靶向活性基因编辑剂及使用方法与流程

chem,140(21),第6596-6603页)。


技术实现要素：

7.对具有靶向所需细胞或组织的能力的rna引导核酸内切酶(尤其是用于体内编辑)存在未满足的需求。本领域需要利用具有靶向所需细胞或组织的能力的rna引导核酸内切酶有效递送基因编辑疗法。此外，对提供体内靶向基因编辑的组合物和方法存在未满足的需求。
8.本文提供了能够体内和离体编辑特定细胞类型的靶向活性基因编辑(tage)剂。tage剂的模块化和可编程设计使得能够快速重新靶向和实现多功能性，从而能够灵活靶向各种细胞类型。此外，通过编辑靶细胞中的特定核酸序列(例如，基因和调控元件)，tage剂具有双重特异性，并且比基于dna的递送方法具有更少的脱靶效应(cameron等人,nature methods.14.6(2017):600；kim等人genome research.24.6(2014):1012-1019)。tage剂包含一个或多个胞外细胞膜结合部分(例如，抗原结合多肽、配体和/或细胞穿透肽)，其促进tage剂在靶细胞中的细胞结合(例如，细胞表面结合)、细胞内化和/或核内化。此外，一些胞外细胞膜结合部分(例如，细胞表面结合部分)，诸如配体和抗原结合多肽，不仅允许受体介导的tage进入，而且在某些情况下，还介导细胞的生物学(例如，通过改变胞内信号转导通路)。
9.因此，本文提供了涉及靶向活性基因编辑剂(即，tage剂，可选地称为靶向活性基因编辑剂(tage))的方法和组合物，所述靶向活性基因编辑剂包含与胞外细胞膜结合分子(例如，细胞表面分子)结合的胞外细胞膜结合部分以及识别核酸序列的定点修饰多肽，其中所述胞外细胞膜结合部分与所述定点修饰多肽稳定缔合，使得所述定点修饰多肽能够被内化到展示所述胞外细胞膜结合分子(例如，细胞表面分子)的细胞中。
10.此外，本文提供了涉及包含促进细胞内化和/或核内化的胞外细胞膜结合部分(例如，细胞穿透肽)以及识别核酸序列的定点修饰多肽的tage剂的方法和组合物，其中所述胞外细胞膜结合部分与所述定点修饰多肽稳定缔合，使得所述定点修饰多肽能够被内化到细胞中。
11.在某些实施方案中，所述胞外细胞膜结合部分是与胞外细胞膜结合分子特异性结合的抗原结合多肽、细胞穿透肽、配体、或其组合。
12.在一些实施方案中，所述tage剂包含至少两个胞外细胞膜结合部分。
13.在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是cpp和抗原结合多肽。在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是至少两种cpp和一种抗原结合多肽。在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是四种cpp和一种抗原结合多肽。在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是六种cpp和一种抗原结合多肽。
14.在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是cpp和配体。在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是至少两种cpp和一种配体。在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是四种cpp和一种配体。在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是六种cpp和一种配体。
15.在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是配体和抗原结合多肽。
16.在一些实施方案中，所述tage剂的至少两个胞外细胞膜结合部分是至少一种cpp、一种配体和一种抗原结合多肽。
17.在某些方面，本发明提供了与胞外细胞膜结合分子特异性结合的抗原结合多肽，以及识别核酸序列的定点修饰多肽，其中所述抗原结合多肽与所述定点修饰多肽稳定缔合，使得所述定点修饰多肽能够被内化到展示所述胞外细胞膜结合分子的细胞中。
18.在一些实施方案中，所述抗原结合多肽是抗体、抗体的抗原结合部分、或抗体模拟物。
19.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽包含核酸酶或切口酶。在某些实施方案中，所述核酸酶是dna核酸内切酶，诸如cas9或cas12。
20.在一些实施方案中，所述tage剂进一步包含与所述细胞的基因组的靶区域特异性杂交的引导rna，其中所述引导rna和所述定点修饰多肽形成核糖核蛋白。
21.在另一方面，本发明提供了一种靶向活性基因编辑(tage)剂，其包含与胞外细胞膜结合分子特异性结合的抗原结合多肽以及含有识别crispr序列的rna引导dna核酸内切酶的定点修饰多肽，其中所述抗原结合多肽和所述定点修饰多肽稳定缔合，使得所述定点修饰多肽能够被内化到展示所述胞外细胞膜结合分子的细胞中，并且其中所述抗原结合多肽是抗体、抗体的抗原结合部分、或抗体模拟物。
22.在一些实施方案中，所述tage剂包含与所述细胞的基因组的靶区域特异性杂交的引导rna，其中所述引导rna和所述定点修饰多肽形成核糖核蛋白。
23.在一些实施方案中，所述rna引导dna核酸内切酶是cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶是野生型cas9核酸酶(例如，化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)cas9，seq id no:55)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:55具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cas9核酸酶包含氨基酸取代c80a(例如，seq id no:1)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:1具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
24.在一些实施方案中，所述rna引导dna核酸内切酶是除cas9之外的核酸酶(例如，诸如章节iii中描述的一种)。在一些实施方案中，所述rna引导dna核酸内切酶是crispr v型核酸酶。在具体实施方案中，所述rna引导dna核酸内切酶是cas12核酸酶。在一些实施方案中，所述cas12核酸酶是野生型cas12a核酸酶(例如，氨基酸球菌属物种(acidaminococcus sp.)cas12a，seq id no:56)。在一些实施方案中，所述cas12核酸酶包含与seq id no:56具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。可用于本文的tage剂中的cas12a变体的示例包括但不限于cas12a(cpf1)ultra(例如，idt目录号10001272)或kleinstiver等人nature biotechnology 37.3(2019):276-282所述的cas12a，将其通过引用特此并入。
25.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含至少一个核定位信号(nls)。
26.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含与所述抗原结合多肽结合的缀合部分。在某些实施方案中，所述缀合部分是蛋白质。在某些实施方案中，所述蛋白质是蛋
白a、spycatcher或halo标签。
27.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽和所述抗原结合多肽通过接头缀合。在某些实施方案中，所述接头是可切割的。
28.在一些实施方案中，所述抗体模拟物是艾得奈可汀(adnectin)(即，基于纤连蛋白的结合分子)、affilin、affimer、affitin、α体(alphabody)、亲和体(affibody)、darpin、抗运载蛋白(anticalin)、高亲合性多聚体(avimer)、fynomer、kunitz结构域肽、单体(monobody)、nanoclamp、单抗体(unibody)、万能抗体(versabody)、适体、或肽分子。
29.在一些实施方案中，抗体的抗原结合部分是纳米抗体、结构域抗体、scfv、fab、双抗体、bite、双抗体、dart、微型抗体、f(ab')2、或胞内抗体(intrabody)。
30.在一些实施方案中，所述抗体是完整抗体或双特异性抗体。
31.在一些方面，本发明提供了一种靶向活性基因编辑(tage)剂，其包含与胞外细胞膜结合蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合部分以及含有cas9核酸酶的定点修饰多肽，其中所述抗体或其抗原结合部分与所述定点修饰多肽通过缀合部分稳定缔合，使得所述定点修饰多肽能够通过所述抗体或其抗原结合部分被内化到表达所述胞外细胞膜结合蛋白的细胞中。
32.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含至少一个核定位信号(nls)。在某些实施方案中，所述至少一个nls包括sv40 nls。在某些实施方案中，所述sv40 nls包含氨基酸序列pkkkrkv(seq id no:10)。在某些实施方案中，所述至少一个nls在所述定点修饰多肽的c-末端、n-末端、或两者处。在某些实施方案中，所述tage剂包含至少两个nls。
33.在某些实施方案中，所述tage剂进一步包含与表达所述胞外细胞膜结合蛋白的细胞的基因组的靶区域特异性杂交的引导rna，其中所述引导rna和所述定点修饰多肽形成核蛋白。
34.在某些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含能够与所述抗体或其抗原结合部分结合的缀合部分。在某些实施方案中，所述缀合部分是蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是蛋白a、spycatcher或halo标签。
35.在一些实施方案中，所述cas9核酸酶是野生型cas9核酸酶(例如，化脓性链球菌cas9，seq id no:55)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:55具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cas9核酸酶包含氨基酸取代c80a(例如，seq id no:1)。在某些实施方案中，cas9核酸酶具有与seq id no:1具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
36.在某些实施方案中，抗体的抗原结合部分是纳米抗体、结构域抗体、scfv、fab、双抗体、bite、双抗体、dart、微型抗体、f(ab')2、或胞内抗体。
37.在某些实施方案中，所述抗体是完整抗体或双特异性抗体。
38.在某些实施方案中，所述胞外细胞膜结合分子或蛋白质(例如，细胞表面蛋白)是hla-dr、cd44、cd11a、cd22、cd3、cd20、cd33、cd32、cd44、cd47、cd59、cd54、cd25、achr、cd70、cd74、ctla4、egfr、her2、epcam、ox40、pd-1、pd-l1、gitr、cd52、cd34、cd27、cd30、icos、或rsv。
39.在另一方面，本发明提供了一种定点修饰多肽，其包含识别crispr序列的rna引导
dna核酸内切酶以及结合与胞外细胞膜结合分子特异性结合的抗体、抗体的抗原结合部分、或抗体模拟物的缀合部分。
40.在某些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含与细胞的基因组的靶区域特异性杂交的引导rna。在某些实施方案中，所述rna引导dna核酸内切酶是cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶是野生型cas9核酸酶(例如，化脓性链球菌cas9，seq id no:55)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:55具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cas9核酸酶包含氨基酸取代c80a(例如，seq id no:1)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:1具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
41.在某些实施方案中，所述rna引导dna核酸内切酶是crispr v型核酸酶。在具体实施方案中，所述rna引导dna核酸内切酶是cas12核酸酶。在某些实施方案中，所述rna引导dna核酸内切酶是crispr v型核酸酶。在具体实施方案中，所述rna引导dna核酸内切酶是cas12核酸酶。在一些实施方案中，cas12核酸酶是野生型cas12a核酸酶(例如，氨基酸球菌属物种cas12a，seq id no:56)。在一些实施方案中，所述cas12核酸酶包含与seq id no:56具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。可用于本文的tage剂中的cas12a变体的示例包括但不限于cas12a(cpf1)ultra(例如，idt目录号10001272)或kleinstiver等人nature biotechnology 37.3(2019):276-282所述的cas12a，将其通过引用特此并入。
42.在某些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含至少一个核定位信号(nls)。在某些实施方案中，所述至少一个nls包括sv40 nls。在某些实施方案中，所述sv40 nls包含pkkkrkv(seq id no:10)。在某些实施方案中，所述定点修饰多肽包含至少两个nls。在某些实施方案中，所述至少一个nls在所述定点修饰多肽的c-末端、n-末端、或两者处。
43.在某些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含能够与所述抗体、其抗原结合部分或抗体模拟物结合的缀合部分。在某些实施方案中，所述缀合部分是蛋白质。在某些实施方案中，所述蛋白质是蛋白a、spycatcher或halo标签。
44.在某些实施方案中，胞外细胞膜结合分子是选自由以下组成的组的蛋白质(例如，细胞表面蛋白)：hla-dr、cd44、cd11a、cd22、cd3、cd20、cd33、cd32、cd44、cd47、cd59、cd54、cd25、achr、cd70、cd74、ctla4、egfr、her2、epcam、ox40、pd-1、pd-l1、gitr、cd52、cd34、cd27、cd30、icos、或rsv。
45.在另一方面，本发明提供了包含定点修饰多肽和引导rna的核蛋白，其中所述引导rna与展示所述胞外细胞膜结合蛋白的细胞的基因组的靶区域特异性杂交。
46.在另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码本文所述的定点修饰多肽。在一个实施方案中，载体包含所述核酸。在另一个实施方案中，细胞包含所述定点修饰多肽。
47.在另一方面，本发明提供了一种修饰靶细胞的基因组的方法，所述方法包括使所述靶细胞与本文所述的靶向活性基因编辑(tage)剂(例如，包含抗原结合多肽)接触。在某些实施方案中，所述靶细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述哺乳动物细胞是小鼠细胞、非人灵长类动物细胞或人细胞。在某些实施方案中，所述定点修饰多肽在所述基因组的靶区域处产生切割位点，从而修饰所述基因组。在某些实施方案中，所述基因组的靶区域是靶基因。
48.在某些实施方案中，包括使用本文所述的tage剂(例如，包含抗原结合多肽)的方法有效于修饰所述靶基因的表达。在某些实施方案中，所述方法有效于相对于参考水平，增加所述靶基因的表达。在某些实施方案中，所述方法有效于相对于参考水平，降低所述靶基因的表达。
49.本文提供了涉及靶向活性基因编辑剂(tage剂)的方法和组合物，其包含与胞外细胞膜结合分子(例如，细胞表面分子)特异性结合的配体和识别核酸序列的定点修饰多肽，其中所述配体与所述定点修饰多肽稳定缔合，使得所述定点修饰多肽能够被内化到所述配体靶向的细胞中。
50.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽包含核酸酶或切口酶。在某些实施方案中，所述核酸酶是dna核酸内切酶，诸如cas9。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶是野生型cas9核酸酶(例如，化脓性链球菌cas9，seq id no:55)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:55具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cas9核酸酶包含氨基酸取代c80a(例如，seq id no:1)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:1具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
