一种用于检测布鲁氏杆菌的荧光试剂盒与检测方法与流程

1.本发明涉及一种用于检测布鲁氏杆菌的荧光试剂盒与检测方法，属于生物检测技术领域。


背景技术：

2.布鲁氏菌病(brucellosis)是由布鲁氏杆菌(brucella)感染引起的疾病，是一种人畜共患性全身传染病，简称"布病"，又有地中海弛张热、马耳他热、波浪热等称谓。世界动物卫生组织(oie)将其列为法定动物报告疾病。布鲁菌可通过皮肤黏膜、呼吸道、消化道等途径侵入机体，引起发热、流产、不育、虚弱、关节痛等临床症状。布鲁菌宿主广泛、传染性强，不同种布鲁菌具有宿主间交叉感染的能力，对畜牧业和人类健康均构成严重威胁。因此，在当前严峻的防控形势下研发简便、快速、精确的布鲁氏杆菌检测技术就显得非常迫切。
3.布鲁氏杆菌(brucella)是一种革兰氏阴性的不运动细菌，无荚膜(光滑型有微荚膜)，触酶、氧化酶阳性，绝对嗜氧菌，可还原硝酸盐，细胞内寄生，可以在很多种家畜体内存活。目前，布鲁菌属主要有7个种，为羊种布鲁菌、牛种布鲁菌、猪种布鲁菌、犬种布鲁菌、绵羊附睾种布鲁菌、沙林鼠种布鲁菌和海洋哺乳动物种布鲁菌共21个生物型。布鲁菌广泛分布于世界各地，调查全世界有170个国家和地区有布鲁菌病报道发生，最严重的地区位于地中海沿岸和阿拉伯半岛诸国，该病在印度、墨西哥、美国的南部和中部地区也较普遍。尽管一些国家已经有效控制了布鲁菌病，但中亚地区逐渐成为人布鲁菌病的新发地区。据统计，全球每年出现约50万例人布鲁菌病。布鲁菌病在我国也广泛存在，尤其是在以畜牧业生产为主的地区。2009年全国布鲁菌病监测数据显示，全国有29个省区、市发生畜间布鲁菌病，牛、羊、猪等感染量达百万头之多，见于内蒙、东北、西北等牧区。人布鲁菌病亦呈上升趋势，人布鲁菌病疫情表现出明显的职业性、地区性、季节性，人布鲁菌病可能与接触感染动物有关。因此，必须从根本上预防和控制动物布鲁菌病。
4.目前，主要是使用传统的病原分离培养、血清学检测技术和分子生物学检测技术等进行布鲁氏杆菌检测。这些传统的检测方法存在诸多局限性，如常规生化识别过程繁琐、周期长、效率低；免疫检测特异性不强，容易造成漏检；rt-pcr需要耗时、繁琐、仪器昂贵不便携带和需要专业人员操作等。这就使得开发布鲁氏菌病的简便、快速、精准的现场诊断方法变得尤为重要。因此，亟需提供一种简单快速，且灵敏度、特异性高的特异性片段以及检测方法。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供一种用于检测布鲁氏杆菌的荧光试剂盒与检测方法。
6.本发明技术方案如下：
7.一种用于检测布鲁氏杆菌的crrna，其特征在于，所述crrna选自如下所示的序列：
8.crrna-wt-1：其序列如seq id no.1所示；
9.crrna-vac-1：其序列如seq id no.2所示；
10.crrna-wt-2：其序列如seq id no.3所示；
11.crrna-vac-2：其序列如seq id no.4所示；
12.crrna-wt-3：其序列如seq id no.5所示；
13.crrna-vac-3：其序列如seq id no.6所示；
14.crrna-wt-4：其序列如seq id no.7所示；
15.crrna-vac-4：其序列如seq id no.8所示；
16.crrna-wt-5：其序列如seq id no.9所示；
17.crrna-vac-5：其序列如seq id no.10所示。
18.一种用于检测布鲁氏杆菌的crdna，其特征在于，所述crdna选自如下所示的序列：
19.crdna-wt-1：其序列如seq id no.11所示；
20.crdna-vac-1：其序列如seq id no.12所示；
21.crdna-wt-2：其序列如seq id no.13所示；
22.crdna-vac-2：其序列如seq id no.14所示；
23.crdna-wt-3：其序列如seq id no.15所示；
24.crdna-vac-3：其序列如seq id no.16所示；
25.crdna-wt-4：其序列如seq id no.17所示；
26.crdna-vac-4：其序列如seq id no.18所示；
