例性抗体19的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0229]
[0230][0231]
在一些情况下，第iii组的抗体(即，与αvβ1整联蛋白以及一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的整联蛋白结合的抗体)含有示例性抗体19的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。
[0232]
在一种情况下，第iii组的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:14中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:16中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:17中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:101中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:102中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:103中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，第iii组的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:13中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:15中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:17中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:101中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:102中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:103中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0233]
在一些情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:21中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:104中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:21中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:104中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:21中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:104中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:21中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:104中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0234]
在某些情况下，第iii组的抗体是与包含具有seq id no:21中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:104中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0235]
示例性抗体20
[0236]
示例性抗体20与人αvβ1和至少一种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种)其他rgd家族整联蛋白(例如，αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3)特异性结合。下面提供了示例性抗体20的cdr以及成熟重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[0237][0238][0239]
在一些情况下，第iii组的抗体(即，与αvβ1整联蛋白以及一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的整联蛋白结合的抗体)含有示例性抗体20的包含三个vh cdr的vh和包含三个vl cdr的vl。这六个cdr可以基于本领域已知的任何定义，诸如但不限于kabat、chothia、增强的chothia、contact、imgt或honegger定义。
[0240]
在一种情况下，第iii组的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:37中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:39中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:46中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:105中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:80中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:106中示出的氨基酸序列的vlcdr3。在另一种情况下，第iii组的抗体包含(i)vh，所述vh含有包含seq id no:36中示出的氨基酸序列的vhcdr1、包含seq id no:38中示出的氨基酸序列的vhcdr2和包含seq id no:46中示出的氨基酸序列的vhcdr3；和(ii)vl，所述vl含有包含seq id no:105中示出的氨基酸序列的vlcdr1、包含seq id no:80中示出的氨基酸序列的vlcdr2和包含seq id no:106中示出的氨基酸序列的vlcdr3。
[0241]
在一些情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:49中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh。在一些情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:107中示出的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。在一种情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:49中示出的氨基酸序列至少85％相同的vh和与seq id no:107中示出的氨基酸序列至少85％相同的vl。在另一种情况下，第iii组的抗体包含与
seq id no:49中示出的氨基酸序列至少90％相同的vh和与seq id no:107中示出的氨基酸序列至少90％相同的vl。在又一情况下，第iii组的抗体包含与seq id no:49中示出的氨基酸序列相同的vh和与seq id no:107中示出的氨基酸序列相同的vl。
[0242]
在某些情况下，第iii组的抗体是与包含具有seq id no:49中示出的氨基酸序列的vh和具有seq id no:107中示出的氨基酸序列的vl的参考抗体竞争或结合相同的表位的抗体。
[0243]
抗体片段
[0244]
抗体片段(例如，fab、fab’、f(ab’)2、facb和fv)可以通过完整抗体的蛋白水解消化来制备。例如，抗体片段可以通过用诸如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纤溶酶的酶处理完整抗体来获得。完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生f(ab)2或fab片段；完整抗体的胃蛋白酶消化产生f(ab’)2或fab’；并且完整抗体的纤溶酶消化产生facb片段。
[0245]
或者，抗体片段可以重组产生。例如，可以构建编码目标抗体片段的核酸，将其引入表达载体中，并在合适的宿主细胞中表达。参见，例如，co,m.s.等,j.immunol.,152:2968-2976(1994)；better,m.和horwitz,a.h.,methods in enzymology,178:476-496(1989)；pluckthun,a.和skerra,a.,methods in enzymology,178:476-496(1989)；lamoyi,e.,methods in enzymology,121:652-663(1989)；rousseaux,j.等,methods in enzymology,(1989)121:663-669(1989)；以及bird,r.e.等,tibtech,9:132-137(1991))。抗体片段可以在大肠杆菌(e.coli)中表达并从大肠杆菌中分泌，因此允许容易地产生大量的这些片段。抗体片段可以从抗体噬菌体文库中分离。或者，fab'-sh片段可以直接从大肠杆菌中回收并化学偶联以形成f(ab)2片段(carter等,bio/technology,10:163-167(1992))。根据另一种方法，f(ab')2片段可以直接从重组宿主细胞培养物中分离。包含补救受体结合表位残基的具有增加的体内半衰期的fab和f(ab')2片段描述于美国专利号5,869,046中。
[0246]
微抗体
[0247]
本文所述抗体中的任一种的微抗体包括双抗体、单链(scfv)和单链(fv)2(sc(fv)2)。在一些情况下，所述微抗体与人fc或人fc的ch3结构域融合。例如，可以将结合αvβ1或αvβ1和αvβ6的scfv或sc(fv)2与人igg1 fc或人igg1 ch3结构域融合。这些结构域可以经修饰以降低效应子功能。这些结构域可以经修饰以减少或防止翻译后修饰(例如，糖基化)。
[0248]“双抗体”是通过基因融合构建的二价微抗体(参见，例如，holliger,p.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,90:6444-6448(1993)；ep 404,097；wo 93/11161)。双抗体是由两条多肽链组成的二聚体。双抗体的每条多肽链的vl结构域和vh结构域通过接头结合。构成接头的氨基酸残基的数目可以在2至12个残基之间(例如，3-10个残基或五个或约五个残基)。双抗体中多肽的接头通常太短以致于不允许vl和vh彼此结合。因此，在同一多肽链中编码的vl和vh不能形成单链可变区片段，而是与不同的单链可变区片段形成二聚体。结果，双抗体具有两个抗原结合位点。
[0249]
scfv是通过用接头连接vh和vl而获得的单链多肽抗体(参见例如，huston等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,85:5879-5883(1988)；和pluckthun,“the pharmacology of monoclonal antibodies”,第113卷,resenburg和moore编,springer verlag,new york,第269-315页,(1994))。对要连接的vh和vl的顺序没有特别限制，并且它们可以以任何顺序排
列。排列布置的实例包括：[vh]接头[vl]；或[vl]接头[vh]。scfv中的h链v区和l链v区可以源自本文所述的任何抗整联蛋白抗体(例如，示例性抗体1至20)。
[0250]
sc(fv)2是其中两个vh和两个vl通过接头连接以形成单链的微抗体(hudson等,j.immunol.methods,(1999)231:177-189(1999))。sc(fv)2可以例如通过用接头连接scfv来制备。本发明的sc(fv)2包括优选地其中两个vh和两个vl按照以下顺序排列的抗体：vh、vl、vh和vl([vh]接头[vl]接头[vh]接头[vl])，从单链多肽的n末端开始；然而，两个vh和两个vl的顺序不限于上述排列，并且它们可以以任何顺序排列。排列的实例如下：
[0251]
[vl]接头[vh]接头[vh]接头[vl]
[0252]
[vh]接头[vl]接头[vl]接头[vh]
[0253]
[vh]接头[vh]接头[vl]接头[vl]
[0254]
[vl]接头[vl]接头[vh]接头[vh]
[0255]
[vl]接头[vh]接头[vl]接头[vh]
[0256]