51.在某些实施方案中，所述核酸酶是v型rna引导核酸内切酶，诸如cas12。在一些实施方案中，cas12核酸酶是野生型cas12a核酸酶(例如，氨基酸球菌属物种cas12a，seq id no:56)。在一些实施方案中，所述cas12核酸酶包含与seq id no:56具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。可用于本文的tage剂中的cas12a变体的示例包括但不限于cas12a(cpf1)ultra(例如，idt目录号10001272)或kleinstiver等人nature biotechnology 37.3(2019):276-282所述的cas12a。
52.在一些实施方案中，所述tage剂进一步包含与所述细胞的基因组的靶区域特异性杂交的引导rna，其中所述引导rna和所述定点修饰多肽形成核糖核蛋白。
53.在某些实施方案中，所述配体选自il2、csf-1、csf-2、csf-3、ccl2、ccl5、ccl7、ccl8、ccl13、ccl16、igf2、il7、il15、ifnγ、tcr/dc4或pd-l1，或任何前述配体的功能片段。在某些实施方案中，所述配体是il-2或其功能片段。在某些实施方案中，所述配体是ifnγ或其功能片段。在某些实施方案中，所述配体是csf-2或其功能片段。在一些实施方案中，所述配体是本文所述的配体的突变和/或重组形式。
54.在另一方面，本发明提供了一种靶向活性基因编辑(tage)剂，其包含与胞外细胞膜结合分子(例如，细胞表面分子)特异性结合的配体以及含有识别crispr序列的rna引导dna核酸内切酶的定点修饰多肽，其中所述配体与所述定点修饰多肽稳定缔合，使得所述定点修饰多肽能够通过所述配体被内化到靶细胞中。
55.在一些实施方案中，所述tage剂包含与所述细胞的基因组的靶区域特异性杂交的引导rna，其中所述引导rna和所述定点修饰多肽形成核糖核蛋白。
56.在一些实施方案中，所述rna引导dna核酸内切酶是cas9核酸酶。
57.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含至少一个核定位信号(nls)。
58.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含与所述配体结合的缀合部分。在某些实施方案中，所述缀合部分是蛋白质。在某些实施方案中，所述蛋白质是spycatcher或halo标签。
59.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽和所述配体通过接头缀合。在某些实施方案中，所述接头是可切割的。
60.在某些实施方案中，所述配体选自il2、csf-1、csf-2、csf-3、ccl2、ccl5、ccl7、ccl8、ccl13、ccl16、igf2、il7、il15、ifnγ、tcr/dc4或pd-l1，或任何前述配体的功能片段。在某些实施方案中，所述配体是il-2或其功能片段。在某些实施方案中，所述配体是ifnγ或其功能片段。在某些实施方案中，所述配体是csf-2或其功能片段。在一些实施方案中，所述配体是本文所述的配体的突变和/或重组形式。
61.在一些方面，本发明提供了一种靶向活性基因编辑(tage)剂，其包含与胞外细胞膜结合分子(例如，细胞表面分子)特异性结合的配体以及含有cas9核酸酶的定点修饰多肽，其中所述配体与所述定点修饰多肽通过缀合部分稳定缔合，使得所述定点修饰多肽能够被内化到所述配体靶向的细胞中。
62.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含至少一个核定位信号(nls)。在某些实施方案中，所述至少一个nls包括sv40 nls。在某些实施方案中，所述sv40 nls包含氨基酸序列pkkkrkv(seq id no:10)。在某些实施方案中，所述至少一个nls在所述定点修饰多肽的c-末端、n-末端、或两者处。在某些实施方案中，所述tage剂包含至少两个nls。
63.在某些实施方案中，所述tage剂进一步包含与表达所述胞外细胞膜结合蛋白的细胞的基因组的靶区域特异性杂交的引导rna，其中所述引导rna和所述定点修饰多肽形成核蛋白。
64.在某些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含可与所述配体结合的缀合部分。在某些实施方案中，所述缀合部分是蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是spycatcher或halo标签。
65.在一些实施方案中，所述cas9核酸酶是野生型cas9核酸酶(例如，化脓性链球菌cas9，seq id no:55)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:55具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
66.在某些实施方案中，所述cas9核酸酶包含氨基酸取代c80a(例如，seq id no:1)。在某些实施方案中，所述cas9核酸酶具有与seq id no:1或2所阐述的cas9至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
67.在某些实施方案中，所述配体选自il2、csf-1、csf-2、csf-3、ccl2、ccl5、ccl7、ccl8、ccl13、ccl16、igf2、il7、il15、ifnγ、tcr/dc4或pd-l1，或任一种前述配体的功能片段。在某些实施方案中，所述配体是il-2或其功能片段。在某些实施方案中，所述配体是ifnγ。在某些实施方案中，所述配体是csf-2或其功能片段。在一些实施方案中，所述配体是本文所述的配体的突变和/或重组形式。
68.在另一方面，本发明提供了一种定点修饰多肽，其包含识别crispr序列的rna引导dna核酸内切酶和与配体结合的缀合部分，所述配体促进与该配体缀合的多肽的摄取。
69.在某些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含与细胞的基因组的靶区域特异性杂交的引导rna。在某些实施方案中，所述rna引导dna核酸内切酶是cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶是野生型cas9核酸酶(例如，化脓性链球菌cas9，seq id no:55)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:55具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cas9核酸酶包含氨
基酸取代c80a(例如，seq id no:1)。在另一个中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:1或2所阐述的cas9具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
70.在某些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含至少一个核定位信号(nls)。在某些实施方案中，所述至少一个nls包括sv40 nls。在某些实施方案中，所述sv40 nls包含pkkkrkv(seq id no:10)。在某些实施方案中，所述定点修饰多肽包含至少两个nls。在某些实施方案中，所述至少一个nls在所述定点修饰多肽的c-末端、n-末端、或两者处。
71.在某些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含可与所述配体结合的缀合部分。在某些实施方案中，所述缀合部分是蛋白质。在某些实施方案中，所述蛋白质是spycatcher或halo标签。
72.在某些实施方案中，所述配体选自il2、csf-1、csf-2、csf-3、ccl2、ccl5、ccl7、ccl8、ccl13、ccl16、igf2、il7、il15、ifnγ、tcr/dc4或pd-l1，或任一种前述配体的功能片段。在某些实施方案中，所述配体是il-2或其功能片段。在某些实施方案中，所述配体是ifnγ或其功能片段。在某些实施方案中，所述配体是csf-2或其功能片段。在一些实施方案中，所述配体是本文所述的配体的突变和/或重组形式。
73.在另一方面，本发明提供了包含定点修饰多肽和引导rna的核蛋白，其中所述引导rna与展示所述胞外细胞膜结合蛋白的细胞的基因组的靶区域特异性杂交。
74.在另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码本文所述的定点修饰多肽。在一个实施方案中，载体包含所述核酸。在另一个实施方案中，细胞包含所述定点修饰多肽。
75.在另一方面，本发明提供了一种修饰靶细胞的基因组的方法，所述方法包括使所述靶细胞与本文所述的靶向活性基因编辑(tage)剂(例如，包含配体)接触。在某些实施方案中，所述靶细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述哺乳动物细胞是小鼠细胞、非人灵长类动物细胞或人细胞。在某些实施方案中，所述定点修饰多肽在所述基因组的靶区域处产生切割位点，从而修饰所述基因组。在某些实施方案中，所述基因组的靶区域是靶基因。
76.在某些实施方案中，包括使用本文所述的tage剂(例如，包含配体)的方法有效于修饰所述靶基因的表达。在某些实施方案中，所述方法有效于相对于参考水平，增加所述靶基因的表达。在某些实施方案中，所述方法有效于相对于参考水平，降低所述靶基因的表达。
77.本文提供了涉及靶向活性基因编辑剂(tage剂)的方法和组合物，所述靶向活性基因编辑剂包含促进将多肽摄取到细胞中的细胞穿透肽(cpp)和识别核酸序列的定点修饰多肽，其中所述cpp与所述定点修饰多肽稳定缔合，使得所述定点修饰多肽能够被内化到所述cpp靶向的细胞中。
78.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽包含核酸酶或切口酶。在某些实施方案中，所述核酸酶是dna核酸内切酶，诸如cas9。
79.在一些实施方案中，所述tage剂进一步包含与所述细胞的基因组的靶区域特异性杂交的引导rna，其中所述引导rna和所述定点修饰多肽形成核糖核蛋白。
80.在另一方面，本发明提供了一种靶向活性基因编辑(tage)剂，其包含促进将多肽摄取到细胞中的cpp以及含有识别crispr序列的rna引导dna核酸内切酶的定点修饰多肽，其中所述cpp与所述定点修饰多肽稳定缔合，使得所述定点修饰多肽能够通过所述cpp被内
化到靶细胞中。
81.在一些实施方案中，所述tage剂包含与所述细胞的基因组的靶区域特异性杂交的引导rna，其中所述引导rna和所述定点修饰多肽形成核糖核蛋白。
82.在一些实施方案中，所述rna引导dna核酸内切酶是cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶是野生型cas9核酸酶(例如，化脓性链球菌cas9，seq id no:55)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:55具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cas9核酸酶包含氨基酸取代c80a(例如，seq id no:1)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:1具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
83.在某些实施方案中，所述核酸酶是v型rna引导核酸内切酶，诸如cas12。在一些实施方案中，cas12核酸酶是野生型cas12a核酸酶(例如，氨基酸球菌属物种cas12a，seq id no:56)。在一些实施方案中，所述cas12核酸酶包含与seq id no:56具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。可用于本文的tage剂中的cas12a变体的示例包括但不限于cas12a(cpf1)ultra(例如，idt目录号10001272)或kleinstiver等人nature biotechnology 37.3(2019):276-282所述的cas12a。
84.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含至少一个核定位信号(nls)。
85.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含与所述cpp结合的缀合部分。在某些实施方案中，所述缀合部分是蛋白质。在某些实施方案中，所述蛋白质是spycatcher或halo标签。
86.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽和所述cpp通过接头缀合。在某些实施方案中，所述接头是可切割的。
87.在一些实施方案中，所述cpp是nls、tat、tat-ha、s19-tat、cm18、hph1、l17e、imt-p8、tdp、tdp-kdel(seq id no:17)、穿膜肽(penetratin)、polyr、或aurein。
88.在一些方面，本发明提供了一种靶向活性基因编辑(tage)剂，其包含促进将多肽摄取到细胞中的细胞穿透肽(cpp)以及含有cas9核酸酶的定点修饰多肽，其中所述cpp与所述定点修饰多肽通过缀合部分稳定缔合，使得所述定点修饰多肽能够被内化到所述cpp靶向的细胞中。
89.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含至少一个核定位信号(nls)。在某些实施方案中，所述至少一个nls包括sv40 nls。在某些实施方案中，所述sv40 nls包含氨基酸序列pkkkrkv(seq id no:10)。在某些实施方案中，所述至少一个nls在所述定点修饰多肽的c-末端、n-末端、或两者处。在某些实施方案中，所述tage剂包含至少两个nls。
90.在某些实施方案中，所述tage剂进一步包含与所述cpp靶向的细胞的基因组的靶区域特异性杂交的引导rna，其中所述引导rna和所述定点修饰多肽形成核蛋白。
91.在某些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含可与所述cpp结合的缀合部分。在某些实施方案中，所述缀合部分是蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是spycatcher或halo标签。
92.在一些实施方案中，所述cas9核酸酶是野生型cas9核酸酶(例如，化脓性链球菌cas9，seq id no:55)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:55具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
93.在某些实施方案中，所述cas9核酸酶包含氨基酸取代c80a(例如，seq id no:1)。在某些实施方案中，所述cas9核酸酶具有与序列表中所述的cas9至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
94.在一些实施方案中，所述cpp是nls、tat、tat-ha、s19-tat、cm18、hph1、l17e、imt-p8、tdp、tdp-kdel(seq id no:17)、穿膜肽、polyr、或aurein。
95.在另一方面，本发明提供了一种定点修饰多肽，其包含识别crispr序列的rna引导dna核酸内切酶和与促进多肽的摄取的cpp结合的缀合部分。
96.在某些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含与细胞的基因组的靶区域特异性杂交的引导rna。在某些实施方案中，所述rna引导dna核酸内切酶是cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶是野生型cas9核酸酶(例如，化脓性链球菌cas9，seq id no:55)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:55具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cas9核酸酶包含氨基酸取代c80a(例如，seq id no:1)。在另一个中，所述cas9核酸酶包含与序列表中所述的cas9具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
97.在某些实施方案中，所述rna引导dna核酸内切酶是v型核酸酶，诸如cas12核酸酶。在一些实施方案中，cas12核酸酶是野生型cas12a核酸酶(例如，氨基酸球菌属物种cas12a，seq id no:56)。在一些实施方案中，所述cas12核酸酶包含与seq id no:56具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
98.在一个实施方案中，所述cpp是tat相关cpp。
99.在某些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含至少一个核定位信号(nls)。在某些实施方案中，所述至少一个nls包括sv40nls。在某些实施方案中，所述sv40 nls包含pkkkrkv(seq id no:10)。在某些实施方案中，所述定点修饰多肽包含至少两个nls。
100.在某些实施方案中，所述至少一个nls在所述定点修饰多肽的c-末端、n-末端、或两者处。
101.在某些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含可与所述cpp结合的缀合部分。在某些实施方案中，所述缀合部分是蛋白质。在某些实施方案中，所述蛋白质是spycatcher或halo标签。
102.在一些实施方案中，所述cpp是nls、tat、tat-ha、s19-tat、cm18、hph1、l17e、imt-p8、tdp、tdp-kdel(seq id no:17)、穿膜肽、polyr、或aurein。