27.crdna-wt-5：其序列如seq id no.19所示；
28.crdna-vac-5：其序列如seq id no.20所示。
29.一种用于检测布鲁氏杆菌的dna，其特征在于，所述dna选自如下所示的序列：
30.dna-wt-1：其序列如seq id no.21所示；
31.dna-vac-1：其序列如seq id no.22所示；
32.dna-wt-2：其序列如seq id no.23所示；
33.dna-vac-2：其序列如seq id no.24所示；
34.dna-wt-3：其序列如seq id no.25所示；
35.dna-vac-3：其序列如seq id no.26所示；
36.dna-wt-4：其序列如seq id no.27所示；
37.dna-vac-4：其序列如seq id no.28所示；
38.dna-wt-5：其序列如seq id no.29所示；
39.dna-vac-5：其序列如seq id no.30所示。
40.所述crrna-wt和crrna-vac可以经人工合成得到，或以crdna-wt和crdna-vac为模板转录得到，所述dna-wt是crrna-wt的靶向序列，所述dna-vac是crrna-vac的靶向序列，用于检测和区分牛种布鲁氏杆菌野毒株和布鲁氏杆菌a19疫苗株。
41.一种用于检测布鲁氏杆菌的荧光试剂盒，其特征在于，包含上述crrna或crdna。
42.根据本发明优选的，所述试剂盒还包括cas蛋白和荧光探针；
43.进一步优选的，所述cas蛋白为crispr-cas13蛋白；
44.根据本发明优选的，所述荧光探针序列的5端标记有荧光基团，3端标记有淬灭基
团。
45.进一步优选的，所述荧光基团为fam或rox；淬灭基团为bhq1或bhq2。
46.进一步优选的，所述荧光探针ssrna荧光探针，vac荧光探针序列为5
’‑
fam-uuuuu-3’bhq1；wt荧光探针序列为5
’‑
rox-uuuuu-3’bhq2。
47.一种利用上述试剂盒检测布鲁氏杆菌的方法，包括步骤如下：
48.(1)提取待测样本的基因组；
49.(2)以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和聚合酶的反应体系中，进行rpa扩增；
50.(3)取rpa扩增产物分别建立wt检测体系和vac检测体系，在37℃下，孵育5-30min；
51.(4)将wt检测体系和vac检测体系分别放入led照射灯下，当检测液荧光显色为红色时，表明待测样本是野毒株；当检测液荧光显色为绿色时，表明待测样本是a19疫苗株；当不形成荧光显示时，表明待测样本不存在布鲁氏杆菌感染。
52.根据本发明优选的，步骤(1)中，所述待测样本为经过65-80℃、10分钟预灭活处理的牛全血、牛尿液或牛唾液。
53.根据本发明优选的，步骤(2)中，所述rpa扩增的引物分别为：
54.crrna-wt-1和crrna-vac-1的正向引物：
55.5'-gaaattaatacgactcactatagggttgccgcatcttcttgcgtacggcttcattt-3'；
56.crrna-wt-1和crrna-vac-1的反向引物：
57.5'-gacatatacacggcatttgataggggacata-3'；
58.crrna-wt-2和crrna-vac-2的正向引物：
59.5'-gaaattaatacgactcactatagggcgtcgattgccgccagcatggccttgcggtt-3'；
60.crrna-wt-2和crrna-vac-2的反向引物：
61.5'-cacgtcggaaatccggcgtatgctgatcgga-3'；
62.crrna-wt-3和crrna-vac-3的正向引物：
63.5'-gaaattaatacgactcactataggggctcgtcatcctcaatggcggcatcgacctt-3'；
64.crrna-wt-3和crrna-vac-3的反向引物：
65.5'-cagataagcgatcaacacaccattgaccgcg-3'；