通常，当连接四个抗体可变区时需要三个接头；所用的接头可以是相同的或不同的。对连接微抗体的vh区和vl区的接头没有特别限制。在一些实施方案中，接头是肽接头。任何包含约三至25个(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个)残基的任意单链肽都可以用作接头。此类肽接头的实例包括：ser；gly ser；gly gly ser；ser gly gly；gly gly gly ser(seq id no:108)；ser gly gly gly(seq id no:109)；gly gly gly gly ser(seq id no:110)；ser gly gly gly gly(seq id no:111)；gly gly gly gly gly ser(seq id no:112)；ser gly gly gly gly gly(seq id no:113)；gly gly gly gly gly gly ser(seq id no:114)；ser gly gly gly gly gly gly(seq id no:115)；(gly gly gly gly ser)n(seq id no:110)n，其中n是一或大于一的整数；和(ser gly gly gly gly)n(seq id no:111)n，其中n是一或大于一的整数。
[0257]
在某些实施方案中，接头是合成化合物接头(化学交联剂)。市场上可获得的交联剂的实例包括n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、双琥珀酰亚胺基辛二酸酯(dss)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(bs3)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(dsp)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(dtssp)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(egs)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(磺基-egs)、双琥珀酰亚胺基酒石酸酯(dst)、双磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯(磺基-dst)、双[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰氧基)乙基]砜(bsocoes)和双[2-(磺基琥珀酰亚胺基氧基羰氧基)乙基]砜(磺基-bsocoes)。
[0258]
微抗体中vh或vl的氨基酸序列可以包括修饰，诸如取代、缺失、添加和/或插入。例如，修饰可以在本文所述的抗体(例如，示例性抗体1-20)的框架区中的一个或多个中。在某些实施方案中，修饰涉及在微抗体的vh结构域和/或vl结构域的一个或多个框架区中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个或二十个氨基酸取代。进行此类取代以改善微抗体的结合和/或功能活性。在其他实施方案中，可以缺失或添加本文所述的抗体的fr的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个或二十个氨基酸，条件是当vh和vl缔合时，存在αvβ1结合(和与αvβ6结合，或与αvβ6、αvβ3、αvβ5、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3中的一种或多种结合)和/或功能活性。
[0259]
双特异性或多特异性抗体
[0260]
多特异性抗体是对两种或更多种不同表位具有结合特异性的抗体。双特异性抗体是对一种抗原的两种不同表位或对两种不同抗原具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以与αvβ1蛋白的两种不同表位结合。其他此类抗体可以将αvβ1结合位点与另一种蛋白(例如，αvβ6、αvβ3、αvβ5、αvβ8、α5β1、α8β1、αiibβ3)的结合位点组合。在一些情况下，双特异性抗体包含与αvβ1特异性结合的第一vh和第一vl以及与αvβ6特异性结合的第二vh和第二vl。在其他情况下，双特异性抗体包含与αvβ1特异性结合的第一vh和第一vl以及与αvβ1和αvβ6两者特异性结合的第二vh和第二vl。在一些情况下，双特异性抗体包含与αvβ1特异性结合的第一vh和第一vl以及与αvβ6、αvβ3、αvβ5、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3中的一种或多种特异性结合的第二vh和第二vl。在又其他情况下，双特异性抗体包含与αvβ1和αvβ6两者特异性结合的第一vh和第一vl以及与αvβ6、αvβ3、αvβ5、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3中的一种或多种特异性结合的第二vh和第二vl。双特异性抗体可以制备为全长抗体或其低分子量形式(例如，f(ab')2双特异性抗体、scfv双特异性抗体、sc(fv)2双特异性抗体、双抗体特异性抗体)。
[0261]
全长双特异性抗体的传统生产是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中所述两条链具有不同的特异性(millstein等,nature,305:537-539(1983))。在不同的方法中，将具有所需结合特异性的抗体可变结构域融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。将编码免疫球蛋白重链融合体和(如果需要)免疫球蛋白轻链的dna插入单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主细胞中。这在调整三种多肽片段的比例方面提供了更大的灵活性。然而，当至少两条多肽链以相等比率表达导致高产量时，可以将两条或所有三条多肽链的编码序列插入单一表达载体中。
[0262]
根据美国专利号5,731,168中描述的另一种方法，可以工程改造一对抗体分子之间的界面以使从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含c
h3
结构域的至少一部分。在此方法中，来自第一抗体分子界面的一条或多条小氨基酸侧链被较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与所述大的侧链大小相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了一种用于增加异二聚体的产量使得超过其他不希望的诸如同二聚体的终产物的机制。
[0263]
制备双特异性抗体的方法是本领域众所周知的。参见，例如，s pasevska i,duong mn,klein c,dumontet c(2015)advances in bispecific antibodies engineering:novel concepts for immunothera pies.j blood disord transfus 6:243.doi:10.4172/2155-9864.1000243；以及husain,b.和ellerman,d.biodrugs(2018)32:441.doi.org/10.1007/s40259-018-0299-9。
[0264]
双特异性抗体包括交联的或“异源缀合”的抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶联，另一种抗体与生物素偶联。可以使用任何方便的交联方法制备异源缀合的抗体。
[0265]“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代性机制。所述片段包含通过接头与vl连接的vh，所述接头太短以致于不允许在同一链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的vh结构域和vl结构域被迫与另一片段的互补vl结构域和vh结构域配对，从而形成
两个抗原结合位点。
[0266]
多价抗体
[0267]
多价抗体可以比二价抗体更快地被表达与所述抗体结合的抗原(例如，αvβ1、αvβ1和αvβ6)的细胞内化(和/或分解代谢)。本文所述抗体中的任一种可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如，四价抗体)，其可以通过编码所述抗体的多肽链的核酸的重组表达容易地产生。本文所述的抗体可以包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。示例性二聚化结构域包含fc区或铰链区(或由其组成)。本文所述的抗体可以包含三个至约八个(例如，四个)抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体任选地包含至少一条多肽链(例如，至少两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，所述多肽链可以包含vd1-(x1)
n-vd2-(x2)
n-fc，其中vd1是第一可变结构域，vd2是第二可变结构域，fc是fc区的多肽链，x1和x2代表氨基酸或肽间隔区，并且n是0或1。
[0268]
缀合的抗体
[0269]
本文公开的抗体可以是缀合的抗体，其与各种分子结合，所述分子包括大分子物质，诸如聚合物(例如，聚乙二醇(peg)、用peg修饰的聚乙烯亚胺(pei)(pei-peg)、聚谷氨酸(pga)(n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(hpma)共聚物)、透明质酸、放射性物质(例如
90
y、
131
i)、荧光物质、发光物质、半抗原、酶、金属螯合物和药物。
[0270]
在某些实施方案中，本文所述的抗体用以下部分修饰，所述部分改善所述抗体在循环中，例如在血液、血清或其他组织中的稳定和/或保留，例如至少1.5、2、5、10、15、20、25、30、40或50倍。例如，本文所述的抗体可以与聚合物缔合(例如，缀合)，所述聚合物例如基本上非抗原性的聚合物，诸如聚环氧烷或聚环氧乙烷。合适的聚合物将按重量显著变化。可以使用具有约200至约35,000(或约1,000至约15,000，和2,000至约12,500)道尔顿的数均分子量的聚合物。例如，本文所述的抗体可以与水溶性聚合物缀合，例如亲水性聚乙烯基聚合物，例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。此类聚合物的实例包括聚环氧烷均聚物，诸如聚乙二醇(peg)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物，条件是维持嵌段共聚物的水溶性。另外可用的聚合物包括聚氧化烯，诸如聚氧乙烯、聚氧丙烯，以及聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；和支链或非支链多糖。
[0271]
上述缀合的抗体可以通过对本文所述的抗体或其较低分子量形式进行化学修饰来制备。用于修饰抗体的方法是本领域众所周知的(例如，us 5,057,313和us 5,156,840)。
[0272]
具有降低的效应子功能的抗体
[0273]
抗体和抗体-抗原复合物与免疫系统的细胞的相互作用触发多种响应，本文中称为效应子功能。免疫介导的效应子功能包括两种主要机制：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc)。它们都由免疫球蛋白的恒定区介导。因此，抗体fc结构域是定义与免疫效应子机制的相互作用的部分。
[0274]
igg抗体通过与细胞表面fcγ受体家族的成员结合以及与补体系统的c1q结合来激活免疫系统的效应子途径。效应子蛋白通过成簇抗体的连接触发多种响应，包括炎性细胞因子的释放、抗原产生的调节、胞吞作用和细胞杀伤。这些响应可以激起不希望的副作用，诸如炎症和携带抗原的细胞的消除。因此，本发明还涉及效应子功能降低的抗整联蛋白结合蛋白，包括抗体(例如，抗αvβ1、抗αvβ1和αvβ6抗体)。
[0275]
本发明的抗体的效应子功能可以使用许多已知测定之一来测定。抗体的效应子功
能相对于第二抗体可能是降低的。在一些实施方案中，当目标抗体已经被修饰以降低效应子功能时，第二抗体可以是未修饰的或亲本型式的抗体(诸如具有野生型fc区的示例性抗体1至20(例如，igg1、igg2、igg3))。
[0276]