103.在另一方面，本发明提供了包含定点修饰多肽和引导rna的核蛋白，其中所述引导rna与所述cpp靶向的细胞的基因组的靶区域特异性杂交。
104.在另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码本文所述的定点修饰多肽。在一个实施方案中，载体包含所述核酸。在另一个实施方案中，细胞包含所述定点修饰多肽。
105.在另一方面，本发明提供了一种修饰靶细胞的基因组的方法，所述方法包括使所述靶细胞与本文所述的靶向活性基因编辑(tage)剂(例如，包含cpp)接触。在某些实施方案中，所述靶细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述哺乳动物细胞是小鼠细胞、非人灵长类动物细胞或人细胞。在某些实施方案中，所述定点修饰多肽在所述基因组的靶区域处产生切割位点，从而修饰所述基因组。在某些实施方案中，所述基因组的靶区域是靶基因。
106.在某些实施方案中，包括使用本文所述的tage剂(例如，包含cpp)的方法有效于修饰所述靶基因的表达。在某些实施方案中，所述方法有效于相对于参考水平，增加所述靶基因的表达。在某些实施方案中，所述方法有效于相对于参考水平，降低所述靶基因的表达。
107.在另一方面，本文提供了一种修饰哺乳动物受试者中的靶细胞(例如，靶哺乳动物细胞)内的核酸序列的方法，所述方法包括使所述受试者中的所述靶细胞与包含胞外细胞膜结合部分和识别所述靶细胞内的所述核酸序列的定点修饰多肽的靶向活性基因编辑(tage)剂接触，使得所述靶细胞的所述核酸序列被修饰。
108.在另一方面，本文提供了一种修饰哺乳动物受试者中的靶细胞(例如，靶哺乳动物细胞)内的核酸序列的方法，所述方法包括向所述受试者局部施用包含胞外细胞膜结合部分和识别所述靶细胞内的所述核酸序列的定点修饰多肽的靶向活性基因编辑(tage)剂，使得所述靶细胞的所述核酸序列被修饰。
109.在一些实施方案中，所述方法包括通过肌肉内注射、骨内注射、眼内注射、瘤内注射或真皮内注射，向所述受试者局部施用所述tage剂。
110.在一些实施方案中，所述方法有效于将受试者中的经基因修饰的靶细胞的水平(数量)增加到治疗水平。在某些情况下，相对于用缺乏胞外细胞膜结合部分的定点修饰多肽处理所实现水平的细胞数量增加可以通过测定接受所述tage剂的测定中的细胞数量来确定。
111.在一些实施方案中，所述哺乳动物受试者是人类受试者。
112.在一些实施方案中，所述受试者患有选自眼病、干细胞病症和癌症的疾病，并且其中所述方法有效于治疗所述疾病。
113.在另一方面，本文提供了一种修饰靶哺乳动物细胞内的核酸序列的方法，所述方法包括在靶向活性基因编辑(tage)剂被内化到所述靶细胞中的条件下，使所述靶哺乳动物细胞与所述tage剂接触，使得所述核酸序列被修饰，其中所述tage剂包含胞外细胞膜结合部分和识别所述靶细胞内的所述核酸序列的定点修饰多肽，其中所述tage剂的内化不依赖于电穿孔。
114.在一些实施方案中，所述靶哺乳动物细胞是造血细胞(hsc)、中性粒细胞、t细胞、b细胞、树突细胞、巨噬细胞或成纤维细胞。
115.在一些实施方案中，所述靶哺乳动物细胞是造血干细胞(hsc)。在某些实施方案中，所述靶哺乳动物细胞是骨髓中不为造血干细胞的细胞(例如，成纤维细胞、巨噬细胞、成骨细胞、破骨细胞(ostclast)或内皮细胞)。
116.在一些实施方案中，所述胞外细胞膜结合部分特异性结合人hsc上的胞外细胞膜结合分子(例如，细胞表面蛋白)。在某些实施方案中，所述hsc上的所述胞外细胞膜结合分子(例如，细胞表面蛋白)是cd34、emcn、cd59、cd90、ckit、cd45或cd49f。
117.在一些实施方案中，通过离体共孵育，使所述靶哺乳动物细胞与所述tage接触。
118.在一些实施方案中，所述方法提供了向有需要的受试者施用的经基因修饰的靶细胞。
119.在一些实施方案中，通过注射到受试者的组织中，使所述靶哺乳动物细胞与所述tage原位接触。
120.在一些实施方案中，通过肌肉内注射、骨内注射、眼内注射、瘤内注射或真皮内注
射，向所述受试者施用所述tage剂。
121.在一些实施方案中，所述核酸是所述细胞的基因组中的基因，其中所述基因的表达在所述修饰后被改变。
122.在一些实施方案中，所述靶哺乳动物细胞是小鼠细胞、非人灵长类细胞或人细胞。
123.在一些实施方案中，所述tage剂的所述胞外细胞膜结合部分是细胞穿透肽、配体、与胞外细胞膜结合分子(例如，细胞表面蛋白)结合的抗原结合多肽、或其组合。
124.在一些实施方案中，所述tage剂的所述胞外细胞膜结合部分包含一种或多种细胞穿透肽(cpp)。在一些实施方案中，所述一种或多种cpp是nls、tat、tat-nls、his-tat-nls(htn)、tat-ha、s19-tat、cm18、cm18-tat、hph1、l17e、imt-p8、imt-p8(c14s)、tdp、tdp-kdel(seq id no:17)、穿膜肽、polyr、aurein、lah4-l1、lmwp、pardaxin、s10、s18、s19、s85、vectofusin1、zf5.3或其组合。在一些实施方案中，所述一种或多种cpp包括tat肽。在一些实施方案中，所述一种或多种cpp包括his-tat-nls(htn)肽。在一些实施方案中，所述tage剂的所述胞外细胞膜结合部分包含与胞外细胞膜结合分子(例如，细胞表面蛋白)特异性结合的抗原结合多肽。
125.在一些实施方案中，所述抗原结合多肽是抗体、抗体的抗原结合部分、或抗体模拟物。在一些实施方案中，所述抗体模拟物是艾得奈可汀(即，基于纤连蛋白的结合分子)、affilin、affimer、affitin、α体、亲和体、darpin、抗运载蛋白、高亲合性多聚体、fynomer、kunitz结构域肽、单体、nanoclamp、单抗体、万能抗体、适体、或肽分子。在一些实施方案中，抗体的抗原结合部分是纳米抗体、结构域抗体、scfv、fab、双抗体、bite、双抗体、dart、微型抗体、f(ab')2、或胞内抗体。在一些实施方案中，所述抗体是完整抗体或双特异性抗体。
126.在一些实施方案中，由所述抗原结合多肽结合的所述胞外细胞膜结合分子(例如，细胞表面蛋白)是hla-dr、cd44、cd11a、cd22、cd3、cd20、cd33、cd32、cd44、cd47、cd59、cd54、cd25、achr、cd70、cd74、ctla4、egfr、her2、epcam、ox40、pd-1、pd-l1、gitr、cd52、cd34、cd27、cd30、icos、或rsv。
127.在一些实施方案中，所述tage剂的所述胞外细胞膜结合部分包含与胞外细胞膜结合分子(例如，细胞表面分子)结合的配体。在一些实施方案中，所述配体是il-2、csf-2、csf-1、ccl2、ccl5、ccl7、ccl8、ccl13、ccl16、igf2、il7、il15、ifnγ、tcr/dc4或pd-l1，或任一种前述配体的功能片段。在某些实施方案中，所述配体是il-2或其功能片段。在某些实施方案中，所述配体是ifnγ或其功能片段。在某些实施方案中，所述配体是csf-2或其功能片段。在一些实施方案中，所述配体是本文所述的配体或其功能片段的突变和/或重组形式。
128.在一些实施方案中，所述tage剂的所述胞外细胞膜结合部分进一步包含至少一个核定位信号(nls)。在一些实施方案中，所述tage剂的胞外细胞膜结合部分包含至少两个核定位信号(nls)。在一些实施方案中，所述tage剂的胞外细胞膜结合部分包含四个核定位信号(nls)。在一些实施方案中，所述tage剂的胞外细胞膜结合部分包含六个核定位信号(nls)。在一些实施方案中，所述tage剂的胞外细胞膜结合部分包含七个核定位信号(nls)。在一些实施方案中，所述tage剂的胞外细胞膜结合部分包含八个核定位信号(nls)。在一些实施方案中，所述tage剂的胞外细胞膜结合部分包含多于八个(例如，9、10、11、12、13个或更多个)nls。在一些实施方案中，所述nls包括sv40 nls。在某些实施方案中，所述sv40 nls包含氨基酸序列pkkkrkv(seq id no:10)。
129.在一些实施方案中，所述tage剂包含至少两个胞外细胞膜结合部分。
130.在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是cpp和抗原结合多肽。在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是至少两种cpp和一种抗原结合多肽。在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是四种cpp和一种抗原结合多肽。在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是六种cpp和一种抗原结合多肽。
131.在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是cpp和配体。在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是至少两种cpp和一种配体。在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是四种cpp和一种配体。在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是六种cpp和一种配体。
132.在一些实施方案中，所述tage剂的所述至少两个胞外细胞膜结合部分是配体和抗原结合多肽。
133.在一些实施方案中，所述tage剂的至少两个胞外细胞膜结合部分是至少一种cpp、一种配体和一种抗原结合多肽。
134.在一些实施方案中，所述靶哺乳动物细胞是靶哺乳动物细胞的群体。在某些实施方案中，所述方法有效于增加所述群体中经基因修饰的靶哺乳动物细胞的水平(数量)。在某些实施方案中，所述增加由所述哺乳动物细胞中的反应(例如，表型反应)来证明。在某些实施方案中，被所述tage剂修饰的哺乳动物细胞的数量的增加可以通过比较哺乳动物细胞群体中的水平与用缺乏胞外细胞膜结合部分的定点修饰多肽处理所实现的水平来确定。
135.在一些实施方案中，所述tage剂的所述定点修饰多肽在所述靶哺乳动物细胞中具有增加的细胞内化。在某些实施方案中，内化的增加由所述哺乳动物细胞中的反应(例如，表型反应)来证明。在某些实施方案中，哺乳动物细胞中tage剂内化的增加可以通过比较哺乳动物细胞群体中所述tage剂的内化与用缺乏胞外细胞膜结合部分的定点修饰多肽实现的细胞内化来确定。
136.在一些实施方案中，相对于用缺乏胞外细胞膜结合部分的定点修饰多肽实现的细胞结合，所述tage的所述定点修饰多肽在所述靶哺乳动物细胞中具有增加的细胞结合。
137.在一些实施方案中，相对于用缺乏胞外细胞膜结合部分的定点修饰多肽实现的核内化，所述tage的所述定点修饰多肽在所述靶哺乳动物细胞中具有增加的核内化。
138.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽包含核酸酶或切口酶。在一些实施方案中，所述定点修饰多肽是核酸引导核酸酶，并且所述tage剂进一步包含与所述靶哺乳动物细胞的核酸序列的靶区域特异性杂交的引导核酸，其中所述引导核酸和所述核酸引导核酸酶形成核蛋白。
139.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽是rna引导核酸酶，并且所述tage剂进一步包含与所述靶哺乳动物细胞的核酸序列的靶区域特异性杂交的引导rna，其中所述引导rna和所述rna引导核酸酶形成核糖核蛋白。在一些实施方案中，所述引导rna是单引导rna(sgrna)或cr:trrna。
140.在一些实施方案中，所述rna引导核酸酶是2类cas多肽。在一些实施方案中，所述2类cas多肽是ii型cas多肽。在某些实施方案中，所述ii型cas多肽是cas9。在一些实施方案
中，所述cas9核酸酶是野生型cas9核酸酶(例如，化脓性链球菌cas9，seq id no:55)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:55具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cas9核酸酶包含氨基酸取代c80a(例如，seq id no:1)。在一些实施方案中，所述cas9核酸酶包含与seq id no:1具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
141.在一些实施方案中，所述2类cas多肽是v型cas多肽。在一些实施方案中，所述v型cas多肽是cas12。在一些实施方案中，cas12核酸酶是野生型cas12a核酸酶(例如，氨基酸球菌属物种cas12a，seq id no:56)。在一些实施方案中，所述cas12核酸酶包含与seq id no:56具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
142.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽进一步包含与所述胞外细胞膜结合部分结合的缀合部分或与其附接的互补结合部分。在一些实施方案中，所述缀合部分是蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是spycatcher或halo标签。在某些实施方案中，所述蛋白质是spycatcher。
143.在一些实施方案中，所述定点修饰多肽和所述胞外细胞膜结合部分通过接头缀合。在某些实施方案中，所述接头是可切割的接头。
144.在一些实施方案中，所述tage剂进一步包含内体逃逸剂。在某些实施方案中，所述内体逃逸剂是tdp或tdp-kdel。
附图说明
145.图1是本文所述的核酸酶抗体结合剂与抗体、抗原结合剂或抗体样分子复合以形成靶向活性基因编辑(tage)剂的示意图。在图1中，术语“核酸酶抗体结合剂”是指包括核酸酶的定点修饰多肽。
146.图2以图形方式描绘了评估单独的cas9-2xnls-蛋白a(“cas9-pa”)或与抗cd3抗体复合的cas9-2xnls-蛋白a(“cas9-pa:α-cd3”)、或cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)的体外dna切割测定的结果，活性是相对于cas9(c80a)-2xnls活性绘制的。
147.图3以图形方式描绘了评估cas9-2xnls-蛋白a(“cas9-pa”)或cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)在核转染到受刺激的人t细胞中后的编辑活性的离体编辑测定的结果。将靶向cd47的引导rna(grna)与相应的tage剂缔合以形成核糖核蛋白，并将核糖核蛋白核转染到t细胞中以进行编辑测试。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。编辑活性是相对于cas9(c80a)-2xnls活性绘制的。
148.图4以图形方式描绘了评估cas9-2xnls-蛋白a(“cas9-pa”)与抗cd3抗体的结合的体外结合测定的结果。还显示了单独的cas9-pa和单独的抗cd3抗体的结果。
149.图5a和图5b以图形方式描绘了基于facs的内化测定的结果，该测定测量了cd8 t细胞中(图5a)和cd19 b细胞中(图5b)抗cd3(18nm)或抗cd22(100nm)抗体的pbmc内化率。
150.图6a至图6c显示了抗体(huigg1，cd22)与cas9-2xnls-蛋白a(“cas9-pa”)复合以形成tage剂的结合和内化研究的结果。图6a以图形方式描绘了基于facs的细胞结合测定的结果，其中将10nm的每种指定蛋白质添加到pbmc中并染色30分钟。图6b以图形方式描绘了基于facs的内化测定的结果，其中将10nm的每种指定蛋白质添加到pbmc中，保持指定温度和时间。通过facs分析评估来自使用和未使用抗a488抗体淬灭的每种条件的样品。图6c进
一步说明了pbmc池中t细胞与b细胞的内化。
151.图7a至图7d以图形方式描绘了利用各种淬灭方法(肝素洗涤、酸洗、抗a488抗体、无淬灭)的基于facs的内化测定的结果，其中在t细胞(图7a和图7b)或骨髓细胞(图7c)中评估了cas9-2xnls-蛋白a(“cas9pa”)、抗cd3抗体、或包含与抗cd3抗体复合的cas9-2xnls-蛋白a(“cas9pa:cd3”)的tage剂的内化。图7a以图形方式描绘了用a488标记的抗cd3抗体或用a488标记的具有引导rna的cas9-2xnls-pa:抗cd3 rnp进行的内化测定的结果。图7b以图形方式描绘了在t细胞中用atto550标记的具有引导rna的cas9-2xnls-pa:抗cd3 rnp或cas9-2xnls-pa进行的内化测定的结果。图7c以图形方式描绘了在髓细胞中用atto550标记的具有引导rna的cas9-2xnls-pa:抗cd3 rnp或cas9-2xnls-pa进行的内化测定的结果。图7d以图形方式描绘了用以评估每种淬灭方法的毒性作用的基于活死facs的测定的结果。
152.图8以图形方式描绘了评估通过tage剂cas9-2xnls-darpin(ec1)(“cas9-darpin(ec1)”；也称为cas9-darpin(epcam))或cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)进行的dna切割的体外dna切割测定的结果，活性是相对于cas9(c80a)-2xnls活性绘制的。
153.图9以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，该测定评估tage剂cas9-2xnls-darpin(ec1)(“cas9-darpin(ec1)”)或cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)在核转染到受刺激的人t细胞中后的编辑。将靶向cd47的引导rna与相应的tage剂缔合以形成核糖核蛋白，并将核糖核蛋白核转染到t细胞中以测试编辑。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。编辑活性是相对于cas9(c80a)-2xnls活性绘制的。