66.crrna-wt-4和crrna-vac-4的正向引物：
67.5'-gaaattaatacgactcactatagggaatgaaggctgcattggcggaggcaagttcg-3'；
68.crrna-wt-4和crrna-vac-4的反向引物：
69.5'-tcatcggcatgatggcgctgccctacctcat-3'；
70.crrna-wt-5和crrna-vac-5的正向引物：
71.5'-gaaattaatacgactcactatagggatgagctgacggtttccgagaccggcgataa-3'；
72.crrna-wt-5和crrna-vac-5的反向引物：
73.5'-ttgtgacggcgcgcataacggatcgtcgctt-3'。
74.根据本发明优选的，步骤(2)中，所述rpa扩增体系为：rpa基础反应球一管，再水合缓冲液29.5μl，醋酸镁缓冲液2.5μl，正向引物2.5μl，反向引物2.5μl，其余用无酶水8μl补足，然后进行5等份分配，每9μl一份，每份加待测样本1μl，总体积10μl。
75.扩增条件为：反应温度39～42℃，孵育时间5～20min。
76.其中，rpa基础反应球、再水合缓冲液和醋酸镁缓冲液均来自于twistamprbasic试剂盒，rpa基础反应球为球状固体，内含重组酶、聚合酶等成分。
77.根据本发明优选的，步骤(3)中，所述wt检测体系和vac检测体系相同，具体为：tris-hcl(400mm)、mgcl2(120mm)、ssrna荧光探针(5μm)、crrna 1μl、rnase inhibitor 1μl、cas13a蛋白2μl、t7 polymerase 0.5μl、rntp 0.8μl，rpa扩增产物1μl，总体积20μl。
78.根据本发明优选的，步骤(4)中，所述led照射灯为便携式led照射灯，激发波长为360～450纳米。
79.本发明未详细说明的均为现有技术。
80.本发明的技术特点：
81.本发明检测体系中的cas13a蛋白与crrna(vac)结合成cas13a-crrna(vac)复合物，该复合物能够特异性地识别rpa扩增产物中的dna(vac)的转录产物，若rpa扩增产物中有dna(vac)片段，cas13a蛋白被激活，并对ssrna荧光报告基团进行切割。被切割的ssrna荧光报告基团通过led设备激发后将会发出荧光，表明样品为阳性，发出绿色荧光是疫苗株感染，发出红色荧光是野毒株感染。若rpa扩增产物中无dna(vac)片段，cas13a则不会被激活，ssrna荧光报告基团不会被切割，不形成荧光显示，表明样品为阴性，样本不存在布鲁氏杆菌感染。
82.有益效果：
83.1、本发明提供的布鲁氏杆菌的荧光试剂盒可以同时区分待测样品是牛种布鲁氏杆菌野毒株或布鲁氏杆菌a19疫苗株，有效解决了现有技术中a19疫苗株和野毒株分别鉴定区分的问题。并且本发明提供的检测方法与传统的检测方法相对比特异性强、检测限低、灵敏度高，检测灵敏度能达到18am，还具有价格便宜，操作简单、快速，且设备仪器方便携带的优点。
84.2、本发明提供的检测方法将rpa扩增技术、crispr系统和快速荧光检测技术联用，通过合理配比降低相互之间的干扰，使反应试剂之间依然能够准确地、特异地实现各自的功能，通过扩增和检测结合进行，用便携式的led照射灯观测即可得到结果，使得整个检测过程耗时极短，进行定性检测时在5～30min内即可完成，且操作步骤简单，通过荧光颜色即可肉眼分辨出待检测样本是疫苗株还是野毒株，为布鲁氏杆菌病的净化提供全新的思路和方法。
附图说明
85.图1为本发明荧光试剂盒检测原理示意图。
86.图2为113基因的差异基因分析图。
87.图3为methylcrotonoyl-coa carboxylase基因的差异基因分析图。
88.图4为abc transporter permease基因的差异基因分析图。
89.图5为mfs transportor基因的差异基因分析图。
90.图6为ribd基因的差异基因分析图。
91.图7为本发明实施例3的检测结果照片。
92.图中：左图为针对五个差异基因对野毒株进行荧光检测，红色荧光检测阳性结果及阴性对照结果、右图为针对五个差异基因对疫苗株进行荧光检测，绿色荧光检测阳性结