效应子功能包括adcc，由此抗体结合细胞毒性t细胞、自然杀伤(nk)细胞或巨噬细胞上的fc受体，从而导致细胞死亡；和cdc，其是经由补体级联的激活而诱导的细胞死亡(在daeron,annu.rev.immunol.,15:203-234(1997)；ward和ghetie,therapeutic immunol.,2:77-94(1995)；以及ravetch和kinet,annu.rev.immunol.9:457-492(1991)中综述)。此类效应子功能通常需要fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可以使用本领域已知的标准测定进行评估(参见，例如，wo 05/018572、wo 05/003175和u.s.6,242,195)。
[0277]
通过使用缺乏fc结构域的抗体片段(诸如fab、fab'2或单链fv)，可以避免效应子功能。替代方案是使用igg4亚型抗体，其与fcγri结合但与c1q和fcγrii和riii结合较差。然而，igg4抗体可以形成聚集体，因为与igg1抗体相比，它们在低ph下的稳定性较差。igg4抗体的稳定性可以通过用赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸中的任一种取代位置409处(根据kabat等,sequences of proteins of immunological interest,1991,第5版提出的eu索引)的精氨酸来改善。或者和或另外，igg4抗体的稳定性可以通过用igg1抗体的ch3结构域取代igg4抗体的ch3结构域，或用igg1的ch2结构域和ch3结构域取代igg4的ch2结构域和ch3结构域来改善。因此，本发明的作为igg4同种型的抗整联蛋白抗体可以包含在位置409处的修饰和/或用igg1结构域替换ch2结构域和/或ch3结构域，以便增加抗体的稳定性，同时降低效应子功能。igg2亚型也具有降低的与fc受体的结合，但保留了与fcγriia的h131同种异型和与c1q的显著结合。因此，可能需要fc序列中的另外变化来消除与所有fc受体和与c1q的结合。
[0278]
若干种抗体效应子功能，包括adcc，由fc受体(fcr)介导，所述fc受体结合抗体的fc区。抗体对特定fcr的亲和力，以及因此由抗体介导的效应子活性，可以通过改变抗体的fc和/或恒定区的氨基酸序列和/或翻译后修饰来调节。
[0279]
fcr通过其对免疫球蛋白同种型的特异性来定义；igg抗体的fc受体被称为fcγr，ige抗体的fc受体被称为fcεr，iga抗体的fc受体被称为fcαr，等等。已经鉴定了fcγr的三个亚类：fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)和fcγriii(cd16)。fcγrii和fcγriii两者都具有两种类型：fcγriia(cd32a)和fcγriib(cd32b)；以及fcγriiia(cd16a)和fcγriiib(cd16b)。因为每个fcγr亚类都是由两个或三个基因编码的，并且替代性rna剪接导致多种转录物，所以存在fcγr同工型的广泛多样性。例如，fcγrii(cd32)包括同工型iia、iib1、iib2、iib3和iic。
[0280]
先前已经将人和小鼠抗体上fcγr的结合位点映射到由残基g233-s239(eu索引编号，如在kabat等,sequences of proteins of immunological interest,第5版,public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991)；woof等,molec.immunol.23:319-330(1986)；duncan等,nature 332:563(1988)；canfield和morrison,j.exp.med.173:1483-1491(1991)；chappel等,proc.natl.acad.sci usa 88:9036-9040(1991)中)组成的所谓“下铰链区”。在残基g233-s239中，p238和s239是被提到可能参与结合的那些残基。参与与fcγr的结合的其他残基是：g316-k338(woof等,mol.immunol.,23:319-330(1986))；k274-r301(sarmay等,molec.immunol.21:43-51
(1984))；y407-r416(gergely等,biochem.soc.trans.12:739-743(1984)以及shields等,j biol chem 276:6591-6604(2001)；lazar ga等,proc natl acad sci 103:4005-4010(2006))；n297；t299；e318；l234-s239；n265-e269；n297-t299；和a327-i332。通过检查ig-fcr复合物的晶体结构，参与fcr结合的氨基酸残基的这些和其他延伸或区域对本领域技术人员来说可以是显而易见的(参见，例如，sondermann等,2000nature 406(6793):267-73以及sondermann等,2002biochem soc trans.30(4):481-6)。因此，本发明的抗整联蛋白抗体包含上述残基中的一个或多个的修饰，以根据需要降低效应子功能。
[0281]
改变单克隆抗体效应子功能的另一种方法包括使单克隆抗体表面上参与效应子结合相互作用的氨基酸突变(lund,j.等(1991)j.immunol.147(8):2657-62；shields,r.l.等(2001)j.biol.chem.276(9):6591-604)。
[0282]
为了降低效应子功能，可以使用不同亚型序列区段的组合(例如，igg2和igg4组合)，以产生与单独的任一种亚型相比更大程度降低的与fcγ受体的结合(armour等,eur.j.immunol.,29:2613-1624(1999)；mol.immunol.,40:585-593(2003))。对一些或所有fc受体亚型(并且因此对效应子功能)具有改变和/或降低的亲和力的大量fc变体是本领域已知的。参见，例如，us 2007/0224188；us 2007/0148171；us 2007/0048300；us 2007/0041966；us 2007/0009523；us 2007/0036799；us 2006/0275283；us 2006/0235208；us 2006/0193856；us 2006/0160996；us 2006/0134105；us 2006/0024298；us2005/0244403；us 2005/0233382；us 2005/0215768；us 2005/0118174；us 2005/0054832；us 2004/0228856；us 2004/132101；us2003/158389；还参见us 7,183,387；6,737,056；6,538,124；6,528,624；6,194,551；5,624,821；5,648,260；以及wang,x.,mathieu,m.和brezski,r.j.,protein cell,(2018)9:63.doi.org/10.1007/s13238-017-0473-8。在某些实施方案中，在位置232、234、235、236、237、239、264、265、267、269、270、299、325、328、329和330处(根据eu编号进行编号)的氨基酸被取代以降低效应子功能。降低效应子功能的取代的非限制性实例包括以下一种或多种：k322a；l234a/l235a；g236t；g236r；g236q；h268a；h268q；v309l；a330s；p331s；v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s；e233p/l234v/l235a/g236q a327g/a330s/p331s；和l235e e318a/k320a/k322a。
[0283]
本发明的具有降低的效应子功能的抗体包括相对于亲本或非变异抗体而言对一种或多种fc受体(fcr)具有降低的结合亲和力的抗体。因此，本文所述的具有降低的fcr结合亲和力的抗体包括与亲本或非变异抗体相比，表现出对一种或多种fc受体的结合亲和力降低1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或25倍或更高倍数的抗体。在一些实施方案中，本文所述的具有降低的效应子功能的抗体中的任一种抗体以相对于亲本或非变异抗体而言低约10倍的亲和力与fcr结合。在一些实施方案中，本文所述的具有降低的效应子功能的抗体中的任一种抗体以相对于亲本或非变异抗体而言低约15倍的亲和力或低约20倍的亲和力与fcr结合。fcr受体可以是fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)和fcγriii及其同工型，以及fcεr、fcμr、fcδr和/或fcαr中的一种或多种。在特定的实施方案中，本文所述的具有降低的效应子功能的抗体中的任一种抗体表现出对fcγriia的结合亲和力降低1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、或5倍或更高倍数。
[0284]
在cdc中，抗体-抗原复合物结合补体，导致补体级联的激活和膜攻击复合物的产生。经典补体途径的激活通过补体系统的第一组分(c1q)与结合其同源抗原的抗体(适当亚
类)的结合而起始；因此，补体级联的激活部分地由免疫球蛋白对c1q蛋白的结合亲和力调节。为了激活补体级联，c1q必须与igg1、igg2或igg3中的至少两个分子结合，但仅与一个附接至抗原性靶的igm分子结合(ward和ghetie,therapeutic immunology 2:77-94(1995),第80页)。为了评估补体激活，可以进行cdc测定，例如，如gazzano-santoro等,j.immunol.methods,202:163(1996)中所述。
[0285]
已经提出igg分子的各种残基参与与c1q的结合，包括ch2结构域上的glu318、lys320和lys322残基，位于同一β链附近的转角上的氨基酸残基331，位于下铰链区的lys235和gly237残基，和位于ch2结构域的n末端区的残基231至238(参见例如，xu等,j.immunol.150:152a(摘要)(1993),wo94/29351；tao等,j.exp.med.,178:661-667(1993)；brekke等,eur.j.immunol.,24:2542-47(1994)；burton等,nature,288:338-344(1980)；duncan和winter,nature332:738-40(1988)；idusogie等,j immunol 164:4178-4184(2000；u.s.5,648,260和u.s.5,624,821)。
[0286]
本文所述的具有降低的c1q结合的抗体可以包含在人igg fc区的氨基酸位置270、322、329和331中的一个、两个、三个或四个处的氨基酸取代，其中igg fc区中的残基的编号是如kabat中的eu索引的编号。作为igg1中的一个实例，在人igg1的ch2结构域的cooh末端区中的两个突变—k322a和p329a—不激活cdc途径，并且表明导致c1q结合降低超过100倍(us 6,242,195)。
[0287]
因此，在某些实施方案中，本发明的抗体相对于第二抗体(诸如具有野生型fc区的示例性抗体1至20(例如，igg1、igg2、igg3))表现出与补体蛋白的结合降低的在某些实施方案中，本发明的抗体相对于第二抗体表现出与c1q的结合降低约1.5倍或更多倍、约2倍或更多倍、约3倍或更多倍、约4倍或更多倍、约5倍或更多倍、约6倍或更多倍、约7倍或更多倍、约8倍或更多倍、约9倍或更多倍、约10倍或更多倍、或约15倍或更多倍。
[0288]
因此，在本发明的某些实施方案中，可以修饰、取代或去除这些残基中的一个或多个，或者可以插入一个或多个氨基酸残基，以便降低本文提供的抗体的cdc活性。
[0289]
在某些其他实施方案中，本发明提供了表现出与一种或多种fcr受体的结合降低但维持其结合补体的能力(例如，与天然、非变异或亲本抗体相比，相似的或在一些实施方案中较低的程度)的抗体。因此，本发明的抗体可以结合并激活补体，同时表现出与fcr，例如像fcγriia(例如，血小板上表达的fcγriia)的结合降低。此种与fcγriia(例如像，血小板上表达的fcγriia)的结合降低或不与其结合但可以结合c1q并至少在一定程度上激活补体级联的抗体将降低血栓栓塞事件的风险，同时维持可能期望的效应子功能。在替代性实施方案中，本发明的抗体表现出与一种或多种fcr的结合降低，但维持其结合一种或多种其他fcr的能力。参见，例如us 2007-0009523、2006-0194290、2005-0233382、2004-0228856和2004-0191244，其描述了产生与fcri、fcrii和/或fcriii的结合降低的抗体的各种氨基酸修饰，以及导致与一种fcr的结合增加但与另一种fcr的结合降低的氨基酸取代。
[0290]