154.图10a至图10d以图形方式描绘了基于facs的结合测定的结果，该测定用以评估tage剂cas9-2xnls-darpin(epcam)(“darpin”)或cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)在上皮细胞系bt474或skbr3的细胞表面上的结合。图10a和图10b以图形方式描绘了对bt474细胞(图10a)或skbr3细胞(图10b)上10、25、50、100或300nm的cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)或cas9-2xnls-darpin(epcam)进行的基于facs的结合测定的结果。图10c以图形方式描绘了epcam抗体(“epcam ab”)在skbr3细胞或bt474细胞上的结合结果，证明两个细胞系都表达epcam。图10d以图形方式描绘了对bt474细胞或skbr3细胞上25、100或300nm的cas9(c80a)-2xnls或cas9-2xnls-darpin(epcam)进行的基于facs的结合测定的结果。
155.图11以图形方式描绘了基于facs的内化测定的结果，其中在37℃或4℃下，将100nm或300nm tage剂cas9-2xnls-darpin(epcam)与bt474细胞或skbr3细胞一起孵育，保持指定时间(60分钟或30分钟)，之后在有或没有预先淬灭的情况下用facs测定。
156.图12以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，该测定评估通过将tage剂cas9-2xnls-darpin(epcam)rnp与hucd47引导rna在bt474细胞或skbr3细胞中共孵育指定时间(4天或7天)后实现的编辑。还显示了未暴露于rnp的对照细胞中获得的结果。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。在每个图形上示出了通过流式细胞术确定的经编辑细胞的百分比。
157.图13以图形方式描绘了如在人t细胞中用具有hucd47引导rna的tage剂cas9-2xnls-darpin(epcam)rnp共转染后，在指定时间(4天或7天)后通过流式细胞术评估的离体编辑测定的结果。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。
158.图14a和图14b以图形方式描绘了cas9-2xnls-halo:抗cd22(“cas9-halo＝mcd22”)tage剂的分析。图14a以图形方式描绘了来自cas9-halo:抗cd22抗体tage剂的尺寸
交换色谱法(s20010/300increase尺寸柱)的色谱图，其中8.5-11ml之间的峰代表抗体-cas9缀合材料。图14b是用以鉴定cas9-抗体缀合比率的sds-page的图像。包含尺寸交换分析的峰1至峰3的材料的泳道被标出。ab-2xcas9是指每个抗体具有两个cas9分子的缀合物。
159.图15a和图15b以图形方式描绘了基于facs的内化测定的结果，其中在37℃或4℃下，将20nm的具有a488引导rna的指定tage剂rnp(cas9-2xnls-halo:抗cd22抗体(“cas9-halo:mcd22”)、cas9-2xnls-halo:igg1(“cas9-halo-igg1”)或cas9-2xnls-halo(“cas9-halo”))与总脾细胞(图15a)或肿瘤浸润淋巴细胞(图15b)一起孵育，保持指定时间(15分钟或60分钟)。通过在cd19 b细胞上门控的facs分析评估来自有和没有淬灭的每种条件的样品。
160.图16a和图116b以图形方式描绘了评估在人t细胞中通过单独的cas9-2xnls-halo(“cas9-halo”)或包含与抗cd22抗体(“cas9-halo:mcd22”)、抗ctla4抗体(“cas9-halo:mctla4”)或igg1(“cas9-halo:igg1”)复合的cas9-2xnls-halo的tage剂进行的dna切割的体外dna切割测定(图17a)和离体核转染编辑测定(图16b)的结果。活性是相对于cas9(c80a)-2xnls活性绘制的。为了评估离体编辑，将靶向cd47的引导rna与相应的tage剂缔合以形成核糖核蛋白，并将核糖核蛋白核转染到t细胞中以测试编辑。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。图16b另外显示了通过halo-30a.a.-cas9、halo-3a.a.-cas9和higg1:halo-3a.a.-cas9进行的编辑，其中30a.a.和3a.a.是指构建体中肽接头的氨基酸(“a.a.”)长度。
161.图17以图形方式描绘了基于facs的内化测定的结果，其中针对从b16f10肿瘤中分离的混合细胞群体的内化，评估了指定tage剂rnp(cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)，单独的cas9-2xnls-halo(“cas9-halo”)，或与抗cd22抗体(“halo-mcd22”)、抗ctla4抗体(“halo-mctla4”)、mhcii-nb(“mhcii-nb”)或igg1(“halo-igg1”)复合的cas9-2xnls-halo)。显示了门控的dc细胞、非dc髓细胞、b细胞、t细胞、非t/b细胞和cd45-pdpn 细胞的结果。
162.图18a至图18c以图形方式描绘了用包含缀合至抗cd22抗体(图18a；与小鼠脾细胞结合)、抗fap抗体(图18b；与人成纤维细胞结合)或抗ctla-4抗体(图18c；与t细胞结合)的cas9-2xnls-halo(“cas9-halo”)的tage剂进行的体外结合测定的结果。图18a：将20nm的具有a488标记的引导物或a488标记的抗体的rnp与总小鼠脾细胞一起在冰上孵育30分钟。图18b：将人成纤维细胞与20nm蛋白质一起在冰上孵育30分钟。抗体用a488(染料:抗体1:1)标记，每个rnp都含有a488标记的引导物。图18c：将受刺激的小鼠t细胞与20或100nm蛋白质一起在37c下孵育15分钟。抗体用a488(染料:抗体1:1)标记，每个rnp都含有a488标记的引导物。
163.图18d以图形方式描绘了用包含缀合至cas9-2xnls-halo并与人真皮成纤维细胞共孵育的人抗fap抗体的tage剂进行的离体编辑测定的结果。将人真皮成纤维细胞铺板过夜。将靶向cd47的引导rna与相应的tage剂缔合以形成核糖核蛋白，并将核糖核蛋白与成纤维细胞共孵育以测试编辑。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。将37.5um rnp与这些细胞一起在2.5％fbs中孵育1小时。然后添加完全培养基，将rnp稀释至300nm。在孵育后第6天分析样品的cd47表达。
164.图18e和图18f以图形方式描绘了用缀合至cas9-halo-2xnls并与调节性t细胞(图18e)或总受刺激的t细胞(图18f)共孵育的小鼠抗ctla-4抗体的tage剂进行的离体编辑测
spycatcher-htn(“ac28”)或cas9(wt)-2xnls-spycatcher-4xnls(“ac26”)缀合，以形成基于抗体的tage剂。将靶向cd47的引导rna与相应的tage剂缔合，并且将tage剂与t细胞共孵育以测试编辑。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。“2步”表示添加3750nm rnp 1小时，然后稀释直至300nm，并孵育直至读出。抗体＝ac26(或ac28)是指包含全长抗体的测试品；pali＝ac26或pali＝ac28用作阴性对照，因为它不结合t细胞。f(ab')2是指不含fc结构域的抗体片段。
168.图22是位点特异性修饰多肽(例如核酸酶)与配体复合以形成靶向活性基因编辑(tage)剂的示意图。
169.图23a至图23e以图形方式描绘了来自纯化的tage剂cas9-2xnls-il2(图23a)、2xnls-cas9-hil2(sk)(图23b)、2xnls-cas9-hil2(wt)(图23c)和cas9-2xnls
‑‑
mil2(wt)(图23d)的s200尺寸排阻色谱分析的色谱图。
170.图24a至图24c以图形方式描绘了体外dna切割测定的结果，其中相对于cas9(c80a)-2xnls活性评估多种包含cas9和il-2(即，cas9-il2生物缀合物)或cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)的tage剂。图24a描绘了用cas9-2xnls-il2(“cas9-il2”)和cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)进行的dna切割测定的结果。图24b描绘了用cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)、4xnls-cas9-2xnls(“4xnls”)、cas9-2xnls-人il2(sk)(“cas9-hil2(sk)”、cas9-2xnls-人il2(wt)(“cas9-hil2(wt)”)、cas9-2xnls-小鼠il2(wt)(“cas9-mil2(wt)”)和gfp-cas9进行的dna切割测定的结果。图24c描绘了用cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)、spycatcher-cas9-2xnls(“spycatcher-cas9”)、spycatcher-tdp-cas9、spycatcher-tdp-cas9-(kdel)(“kdel”公开为seq id no:40)、il2-spytag:spycatcher-cas9-2xnls(“il2-st:spycatcher-cas9”)、il2-spytag:spycatcher-tdp-cas9(“il2-st:spycatcher-tdp-cas9”)、il2-spytag:spycatcher-tdp_cas9-(kdel)(“il2-st:spycatcher-tdp-cas9-(kdel)”；“kdel”公开为seq id no:40)进行的dna切割测定的结果。
171.图25a至图25d以图形方式描绘了评估用多种包含cas9和il-2(例如，cas9-il2生物缀合物)的tage剂核转染的受刺激的原代人t细胞或小鼠t细胞中的编辑活性的离体编辑测定的结果。对于图25a，使用tdtomato荧光报告系统来检测编辑。对于图25b至图25d，将靶向cd47的引导rna与相应的tage剂缔合以形成核糖核蛋白，并将核糖核蛋白核转染到t细胞中以测试编辑。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。图25a描绘了用cas9-2xnls-il2(“cas9-il2”)和阴性对照对受刺激的小鼠t细胞进行核转染后的离体编辑测定的结果，如通过facs评估的。图25b描绘了用4xnls-cas9-2xnls(“4xnls”)、cas9-2xnls-小鼠il2 wt(“cas9-mil2 wt”)、cas9-2xnls-人il2 wt(“cas9-hil2 wt”，cas9-2xnls-il2(superkine)(“cas9-il2(sk)”)、cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)和无cas9对照对受刺激的原代人t细胞进行核转染后的离体编辑测定的结果。图25c描绘了用指定rnp(cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)、4xnls-cas9-2xnls(“4xnls”)、cas9-2xnls-il2(sk)(“cas9-il2(sk)”)、cas9-2xnls-小鼠il2(“cas9-mil2”)、cas9-2xnls-人il2(“cas9-hil2”))进行核转染后的离体编辑测定的结果，并报告为经编辑细胞的百分比。图25d进一步描绘了用指定rnp(cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)、4xnls-cas9-2xnls(“4xnls”)、cas9-2xnls-il2(sk)(“cas9-il2(sk)”)、cas9-2xnls-小鼠il2(“cas9-mil2”)、cas9-2xnls-人il2(“cas9-hil2”))进行核转染后经编辑的总t细胞、cd4t细胞和cd8t细胞的百分比。
172.图26a和图26b以图形方式描绘了用包含缀合至cas9的il2的tage剂进行的细胞因子活性测定的结果。图26a以图形方式描绘了细胞因子活性测定的结果，该测定评估作为cas9-2xnls-il2(sk)(“cas9-il2(sk)”)、重组人il-2(“hil-2”)或重组小鼠il-2(“mil-2”)的浓度的函数的小鼠t细胞增殖的百分比变化。图26b以图形方式描绘了细胞因子活性测定的结果，该测定评估作为包含经由spytag缀合至spycatcher-cas9(wt)-2xnls(“sc-cas9”)或cas9(wt)-2xnls-spycatcher-4xnls(“ac26”)的il-2的指定rnp的浓度的函数的人t细胞增殖的百分比变化。将无rnp条件、单独的sc-cas9和单独的ac26作为对照进行评估。另外通过反式递送的重组人il-2(“ac26 rhil-2”)的递送评估ac26。
173.图27a至图27e以图形方式描绘了用包含缀合至cas9的il2的tage剂进行的il-2细胞因子活性测定的结果。该细胞因子活性测定使用hek il-2报告细胞系，其允许基于seap的诱导评估每种指定cas9-il2 rnp的il-2活性，这可以通过seap催化的比色反应进行评估(od 630nm处读数)。il-2活性(od)的程度显示为rnp浓度的函数。图27a以图形方式描绘了对重组人il-2(“rec.hil-2”)、cas9-2xnls-il2(superkine)(“cas9-il2(sk)”)、cas9-2xnls-人wt il2(“cas9-hwt il2”)、cas9-2xnls-小鼠wt il2(“cas9-mwt il2”)、spytag-il2(sk)、spycatcher-cas9(wt)-2xnls:spytag-il2(sk)缀合物(“cas9:spytag-il2(sk)conj.”)进行的细胞因子测定的结果。图27b以图形方式描绘了对重组人il2(“rec.hil-2”)、cas9-2xnls-人wt il2(“cas9-hwt-il2”)、apo cas9-人wt il2(“apo cas9-hwt il2”)和重组小鼠il2(“rec.mil-2”)进行的细胞因子测定的结果。图27c描绘了对重组小鼠il-2(“rec.mil-2”)和重组人il-2(“hil-2”)进行的两轮细胞因子测定的结果。图27d以图形方式描绘了用指定分子(rec.hil，储存在4c的il-2(sk)(“4c il-2(sk)”)，冷冻和解冻的il-2(sk)“f/t il-2(sk)”，或者缀合至spycatcher-tdp-cas9、spycatcher-tdp-cas9-kdel(“kdel”公开为seq id no:40)或spycatcher-cas9-2xnls(“spyc-cas9”)的il-2(sk)-spytag(il2(sk))进行的细胞因子测定的结果。图27e以图形方式描绘了用指定分子(rec.人il-2“rec.hil-2”、反式递送的具有小鼠il-2(wt)-spytag的cas9(c80a)-2xnls(“c80a mil-2(wt)-st”)、cas9(c80a)-2xnls、缀合至cas9(wt)-2xnls-spycatcher-4xnls的il-2(sk)-spytag(“il-2(sk)-st＝ac26)、或缀合至cas9(wt)-2xnls-spycatcher-4xnls的小鼠il-2(wt)(“mil-2(wt)-st＝ac26”))进行的细胞因子测定的结果。图27f以图形方式描绘了用游离il2(sk)-spytag和20nm il2(sk)-spytag:spycatcher-cas9(“il2(sk)-st:spyc-cas9”，非类配对)进行的结合竞争测定的结果。缀合物结合(由af488的平均荧光强度(mfi)表示)显示为未标记的il2(sk)-st的函数。
174.图28以图形方式描绘了基于facs的细胞内化测定的结果，该测定评估了tage剂cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)和cas9-2xnls-il2(“cas9-il2)在受刺激的人t细胞中的内化。
175.图29以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，该测定比较了将指定rnp(cas9-2xnls-il2(“cas9-il2”)或cas9(c80a)-2xnls(“c80a”))与鼠胸腺细胞共孵育或核转染指定rnp后实现的编辑。使用tdtomato荧光报告系统来检测编辑。编辑被测量为rnp切除介导的荧光激活的水平(tdtomato)。
176.图30a至图30d以图形方式描绘了用包含缀合至cas9的il-2的tage剂进行的离体编辑测定的结果。评估缀合物在小鼠脾细胞、胸腺细胞和肿瘤衍生的小鼠cd8 t细胞中的编辑。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。图30a以图形方式描绘了离体编辑测定的结