果及阴性对照结果。
93.图8为疫苗株荧光检测绿色荧光结果照片。
94.图9为疫苗株酶标仪荧光检测随时间变化的曲线图，检测灵敏度(布鲁氏杆菌基因组核酸浓度梯度稀释)能达到18am。
95.图10为野毒株荧光检测红色荧光结果照片。
96.图11为野毒株酶标仪荧光检测随时间变化的曲线图，检测灵敏度(布鲁氏杆菌基因组核酸浓度梯度稀释)能达到18am。
具体实施方式
97.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
98.以下实施例中crispr-cas13蛋白，(北京科昕生物)公司有售。
99.twistamprbasic试剂盒，twistdx公司有售。
100.实施例1用于检测布鲁氏杆菌的crrna和dna的设计及获得
101.登录ncbi，从genbank中下载基因序列包括：牛种疫苗株a19、野毒株代表株(a13334、2308、9-941、104m、bd、bab8416、clpp、mc、bj1毒株)及国外常用疫苗毒株(s19、rb51)等菌株进行基因组生物信息学分析和差异性分析比对，分析结果如图2～6所示。
102.由图2～6可知，牛种疫苗株a19、野毒株代表株和国外常用疫苗毒株之间基因序列存在差异。本发明发现了5个检测基因分别为113基因、methylcrotonoyl-coa carboxylase基因、abc transporter permease基因、mfs transportor基因和ribd基因、。
103.其中，所述113基因区域，牛种疫苗株a19和野毒株具体的差异部分是2个碱基插入，具体分别是为dna-wt-1和dna-vac-1，其序列分别如seq id no.21和seq id no.22所示，其中疫苗株dna-vac-1含有碱基ctttt，而野毒株dna-wt-1对应的碱基为c
‑‑
tt。然后根据dna-wt-1和dna-vac-1的基因序列，设计得到crrna-wt-1和crrna-vac-1，其序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示，本发明设计的crrna-wt-1和crrna-vac-1中含有部分spacer片段，该部分片段能够特异性的匹配到疫苗株ctttt区域和野毒株的共差异c
‑‑
tt区域。从而激活对应的cas蛋白核酸酶活性，对各自检测体系中的报告基团进行切割。
104.所述methylcrotonoyl-coa carboxylase基因区域，牛种疫苗株a19和野毒株具体的差异部分是7个碱基缺失，具体分别是为dna-wt-2和dna-vac-2，其序列分别如seq id no.23和seq id no.24所示，其中疫苗株dna-vac-2含有碱基g
‑‑‑‑‑‑‑
a，而野毒株dna-wt-2对应的碱基为gagatttca。然后根据dna-wt-2和dna-vac-2的基因序列，设计得到crrna-wt-2和crrna-vac-2，其序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示，本发明设计的crrna-wt-2和crrna-vac-2中含有部分spacer片段，该部分片段能够特异性的匹配到疫苗株g
‑‑‑‑‑‑‑
a区域和野毒株的共差异gagatttca区域。从而激活对应的cas蛋白核酸酶活性，对各自检测体系中的报告基团进行切割。
105.所述abc transporter permease基因区域，牛种疫苗株a19和野毒株具体的差异部分是68个碱基缺失，具体分别是为dna-wt-3和dna-vac-3，其序列分别如seq id no.25和
seq id no.26所示，其中疫苗株dna-wt-3含有碱基gccggtgtggtcgcgggcttcctgatgcagggcgtgaccttgcaggaattcggcatcatcctttatttcc，而野毒株dna-vac-3对应的碱基为g
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