因此，涉及本文所述的抗体的恒定区的效应子功能可以通过改变恒定区且特别是fc区的特性来调节。在某些实施方案中，将具有降低的效应子功能的抗体与第二抗体进行比较，所述第二抗体具有效应子功能并且可以是包含介导效应子功能的天然恒定区或fc区的非变异、天然或亲本抗体。在一些情况下，如果抗体是具有降低效应子功能的修饰的fc的抗整联蛋白(例如，抗αvβ1抗体；抗αvβ1和抗αvβ6抗体；抗αvβ1和另一种rgd结合整联蛋白抗
chem.2002；277(30):26733-40；shinkawa等j biol chem.2003 278(5):3466-73；umana等nat biotechnol.1999年2月；17(2):176-80)。例如，igg结合c1q并激活补体级联的能力可以取决于定位在两个ch2结构域之间的碳水化合物部分(其通常锚定在asn297处)的存在、不存在或修饰(ward和ghetie,therapeutic immunology 2:77-94(1995)。
[0298]
可以通过标准技术鉴定含fc的多肽(例如抗体，诸如igg抗体)中的糖基化位点。糖基化位点的鉴定可以是实验性的或基于序列分析或建模数据。已经描述了共有基序，即被各种糖基转移酶识别的氨基酸序列。例如，n连接的糖基化基序的共有基序通常是nxt或nxs，其中x可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。还描述了若干种用于定位潜在糖基化基序的算法。因此，为了鉴定抗体或含fc的片段内的潜在糖基化位点，例如通过使用公众可获得的数据库，诸如由生物序列分析中心(the center for biological sequence analysis)提供的网站(参见用于预测n连接的糖基化位点的netnglyc服务和用于预测o连接的糖基化位点的netoglyc服务)，来检查抗体的序列。
[0299]
体内研究已经证实无糖基抗体的效应子功能降低。例如，无糖基抗cd8抗体不能消耗小鼠中携带cd8的细胞(isaacs,1992j.immunol.148:3062)，并且无糖基抗cd3抗体不诱导小鼠或人中的细胞因子释放综合征(boyd,1995同上；friend,1999transplantation 68:1632)。
[0300]
重要的是，尽管ch2结构域中聚糖的去除似乎对效应子功能具有显著影响，但抗体的其他功能和物理特性保持不变。具体地，已经表明聚糖的去除对血清半衰期和与抗原的结合几乎没有影响或没有影响(nose,1983同上；tao,1989同上；dorai,1991同上；hand,1992同上；hobbs,1992mol.immunol.29:949)。
[0301]
可以修饰或改变本发明的抗体以引发与第二抗体(例如，具有野生型人igg1、igg2、igg3 fc区的示例性抗体1至20)相比降低的效应子功能。用于改变抗体的糖基化位点的方法描述于例如us6,350,861和us 5,714,350、wo 05/18572和wo 05/03175中；这些方法可以用于产生本发明的糖基化改变、减少或无糖基化的抗体。
[0302]
在一些情况下，本公开的抗体包含fc区(例如人igg1 fc)，其具有减少或消除fc区中的糖基化的修饰(例如，t299a或n297q取代(根据eu编号进行编号))。
[0303]
或者，本发明的抗体可以在提供所需糖基化特征的细胞系中产生。例如，可以使用几乎不产生无岩藻糖基化抗体的细胞(诸如cho细胞)进行生产。在另一个实施方案中，可以操纵制造过程和/或培养基含量或条件以调节半乳糖和/或高甘露糖含量。在一个实施方案中，抗体的半乳糖/高甘露糖含量是低的或降低的。
[0304]
亲和力成熟
[0305]
在一个实施方案中，例如通过诱变修饰本文所述的抗整联蛋白抗体，以提供修饰的抗体池。然后评价修饰的抗体以鉴定一种或多种具有改变的功能特性(例如，改善的结合、改善的稳定性、降低的抗原性或增加的体内稳定性)的抗体。在一个实施方式中，使用展示文库技术来选择或筛选修饰的抗体池。然后例如通过使用更高严格性或更具竞争性的结合和洗涤条件从第二文库中鉴定出更高亲和力抗体。也可以使用其他筛选技术。
[0306]
在一些实施方式中，诱变靶向已知或可能在结合界面处的区域。例如，如果鉴定的结合蛋白是抗体，则可以如本文所述将诱变定向到重链或轻链的cdr区。此外，可以将诱变定向到cdr附近或邻近的框架区，例如特别是cdr连接处的10、5或3个氨基酸内的框架区。在
抗体的情况下，诱变也可以限于一个或几个cdr，例如，以进行逐步改善。
[0307]
在一个实施方案中，使用诱变来制备与一个或多个种系序列更相似的抗体。一种示例性种系化方法可以包括：鉴定与分离的抗体的序列相似(例如，在特定数据库中最相似)的一个或多个种系序列。然后可以在分离的抗体中递增地、组合地或以两者进行突变(在氨基酸水平上)。例如，制备包含编码一些或所有可能的种系突变的序列的核酸文库。然后评价突变的抗体，例如，以鉴定出相对于分离的抗体具有一个或多个另外种系残基并且仍然可用(例如，具有功能活性)的抗体。在一个实施方案中，将尽可能多的种系残基引入分离的抗体中。
[0308]
在一个实施方案中，使用诱变以将一个或多个种系残基取代或插入cdr区。例如，种系cdr残基可以来自与被修饰的可变区相似(例如，最相似)的种系序列。诱变后，可以评价抗体的活性(例如，结合或其他功能活性)以确定是否耐受一个或多个种系残基。在框架区中可以进行相似的诱变。
[0309]
选择种系序列可以以不同方式进行。例如，如果种系序列满足选择性或相似性的预定标准，例如相对于供体非人抗体具有至少一定百分比的同一性，例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的同一性，则可以选择所述种系序列。可以使用至少2、3、5或10个种系序列进行选择。在cdr1和cdr2的情况下，鉴定相似的种系序列可以包括选择一个此种序列。在cdr3的情况下，鉴定相似的种系序列可以包括选择一个此种序列，但可以包括使用两个种系序列，其分别贡献氨基末端部分和羧基末端部分。在其他实施方式中，使用多于一个或两个种系序列，例如，以形成共有序列。
[0310]
如下进行两个序列之间的“序列同一性”的计算。出于最佳比较的目的，对序列进行对齐(例如，为了最佳对齐，可以在第一氨基酸或核酸序列和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)。最佳对齐是使用gcg软件包中的gap程序以最佳得分确定的，其中blossum 62评分矩阵的空位罚分为12，空位延伸罚分为4并且移码空位罚分为5。然后比较对应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在此位置处是相同的。这两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数目的函数。
[0311]
在其他实施方案中，抗体可以被修饰以具有改变的糖基化模式(即，从原始或天然糖基化模式改变)。如本文中所用，“改变的”意指一个或多个碳水化合物部分缺失，和/或具有一个或多个添加到原始抗体的糖基化位点。向本发明公开的抗体添加糖基化位点可以通过改变氨基酸序列以包含糖基化位点共有序列来完成；此类技术是本领域众所周知的。增加抗体上碳水化合物部分的数目的另一种手段是通过糖苷与抗体的氨基酸残基的化学或酶促偶联完成。这些方法描述于例如wo 87/05330以及aplin和wriston(1981)crc crit.rev.biochem.,22:259-306中。抗体上存在的任何碳水化合物部分的去除都可以如本领域(hakimuddin等(1987)arch.biochem.biophys.,259:52；edge等(1981)anal.biochem.,118:131；以及thotakura等(1987)meth.enzymol.,138:350)中所述通过化学或酶促完成。参见，例如，美国专利号5,869,046关于通过提供补救受体结合表位来增加体内半衰期的修饰。
[0312]
与cdr不同，可以在结构框架区(fr)中进行更大的改变，而不会不利地影响抗体的结合特性。fr的改变包括但不限于人源化非人源性框架或工程改造某些对于抗原接触或稳定结合位点重要的框架残基，例如改变恒定区的类别或亚类，改变可能改变效应子功能(诸如fc受体结合)的特定氨基酸残基(lund等,j.immun.,147:2657-62(1991)；morgan等,immunology,86:319-24(1995))，或改变恒定区所来源的物种。
[0313]
抗整联蛋白抗体可以呈抗整联蛋白抗体的全长(或完整)抗体形式，或低分子量形式(例如，生物活性抗体片段或微抗体)的形式，例如fab、fab’、f(ab’)2、fv、fd、dab、scfv和sc(fv)2。本公开涵盖的其他抗整联蛋白抗体包括含有单一可变链(诸如vh或vl)的单结构域抗体(sdab)或其生物学活性片段。参见，例如，moller等,j.biol.chem.,285(49):38348-38361(2010)；harmsen等,appl.microbiol.biotechnol.,77(1):13-22(2007)；u.s.2005/0079574和davies等,(1996)protein eng.,9(6):531-7。与完整抗体一样，sdab能够与特定抗原(例如，αvβ1、αvβ1和αvβ6)选择性地结合。sdab的分子量仅为12
–
15kda，比普通抗体小得多，并且甚至比fab片段和单链可变片段还小。
[0314]
在某些实施方案中，抗整联蛋白抗体或其抗原结合片段或其低分子量抗体与αvβ1或αvβ1和αvβ6特异性结合，当施用于具有以下一种或多种的人患者或动物模型时，降低症状的严重性：纤维化(例如，肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化)、急性肺损伤、急性肾损伤。在一个实施方案中，抗整联蛋白抗体或其低分子量抗体抑制特发性肺纤维化模型中的疾病发展(degryse等,am j med sci.,341(6):444-9(2011))。抗整联蛋白抗体或其低分子量抗体的这些特征可以根据本领域已知的方法测量。
[0315]
核酸、载体、宿主细胞
[0316]
本公开的特征还在于编码本文公开的抗体的核酸。本文提供了编码本文所述的抗整联蛋白抗体(例如示例性抗体1-20)的vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的核酸。特征还在于编码本文所述的抗整联蛋白抗体(例如示例性抗体1-20)的vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的核酸。本文提供了编码本文所述的抗整联蛋白抗体(例如示例性抗体1-20)的vh cdr1、vh cdr2、vh cdr3、vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的核酸。还提供了编码本文所述的抗整联蛋白抗体(例如示例性抗体1-20)的重链可变区(vh)的核酸，和/或编码本文所述的抗整联蛋白抗体(例如示例性抗体1-20)的轻链可变区(vl)的核酸。在某些情况下，本文提供了编码分别与人重链恒定区和/或人轻链恒定区连接的本文所述的抗整联蛋白抗体(例如示例性抗体1-20)的vh和/或vl的核酸。本文还提供了编码本文所述的抗整联蛋白抗体(例如示例性抗体1-20)的vh和vl两者的核酸。在一些情况下，本文所述的核酸包括编码人抗体(例如，人igg1、igg2、igg3或igg4)的fc区的核酸。在某些情况下，所述核酸包括编码人抗体的fc区的核酸，所述人抗体的fc区已被修饰以降低或消除效应子功能(例如，人igg1fc区中的n297q或t299a取代(根据eu编号进行编号))。在一些情况下，所述核酸包括编码fc部分的核酸，所述fc部分是higg1 fc、higg2 fc、higg3 fc、higg4 fc、higg1agly fc、higg2 saa fc、higg4(s228p)fc或higg4(s228p)/g1 agly fc。
[0317]
本文还公开了含有上述核酸中的任一种的载体(例如表达载体)。
[0318]
此外，本公开涉及含有上述载体或核酸的宿主细胞(例如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞)。
[0319]
产生抗整联蛋白抗体的方法
[0320]
抗体，诸如上述那些，可以例如通过制备和表达编码所述氨基酸序列的合成基因来制备。用于产生抗整联蛋白抗体中的任一种的变体(例如，包含氨基酸取代)的方法是本领域众所周知的。这些方法包括但不限于通过定点(或寡核苷酸介导的)诱变、pcr诱变和盒式诱变编码抗体或其任何部分(例如，框架区、cdr、恒定区)的制备的dna分子来制备。定点诱变是本领域众所周知的(参见，例如，carter等,nucleic acids res.,13:4431-4443(1985)以及kunkel等,proc.natl.acad.sci.usa,82:488(1987))。pcr诱变也适合制备起始多肽的氨基酸序列变体。参见higuchi,pcr protocols,第177-183页(academic press,1990)；以及vallette等,nuc.acids res.17:723-733(1989)。另一种用于制备序列变体的方法，盒式诱变，是基于由wells等,gene,34:315-323(1985)描述的技术。