cas9(wt)-2xnls(“4xnls”)，spycatcher-tdp-cas9(“tdp”)，spycatcher-tdp-cas9-(kdel)(“kdel”；“kdel”公开为seq id no:40)，spycatcher-cas9(wt)-2xnls(“spyc”)，cas9(wt)-2xnls-spycatcher-4xnls(“ac26”)，4xnls-spycatcher-cas9(wt)-2xnls(“ac32”)，或缀合至tdp、kdel(“kdel”公开为seq id no:40)、spyc-cas9、ac26或ac32的il2(sk)-spytag共孵育的hek il2报告细胞中的编辑水平。图32f以图形方式描绘了与不同浓度的缀合至cas9-spycatcher(“cas9-sc”)的il2(sk)-spytag(“il2(sk)-st”)、il2(sk)-spytag＝cas9-2xnls-spycatcher-4xnls(“cas9-sc-4xnls”)共孵育的hek il2报告细胞中的编辑水平。
179.图33a和图33b以图形方式描绘了cas9(c80a)-2xnls稳定性研究的结果。图33a以图形方式描绘了在体外切割测定之前用指定鼠血清、血浆、血液或肿瘤微环境(tme)预处理的cas9(c80a)-2xnls rnp的体外dna切割测定随时间的推移的结果。图33b以图形方式描绘了在体外切割测定之前用指定ph的缓冲液预处理的cas9(c80a)-2xnls rnp的体外dna切割测定随时间的推移的结果。
180.图34a至图34c cas9(c80a)-2xnls rnp生物分布。图34a和图34b以图形方式描绘了facs分析的结果，其中在从静脉内注射了指定rnp的小鼠分离的肝组织中检测到未标记的cas9(c80a)-2xnls(图35a)或cas9(c80a)-2xnls-egfp(图34b)。图34c以图形方式描绘了facs分析的结果，其中在从静脉内注射了指定rnp的小鼠分离的皮肤组织中的cd45 和cd45-细胞中检测到cas9(c80a)-2xnls。
181.图35显示了在有或没有rnaimax的情况下，从注射了具有指定引导rna(靶向引导rna，sgjd298，或非靶向引导rna，sghbb)的cas9(c80a)-2xnls rnp的小鼠中分离的组织的图像，且针对dapi和tdtomato荧光成像。tdtomato荧光指示发生rnp切除介导的荧光激活的位点。
182.图36以图形方式描绘了体内编辑研究的结果，该研究比较了用具有对照引导rna(sgbfp)或靶向引导物(sgjd298)的tage剂cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)或cas9-2xnls-il2(“cas9-il2”)双侧胁腹皮内注射ai9小鼠7天后cd45 免疫细胞中的编辑百分比。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。
183.图37a至图37c以图形方式描绘了体内编辑测定的结果，其中通过瘤内注射向ai9小鼠结肠癌的mc38ova模型施用包含缀合至cas9的il2或il2(sk)的tage剂。rnp包含靶向sgrna(sgjd298)或非靶向对照sgrna(sgbfp)。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。图37a以图形方式描绘了如通过tdtomato切除介导的荧光激活所测量的，针对指定肿瘤微环境细胞类型的编辑程度。图37b和图37c以图形方式描绘了在施用rnp之前(图37b)和rnp注射后7天(图37c)指定处理组中小鼠的肿瘤体积。“无rnp”是指未添加cas9的条件；“c80a:bfp”是指cas9(c80a)-2xnls加非靶向引导物，并且“c80a:jd298”是指cas9(c80a)-2xnls加靶向引导物(开启tdtomato表达)。所有其他分子都具有靶向sgjd298引导物。“ac26”是指cas9(wt)-2xnls-spycatcher-4xnls；“il2(sk)-ac26”是指缀合至ac26的il-2(sk)-spytag。“il2(wt)-ac26”是指缀合至ac26的il-2(wt)-spytag。
184.图38a至图38c以图形方式描绘了来自基于facs的rnp内化测定的结果，其中评估了指定rnp向从b16f10肿瘤分离的混合细胞群体中的内化。图38a以图形方式描绘了在有或没有淬灭的情况下，将spycatcher-cas9-tdp(“spyc-cas9-tdp”)和il2-spytag(st):spycatcher-cas9-tdp(“il2st-spyc-cas9-tdp”)与混合细胞群体一起孵育，保持指定温度
和时间，并进行t细胞门控的基于facs的内化分析的结果。图38b以图形方式总结了指定rnp(cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)、4xnls-cas9-2xnls(“4xnls”)、cas9-0x(“cas9-0x”)、cas9-2xnls-il2(sk)(“il2(sk)”)、cas9-2xnls-mil2(wt)(“mil2(wt)”)、spycatcher-cas9-2xnls(“spyc-cas9”)、spycatcher-tdp-cas9(“spyc tdp cas9”)、cas9-il2-spytag:spycatcher-cas9-2xnls(“il2-st-spyc)、cas9-il2-spytag:spycatcher-tdp-cas9(“il2-st-spyc-tdp”)的内化。评估了dc细胞、非dc髓细胞、b细胞、t细胞、非t/b细胞和cd45-pdpn 细胞(％sgrna ＝37c淬灭-4c淬灭)中的内化。图38c以图形方式总结了指定rnp(spycatcher-cas9-2xnls(“spyc cas9”)、spycatcher-tdp-cas9(“spyc-tdp cas9”)、cas9-il2-spytag:spycatcher-cas9-2xnls(“il2-st-spyc”)、cas9-il2-spytag:spycatcher-tdp-cas9(“il2-st-spyc-tdp”)在dc细胞、非dc髓细胞、b细胞和t细胞中的内化。
185.图39以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，其中将包含小鼠ifnγ和缀合至cas9的cpp的tage剂与小鼠巨噬细胞共孵育并评估编辑。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。评估的条件包括无rnp条件、具有非靶向sgrna的his-tat-nls-cas9(wt)-2xnls(“htn:sgbfp”)、具有靶向grna的his-tat-nls-cas9(wt)-2xnls(“htn”)、ac26(“cas9(wt)-2xnls-spycatcher-4xnls”)、ac28(cas9(wt)-2xnls-spycatcher-htn)、缀合至ac26或ac28的ifnγ、或伴随ac26反式递送的ifnγ。
186.图40以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，其中将包含小鼠集落刺激因子(csf)和缀合至cas9的cpp的tage剂与小鼠巨噬细胞共孵育并评估编辑。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。评估的条件包括无rnp条件、具有非靶向sgrna的his-tat-nls-cas9(wt)-2xnls(“sgbfp htn”)、具有靶向grna的his-tat-nls-cas9(wt)-2xnls(“htn”)、sc-cas9(“spycatcher-cas9(wt)-2xnls”)、ac28(cas9(wt)-2xnls-spycatcher-htn)、2xspytag＝(sc-cas9)2(“spymer”)、spytag-fc＝(sc-cas9)2(“fc-cas9”)、csf-fc-spytag＝(sc-cas9)2(“scf fc-cas9”)、spytag-fc＝(ac28)2(fc＝ac28)、或csf-fc-spytag＝(ac28)2(“csf fc＝ac28”)。除非另有说明，所有rnp都与引导物sgjd298复合。
187.图41是核酸酶与细胞穿透肽复合以形成靶向活性基因编辑(tage)剂的示意图。
188.图42a和图42b以图形方式描绘了体外dna切割测定的结果，其中评估了包含不同cpp的多种tage剂的dna切割活性。图42a以图形方式描绘了4xnls-cas9-2xnls(“4xnls-cas9”)或cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)dna的体外dna切割活性(切割活性相对于cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)活性显示)。图42b以图形方式描绘了cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)、4xnls-cas9-2xnls(“4xnls-cas9”)、his-4xnls-cas9-2xnls(“his-4xnls-cas9”)、his-tat-nls-cas9-2xnls(“htn-cas9”)、tat-cas9(c80a)-2xnls(“tat-c80a”)、tat-ha-cas9(c80a)-2xnls(“tat-ha-c80a”)、s19-cas9(c80a)-2xnls(“s19-c80a”)、hph1-cas9(c80a)-2xnls(“hph1-c80a”)、l17e-cas9(c80a)-2xnls(“l17e-c80a”)和imt-p8-cas9(c80a)-2xnls(“imt-p8 c80a”)的体外dna切割活性。
189.图43a和图43b以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，其中评估了通过各种包含不同cpp的tage剂进行的核转染得到的离体编辑活性。将靶向cd47的引导rna与相应的tage剂缔合以形成核糖核蛋白，并将核糖核蛋白核转染到t细胞中以测试编辑。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。图43a以图形方式描绘了核转染到受刺激的人t
细胞中的4xnls-cas9-2xnls(“4xnls”)或cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)的离体编辑活性(相对于cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)活性绘制)。图43b以图形方式描绘了核转染到受刺激的人t细胞中的cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)、4xnls-cas9-2xnls(“4xnls-cas9”)、his-4xnls-cas9-2xnls(“his4xnls-cas9”)、his-tat-nls-cas9-2xnls(“htn-cas9”)、tat-cas9(c80a)-2xnls(“tat-c80a”)、tat-ha-cas9(c80a)-2xnls(“tat hs-c80a”)、s19-cas9(c80a)-2xnls(“s19-c80a”)、hph1-cas9(c80a)-2xnls(“hph1-c80a”)和l17e-cas9(c80a)-2xnls(“l17e-c80a”)的离体编辑活性(相对于cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)活性绘制)。
190.图44a和图44b以图形方式描绘了细胞内化测定的结果，该测定评估tage剂4xnls-cas9(c80a)-2xnls在小鼠脾t细胞(图44a)或受刺激的人t细胞(图44b)中的内化。
191.图45a至图45d以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，该测定比较了在将指定tage剂rnp(cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)或4xnls-cas9-2xnls“4xnls”)与小鼠成纤维细胞(图45a)或脾t细胞(图45b)共孵育或进行核转染(“tage对照”)之后实现的编辑百分比。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。编辑频率被测量为rnp切除介导的荧光激活的程度(％tdtomato)。如图45c和图45d所示，在不同条件组下在人pbmc中进一步评估共孵育，以优化共孵育后的编辑。
192.图46以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，该测定比较了将指定tage剂rnp(4xnls-cas9-2xnls(“4xnls”)或cas9(c80a)-2xnls(“c80a”))与鼠胸腺细胞或脾细胞共孵育或核转染指定rnp后实现的编辑率。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。编辑频率被测量为rnp切除介导的荧光激活的程度(％tdtomato)。
193.图47以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，该测定评估了在将指定tage剂rnp(cas9(c80a)-2xnls、4xnls-cas9-2xnls、his-4xnls-cas9-2xnls、his-tat-nls-cas9-2xnls(htn-cas9-2xnls)、tat-cas9-2xnls和tat-ha-cas9-2xnls)与鼠成纤维细胞共孵育后实现的编辑。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。编辑频率被测量为rnp切除介导的荧光激活的程度(％tdtomato)。
194.图48以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，该测定评估了在将包含靶向sgrna(sgjd298)或非靶向对照sgrna(sghbb)的指定tage剂rnp(cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)、imt-p8-cas9-2xnls(“imt-p8”)、his-tat-nls-cas9-2xnls(“htn”)或spycatcher-cas9-2xnls)与分化的小鼠骨髓衍生的巨噬细胞(bmdm)共孵育后实现的编辑。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。将指定rnp与m0(左图)、m1(中图)或m2(右图)bmdm共孵育，并且编辑频率测量为rnp切除介导的荧光激活的程度(％tdtomato)。
195.图49以图形方式描绘了体内编辑研究的结果，该研究比较了用具有对照引导rna(sgbfp)或靶向引导物(sgjd298)的cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)或4xnls-cas9(c80a)-2xnls(“4xnls”)双侧胁腹皮内注射ai9小鼠7天后cd45 免疫细胞中的编辑百分比。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。
196.图50a至图50d以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，其中将3.75um的包含指定cpp的tage剂与人t细胞(图51a或图51b)或小鼠成纤维细胞(图50c或图50d)共孵育。对于图图50a和图50b，将靶向cd47的引导rna与相应的tage剂缔合以形成核糖核蛋白，并将核糖核蛋白与t细胞共孵育以测试编辑。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。对于图50c和图50d，使用tdtomato荧光报告系统来检测成纤维细胞中的编辑。图50a和
图50c中评估的cpp tage剂包括4xnls-cas9-2xnls(“4xnls-cas9”)、his-4xnls-cas9-2xnls(“his4xnls-cas9”)、his-tat-nls-cas9-2xnls(“htn-cas9”)、tat-cas9(c80a)-2xnls(“tat-c80a”)、tat-ha-cas9(c80a)-2xnls(“tat ha-c80a”)、s19-cas9(c80a)-2xnls(“s19-c80a”)、hph1-cas9(c80a)-2xnls(“hph1-c80a”)、l17e-cas9(c80a)-2xnls(“l17e-c80a”)、imt-p8-cas9(c80a)-2xnls(“imt-p8-c80a”)。图50b中评估的cpp tage剂包括cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)、4xnls-cas9-2xnls(“4xnls”)、cas9(wt)-2xnls-spycatcher-4xnls(“ac26”)、s10-cas9(c80a)-2xnls(“s10”)、s18-cas9(c80a)-2xnls(“s18”)、s85-cas9(c80a)-2xnls(“s85”)、zf5.3-cas9(c80a)-2xnls(“zf5.3”)和穿膜肽-cas9(c80a)-2xnls(“穿膜肽”)。图50d中评估的cpp tage剂包括cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)、4xnls-cas9-2xnls(“4xnls-cas9”)、his-tat-nls-cas9-2xnls(“htn-cas9”)、s10-cas9(c80a)-2xnls(“s10”)、s18-cas9(c80a)-2xnls(“s18”)、s85-cas9(c80a)-2xnls(“s85”)、zf5.3-cas9(c80a)-2xnls(“zf5.3”)、穿膜肽-cas9(c80a)-2xnls(“穿膜肽”)、aurein1.2-cas9(c80a)-2xnls(“aurein1.2”)、lmwp-cas9(c80a)-2xnls(“lmwp”)、lah4-l1-cas9(c80a)-2xnls(“lah4-l1”)、vectofusin-1-cas9(c80a)-2xnls(“vectofusin”)和cm18-tat-cas9(c80a)-2xnls(“cm18-tat”)。