c。然后根据dna-wt-3和dna-vac-3的基因序列，设计得到crrna-wt-3和crrna-vac-3，其序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示，本发明设计的crrna-wt-3和crrna-vac-3中含有部分spacer片段，该部分片段能够特异性的匹配到疫苗株g
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
c区域和野毒株的共差异gccggtgtggtcgcgggcttcctgatgcagggcgtgaccttgcaggaattcggcatca tcctttatttcc区域。从而激活对应的cas蛋白核酸酶活性，对各自检测体系中的报告基团进行切割。
106.所述mfs transportor基因区域，牛种疫苗株a19和野毒株具体的差异部分是2个碱基插入，具体分别是为dna-wt-4和dna-vac-4，其序列分别如seq id no.27和seq id no.28所示，其中疫苗株dna-vac-4含有碱基ccgc，而野毒株dna-wt-4对应的碱基为c
‑‑‑
c。然后根据dna-wt-4和dna-vac-4的基因序列，设计得到crrna-wt-4和crrna-vac-4，其序列分别如seq id no.7和seq id no.8所示，本发明设计的crrna-wt-4和crrna-vac-4中含有部分spacer片段，该部分片段能够特异性的匹配到疫苗株ccgc区域和野毒株的共差异c
‑‑‑
c区域。从而激活对应的cas蛋白核酸酶活性，对各自检测体系中的报告基团进行切割。
107.ribd基因区域，牛种疫苗株a19和野毒株具体的差异部分是2个碱基插入，具体分别是为dna-wt-5和dna-vac-5，其序列分别如seq id no.29和seq id no.30所示，其中疫苗株dna-vac-5含有碱基taaaaa，而野毒株dna-wt-5对应的碱基为t
‑‑
caa。然后根据dna-wt-5和dna-vac-5的基因序列，设计得到crrna-wt-5和crrna-vac-4，其序列分别如seq id no.9和seq id no.10所示，本发明设计的crrna-wt-5和crrna-vac-5中含有部分spacer片段，该部分片段能够特异性的匹配到疫苗株taaaaa区域和野毒株的共差异t
‑‑
caa区域。从而激活对应的cas蛋白核酸酶活性，对各自检测体系中的报告基团进行切割。
108.获得crrna-wt和crrna-vac的具体操作方法如下：以crdna-wt和crdna-vac为模板，分别进行退火反应形成双链dna，然后进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化dna片段，在t7 rna聚合酶作用下转录生成rna，回收纯化得到crrna(wt)和crrna(vac)，将纯化的crrna-wt和crrna-vac分装冻存至-80℃。
109.其中，crdna-wt-1序列如seq id no.11所示；crdna-vac-1：其序列如seq id no.12所示；crdna-wt-2：其序列如seq id no.13所示；crdna-vac-2：其序列如seq id no.14所示；crdna-wt-3：其序列如seq id no.15所示；crdna-vac-3：其序列如seq id no.16所示；crdna-wt-4：其序列如seq id no.17所示；crdna-vac-4：其序列如seq id no.18所示；crdna-wt-5：其序列如seq id no.19所示；crdna-vac-5：其序列如seq id no.20所示。
110.退火体系：把待退火的dna oligo(合成的引物)用经灭菌的无酶水或重蒸水配制成50μm。
111.溶解annealing buffer for dna oligos(5x)，混匀备用。
[0112][0113]
按照上述顺序依次加入各种试剂，混匀。
[0114]
t7 primer的序列如下：
[0115]5’‑
gaaattaatacgactcactataggg-3’。