[0321]
抗体或其抗原结合片段可以在细菌或真核细胞中产生。一些抗体，例如fab’，可以在细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)中产生。抗体或其抗原结合片段也可以在真核细胞(诸如转化的细胞系)(例如，cho、293e、cos、hela)中产生。另外，抗体(例如，scfv’)可以在酵母细胞中表达，诸如毕赤氏酵母属(pichia)(参见，例如，powers等,j immunol methods.251:123-35(2001))、汉逊酵母属(hanseula)或酿酒酵母属(saccharomyces)。在一个实施方案中，本文所述的抗体在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢(cho)细胞系dg44中产生。在另一个实施方案中，本文所述的抗体在dg44i细胞系中产生。为了产生目标抗体或其抗原结合片段，构建编码抗体的多核苷酸，将其引入表达载体，然后在合适的宿主细胞中表达。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞并回收抗体。
[0322]
如果抗体将在细菌细胞(例如，大肠杆菌)中表达，则表达载体应具有允许载体在细菌细胞中扩增的特征。另外，当将诸如jm109、dh5α、hb101或xl1-blue的大肠杆菌用作宿主时，载体必须具有启动子，例如lacz启动子(ward等,341:544-546(1989)、arab启动子(better等,science,240:1041-1043(1988))或t7启动子，所述启动子可以允许在大肠杆菌中的有效表达。此类载体的实例包括例如m13系列载体、puc系列载体、pbr322、pbluescript、pcr-script、pgex-5x-1(pharmacia)、“qiaexpress系统”(qiagen)、pegfp和pet(使用这种表达载体时，宿主优选是表达t7 rna聚合酶的bl21)。表达载体可以含有用于抗体分泌的信号序列。为了产生到大肠杆菌的胞周质中，可以使用pelb信号序列(lei等,j.bacteriol.,169:4379(1987))作为抗体分泌的信号序列。对于细菌表达，可以使用氯化钙方法或电穿孔方法将表达载体引入细菌细胞。
[0323]
如果抗体将在动物细胞(诸如cho、cos和nih3t3细胞)中表达，则表达载体包括在这些细胞中表达所必需的启动子，例如sv40启动子(mulligan等,nature,277:108(1979))、mmlv-ltr启动子、ef1α启动子(mizushima等,nucleic acids res.,18:5322(1990))或cmv启动子。除了编码免疫球蛋白或其结构域的核酸序列之外，重组表达载体还可以携带另外的序列，诸如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择已经引入了载体的宿主细胞(参见例如，美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常选择标记基因赋予已引入了载体的宿主细胞对药物(诸如g418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。具有选择标记的载体的实例包括pmam、pdr2、pbk-rsv、pbk-cmv、poprsv和pop13。
[0324]
在一个实施方案中，抗体在哺乳动物细胞中产生。用于表达抗体的示例性哺乳动
物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(cho细胞)(包括dhfr-cho细胞，描述于urlaub和chasin(1980)proc.natl.acad.sci.usa 77:4216-4220中，与dhfr选择标记一起使用，例如，如kaufman和sharp(1982)mol.biol.159:601-621中所述)、人胚肾293细胞(例如，293、293e、293t)、cos细胞、nih3t3细胞、淋巴细胞系(例如ns0骨髓瘤细胞和sp2细胞)以及来自转基因动物(例如转基因哺乳动物)的细胞。例如，所述细胞是乳腺上皮细胞。
[0325]
在用于抗体表达的示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染将分别编码本文所述的任何抗体(例如，示例性抗体1-20)的抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-cho细胞。在一个具体的实施方案中，所述dhfr-cho细胞是dg44细胞系的细胞，诸如dg44i(参见，例如，derouaz等,biochem biophys res commun.340(4):1069-77(2006))。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自与增强子/启动子调节元件(例如，来源于sv40、cmv、腺病毒等，诸如cmv增强子/admlp启动子调节元件或sv40增强子/admlp启动子调节元件)可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带dhfr基因，其允许使用氨甲蝶呤选择/扩增选择已经用载体转染的cho细胞。培养选择的转化体宿主细胞以允许抗体重链和轻链的表达，并从培养基中回收抗体。
[0326]
抗体也可以由转基因动物产生。例如，美国专利号5,849,992描述了在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建了包含乳汁特异性启动子和编码目标抗体的核酸以及用于分泌的信号序列的转基因。由此类转基因哺乳动物的雌性产生的乳汁包含在其中分泌的目标抗体。抗体可以从乳汁中纯化，或者对于一些应用，可以直接使用。还提供了包含本文所述核酸中的一种或多种的动物。
[0327]
本公开的抗体可以从宿主细胞的内部或外部(诸如培养基)分离，并且纯化为基本上纯的和同质的抗体。抗体纯化中常用的分离和纯化方法可以用于抗体的分离和纯化，并且不限于任何特定的方法。抗体可以通过适当地选择和组合例如柱色谱法、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳、透析和重结晶来分离和纯化。色谱法包括例如亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤、反相色谱法和吸附色谱法(strategies for protein purification and characterization:a laboratory course manual.daniel r.marshak等编,cold spring harbor laboratory press,1996)。色谱法可以使用液相色谱法(诸如hplc和fplc)进行。用于亲和色谱法的柱包括蛋白a柱和蛋白g柱。使用蛋白a柱的柱的实例包括hyper d、poros和sepharose ff(ge healthcare biosciences)。本公开还包括使用这些纯化方法进行高度纯化的抗体。
[0328]
抗体的表征
[0329]
本文所述的抗体的整联蛋白结合特性可以通过任何标准方法来测量，例如以下方法中的一种或多种：表面等离子体共振(spr)、biacore
tm
分析、酶联免疫吸附测定(elisa)、eia(酶免疫测定)、ria(放射免疫测定)和荧光共振能量转移(fret)。
[0330]
目标蛋白(抗整联蛋白抗体)和靶(例如，整联蛋白)的结合相互作用可以使用系统来分析。在此方法中，使用由fort
é
bio公司制造的若干种仪器变型之一(例如，qke和qk)来确定蛋白质相互作用、结合特异性和表位映射。系统提供一种通过测量沿定制尖端向下传播然后返回传感器的偏振光的变化来监测实时结合的
简单方式。
[0331]
目标蛋白(抗整联蛋白抗体)和靶(例如，整联蛋白)的结合相互作用可以使用表面等离子体共振(spr)来分析。spr或生物分子相互作用分析(bia)实时检测生物特异性相互作用，而无需标记相互作用物中的任一个。bia芯片的结合表面处的质量变化(指示结合事件)导致表面附近光的折射率的改变(表面等离子体共振(spr)的光学现象)。折射率的变化产生可检测的信号，其被测量为生物分子之间的实时反应的指示。使用spr的方法描述于例如美国专利号5,641,640；raether(1988)surface plasmons springer verlag；sjolander和urbaniczky(1991)anal.chem.63:2338-2345；szabo等(1995)curr.opin.struct.biol.5:699-705和由biacore international ab(uppsala,sweden)提供的在线资源中。来自spr的信息可以用于提供生物分子与靶的结合的平衡解离常数(kd)和动力学参数(包括k
on
和k
off
)的准确和定量测量。
[0332]
表位也可以通过使用biacore色谱技术(pharmacia biatechnology handbook,"epitope mapping",第6.3.2节,α(1994年5月)β；α还β参见αjohne等βαβαβα,(1993)j.immunol.βmethods,160:191-198)评估不同抗体彼此竞争结合人αvβ1、αvβ6或一种或多种选自由v3、v5、v8、51、81和iib3组成的组的rgd结合整联蛋白的能力来直接映射。
[0333]
在采用酶免疫测定时，将含有抗体的样品，例如产生抗体的细胞的培养物上清液或纯化的抗体添加到抗原涂覆的板中。添加用酶(诸如碱性磷酸酶)标记的二抗，孵育板，并且在洗涤后，添加酶底物诸如对硝基苯磷酸酯，并且测量吸光度以评价抗原结合活性。
[0334]
用于评价抗体的另外的一般指导，例如蛋白质免疫印迹(western blot)和免疫沉淀测定，可见于antibodies:a laboratory manual,harlow和lane编,cold spring harbor press(1988))中。
[0335]
适应症
[0336]
a.第i-iii组抗体
[0337]
αvβ1整联蛋白在激活的成纤维细胞上高度表达，并且在激活转化生长因子β(tgfβ)和驱动组织纤维化中起作用(reed等,sci transl med,7:288(2015))。因此，本文所述抗体中的任一种(例如，第i组、第ii组和第iii组抗体)可以用于治疗或预防本文所述的或本领域已知的任何纤维化疾病或病状。在一些实施方案中，本文所述的抗体可用于治疗或预防此类疾病或病状，至少是因为所述抗体阻断tgfβ的激活。
[0338]
本文提供的抗体可以用于治疗或预防器官纤维化、软组织纤维化、关节和结缔组织纤维化以及多器官或系统性纤维化。器官纤维化的非限制性实例包括肺纤维化、肾纤维化、肝/肝脏纤维化、头颈纤维化、脊髓损伤/纤维化、脑中神经胶质瘢痕形成、眼纤维化、心脏纤维化、皮肤纤维化和骨髓纤维化。软组织纤维化的非限制性实例包括纵隔纤维化和腹膜后纤维化。关节和结缔组织纤维化的非限制性实例包括关节纤维化和粘连性关节囊炎。多器官或系统性纤维化的非限制性实例包括结节病、系统性硬化症、淀粉样变性、手术纤维化和肾原性系统性纤维化。
[0339]
本文提供的抗体可以用于治疗或预防肺纤维化，诸如但不限于ipf(特发性肺纤维化)、ipf的急性恶化、辐射诱导的肺损伤/纤维化、流感诱导的纤维化、凝血诱导的纤维化、血管损伤诱导的纤维化、常见间质性肺炎(uip)、慢性阻塞性肺病(copd)、博来霉素诱导的纤维化、哮喘(例如，慢性哮喘)、硅肺、石棉诱导的纤维化、急性肺损伤和急性呼吸窘迫(包
括细菌性肺炎诱导的、创伤诱导的、病毒性肺炎诱导的、呼吸机诱导的、非肺脓毒症诱导的和吸入诱导的)、肺组织细胞增生症x和进行性大块纤维化。
[0340]
本文提供的抗体可以用于治疗或预防肾纤维化，诸如但不限于急性肾损伤、特发性肾病综合征、特发性膜增生性肾小球肾炎、与损伤和/或纤维化相关联的慢性肾病(例如狼疮、糖尿病、硬皮病、肾小球肾炎、局灶性节段性肾小球硬化、iga肾病、高血压、同种异体移植和阿尔波特氏病(alport's disease))。
[0341]
本文提供的抗体可以用于治疗或预防肝/肝脏纤维化(诸如但不限于急性肝损伤、胆管损伤诱导的纤维化和肝硬化)、肠纤维化(诸如但不限于炎性肠病和克罗恩氏病)、眼纤维化(诸如但不限于角膜瘢痕形成、lasix、角膜移植和小梁切除术)、心脏纤维化(诸如但不限于特发性限制性心肌病、心房纤维化、心内膜纤维化和心肌梗死)、皮肤纤维化(诸如但不限于肥厚性瘢痕形成、烧伤诱导的纤维化、银屑病和瘢痕瘤)以及骨髓纤维化(诸如但不限于骨髓纤维化症(myelofibrosis))。