197.图51以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，其中将包含融合到4xnls(4xnls-cas9-2xnls(“4xnls-cas9”))或his-tat-nls(htn-cas9-2xnls(“htn-cas9”))的cas9(c80a)的tage剂与原代人t细胞共孵育并评估编辑。将靶向cd47的引导rna与相应的tage剂缔合以形成核糖核蛋白，并将核糖核蛋白与t细胞共孵育以测试编辑。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。
198.图52a和图52b以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，其中将包含cas9(c80a)-2xnls(“c80a”；图53a和图53b)、4xnls-cas9-2xnls(“4xnls”；图53a和图53b)或his-tat-nls-cas9-2xnls(“htn”；图53b)或对照的cpp-tage rnp与人造血祖干细胞(hspc)共孵育。将靶向cd47的引导rna与相应的tage剂缔合以形成核糖核蛋白，并将核糖核蛋白与t细胞共孵育以测试编辑。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。
199.图53a和图53b描绘了体内编辑测定的结果，其中通过骨内注射将cpp tage rnp施用到ai9报告小鼠模型中。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。图53a以图形方式描绘了荧光图像，其显示了骨内施用包含靶向sgrna(sgjd298)或非靶向对照sgrna(sgbfp)的cpp-tage rnp(4xnls-cas9-2xnls(“4xnls”)或his-tat-nls-cas9-2xnls(“htn”))的小鼠中的rnp切除介导的荧光(tdtomato)。在rnp注射后两周对来自指定处理组的小鼠的胫骨进行成像。图53b以图形方式描绘了流式细胞术测定的结果，该测定用以评估在rnp注射后从小鼠骨髓收获的细胞的原位编辑。
200.图54描绘了体内编辑测定的结果，其中通过眼内注射将cpp tage rnp施用到ai9报告小鼠模型中。为了在体内评估cpp tage的眼内编辑，通过视网膜下注射将与靶向grna(jd298)复合的4xnls-cas9(c80a)-2xnls、cas9(c80a)-2xnls或htn-cas9(c80a)-2xnls注射到小鼠体内。将具有靶向grna的cas9(c80a)-0xnls或具有非靶向grna的cas9(c80a)作为阴性对照进行评估。
201.图55以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，其中将包含缀合至cas9或spycatcher-cas9的cpp的cpp tage剂与通过从mc38小鼠模型解离肿瘤而分离的细胞共孵
育并评估编辑。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。评估的cpp tage剂包括4xnls-cas9-2xnls(“4xnls”)、cas9-2xnls-spycatcher-4xnls(“sc-4xnls”)、his-tat-nls-cas9-2xnls(“htn-cas9”)或cas9-2xnls-spycatcher-his-tat-nls(“sc-htn”)。将具有或不具有靶向grna的cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)或spycatcher-cas9(wt)-2xnls(“sc-cas9”)用作对照。
202.图56a和图56b以图形方式描绘了体内编辑测定的结果，其中将包含靶向sgrna(sgjd298)或非靶向对照sgrna(sgbfp)的cpp-tage rnp(4xnls-cas9-2xnls(“4xnls”)或cas9(c80a)-2xnls(“c80a”))通过瘤内注射施用于黑素瘤的b16f10模型(图56a)或结肠癌的mc38ova模型(图56b)。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。如通过tdtomato切除介导的荧光激活所测量的，显示了指定肿瘤微环境细胞类型的编辑程度。
203.图57以图形方式描绘了离体编辑测定的结果，其中将包含缀合至cas12的细胞穿透肽的cpp tage剂与成纤维细胞共孵育并评估编辑。使用t7核酸内切酶i测量靶基因组编辑和编辑效率。评估的cpp tage剂包括his-4xnls-cas12(wt)-2xnls(“4xnls-cas12a”)；his-cas12(wt)-4xnls-2xnls(“cas12a-4xnls”)；his-tat-nls-cas12(wt)-2xnls(“htn-cas12a”)；或his-cas12(wt)-htn v1(肝素早期高峰；“cas12a-htn v1”)和his-cas12(wt)htn v2(肝素晚期高峰；“cas12a-htn v2”)。
204.图58a和图58b以图形方式描绘了比较用于检测t细胞或成纤维细胞的离体编辑的两种不同方法的测定的结果：(1)通过流式细胞术获得的编辑测量(例如，用以检测表型读出，即cd47或cd44的细胞表面表达缺失)或(2)通过下一代测序(ngs)获得的编辑测量(用以检测编码cd47或cd44的基因的编辑)。通过每种方法分析了相同的样品，并比较了测量。图58a以图形方式描绘了针对具有0％至50％编辑的样品，通过流式细胞术(y轴)与ngs(x轴)进行的编辑测量之间的比较。图58a以图形方式描绘了针对具有0％至2％编辑的样品(与图58a中的样品相同，但具有不同的x轴刻度)，通过流式细胞术(y轴)与ngs(x轴)进行的编辑测量之间的比较。
具体实施方式
205.本文提供了涉及靶向活性基因编辑(tage)剂的组合物和方法，所述靶向活性基因编辑剂可以体内和离体编辑特定细胞类型内的核酸。此外，本文提供了用于促进体内和离体细胞内定点修饰多肽的细胞内化的组合物和方法。tage剂的模块化和可编程设计使得能够快速重新靶向和多功能，从而能够灵活靶向各种所需的细胞类型。此外，通过编辑特定靶细胞中的特定核酸，tage剂具有双重特异性，并且比基于dna的递送方法具有更少的脱靶效应。为了实现这一点，tage剂包含一个或多个促进细胞结合、细胞内化和/或核内化的胞外细胞膜结合部分(例如，细胞穿透肽、配体或抗原结合多肽)。本发明的组合物和方法的tage剂从而可以促进定点修饰多肽(例如基因编辑多肽)诸如cas9被递送和内化到靶细胞类型中。此外，胞外细胞膜结合部分，诸如配体和抗原结合多肽，不仅允许受体介导的tage剂进入，而且在某些情况下，所述部分还介导细胞的生物学(例如，通过改变胞内信号转导通路)。
206.因此，本文提供了涉及包含胞外细胞膜结合部分和识别细胞内核酸序列的定点修饰多肽的tage剂的方法和组合物，其中所述胞外细胞膜结合部分与所述定点修饰多肽稳定
缔合，使得所述定点修饰多肽能够被内化到细胞中。因此，本文提供了涉及包含胞外细胞膜结合部分和识别细胞内核酸序列的定点修饰多肽的tage剂的方法和组合物，其中所述胞外细胞膜结合部分与所述定点修饰多肽稳定缔合，使得所述定点修饰多肽能够被内化到细胞中。
207.在一方面，本文提供了靶向活性基因编辑(tage)剂，所述靶向活性基因编辑剂包含与胞外细胞膜结合分子特异性结合的抗原结合多肽或配体以及识别靶细胞内核酸序列的定点修饰多肽。所述抗原结合多肽或配体与所述定点修饰多肽稳定缔合，使得所述定点修饰多肽能够被内化到展示所述胞外细胞膜结合分子的靶细胞中。另外，本文提供了包含细胞穿透肽和识别靶细胞内核酸序列的定点修饰多肽的tage剂。所述细胞穿透肽和定点修饰多肽稳定缔合，使得所述定点修饰多肽能够被内化到所述靶细胞中。
208.此外，本文提供了修饰离体或体内细胞的基因组的方法，以及通过tage剂向受试者递送定点修饰多肽的方法通过tage剂进行的靶向离体编辑使得能够对细胞(例如，造血干细胞)进行基因修饰，以用于多种细胞疗法。另外，向受试者施用tage剂使得能够对所需体内细胞类型进行靶向编辑。
209.i.定义
210.术语“靶向活性基因编辑”或“tage”剂是指分子的复合物，所述分子包含与细胞膜上展示的胞外靶分子(例如，胞外蛋白质或聚糖，诸如细胞表面上的胞外蛋白质)特异性结合或以其他方式促进细胞内化的胞外细胞膜结合部分(诸如但不限于抗原结合多肽(例如，抗体或其抗原结合部分)、配体、细胞穿透肽(cpp)或其组合)以及识别核酸序列的定点修饰多肽(诸如但不限于核酸内切酶)。tage剂的胞外细胞膜结合部分与定点修饰多肽缔合，使得至少定点修饰多肽被靶细胞内化，例如表达被胞外细胞膜结合部分结合的胞外分子的细胞。tage剂的示例是活性crispr靶向或tage剂，其中定点多肽是核酸引导dna核酸内切酶(例如，rna引导核酸内切酶或dna引导核酸内切酶)，诸如cas9或cas 12。在一些实施方案中，tage剂包含至少一个nls。值得注意的是，tage剂可以靶向细胞内的任何核酸，包括但不限于基因。
211.如本文所用，术语“抗原结合多肽”是指结合特定靶抗原的蛋白质，诸如胞外细胞膜结合蛋白质(例如，细胞表面蛋白)。抗原结合多肽的示例包括抗体、抗体的抗原结合片段和抗体模拟物。在某些实施方案中，抗原结合多肽是抗原结合肽。
212.如本文所用，“定点修饰多肽”是指通过识别一个或多个特定序列，通过修饰多肽本身或缔合的分子(例如，rna)而靶向特定核酸序列或多核苷酸链的一组相似序列的蛋白质，其中多肽可以修饰所述多核苷酸链。
213.在本文中可互换使用的术语“多肽”或“蛋白质”是指任何聚合的氨基酸链。术语“多肽”涵盖天然或人工蛋白质、蛋白质片段和具有蛋白质序列的多肽类似物。
214.如本文所用，术语“缀合部分”是指能够缀合诸如抗原结合蛋白、cpp或配体和定点修饰多肽等的两个或更多个分子的部分。如本文所用，术语“缀合”是指在一种分子(例如，抗原结合蛋白(例如抗体)、cpp或配体)与第二分子(例如，定点修饰多肽、治疗剂、药物或靶向分子)之间形成的物理或化学复合。化学复合特异性地构成在第一分子(例如，抗原结合蛋白(例如抗体)、cpp或配体)的官能团与第二分子(例如，定点修饰多肽、治疗剂或药物)的官能团之间形成的键或化学部分。此类键包括但不限于共价键和非共价键，而此类化学部
分包括但不限于酯、碳酸酯、亚胺磷酸酯、腙、缩醛、原酸酯、肽键和寡核苷酸键。在一个实施方案中，缀合是通过物理缔合或非共价复合实现的。
215.如本文所用，术语“配体”是指能够与细胞上或细胞内的另一分子(诸如一种或多种细胞表面受体)特异性结合的分子，并且包括诸如蛋白质、激素、神经递质、细胞因子、生长因子、细胞粘附分子或营养素等分子。通常，配体与另一个或多个特定分子结合。例如，配体可以与受体结合。tage剂的位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)可以通过共价或非共价键与一个或多个配体缔合。可用于本文的配体或由配体结合的靶标的示例以及配体的进一步描述一般公开于bryant&stow(2005).traffic,6(10),947-953；olsnes等人(2003).physiological reviews,83(1),163-182；和planque,n.(2006).cell communication and signaling,4(1),7中，该文献通过引用并入本文。
216.如本文所用，术语“靶细胞”是指包含如下的核酸序列的细胞(诸如哺乳动物细胞(例如，人细胞))或细胞群体，其中需要定点修饰核酸(例如，用以体内或离体产生经基因修饰的细胞)。在一些情况下，靶细胞在其细胞膜上展示被tage剂的胞外细胞膜结合部分特异性结合的胞外分子(例如，胞外蛋白诸如受体或配体，或聚糖)。
217.如本文所用，术语“经基因修饰的细胞”是指如下的细胞或其祖先，其中dna序列已被定点修饰多肽有意修饰。
218.如本文所用，术语“核酸”是指包含如下核苷酸的分子，包括多核苷酸、寡核苷酸或其他dna或rna。在一个实施方案中，核酸存在于细胞中并且可以通过细胞分裂传递给细胞的后代。在一些情况下，核酸是在细胞染色体内的基因组内发现的基因(例如，内源基因)。在其他情况下，核酸是已转染到细胞中的哺乳动物表达载体。使用例如转染方法掺入细胞基因组中的dna也被认为在本文所用的“核酸”的范围内，即使掺入的dna并不意味着传递给后代细胞。
219.如本文所用，术语“内体逃逸剂”或“内体释放剂”是指当与分子(例如多肽，诸如定点修饰多肽)缀合时，能够促进分子从细胞内的内体释放的剂。保留在内体内的多肽最终可以靶向降解或回收，而不是释放到细胞质中或运输到所需的亚细胞目的地。因此，在一些实施方案中，tage剂包括内体逃逸剂。
220.如本文所用，术语“稳定缔合”在用于tage剂的上下文中时是指胞外细胞膜结合部分与定点修饰多肽以使得复合物可被内化到靶细胞中的方式复合，从而可以在细胞内发生核酸编辑的能力。确定tage剂是否稳定缔合的方式的示例包括体外测定，由此在细胞暴露于tage剂后确定复合物的缔合，例如通过使用标准基因编辑系统确定基因编辑是否发生。此类测定的示例是本领域已知的，诸如sds-page、western印迹、尺寸排阻色谱法(sec)和电泳迁移率变动测定以确定蛋白质复合物；pcr扩增、直接测序(例如，下一代测序或sanger测序)、用核酸酶(例如，celery)对基因座进行酶切以确认编辑；和测量编辑特定基因的下游效应的间接表型测定，诸如通过蛋白质印迹或流式细胞术测量的蛋白质损失或通过功能测定测量的功能蛋白质的产生。
221.如本文所用，术语“修饰核酸”是指对定点修饰多肽靶向的核酸的任何修饰。此类修饰的示例包括对氨基酸序列的任何改变，包括但不限于相对于参考序列(例如，野生型或天然序列)，核酸序列中氨基酸残基的任何插入、缺失或取代。例如，此类氨基酸变化可导致基因表达的变化(例如，表达的增加或降低)或核酸序列的替换。核酸的修饰可进一步包括
双链切割、单链切割或本文公开的任何rna引导核酸内切酶与靶位点的结合。rna引导核酸内切酶的结合可抑制核酸的表达或可增加与包含靶位点的核酸可操作连接的任何核酸的表达。
222.术语“细胞穿透肽”(cpp)是指可促进细胞摄取缀合分子的长度通常为约5-60个氨基酸残基(例如，5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55或55-60个氨基酸残基)的肽，特别是一种或多种位点特异性修饰多肽。在某些实施方案中，cpp的特征还在于能够促进分子缀合物移动穿过/横贯穿透脂质双层、胶束、细胞膜、细胞器膜(例如，核膜)、囊泡膜、或细胞壁中的一者或多者。在某些实施方案中，本文的cpp可以是阳离子的、两亲的或疏水的。可用于本文的cpp的示例以及对cpp的进一步描述总体上在以下中公开：borrelli,antonella等人molecules 23.2(2018):295；milletti,francesca.drug discovery today 17.15-16(2012):850-860，将其通过引用并入本文。此外，存在经过实验验证的cpp的数据库(cppsite，gautam等人,2012)。本发明的tage剂的cpp可以是任何已知的cpp，诸如cppsite数据库中显示的cpp。
223.如本文所用，术语“核定位信号”或“nls”是指当缀合至分子(例如多肽，诸如定点修饰多肽)时能够促进通过核转运将分子输入细胞核的肽。例如，nls可以指导将与其缔合的蛋白质从细胞的细胞质转运穿过核膜屏障。nls旨在不仅涵盖特定肽的核定位序列，而且还涵盖能够指导将细胞质多肽易位穿过核膜屏障的衍生物。在一些实施方案中，一个或多个nls(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、2-6、3-7、4-8、5-9、6-10、7-10、8-10个nls)可附接至本文的tage剂的多肽的n-末端、c-末端或n-末端和c-末端两者。
224.如本文所用，术语“tat相关肽”是指衍生自人类免疫缺陷病毒的转录反式激活因子(tat)的cpp。tat肽的氨基酸序列包含rkkrrqrrr(seq id no:11)(例如，grkkrrqrrrpq(seq id no:41))。因此，tat相关肽包括包含氨基酸序列rkkrrqrrr(seq id no:11)(例如，grkkrrqrrrpq(seq id no:41))或具有保守氨基酸取代的氨基酸序列的肽，其中所述肽仍然能够内化到细胞中。在某些实施方案中，tat相关肽包含1、2或3个氨基酸取代，其中所述tat相关肽能够内化到靶细胞中。
225.如本文所用，术语“特异性结合”在抗原结合多肽的上下文中是指识别并结合样品中存在的抗原的抗原结合多肽，但该抗原结合多肽基本上不识别或结合样品中的其他分子。在一个实施方案中，特异性结合抗原的抗原结合多肽以至少约1
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m或更多的kd与抗原结合，如通过表面等离子体共振或本领域已知的其他方法(例如，过滤结合测定、荧光偏振、等温滴定量热法)确定的，包括本文进一步描述的那些方法。在一个实施方案中，如通过表面等离子体共振确定的，如果抗原结合多肽以其对非特异性抗原的亲和力至少两倍的亲和力结合抗原，则抗原结合多肽与抗原特异性结合。当在配体的上下文中使用时，术语“特异性结合”是指配体识别并结合其相应受体的能力。当在cpp的上下文中使用时，术语“特异性结合”是指cpp易位于细胞膜的能力。在一些情况下，当cpp与抗体或配体组合作为tage剂时，tage剂可展示抗体或配体与cpp两者的特异性结合特性。例如，在此类情况下，tage剂的抗体或配体可以赋予与胞外细胞表面分子(诸如细胞表面蛋白)的特异性结合，而cpp赋予tage剂易位穿过细胞膜的增强的能力。