[0116]
如下设置pcr仪进行退火反应：
[0117][0118]
转录体系为：模板dna 1μg，t7 rna聚合酶混合物2μl，ntp buffer mix 10μl，无酶水补足，总体积30μl。
[0119]
转录条件为：37℃，16h。
[0120]
实施例2用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒
[0121]
本实施例试剂盒包括twistamprbasic试剂盒、用于检测布鲁氏杆菌的5个crrna-wt和crrna-vac(seq id no.1-10)或者5个crdna-wt和crdna-vac(seq id no.11-20)、荧光探针、crispr-cas13蛋白、rpa扩增引物、tris-hcl(400mm)、mgcl2(120mm)、ssrna荧光探针(2μm)、rnase inhibitor、t7 polymerase 0.5μl、rntp 0.8μl。
[0122]
其中，所述vac荧光探针序列为5
’‑
fam-uuuuu-3’bhq1；wt荧光探针序列为5
’‑
rox-uuuuu-3’bhq2。
[0123]
实施例3采用实施例2所述试剂盒进行布鲁氏杆菌荧光检测的方法
[0124]
分别取有a19疫苗株、无野毒株基因组的牛血样本20μl，有a19疫苗株、无野毒株基因组的牛血样本20μl，无a19疫苗株、有野毒株基因组的牛血样本20μl作为待测样本，然后以20μl无酶水作为对照组，进行布鲁氏杆菌荧光检测。
[0125]
具体方法，包括步骤如下：
[0126]
(1)将待检测样本经80℃、10分钟预灭活处理，然后加入20μl的np-40裂解液，震荡15s至混匀，置于95-99℃的恒温仪加热10min，得到待测样本的基因组；
[0127]
(2)以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和rpa的反应体系中，进行目的基因的核酸扩增；
[0128]
rpa扩增反应体系：rpa基础反应球一管，再水合缓冲液29.5μl，醋酸镁缓冲液2.5μl，正向引物2.5μl，反向引物2.5μl，其余用无酶水8μl补足，总体积45μl，然后进行5等份分配，每9μl一份，每份加待测样本1μl，可同时扩增五个样本的rpa反应，每个反应体积10μl。
[0129]
扩增条件为：反应温度40℃，孵育时间15min。
[0130]
其中，所述rpa基础反应球、再水合缓冲液和醋酸镁缓冲液均来自于twistamprbasic试剂盒。
[0131]
所述rpa扩增引物选自如下引物对(五对引物任选其一)：
[0132]
crrna-wt-1和crrna-vac-1的正向引物：
[0133]
5'-gaaattaatacgactcactatagggttgccgcatcttcttgcgtacggcttcattt-3'；
[0134]
crrna-wt-1和crrna-vac-1的反向引物：
[0135]
5'-gacatatacacggcatttgataggggacata-3'；对应113基因区域。
[0136]
crrna-wt-2和crrna-vac-2的正向引物：
[0137]
5'-gaaattaatacgactcactatagggcgtcgattgccgccagcatggccttgcggtt-3'；
[0138]
crrna-wt-2和crrna-vac-2的反向引物：
[0139]
5'-cacgtcggaaatccggcgtatgctgatcgga-3'；对应methylcrotonoyl-coa carboxylase基因区域。
[0140]
crrna-wt-3和crrna-vac-3的正向引物：
[0141]
5'-gaaattaatacgactcactataggggctcgtcatcctcaatggcggcatcgacctt-3'；
[0142]
crrna-wt-3和crrna-vac-3的反向引物：
[0143]
5'-cagataagcgatcaacacaccattgaccgcg-3'；对应abc transporter permease基因区域。