[0342]
本文提供的抗体可以用于治疗或预防非酒精性脂肪肝病(nafld)，诸如脂肪肝病和非酒精性脂肪性肝炎(nash)。
[0343]
b.第ii组抗体
[0344]
αvβ6整联蛋白可以与若干种配体结合，所述配体包括纤连蛋白、生腱蛋白和潜在相关肽1和潜在相关肽3(lap1和lap3)(tgf-βl的潜在前体形式的n末端278个氨基酸)。tgf-β细胞因子被合成为潜在复合物，其中n末端lap与成熟的活性c末端tgf-β细胞因子非共价缔合。潜在tgf-β复合物不能与其同源受体结合，并且因此直到转化为活性形式才具有生物活性。αvβ6通过与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(“rgd”)基序的相互作用结合lap1和lap3，并且αvβ6与lap1或lap3的这种结合导致tgf-βl和tgf-β3的潜在前体形式的激活，这是由于潜在复合物中构象的改变使得tgf-β与其受体结合。因此，上调的αvβ6表达可以导致tgf-β的局部激活，这反过来可以激活下游事件的级联。
[0345]
tgf-β细胞因子是调节细胞增殖、分化和免疫响应的多效生长因子。tgf-β也在癌症中起作用。认为tgf-β具有肿瘤抑制和生长抑制活性，然而许多肿瘤发展了对tgf-β的生长抑制活性的抗性。在已建立的肿瘤中，tgf-β表达和活性已经涉及促进肿瘤存活、进展和转移。据信这是由局部肿瘤-基质环境中的自分泌作用和旁分泌作用两者介导的，这些作用包括tgf-β对免疫监视、血管生成和肿瘤间质压力增加的作用。若干研究已经表明抑制tgf-β的抗肿瘤和抗转移作用。
[0346]
αvβ6整联蛋白在健康组织中以相对低的水平在上皮细胞上表达，并且在发育、损伤和伤口愈合期间显著上调。αvβ6整联蛋白的表达在上皮来源的癌症上被上调，所述癌症包括结肠癌、鳞状细胞癌、卵巢癌和乳腺癌。
[0347]
本文所述的与αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白两者结合但不与其他整联蛋白结合的抗体(即第ii组抗体)可以用于保护免于上皮和/或内皮细胞损伤(例如肺泡上皮损伤)。本文所述的第ii组抗体可以用于阻断αvβ6受体与含rgd的配体(例如，病毒表面上的蛋白质)的相互作用，从而减少或预防病毒感染。
[0348]
本文所述的第ii组抗体可以用于治疗癌症或癌症转移(包括肿瘤生长和侵袭)，诸如但不限于上皮癌。上皮癌的非限制性实例包括鳞状细胞癌，例如头颈癌(包括口腔癌、喉癌、咽癌、食道癌)、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、皮肤癌(基底细胞癌)、
卵巢癌和肾癌(例如肾细胞癌)。本文所述的第ii组抗体还可以用于脑和中枢神经系统肿瘤(例如成胶质细胞瘤)、眼科疾病(例如黄斑变性和年龄相关性黄斑变性)、骨质疏松症以及肾脏疾病，诸如但不限于慢性肾小管损伤、慢性肾病、(慢性)间质性纤维化、肾小管萎缩和肾移植患者中的慢性同种异体移植物功能障碍。
[0349]
本公开包括通过鉴定患者中的侵袭前病变或癌来治疗或预防转移性癌症，以及在侵袭前病变有机会发展成侵袭形式之前治疗患者以消除所述侵袭前病变的方法。此类方法包括，例如，(a)获得怀疑含有癌症或侵袭前病变的组织样品，和不含癌症或侵袭前病变的组织样品(优选来自与怀疑含有癌症或侵袭前病变的组织或器官相同的组织或器官)；(b)在有利于一种或多种αvβ6结合配体与组织中无论何处存在的αvβ6整联蛋白结合的条件下，使组织样品与一种或多种αvβ6结合配体(诸如本文所述的任何第ii组抗体)接触；和(c)检测αvβ6结合配体与组织的结合水平或模式，其中所述αvβ6结合配体在增生(例如，肿瘤)周围的肌上皮中的局部结合相对于在增生本身(或其细胞)中的结合而言的增加，或所述αvβ6结合配体在含有癌性或侵袭前病变的组织样品中的结合水平相对于在非癌性组织样品(或其细胞)中的结合而言的增加，指示更可能变为侵袭性和潜在转移的癌。在其他相关的实施方案中，本发明预期减少或预防患者中的转移前或侵袭前肿瘤进展为转移性或侵袭性肿瘤的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的一种或多种配体，所述配体与转移前或侵袭前肿瘤中的一种或多种细胞上的整联蛋白αvβ6的一个或多个亚基结合，其中所述配体与整联蛋白的结合导致减少或预防转移前或侵袭前癌症的细胞侵袭到原发性肿瘤周围的组织区域中。在其他实施方案中，本发明的方法适用于在通过不同方法去除、治疗或根除肿瘤后，消除残余肿瘤细胞，例如残余转移性细胞。例如，此类方法可以用于消除在手术切除肿瘤或通过诸如辐射、化疗等方法根除肿瘤后可能残留在患者体内的残余肿瘤细胞或转移性细胞。在此类治疗方案中，本发明的方法可以包括在肿瘤的手术、放射和/或化学治疗消融之前、期间和/或之后，向患者施用αvβ6结合抗体。
[0350]
c.第iii组抗体
[0351]
本文所述的与αvβ1以及一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的整联蛋白结合的抗体(即，第iii组抗体)可以用于治疗癌症或癌症转移，诸如但不限于实体瘤(例如胰腺癌或乳腺癌)。本文所述的第iii组抗体可以用于治疗有或没有骨转移的卵巢癌、结肠直肠癌和前列腺癌，以及用于治疗肾细胞癌、腹膜癌、脑和中枢神经系统肿瘤以及黑素瘤。本文所述的第iii组抗体可以用于治疗眼科疾病，诸如但不限于黄斑变性、年龄相关性黄斑变性(amd)、湿性年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿和糖尿病性视网膜病。本文所述的第iii组抗体还可以用于治疗急性冠状动脉综合征(acs)、自身免疫性疾病和骨质疏松症。自身免疫性疾病的非限制性实例包括类风湿性关节炎、银屑病、狼疮、炎性肠病、多发性硬化、吉兰-巴雷综合征(guillain-barre syndrome)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、格雷夫斯病(graves’disease)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto’s thyroiditis)、重症肌无力和血管炎。本文所述的第iii组抗体可以用作抗血栓形成剂，并且可以例如在经皮冠状动脉介入治疗(带有或不带有支架放置的血管成形术)期间使用。
[0352]
本发明的抗体的功效可以在各种动物模型中评估。肺纤维化的小鼠模型包括博来霉素-(pittet等,j.clin.invest.,107(12):1537-1544(2001)；以及munger等,cell,96:319-328(1999))和辐射-诱导型肺纤维化(franko等,rad.res.,140:347-355(1994))。肾纤
维化的小鼠模型包括col4a3-/-小鼠(参见，例如，cosgrove等,amer.j.path.,157:1649-1659(2000)、具有阿霉素诱导的损伤的小鼠(wang等,kidney international,58:1797-1804(2000)；deman等,nephrol dial transplant,16:147-150(2001))、db/db小鼠(ziyadeh等,proc.natl.acad.sci.usa,97:8015-8020(2000))和单侧输尿管梗阻的小鼠(fogo等,lab investigation,81:189a(2001)；以及fogo等,journal of the american society of nephrology,12:819a(2001))。可以在标准体内肿瘤生长和转移模型中评估本文所述的αvβ6抗体抑制肿瘤生长、进展和转移的能力。参见，例如，rockwell等,j.natl.cancer inst.,49:735(1972)；guy等,mol.cell biol.,12:954(1992)；wyckoff等,cancer res.,60:2504(2000)；以及oft等,curr.biol.,8:1243(1998)。
[0353]
治疗的功效可以通过多种可用的诊断工具来测量，包括身体检查、血液测试、蛋白尿测量、肌酸酐水平和肌酸酐清除率、肺功能测试、血浆血液尿素氮(bun)水平、瘢痕形成或纤维化病变的观察和评分、细胞外基质(诸如胶原蛋白、平滑肌肌动蛋白和纤连蛋白)的沉积、肾功能测试、超声、磁共振成像(mri)和ct扫描。
[0354]
药物组合物
[0355]
本文所述的抗整联蛋白抗体可以被配制为用于向受试者施用的药物组合物，例如以治疗本文所述的疾病或病状。通常，药物组合物包含药学上可接受的载剂。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。所述组合物可以包括药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐(参见例如，berge,s.m.等(1977)j.pharm.sci.66:1-19)。
[0356]
药物制剂是一种成熟的技术，并且还描述于例如gennaro(编),remington:the science and practice of pharmacy,第20版,lippincott,williams&wilkins(2000)(isbn:0683306472)；ansel等,pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,第7版,lippincott williams&wilkins publishers(1999)(isbn:0683305727)；以及kibbe(编),handbook of pharmaceutical excipients american pharmaceutical association,第3版(2000)(isbn:091733096x)中。
[0357]
药物组合物可以呈多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式可以取决于预期的施用模式和治疗应用。典型地，本文所述的剂的组合物呈可注射或可输注溶液的形式。
[0358]
此类组合物可以通过胃肠外模式(例如，静脉内、皮下、腹膜内或肌内注射)施用。在一个实施方案中，所述抗体组合物经静脉内施用。在另一个实施方案中，所述抗体组合物经皮下施用。如本文所用，短语“胃肠外施用”和“经胃肠外施用”是指除了肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射进行，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
[0359]
所述组合物可以配制成溶液、微乳液、分散体、脂质体或适合在高浓度下稳定储存的其他有序结构。可以通过根据需要将所需量的本文所述的剂与上文所列成分中的一种或组合一起并入适当的溶剂中，随后过滤灭菌，来制备无菌可注射溶液。通常，通过将本文所述的剂并入含有基础分散介质和来自上文所列成分的其他所需成分的无菌媒介物中来制
备分散体。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生本文所述的剂加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外所需成分的粉末。
[0360]
施用
[0361]
本文所述的抗体可以例如通过多种方法施用于受试者，例如有需要的人受试者。对于许多应用，施用途径是下列之一：静脉内注射或输注(iv)、皮下注射(sc)、腹膜内(ip)或肌肉内注射。也可以使用关节内递送。还可以使用其他胃肠外施用模式。此类模式的实例包括：动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内以及硬膜外和胸骨内注射。在一些情况下，施用可以是口服。
[0362]
抗体或其抗原结合片段的施用途径和/或模式也可以，例如通过监测受试者，例如使用断层成像，针对个体病例进行定制，例如以使肿瘤可视化。
[0363]
如果受试者处于发展本文所述的疾病或病状的风险中，则可以在疾病或病状完全发作之前施用抗体，例如作为预防性措施。此种预防性治疗的持续时间可以是抗体的单一剂量，或者所述治疗可以持续(例如，多剂量)。例如，处于疾病风险中或具有疾病易感性的受试者可以用抗体治疗数天、数周、数月或甚至数年，以便防止疾病发生或暴发。
[0364]
药物组合物可以包含“治疗有效量”的本文所述的剂。此类有效量可以基于所施用的剂的效果来确定，或者如果使用多于一种剂，则基于剂的组合效果来确定。剂的治疗有效量也可以根据以下因素而变化，诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及化合物在个体中引起所需响应的能力，例如改善至少一种疾病或病状参数、或者改善疾病或病状的至少一种症状。治疗有效量还是其中组合物的治疗有益效果超过其任何毒性或有害效果的量。
[0365]