226.术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并涵盖各种抗体结构，包括但不限于单
克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、纳米抗体、单体和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性。
227.术语“抗体”包括包含通过二硫键互连的四条多肽链即两条重(h)链和两条轻(l)链的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如igm)。每条重链(hc)包含重链可变区(或结构域)(本文缩写为hcvr或vh)和重链恒定区(或结构域)。重链恒定区包含三个结构域，ch1、ch2和ch3。每条轻链(lc)包含轻链可变区(本文缩写为lcvr或vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(cl1)。每个vh和vl由三个互补决定区(cdr)和四个框架(fr)组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、1-r3、cdr3、fr4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或子类。因此，vh和vl区域可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(cdr)，散布有更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。
228.如本文所用，术语“cdr”或“互补决定区”是指在重链多肽和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区域已由kabat等人,j.biol.chem.252,6609-6616(1977)和kabat等人,sequences of protein of immunological interest.(1991)和chothia等人,j.mol.biol.196:901-917(1987)和maccallum等人,j.mol.biol.262:732-745(1996)描述，其中这些定义包括在相互比较时的重叠氨基酸残基或氨基酸残基的子集。阐述了涵盖由上述引用的每个参考文献定义的cdr的氨基酸残基用于比较。优选地，基于序列比较，术语“cdr”是由kabat定义的cdr。
229.术语“fc结构域”用于定义免疫球蛋白重链的c末端区域，其可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生。fc结构域可以是天然序列fc结构域或变体fc结构域。免疫球蛋白的fc结构域通常包含两个恒定结构域，即ch2结构域和ch3结构域，并且任选地包含ch4结构域。在fc部分中替换氨基酸残基以改变抗体效应子功能是本领域已知的(winter等人的美国专利第5,648,260号、第5,624,821号)。抗体的fc结构域介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、adcc、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(cdc)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。在某些实施方案中，在含fc结构域的结合蛋白的fc结构域中至少一个氨基酸残基被改变(例如，缺失、插入或替换)，使得所述结合蛋白的效应子功能被改变。
230.如本文所用，“完整”或“全长”抗体是指包含四条多肽链、两条重(h)链和两条轻(l)链的抗体。在一个实施方案中，完整抗体是完整的igg抗体。
231.如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，构成所述群体的个体抗体是同一的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂生产过程中出现的变体抗体)，此类变体通常以少量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示抗体的特征是从基本同质的抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组dna方法、噬菌体展示方法和利用含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，此类方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中描述。
232.如本文所用，术语“人抗体”是指具有可变区的其中框架区和cdr区均衍生自人种
系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，则所述恒定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的cdr序列已经被移植到人框架序列上的抗体。
233.术语“人源化抗体”旨在指其中衍生自一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的cdr序列已经被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行另外的框架区修饰。抗体的“人源化形式”，例如非人抗体，是指经过人源化的抗体。
234.术语“嵌合抗体”旨在指其中可变区序列衍生自一个物种并且恒定区序列衍生自另一物种的抗体，诸如其中可变区序列衍生自小鼠抗体并且恒定区序列衍生自人抗体的抗体。
[0235]“抗体片段”、抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指除完整抗体之外的包含完整抗体的一部分并结合完整抗体所结合的抗原的分子。抗体片段的示例包括但不限于fv、fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0236]“多特异性抗原结合多肽”或“多特异性抗体”是靶向并结合多于一种抗原或表位的抗原结合多肽。“双特异性”、“双重特异性”或“双功能”抗原结合多肽或抗体是分别具有两个不同抗原结合位点的杂交抗原结合多肽或抗体。双特异性抗原结合多肽和抗体是多特异性抗原结合多肽或多特异性抗体的示例并且可以通过多种方法产生，包括但不限于杂交瘤的融合或fab'片段的连接。参见例如songsivilai和lac hmann,1990,clin.exp.immunol.79:315-321；kostelny等人,1992,j.immunol.148:1547-1553，brinkmann和kontermann.2017.ma bs.9(2):182-212。例如，双特异性抗原结合多肽或抗体的两个结合位点将结合两个不同的表位，这些表位可以位于相同或不同的蛋白质靶标上。
[0237]
术语“抗体模拟物(antibody mimetic或antibody mimic)”是指在结构上与抗体不相关但能够与抗原特异性结合的分子。抗体模拟物的示例包括但不限于艾得奈可汀(即，基于纤连蛋白的结合分子)、affilin、affimer、affitin、α体、亲和体、darpin、抗运载蛋白、高亲合性多聚体、fynomer、kunitz结构域肽、单体、nanoclamp、单抗体、万能抗体、适体和肽分子，所有这些都采用模拟传统的抗体结合但通过不同的机制产生并发挥作用的结合结构。
[0238]
本文所述的氨基酸序列可包含“保守突变”，包括编码序列中的单个氨基酸或少量氨基酸改变、添加或缺失的核酸取代、缺失或添加，其中核酸改变导致化学上相似的氨基酸的取代。保守氨基酸取代是指第一氨基酸被具有与第一氨基酸相似的化学和/或物理特性(例如，电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)的第二氨基酸替换。保守取代包括用下组中的一个氨基酸替换另一个氨基酸：赖氨酸(k)、精氨酸(r)和组氨酸(h)；天冬氨酸(d)和谷氨酸(e)；天冬酰胺(n)和谷氨酰胺(q)；n、q、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)和酪氨酸(y)；k、r、h、d和e；d、e、n和q；丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、脯氨酸(p)、苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)、蛋氨酸(m)、半胱氨酸(c)和甘氨酸(g)；f、w和y；h、f、w和y；c、s和t；c和a；s和t；c和s；s、t和y；v、i和l；v、i和t。其他保守氨基酸取代也被认为是有效的，这取决于所讨论的氨基酸的上下文。例如，在一些情况下，蛋氨酸(m)可以取代赖氨酸(k)。另外，因保守变异而不同的
序列通常是同源的。
[0239]
术语“分离的”是指如下的化合物，它可以是例如基本上不含其他细胞物质的抗体或抗体片段。因此，在一些方面，提供的抗体是分离的抗体，其与具有不同特异性的抗体分离。
[0240]
以下章节中描述了另外的定义。
[0241]
在以下小节中更详细地描述了本发明的各个方面。
[0242]
ii.靶向活性基因编辑(tage)剂
[0243]
本发明包括可用于将基因编辑多肽(即定点修饰多肽)递送至靶细胞的靶向活性基因编辑(tage)剂。在一些实施方案中，tage剂可以是生物制剂。在特定实施方案中，定点修饰多肽包含允许将蛋白质缀合至胞外细胞膜结合部分(例如，抗原结合蛋白、配体或细胞穿透肽(cpp)或其组合)的缀合部分，所述胞外细胞膜结合部分结合与细胞膜的胞外区缔合的抗原或以其他方式增加定点修饰多肽的细胞内化或核内化。在包含配体或抗原结合蛋白的tage剂的情况下，此靶标特异性地允许将定点修饰多肽仅递送至展示所述抗原的细胞(例如，造血干细胞(hsc)、造血祖干细胞(hpsc)、自然杀伤细胞、巨噬细胞、dc细胞、非dc髓细胞、b细胞、t细胞(例如，激活的t细胞)、成纤维细胞或其他细胞)。此类细胞可与疾病相关的特定组织或细胞类型相关。因此，tage剂提供了一种可以修饰靶细胞的基因组的方法。
[0244]
在一个实施方案中，tage剂包含识别crispr序列的核酸引导核酸内切酶(例如，rna引导核酸内切酶或dna引导核酸内切酶)，诸如cas9，以及特异性结合定位在靶细胞膜上的胞外分子(例如，蛋白质、聚糖、脂质)的抗原结合蛋白。可用于本发明的tage剂中的抗原结合蛋白的示例包括但不限于抗体、抗体的抗原结合部分或抗体模拟物。可用于本文所述的组合物和方法中的抗原结合蛋白的类型在章节iv中更详细地描述。
[0245]
在另一个实施方案中，tage剂包含识别crispr序列的核酸引导核酸内切酶(例如，rna引导核酸内切酶或dna引导核酸内切酶)，诸如cas9，以及特异性结合定位在靶细胞膜上的胞外分子(例如，蛋白质、聚糖、脂质)的配体。可用于本文所述的组合物和方法中的配体的示例在章节iv中更详细地描述。
[0246]
在另一个实施方案中，tage剂包含识别crispr序列的核酸引导核酸内切酶(例如，rna引导核酸内切酶或dna引导核酸内切酶)，诸如cas9，以及cpp。可用于本文所述的组合物和方法中的cpp的示例在章节iv中更详细地描述。
[0247]
tage剂内的蛋白质(即，至少定点多肽和胞外细胞膜结合部分)被稳定缔合，使得胞外细胞膜结合部分将定点修饰多肽指导至细胞表面，并且定点修饰多肽被内化到靶细胞中。在某些实施方案中，胞外细胞膜结合部分与细胞表面上的抗原结合，使得定点修饰多肽被靶细胞内化，但胞外细胞膜结合部分(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)没有被内化。在一些实施方案中，定点修饰多肽和胞外细胞膜结合部分都被内化到靶细胞中。
[0248]
胞外细胞膜结合部分的示例包括但不限于抗原结合多肽，诸如抗体或其片段、配体或cpp。在某些实施方案中，tage剂包含两种或更多种细胞膜结合剂，例如cpp和抗体、cpp和配体、或配体和抗体。在某些实施方案中，此类类配对可改善定点修饰多肽的内化。例如，在某些实施方案中，类配对包括包含处于任何排列的cpp、抗原结合多肽(例如，抗体)和定点修饰多肽的tage剂。细胞结合部分的类配对的其他组合包括处于任何排列的配体、cpp和定点修饰多肽。在一个实施方案中，tage剂包含处于任何排列的抗体、肽细胞表面tcr和定
点修饰多肽。
[0249]
如章节iii中更详细地描述的，在某些实施方案中，当定点修饰多肽是核酸引导核酸内切酶(诸如cas9)时，所述核酸引导核酸内切酶与引导核酸缔合以形成核蛋白。例如，引导rna(grna)与rna引导核酸酶结合以形成核糖核蛋白(rnp)，或者引导dna与dna引导核酸酶结合以形成脱氧核糖核蛋白(dnp)。在其他实施方案中，核酸引导核酸内切酶与包含dna:rna杂交体的引导核酸缔合。在这种情况下，与dna:rna杂交体引导物结合的核糖核蛋白(即，rna引导核酸内切酶和引导rna)、脱氧核糖核蛋白(即，dna引导核酸内切酶和引导dna)或核酸引导核酸内切酶被内化到靶细胞中。在单独的实施方案中，将引导核酸(例如，rna、dna或dna:rna杂交体)与核酸引导核酸内切酶分开递送至靶细胞，进入同一细胞。引导核酸(例如，rna、dna或dna:rna杂交体)可能在核酸引导核酸内切酶与tage剂接触后内化时已经存在于靶细胞中。
[0250]
包含配体或抗原结合蛋白的tage剂与定位在靶细胞膜上的胞外分子(例如，蛋白质、聚糖、脂质)特异性结合。例如，靶分子可以是胞外膜结合蛋白，但也可以是非蛋白分子，诸如聚糖或脂质。在一个实施方案中，胞外分子是由靶细胞表达的胞外蛋白质，诸如配体或受体。胞外靶分子可以与生物体内的特定病状或特定组织相关。以下章节中描述了与细胞膜缔合的胞外分子靶标的示例。
[0251]
定点修饰多肽还包含缀合部分，使得胞外细胞膜结合部分可以与定点修饰多肽稳定缔合(从而形成tage剂)。缀合部分在胞外细胞膜结合部分和定点修饰多肽之间提供共价或非共价键。
[0252]
在某些实施方案中，可用于本发明的tage剂的缀合部分在胞外是稳定的，防止tage分子聚集，和/或保持tage剂可在水性介质中自由溶解并处于单体状态。在转运或递送至细胞之前，tage剂是稳定的并保持完整，例如，胞外细胞膜结合部分保持与核酸引导核酸内切酶连接。
[0253]
在一个实施方案中，缀合部分是蛋白a，其中定点修饰多肽包含蛋白a，并且胞外细胞膜结合部分(例如，抗原结合蛋白)包含可以被蛋白a(例如，包含fc结构域的抗体)结合的fc区。在一个实施方案中，定点修饰多肽包含如序列表(seq id no:2)中所述的蛋白a，或其fc结合部分。
[0254]
在另一个实施方案中，缀合部分是spycatcher/spytag肽系统。例如，在某些实施方案中，定点修饰多肽包含spycatcher(例如，在n-末端或c-末端)，并且胞外细胞膜结合部分包含spytag。例如，在定点修饰多肽包含cas9的情况下，cas9可以缀合至spycatcher以形成spycatcher-cas9(seq id no:6)或cas9-spycatcher(seq id no:7)。在一个实施方案中，spytag肽序列是vptivmvdaykryk(seq id no:46)。
[0255]
可用于本文提供的tage剂中的其他缀合部分包括但不限于spycatcher标签、snoop标签、halo标签(例如，衍生自卤代烷脱卤酶)、分选酶、单体亲和素、acp标签、snap标签、或本领域已知的任何其他缀合部分。在一个实施方案中，缀合部分选自蛋白a、cbp、mbp、gst、poly(his)、生物素/链霉亲和素、v5标签、myc标签、ha标签、ne标签、his标签、flag标签、halo标签、snap标签、fc标签、nus标签、bccp、硫氧还蛋白、snooprtag、spytag、spycatcher、isopeptag、sbp标签、s标签、avitag和钙调蛋白。
[0256]
在一些实施方案中，缀合部分是化学标签。例如，化学标签可以是snap标签、clip
标签、halotag或tmp标签。在一个示例中，化学标签是snap-标签或clip-标签。snap和clip融合蛋白使几乎任何分子都能特异性地、共价附接到所关注的蛋白质。在另一个示例中，化学标签是halotag。halotag涉及一种模块化蛋白质标签化系统，该系统允许将不同分子连接到单个基因融合物上，无论是在溶液中、在活细胞中还是化学固定细胞中。在另一个示例中，化学标签是tmp-标签。
[0257]
在一些实施方案中，缀合部分是表位标签。例如，表位标签可以是多组氨酸标签，诸如六组氨酸标签(seq id no:42)或十二组氨酸、flag标签、myc标签、ha标签、gst标签或v5标签。
[0258]
取决于缀合方法，定点修饰多肽和胞外细胞膜结合部分可以各自被工程化以包含使得在接触时能够稳定缔合的互补结合对。示例性的结合部分配对包括(i)链霉亲和素结合肽(链霉亲和素结合肽；sbp)和链霉亲和素(stv)，(ii)生物素和ema(增强型单体亲和素)，(iii)spytag(st)和spycatcher(sc)，(iv)halo标签和halo标签配体，(v)和snap标签，(vi)myc标签和抗myc免疫球蛋白，(vii)flag标签和抗flag免疫球蛋白，以及(ix)ybbr标签和辅酶a群。在一些实施方案中，缀合部分选自sbp、生物素、spytag、spycatcher、halo标签、snap标签、myc标签或flag标签。
[0259]
在某些实施方案中，定点修饰多肽可选地与胞外细胞膜结合部分(例如抗原结合蛋白、配体或cpp)经由如本文所述的一个或多个接头缔合，其中接头是缀合部分。
[0260]