[0144]
crrna-wt-4和crrna-vac-4的正向引物：
[0145]
5'-gaaattaatacgactcactatagggaatgaaggctgcattggcggaggcaagttcg-3'；
[0146]
crrna-wt-4和crrna-vac-4的反向引物：
[0147]
5'-tcatcggcatgatggcgctgccctacctcat-3'；对应mfs transportor基因区域。
[0148]
crrna-wt-5和crrna-vac-5的正向引物：
[0149]
5'-gaaattaatacgactcactatagggatgagctgacggtttccgagaccggcgataa-3'；
[0150]
crrna-wt-5和crrna-vac-5的反向引物：
[0151]
5'-ttgtgacggcgcgcataacggatcgtcgctt-3'；对应ribd基因区域。
[0152]
rpa扩增条件：反应温度40℃，孵育时间10min；
[0153]
其中，rpa基础反应球、pbs缓冲液和醋酸镁缓冲液均来自于twistamprbasic试剂盒；rpa扩增为现有技术。
[0154]
(3)取rpa扩增产物分别建立wt检测体系和vac检测体系，在37℃下，孵育20min；
[0155]
所述wt检测体系和vac检测体系相同，具体为：tris-hcl(400mm)、mgcl2(120mm)、ssrna荧光探针(5μm)、crrna-vac(与rpa扩增所使用的基因区域相对应)1μl、rnase inhibitor 1μl、cas13a蛋白2μl、t7 polymerase 0.5μl、rntp 0.8μl，rpa扩增产物1μl，总体积20μl。
[0156]
(4)将20μl wt检测体系和20μl vac检测体系分别放入360～450纳米激发波长下的便携led照射灯下，根据荧光显色得到检测结果。
[0157]
根据图1原理可知，当检测液荧光显色为红色时，表明待测样本是野毒株；当检测液荧光显色为绿色时，表明待测样本是a19疫苗株；当不形成荧光显示时，表明待测样本不存在布鲁氏杆菌感染。
[0158]
因此，本实施例的检测结果如图7所示。由图7可知，无酶水的检测结果为不形成荧光显示(阴性组)，为对照组；无a19疫苗株、有野毒株基因组的牛血样本的检测液荧光显色为红色，是野毒株；有a19疫苗株、无野毒株基因组的牛血样本的检测液荧光显色为绿色，是
疫苗株；有a19疫苗株、有野毒株基因组的牛血样本的检测液荧光显色红色和绿色，为野毒株和疫苗株混合型感染。
[0159]
实施例4荧光试剂盒的灵敏度测试
[0160]
采用实施例3中的所述试剂盒进行布鲁氏杆菌荧光检测方法进行酶标仪荧光检测。
[0161]
以mfs transportor基因作为布鲁氏杆菌检测基因，进行样本基因组灵敏度检测。
[0162]
具体方法为：以疫苗株和野毒株为待测样本，按照实施例3所述方法提取待测样本的基因组，将提取后的基因组进行浓度梯度稀释，稀释梯度为：180fm、18fm、1.8fm、180am、18am、1.8am、180zm。采用实施例3中的所述试剂盒进行布鲁氏杆菌荧光检测方法建立疫苗株(vac)和野毒株(wt)检测体系，将20μl wt检测体系和20μl vac检测体系分别加入384孔全黑酶标板中(每个浓度梯度三个重复)，使用酶标仪(品牌thermo，型号lux)进行荧光检测，野毒株使用激发波长(excitation wavelength)：575nm、发射波长(emission wavelength)：602nm；疫苗株使用激发波长(excitation wavelength)：495nm、发射波长(emission wavelength)：521nm。结果如图8～11所示。
[0163]
由图8、9可知，疫苗株检测液荧光显色为绿色，检测灵敏度能达到18am；由图10～11可知，野毒株检测液荧光显色为红色，检测灵敏度能达到18am。说明本发明提供的检测方法与传统的检测方法相对比特异性强、检测限低、灵敏度高，检测灵敏度能达到18am，还具有价格便宜，操作简单、快速，且设备仪器方便携带的优点。