用于治疗的装置和药盒
[0366]
包括本文所述的抗体的药物组合物可以与医疗装置一起施用。所述装置可以设计成具有诸如便携性、室温存储和易于使用的特征，使得它可以在紧急情况下使用，例如，由未经训练的受试者或由现场的急救人员从医疗设施和其他医疗设备中取出。所述装置可以包括例如一个或多个用于储存包含抗体的药物制剂的外壳，并且可以被配置成递送一个或多个单位剂量的抗体。所述装置还可以被配置成作为也包含本文所述的抗体的单一药物组合物或作为两种单独的药物组合物来施用第二剂。
[0367]
药物组合物可以用注射器施用。药物组合物也可以用无针皮下注射装置施用，诸如us 5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。众所周知的植入物和模块的实例包括：us 4,487,603，其公开了一种用于以受控速率分配药物的可植入微型输注泵；us 4,486,194，其公开了一种用于经由皮肤施用药物的治疗装置；us 4,447,233，其公开了一种用于以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；us 4,447,224，其公开了一种用于连续药物递送的可变流量可植入输注仪器；us 4,439,196，其公开了一种具有多室隔室的渗透药物递送系统；和us 4,475,196，其公开了一种渗透药物递送系统。许多其他装置、植入物、递送系统和模块也是已知的。
[0368]
本文所述的抗体可以在药盒中提供。在一个实施方案中，所述药盒包括(a)容器，其含有包含本文所述的抗体的组合物，和任选地(b)信息材料。所述信息材料可以是描述性的、指导性的、市场营销或其他涉及本文所述的方法和/或剂的治疗有益效果的使用的材
料。
[0369]
在一个实施方案中，药盒还包括用于治疗本文所述的疾病或病状的第二剂。例如，药盒包括含有包含本文所述的抗体的组合物的第一容器，和包含第二剂的第二容器。
[0370]
药盒的信息材料在其形式上不受限制。在一个实施方案中，信息材料可以包括关于化合物的生产、化合物的分子量、浓度、有效期、批次或生产地点信息等的信息。在一个实施方案中，信息材料涉及例如以合适的施用模式(例如，本文所述的施用模式)施用本文所述的抗体以治疗已患有本文所述的疾病或病状或具有本文所述的疾病或病状风险的受试者的方法。信息可以以各种格式提供，包括印刷文本、计算机可读材料、视频记录或音频记录，或者例如在因特网上提供实质材料的链接或地址的信息。
[0371]
除了抗体之外，药盒中的组合物还可以包含其他成分，诸如溶剂或缓冲剂、稳定剂或防腐剂。所述抗体可以任何形式提供，例如液体、干燥或冻干形式，优选是基本上纯的和/或无菌的。当所述剂以液体溶液提供时，液体溶液优选是水溶液。当所述剂以干燥形式提供时，通常通过添加合适的溶剂进行重构。溶剂(例如无菌水或缓冲剂)可以任选地提供在药盒中。
[0372]
药盒可以包括一个或多个用于一种或多种含有剂的组合物的容器。在一些实施方案中，药盒含有用于组合物和信息材料的单独容器、分隔物或隔室。例如，组合物可以包含在瓶、小瓶或注射器中，而信息材料可以包含在塑料套或包中。在其他实施方案中，药盒的单独元件包含在单个未分开的容器内。例如，组合物可以包含在瓶、小瓶或注射器中，所述瓶、小瓶或注射器具有附着于其上的标签形式的信息材料。在一些实施方案中，药盒包括多个(例如，一包)单独的容器，每个容器含有一个或多个单位剂型(例如，本文所述的剂型)的剂。容器可以包含组合单位剂型，例如，包含例如所需比率的本文所述的抗体和第二剂两者的单位。例如，药盒包括多个注射器、安瓿、箔包、泡罩包或医疗装置，例如，各自含有单一组合单位剂量。药盒的容器可以是气密的、防水的(例如，对水分的变化或蒸发是不可渗透的)和/或不透光的。药盒任选地包括适用于施用组合物的装置，例如注射器或其他合适的递送装置。所述装置可以提供为预先装有一种或两种剂，或者可以是空的，但适合装载。
[0373]
选择目标抗整联蛋白抗体的方法
[0374]
本公开的一些方面提供了使用本文所述抗整联蛋白抗体中的任一种来选择、发现或分离目标抗体的方法。目标抗体可以是与αvβ1整联蛋白结合但不与其他整联蛋白(例如，其他含αv或β1的整联蛋白或rgd家族整联蛋白)结合的抗体，与αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白结合但不与其他整联蛋白结合的抗体，或与αvβ1以及一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的整联蛋白结合的抗体。
[0375]
例如，为了选择目标抗整联蛋白抗体，可以使用指导抗体进行指导选择过程，所述指导抗体可以是本文所述的与αvβ1整联蛋白结合但不与其他整联蛋白(例如，其他含αv或β1的整联蛋白或rgd家族整联蛋白)结合的抗体，诸如示例性抗体1-10。例如，可以提供标记的重组或纯化的αvβ1整联蛋白(例如，一种或多种包含αv和β1的胞外结构域的多肽)和原核或真核(例如，酵母)抗体表达文库。可以选择在添加指导抗体时表现出与标记抗原的结合降低的抗体表达文库中的克隆，其富集目标抗体。指导选择过程的另外描述可见于例如cherf和cochran,methods mol biol.1319:155-75,2015；xu等protein eng des sel.26(10):663-70,2013；以及mann等acs chem biol.8(3):608-16,2013中。在一些情况下，示例
性抗体11-14和15-20中的任一种或多种也可以用作指导抗体，以选择、发现或分离目标抗体(例如，与αvβ1整联蛋白结合但不与其他整联蛋白(例如，其他含αv或β1的整联蛋白或rgd家族整联蛋白)结合的抗体，与αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白结合但不与其他整联蛋白结合的抗体，或与αvβ1以及一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的整联蛋白结合的抗体)。
[0376]
为了选择与αvβ1整联蛋白结合但不与其他整联蛋白(例如，其他含αv或β1的整联蛋白或rgd家族整联蛋白)结合的抗体，例如，所述方法还可以包括消耗与不希望的整联蛋白结合的抗体，所述不希望的整联蛋白例如含αv或β1的整联蛋白或rgd家族整联蛋白，包括αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3。所述方法还可以包括使用目标靶整联蛋白αvβ1整联蛋白的阳性选择步骤。与αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白结合但不与其他整联蛋白结合的抗体可以通过消耗与除αvβ1和αvβ6外的整联蛋白结合的抗体和/或通过使用αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白进行阳性选择来相似地选择。此类原理也适用于选择与αvβ1整联蛋白以及一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的整联蛋白结合的抗体。
[0377]
也可以对通过上述步骤中的一个或多个富集的抗体进行亲和力成熟以增加对靶整联蛋白的亲和力和特异性，从而使用本领域已知的用于亲和力优化的方法(例如，轻链改组或h-cdr1/h-cdr-2靶向的诱变)构建文库。
[0378]
实施例
[0379]
提供以下实施例以更好地说明要求保护的发明，而不应解释为限制本发明的范围。就提到的具体材料而言，其仅用于说明的目的，而并非旨在限制本发明。本领域的技术人员可在不行使本发明的能力且不脱离本发明范围的情况下开发等效的手段或反应物。
[0380]
实施例1：抗体选择和抗体产生的设计
[0381]
已知整联蛋白αvβ1与若干种细胞外基质蛋白结合。异二聚体复合物是α亚基αv和β亚基β1的组合(seq id no:1和2)。αv亚基能够与另外四种β亚基功能配对：β3、β5、β6和β8。β1亚基能够与另外十一种α亚基功能配对：α1、α2、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11(hynes r o,cell,110(6):673-87(2002))。
[0382]
根据本领域已知的方法重组表达并纯化整联蛋白αvβ1。另外，根据本领域已知的方法重组表达并纯化整联蛋白αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α4β1、α5β1和α8β1。本公开描述了三组不同的抗体：与αvβ1整联蛋白结合但不与其他整联蛋白(例如，其他含αv或β1的整联蛋白)结合的抗体；与αvβ1整联蛋白和αvβ6整联蛋白结合但不与其他整联蛋白结合的抗体；以及与αvβ1以及一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的整联蛋白结合的抗体。
[0383]
为了产生这些组的抗体，根据美国专利公开20100056386和20090181855中公开的方法筛选adimab表达文库。针对目标抗原αvβ1(seq id no:1和2)的选择压力和减少与不希望的抗原αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α4β1、α5β1和α8β1结合的选择压力进行多个迭代轮次。在期望与αvβ1和αvβ6结合的选择中，引入针对αvβ6的选择压力的迭代轮次并且消除减少与αvβ6结合的轮次。还可以设计选择以使用指导蛋白(即mab、fab或配体)指导至目标表位。在存在和不存在阳离子(包括钙、镁和锰)的情况下进行选择。在完成选择后，使用本领域已知的技术对菌落进行测序以鉴定独特的克隆。在四个活动(campaign)之后，使用本领域已知的
方法从酵母中表达并在蛋白a树脂上纯化超过2500种抗体。αvβ1特异性、αvβ1/αvβ6特异性和结合αvβ1加一种或多种整联蛋白的抗体的分类的一般概述描绘在图1中。
[0384]
还进行了抗体优化以增加某些抗体对αvβ1的亲和力以及微调整联蛋白特异性。使用本领域已知的用于亲和力优化的方法(即，轻链改组和h-cdr1/h-cdr-2靶向的诱变)构建抗体文库。使用浓度递减的αvβ1重组蛋白施加针对目标抗原的选择压力的多个迭代轮次。进行减少与不希望的抗原αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α4β1、α5β1和α8β1的结合的选择压力。在完成选择后，使用本领域已知的技术对菌落进行测序以鉴定独特的克隆。在抗体优化活动之后，使用本领域已知的方法从酵母中表达并在蛋白a树脂上纯化超过500种抗体。
[0385]
所述分析导致鉴定了二十种抗体。本文提供了这些抗体的cdr和可变区的氨基酸序列。
[0386]
实施例2：结合动力学和整联蛋白特异性的确定
[0387]
在活动1-3之后，最初在存在或不存在阳离子的情况下筛选与αvβ1结合阳性的抗体。随后筛选与其他含αv的整联蛋白和含β1的整联蛋白结合的阳性抗体。进行此筛选步骤以将未来的表征集中在识别αv亚基和β1亚基的组合的抗体并消除仅识别αv亚基或β1亚基的抗体。此步骤还允许基于对与rgd结合整联蛋白(即，αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1、αiibβ3)和非rgd结合含β1的整联蛋白(即，α4β1)的结合的偏好对抗体分层。
[0388]
使用生物层干涉技术(bli)筛选与靶抗原结合的抗体。根据标准程序，在由fortebio制造的octet red384和octet htx仪器上进行bli。基于特异性将抗体亚组分类，随后在另外的测定中进行筛选。
[0389]
观察到的αvβ1特异性、非特异性和部分选择性的抗体的结合动力学的实例示于图2a-图2k和图3a-图3e中。另外，对于重组αvβ1的单价结合亲和力示于图4a-图4j中。这包括来自最初的三个活动和随后的亲和力优化活动的抗体。亲和力成熟后的单价亲和力筛选允许从优化中选择亲和力最高的克隆用于进一步表征。
[0390]
对于αvβ1表现出特异性的抗体的实例包括示例性抗体1和示例性抗体2。具有部分选择性的抗体的实例包括示例性抗体15和示例性抗体16。亲和力成熟后选择的亲和力更高的抗体包括示例性抗体4和示例性抗体5。
[0391]
实施例3：细胞表面结合和整联蛋白特异性的确定
[0392]
通过本领域已知的方法制备表达αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α4β1、α5β1和α8β1的稳定转染的细胞。
[0393]
在活动1-3之后，最初通过octet red384和octet htx筛选抗体。选择抗体亚组用于针对转染的细胞和未转染的细胞的另外的特异性筛选和亲和力测量。在活动4之后，直接对表达αvβ1的稳定转染的细胞筛选抗体。随后筛选与其他含αv的稳定转染的细胞和含β1的稳定转染的细胞结合的阳性抗体。进行此筛选步骤以将未来的表征集中在识别αv亚基和β1亚基的组合的抗体并消除仅识别αv亚基或β1亚基的抗体。此步骤还允许基于对与rgd结合整联蛋白(即，αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1、αiibβ3)和非rgd结合含β1的整联蛋白(即，α4β1)的结合的偏好对抗体分层。
[0394]
在一至三种浓度下进行初始细胞结合筛选之后，对多个含αv的细胞系和含β1的细胞系进行6或11-pt滴定。
[0395]
收获细胞并证实活力大于90％。通过以1500rpm沉淀3分钟，然后倒出上清液，将细
胞在适当的测定缓冲液中洗涤三次。用于本实验的测定缓冲液是含有1mg/ml bsa且补充有1mm ca 1mm mg或补充有1mm mn的tbs。然后将细胞以1.0-1.5
×
106个细胞/ml的浓度重悬于测定缓冲液中，并以50μl等份转移至96孔测定板(corning 3799)的孔中。然后将板以2000rpm离心3分钟以沉淀细胞并抛掉上清液。将细胞重悬于100μl抗体样品中，并在冰上孵育45至60分钟。较低的抗体浓度需要较久的孵育时间。
[0396]
通过以2000rpm沉淀3分钟，然后抛掉上清液，将板在150μl测定缓冲液中洗涤三次。然后将细胞重悬于50μl藻红蛋白缀合的山羊抗人fab二级试剂中，并在冰上在黑暗中孵育30分钟。通过以2000rpm沉淀3分钟，然后抛掉上清液，将板在150μl测定缓冲液中洗涤三次。然后将细胞在冰上重悬于200μl测定缓冲液 1％聚甲醛(pfa)中30分钟以固定细胞。沉淀细胞以除去pfa，然后将其重悬于150μl测定缓冲液中。
[0397]
在bd facscalibur流式细胞仪上分析细胞群。
[0398]
观察到的αvβ1特异性和部分选择性抗体的结合滴定的实例示于图5a-图5e和图6a-图6j中。这包括来自最初的四个活动和随后的亲和力优化活动的抗体。表1中总结了rgd结合整联蛋白亚组的细胞表面结合的二价亲和力(即，ec50)。
[0399]
表1
[0400][0401][0402]
关键词：n.d.＝未测定；结合＝观察到弱结合但不完全适合计算ec50
[0403]
对αvβ1表现出特异性的抗体的实例包括示例性抗体5、示例性抗体4、示例性抗体7和示例性抗体8。对αvβ1和αvβ6两者表现出特异性的抗体的实例包括示例性抗体11、示例性抗体12和示例性抗体14。具有部分选择性(即，与αvβ1以及一种或多种选自由αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1和αiibβ3组成的组的整联蛋白结合)的抗体的实例包括示例性抗体19和示例性抗体17。
[0404]
实施例4：αvβ1潜在相关肽粘附抑制
[0405]
在确定特异性和部分选择性抗体之后，在潜在相关肽(lap)粘附测定中测试抗体以证实阻断整联蛋白/配体相互作用的能力，从而集中于可以破坏功能生物学活性的抗体。lap是αvβ1异二聚体以及包含αvβ6和αvβ8的其他整联蛋白异二聚体的许多配体之一。
[0406]
在4℃下将96孔微量滴定板(costar 3369)用100μl/孔的在50mm碳酸氢钠，ph 9.2中稀释的10μg/ml lap(r&d systems，目录号246-lp)涂覆过夜。将板用pbs(200μl/孔)洗涤两次，在室温下用在pbs中的1％bsa(200μl/孔)阻断1小时，并且用200μl/孔的测定缓冲液(tbs、2mm葡萄糖、0.1％bsa、1mm cacl2和1mm mgcl2，ph 7.4)洗涤三次。从细胞悬浮液中取出稳定转染的人αvβ1细胞，并且以1100rpm离心5分钟。将沉淀重悬于rpmi 1640，1％bsa缓冲液中，并且与2μm荧光染料(bcecf,molecular probes,eugene,or)一起在37℃孵育箱中孵育30分钟。通过以1100rpm离心5分钟将标记的细胞洗涤两次，并重悬于测定缓冲液中至0.8
×
106个细胞/ml。向洗涤的板的各个孔中添加50μl纯化的抗体和50μl用bcecf标记的人αvβ1细胞，并且将板在室温下黑暗中孵育1小时。用测定缓冲液(200μl/孔)洗涤板3-4次，并且在485nm(激发)波长和538nm(发射)波长下记录由于板上粘附的细胞而产生的荧光。通过比较最终洗涤步骤之前(即添加的总细胞)的荧光与洗涤之后(即结合的细胞)的荧光来确定结合百分比。
[0407]
αvβ1lap粘附抑制的实例示于图7a-图7e中。这包括pan-αv商业抗体(l230)、pan-β1商业抗体(mab13)、公开的β6-特异性抗体和先前公开为αvβ1特异性的c8小分子化合物(reed ni等,sci transl med,7(288):288ra79(2015))的实例。表2中总结了所有抗体对基于细胞的粘附的抑制(即，ic50)。
[0408]
表2
[0409]
[0410][0411]
抑制lap粘附的抗体的实例包括示例性抗体5、示例性抗体17、示例性抗体11、示例性抗体14和示例性抗体8。不抑制lap粘附的抗体的实例包括示例性抗体18。
[0412]
实施例5：α4β1血管细胞粘附蛋白(vcam)粘附抑制
[0413]
通过对重组蛋白的octet筛选和/或细胞表面与稳定转染的细胞系的结合，确立了αvβ1整联蛋白相对于其他rgd结合整联蛋白的特异性。还测试与α4β1(含β1的整联蛋白)结合而不与含rgd的配体结合的抗体。为了证实实施例3中没有与α4β1的结合，还在细胞粘附测定中测试了抗体，以确定它们是否抑制α4β1/配体(即，vcam)相互作用。不期望对含β1的整联蛋白表现出另外的交叉反应性。
[0414]
在4℃下将96孔微量滴定板(costar 3369)用100μl/孔的在50mm碳酸氢钠，ph 9.2中稀释的10μg/ml vcam-ig涂覆过夜。将板用pbs(200μl/孔)洗涤两次，在室温下用在pbs中的1％bsa(200μl/孔)阻断1小时，并且用200μl/孔的测定缓冲液(tbs、2mm葡萄糖、0.1％bsa、1mm cacl2和1mm mgcl2，ph 7.4)洗涤三次。从细胞悬浮液中取出jurkat细胞，并且以1500rpm离心5分钟。将沉淀重悬于rpmi1640，1％bsa缓冲液中，并且与2μm荧光染料(bcecf,molecular probes,eugene,or)一起在37℃孵育箱中孵育30分钟。通过以1100rpm离心5分钟将标记的细胞洗涤两次，并重悬于测定缓冲液中至0.8
×
106个细胞/ml。向洗涤的板的各个孔中添加50μl纯化的抗体和50μl用bcecf标记的jurkat细胞，并且将板在室温下黑暗中孵育1小时。用测定缓冲液(200μl/孔)洗涤板3-4次，并且在485nm(激发)波长和538nm(发射)波长下记录由于板上粘附的细胞而产生的荧光。通过比较最终洗涤步骤之前(即添加的总细胞)的荧光与洗涤之后(即结合的细胞)的荧光来确定结合百分比。
[0415]
α4β1vcam粘附抑制的实例示于图8中。这包括pan-αv商业抗体(l230)、pan-β1商业抗体(mab13)、公开的α4-特异性抗体(那他珠单抗(natalizumab))和先前公开为αvβ1特异性的c8小分子化合物(reed ni等,sci transl med,7(288):288ra79(2015))的实例。此数据证实抗体不与α4β1结合或破坏细胞粘附。实例包括示例性抗体17、示例性抗体19、示例性抗体4和示例性抗体5。mab13(pan-β1)和那他珠单抗(α4)抗体如预期抑制粘附。c8小分子化合物确实抑制α4β1/vcam粘附，尽管在原始公开中没有指明α4β1结合。随后公开的研究已经突出了c8小分子化合物的潜在未知和不期望的整联蛋白交叉反应性(wilkinson al等,eur j pharmacol,842:239-247(2019))。α4β1vcam粘附抑制测定的结果证实c8以足够的亲和力结合α4β1以破坏与vcam的结合。
[0416]
实施例6：成纤维细胞结合测定
[0417]
与内源性细胞系(即，未工程改造的)上的αvβ1结合也是期望的。为了直接靶向成纤维细胞，在mrc9细胞(人肺成纤维细胞系)和blo-11(小鼠骨骼肌成纤维细胞系)上测试抗体的结合。
[0418]
mrc9细胞自sigma(#85020202)获得并且维持在补充有10％胎牛血清(fbs，来自gibco,#16000-077)的emem(atcc,#30-2003)中。blo-11细胞自atcc(#ccl-198)获得并且维持在补充有10％fbs的dmem(atcc#30-2002)中。通过在37℃下与细胞解离缓冲液(gibco，#13150-016)一起孵育10分钟收获细胞，然后将其用含有cacl2和mgcl2的facs缓冲液(facs

adhesions,15:317-331,2008；以及zhu等molecular cell 32:849-861,2008)。另外，通过相似方法将重组分泌人αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α4β1、α5β1和α8β1制备为重组型式#3(具有卷曲螺旋标签)。所有重组整联蛋白都经生物素化以供选择。
[0426]
使用纯化的和生物素化的重组αvβ1型式1、2和3，用adimab酵母表达文库进行选择。在没有阳离子的缓冲液以及含有camg的缓冲液或含有mn的缓冲液中进行选择。前两个选择轮次使用磁激活细胞分选(macs)进行，并且所有随后的轮次都用荧光激活细胞分选(facs)进行。利用基于facs的平台允许对酵母或其他细胞(原核或真核)展示的抗体文库的选择可视化。通过这种可视化，可以设计选择以使用指导蛋白(例如，mab、fab、配体或消耗蛋白)指导至目标表位(参见例如，cherf和cochran,methods mol biol.1319:155-75,2015；xu等protein eng des sel.26(10):663-70,2013；以及mann等acs chem biol.8(3):608-16,2013)。如果在轮次3后观察到稳健富集，则使用l230(pan-αv商业抗体)和/或在含αv的整联蛋白(αvβ3或αvβ5)和含β1的整联蛋白(α5β1或α4β1)上的消耗将随后的轮次指导至目标表位。使用这些条件，我们能够将输出集中到结合多种rgd结合整联蛋白的抗体以及对αvβ1具有特异性的抗体。根据消耗的严格性，选择导致鉴定出αvβ1特异性抗体(例如示例性抗体1、2、3)或结合多种rgd结合整联蛋白的抗体(例如示例性抗体15、16)。随后进行抗体优化以增加某些抗体对αvβ1的亲和力以及微调整联蛋白特异性。使用本领域已知的用于亲和力优化的方法(例如，轻链改组和h-cdr1/h-cdr-2靶向的诱变)构建抗体文库。亲和力成熟后，抗体对αvβ1整联蛋白(例如示例性抗体4和5)具有特异性或结合多种rgd结合整联蛋白(例如示例性抗体17、18、19)。
[0427]
在分离αvβ1特异性抗体后，可以使用这些抗体进行将来的指导选择。使用纯化的和生物素化的重组αvβ1型式3，用adimab酵母表达文库进行新的选择。在含有camg的缓冲液中进行选择。前两个选择轮次使用macs进行，并且所有随后的轮次都用facs进行。在轮次3之后观察到稳健富集，并且使用示例性抗体5来指导至轮次4中与先前使用l230的选择中实现的表位相比更精制的表位。随后对含αv的整联蛋白(αvβ3、αvβ5或αvβ6)和/或含β1的整联蛋白(α5β1或α8β1)进行消耗轮次，在一些情况下随后进行阳性αvβ1选择轮次。这些选择的输出也经过亲和力成熟以增加对αvβ1或αvβ1/αvβ6的亲和力和特异性，从而使用本领域已知的用于亲和力优化的方法(即轻链改组和h-cdr1/h-cdr-2靶向的诱变)构建文库。在αvβ1富集后，用αvβ8和α5β1或α8β1进行消耗轮次，在一些情况下随后进行阳性αvβ1选择轮次。根据消耗的严格性，亲和力优化选择导致鉴定出αvβ1特异性抗体(即示例性抗体6、7、8、9、10)、αvβ1/αvβ6特异性抗体(即示例性抗体11、12、13、14)或结合多种rgd结合整联蛋白的抗体(即示例性抗体20)。
[0428]
在本实施例中提及的序列：
[0429]
重组整联蛋白αvβ1型式#1中的人整联蛋白αv蛋白的氨基酸序列如下所示。
[0430][0431]
重组整联蛋白αvβ1型式#1中的人整联蛋白β1蛋白的氨基酸序列如下所示。
[0432][0433]
重组整联蛋白αvβ1型式#2中的人整联蛋白αv蛋白的氨基酸序列如下所示。
[0434][0435]
重组整联蛋白αvβ1型式#2中的人整联蛋白β1蛋白的氨基酸序列如下所示。下划线表示包括铰链、higg1 fc区和avitag的序列。
[0436][0437]
重组整联蛋白αvβ1型式#3中的人整联蛋白αv蛋白的氨基酸序列如下所示。下划线表示tev-碱性卷曲螺旋-strepii标签。
[0438][0439][0440]
重组整联蛋白αvβ1型式#3中的人整联蛋白β1蛋白的氨基酸序列如下所示。下划线表示tev-碱性卷曲col-6xhis-avitag。
[0441][0442]
其他实施方案
[0443]
虽然已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。