如本文所用，术语“接头”意指包含共价键或原子链的二价化学部分，其将胞外细胞膜结合部分共价附接至定点修饰多肽以形成tage剂。在本公开的上下文中可以使用任何已知的肽或大分子缀合方法。通常，胞外细胞膜结合部分和定点修饰多肽的共价附接需要接头具有两个反应性官能团，即反应意义上的二价。可用于附接两个或更多个功能部分或生物活性部分(诸如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原和报告基团)的二价接头试剂是已知的，并且用于这种缀合的方法已在例如hermanson,g.t.(1996)bioconjugate techniques；academic press:new york,第234-242页中描述，由于涉及适于共价缀合的接头，而将该文献的公开内容通过引用并入本文。另外的接头公开于例如tsuchikama,k.和zhiqiang,a.protein and cell,9(1),第33-46页,(2018)中，由于涉及适于共价缀合的接头，而将该文献的公开内容通过引用并入本文。
[0261]
通常，适用于所公开的组合物和方法中的接头在循环中是稳定的，但允许胞外细胞膜结合部分和/或定点修饰多肽在靶细胞中或可选地紧邻靶细胞释放。适于本公开的接头可以广泛地归类为不可切割的或可切割的，以及胞内或胞外的，下文进一步描述了其中的每一种。
[0262]
不可切割的接头
[0263]
在一些实施方案中，将胞外细胞膜结合部分与定点修饰多肽缀合的接头是不可切割的。不可切割的接头包含抗降解(例如，蛋白水解)的稳定化学键。通常，不可切割的接头需要在靶细胞内进行蛋白水解降解，并表现出高的胞外稳定性。适用于本文的不可切割接头可进一步包含选自以下的一个或多个基团：键、-(c＝o)-、c
1-c6亚烷基、c
1-c6亚杂烷基、c
2-c6亚烯基、c
2-c6亚杂烯基、c
2-c6亚炔基、c
2-c6亚杂炔基、c
3-c6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、杂亚芳基及其组合，它们中的每一个都可以任选地被取代，和/或可以包含一个或多个杂原子(例如，s、n或o)代替一个或多个碳原子。此类基团的非限制性示例包括亚烷基
(ch2)
p
、(c＝o)(ch2)
p
和聚乙二醇(peg；(ch2ch2o)
p
)单元，其中p是针对每个情况独立地选择的1-6的整数。在抗体-药物缀合中利用的不可切割接头的非限制性示例包括基于马来酰亚胺甲基环己烷甲酸酯、己酰基马来酰亚胺和乙酰基苯基丁酸的那些。
[0264]
可切割接头
[0265]
在一些实施方案中，将胞外细胞膜结合部分和定点修饰多肽缀合的接头是可切割的，使得接头的切割(例如，通过蛋白酶，诸如金属蛋白酶)因胞内或胞外(例如，在分子与细胞表面结合后)环境中的tage剂释放crispr靶向元件或抗体(或其抗原结合蛋白)，或两者。设计可切割接头是为了利用局部环境的差异，例如胞外和胞内环境，例如ph、还原电位或酶浓度，以触发靶细胞中的tage剂组分(即，胞外细胞膜结合部分(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)、定点修饰多肽或两者)的释放。通常，可切割接头在体内循环中相对稳定，但特别易于在胞内环境中通过一种或多种机制(例如，包括但不限于蛋白酶、肽酶和葡糖醛酸酶的活性)切割。本文使用的可切割接头在靶细胞外是稳定的，并且可以在靶细胞内或紧邻靶细胞的胞外膜处以某一有效速率切割。有效的接头将：(i)维持胞外细胞膜结合部分(例如抗体、配体或cpp)的特异性结合特性；(ii)允许tage剂或其组分(即定点修饰多肽)的胞内或胞外递送；(iii)保持稳定和完整，即不被切割，直到tage剂被递送或转运到其靶位点；(iv)维持定点修饰多肽的基因靶向效应(例如，crispr)。tage剂的稳定性可以通过标准分析技术测量，诸如质谱、通过尺寸排阻色谱法的尺寸测定或通过动态光散射的扩散常数测量、hplc和分离/分析技术lc/ms。
[0266]
合适的可切割接头包括可以通过例如酶水解、光解、酸性条件下的水解、碱性条件下的水解、氧化、二硫化物还原、亲核切割或有机金属切割来切割的那些接头(参见例如leriche等人,bioorg.med.chem.,20:571-582,2012，由于涉及适于共价缀合的接头，而将该文献的公开内容通过引用并入本文)。合适的可切割接头可包含例如化学部分，诸如肼、二硫化物、硫醚或肽。
[0267]
在酸性条件下可水解的接头包括例如腙、半卡巴腙、硫代半卡巴腙、顺式乌头酰胺(cis-aconitic amide)、原酸酯、缩醛、缩酮等。(参见例如美国专利第5,122,368号、第5,824,805号、第5,622,929号；dubowchik和walker,1999,pharm.therapeutics 83:67-123；neville等人,1989,biol.chem.264:14653-14661，由于涉及适于共价缀合的接头，而将其各自的公开内容通过引用整体并入本文。此类接头在中性ph条件(诸如血液中的那些)下相对稳定，但在低于5.5或5.0(溶酶体的近似ph)时不稳定。通常，包括此类酸不稳定的官能团的接头在胞外往往相对较不稳定。当需要胞外切割时，这种较低的稳定性可能是有利的。
[0268]
在还原条件下可切割的接头包括例如二硫化物。多种二硫化物接头是本领域已知的，包括例如可以使用sata(n-琥珀酰亚胺基-s-乙酰硫代乙酸酯)、spdp(n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)、spdb(n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)和smpt(n-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)甲苯)、spdb和smpt形成的那些(参见例如thorpe等人,1987,cancer res.47:5924-5931；wawrzynczak等人,immunoconjugates:antibody conjugates in radioimagery and therapy of cancer(c.w.vogel编,oxford u.press,1987)。另外参见美国专利第4,880,935号，由于涉及适于共价缀合的接头，而将其各自的公开内容通过引用整体并入本文。基于二硫化物的接头在血浆循环中往往相对不稳定，然而，这种较低的稳定性在需要胞外切割的情况下可能是有
利的。也可以通过例如在二硫化物部分附近引入空间位阻来调节对切割的易感性以阻碍还原切割。
[0269]
对酶水解易感的接头可以是例如被胞内肽酶或蛋白酶切割的含肽接头，包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶。在一些实施方案中，肽基接头的长度为至少两个氨基酸或至少三个氨基酸。示例性氨基酸接头包括二肽、三肽、四肽或五肽。合适的肽的示例包括含有诸如缬氨酸、丙氨酸、瓜氨酸(cit)、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸等的氨基酸的那些。包含氨基酸接头组分的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物(诸如瓜氨酸)。示例性二肽包括缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)和丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。在一些实施方案中，接头包括二肽，诸如val-cit、ala-val或phe-lys、val-lys、ala-lys、phe-cit、leu-cit、ile-cit、phe-arg或trp-cit。含有诸如val-cit或phe-lys等的二肽的接头公开于例如美国专利第6,214,345号中，由于涉及适于共价缀合的接头，而将其公开内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，接头包括选自val-ala和val-cit的二肽。在某些实施方案中，包含肽部分的接头可对胞内和胞外不同程度的切割易感。因此，在一些实施方案中，接头包含二肽，并且tage剂基本上在胞外切割。因此，在一些实施方案中，接头包含二肽，并且tage剂在胞外是稳定的并且在胞内被切割。
[0270]
适于将本文公开的胞外细胞膜结合部分(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)与本文公开的定点修饰多肽缀合的接头包括能够通过1,6-消除过程释放胞外细胞膜结合部分(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)或定点修饰多肽的那些。能够进行这种消除过程的化学部分包括对氨基苄基(pab)基团、6-马来酰亚胺己酸、ph敏感碳酸酯和如jain等人,pharm.res.32:3526-3540,2015中所述的其他试剂，由于涉及适于共价缀合的接头，而将该文献的公开内容通过引用整体并入本文。
[0271]
在一些实施方案中，接头包含“自毁(self-immolative)”基团，诸如前述pab或pabc(对氨基苄氧基羰基)，其公开于例如carl等人,j.med.chem.(1981)24:479-480；chakravarty等人(1983)j.med.chem.26:638-644；us 6214345；us20030130189；us20030096743；us6759509；us20040052793；us6218519；us6835807；us6268488；us20040018194；w098/13059；us20040052793；us6677435；us5621002；us20040121940；w02004/032828中。能够进行该过程的其他此类化学部分(“自毁接头”)包括氨基甲酸亚甲基酯和杂芳基，诸如氨基噻唑、氨基咪唑、氨基嘧啶等。含有此类杂环自毁基团的接头公开于例如美国专利公布第20160303254号和第20150079114号以及美国专利第7,754,681号；hay等人(1999)bioorg.med.chem.lett.9:2237；us 2005/0256030；de groot等人(2001)j.org.chem.66:8815-8830；和us 7223837中。在一些实施方案中，二肽与自毁接头组合使用。
[0272]
适用于本文的接头可进一步包含选自以下的一个或多个基团：c
1-c6亚烷基、c
1-c6亚杂烷基、c
2-c6亚烯基、c
2-c6亚杂烯基、c
2-c6亚炔基、c
2-c6亚杂炔基、c
3-c6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、杂亚芳基及其组合，它们中的每一个都可以任选地被取代。此类基团的非限制性示例包括(ch2)
p
、(ch2ch2o)
p
和-(c＝o)(ch2)
p-单元，其中p是针对每个情况独立地选择的1-6的整数。
[0273]
在一些实施方案中，接头可包括以下中的一种或多种：肼、二硫化物、硫醚、二肽、
对氨基苄基(pab)基团、杂环自毁基团、任选取代的c
1-c6烷基、任选取代的c
1-c6杂烷基、任选取代的c
2-c6烯基、任选取代的c
2-c6杂烯基、任选取代的c
2-c6炔基、任选取代的c
2-c6杂炔基、任选取代的c
3-c6环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、溶解度增强基团、酰基、-(c＝o)-或-(ch2ch2o)
p-基团，其中p是1-6的整数。本领域技术人员将认识到，所列基团中的一种或多种可以以二价(双基)物质的形式存在，例如c
1-c6亚烷基等。
[0274]
在一些实施方案中，接头包括对氨基苄基(pab)。在一个实施方案中，对氨基苄基位于细胞毒性药物与接头中的蛋白酶切割位点之间。在一个实施方案中，对氨基苄基是对氨基苄氧基羰基单元的一部分。在一个实施方案中，对氨基苄基是对氨基苄基氨基单元的一部分。
[0275]
在一些实施方案中，接头包括pab、val-cit-pab、val-ala-pab、val-lys(ac)-pab、phe-lys-pab、phe-lys(ac)-pab、d-val-leu-lys、gly-gly-arg、ala-ala-asn-pab或ala-pab。在一些实施方案中，接头包括以下中的一种或多种的组合：肽、寡糖、-(ch2)
p-、-(ch2ch2o)
p-、pab、val-cit-pab、val-ala-pab、val-lys(ac)-pab、phe-lys-pab、phe-lys(ac)-pab、d-val-leu-lys、gly-gly-arg、ala-ala-asn-pab或ala-pab。
[0276]
合适的接头可以被调节溶解度或反应性的基团取代。合适的接头可包含具有溶解度增强特性的基团。例如，包含(ch2ch2o)
p
单元(聚乙二醇，peg)的接头可以增强溶解度，正如被氨基、磺酸、膦酸或磷酸残基取代的烷基链一样。包含此类部分的接头公开于例如美国专利第8,236,319号和第9,504,756号中，由于涉及适于共价缀合的接头，这些专利各自的公开内容通过引用并入本文。包含此类基团的接头描述于例如美国专利第9,636,421号和美国专利申请公布第2017/0298145号中，由于涉及适于共价缀合的接头，而将这些专利的公开内容通过引用并入本文。
[0277]
用于共价缀合如本文公开的胞外细胞膜结合部分和定点修饰多肽的合适接头可以具有两个反应性官能团(即，两个反应性末端)，一个用于与胞外细胞膜结合部分缀合，另一个用于与定点修饰多肽缀合。在某些实施方案中，用于缀合在胞外细胞膜结合部分上的合适位点是亲核的，诸如硫醇、氨基或羟基。可存在于如本文公开的胞外细胞膜结合部分(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)内的反应性(例如，亲核)位点包括但不限于氨基酸残基上的亲核取代基，诸如(i)n-末端胺基团，(ii)侧链胺基团，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸，(iv)侧链羟基，例如丝氨酸；或(iv)糖羟基或氨基，其中所述抗体被糖基化。用于缀合在胞外细胞膜结合部分上的适合位点包括但不限于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基部分；赖氨酸残基的氨基部分；天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基部分；和半胱氨酸残基的硫醇部分，以及非天然存在的氨基酸的炔丙基、叠氮基、卤代芳基(例如，氟芳基)、卤代杂芳基(例如，氟杂芳基)、卤代烷基和卤代杂烷基部分。因此，在某些实施方案中，接头上的抗体缀合反应性末端是硫醇反应性基团(诸如双键(如在马来酰亚胺中))、离去基团(诸如氯、溴、碘)或r-硫烷基、或羧基。
[0278]
在某些实施方案中，用于缀合在定点修饰多肽上的合适位点也可以是亲核的。可存在于如本文公开的定点修饰多肽内的反应性(例如，亲核)位点包括但不限于氨基酸残基上的亲核取代基，诸如(i)n-末端胺基团，(ii)侧链胺基团，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸，(iv)侧链羟基，例如丝氨酸；或(iv)糖羟基或氨基，其中所述抗体被糖基化。用于缀合在定点修饰多肽上的合适位点包括但不限于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的
羟基部分；赖氨酸残基的氨基部分；天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基部分；和半胱氨酸残基的硫醇部分，以及非天然存在的氨基酸的炔丙基、叠氮基、卤代芳基(例如，氟芳基)、卤代杂芳基(例如，氟杂芳基)、卤代烷基和卤代杂烷基部分。因此，在某些实施方案中，接头上的定点修饰多肽缀合反应性末端是硫醇反应性基团(诸如双键(如在马来酰亚胺中))、离去基团(诸如氯、溴、碘)或r-硫烷基、或羧基。
[0279]
在一些实施方案中，附接至接头的反应性官能团是亲核基团，其与胞外细胞膜结合部分(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)、定点修饰多肽或两者上存在的亲电子基团反应。胞外细胞膜结合部分(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)或定点修饰多肽上的有用亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。亲核基团的杂原子可以与胞外细胞膜结合部分(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)或定点修饰多肽上的亲电子基团反应，并与胞外细胞膜结合部分(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)或定点修饰多肽形成共价键。有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、羟基、肼、硫代半卡巴腙、羧酸肼和芳酰肼。
[0280]
在一些实施方案中，本文公开的tage剂包含核苷或核苷酸。用于缀合在此类核苷或核苷酸上的合适位点分别包括-oh或磷酸酯基团。适用于此类实施方案的接头和缀合方法公开于例如wang,t.p.等人,bioconj.chem.21(9),1642-55,2010以及bernardinelli,g.和hogberg,b.nucleic acids research,45(18),第e160页(于2017年8月16日在线发表)中，由于涉及适于共价缀合的接头，而将这些文献各自的公开内容通过引用并入本文。
[0281]
当使用术语“接头”来描述缀合形式的接头时，因为接头与胞外细胞膜结合部分之间和/或接头与定点修饰多肽之间形成键，反应性末端中的一个或两个都将不存在(已转化为化学部分)或不完整(诸如仅是羧酸的羰基)。因此，本文中有用的接头包括但不限于如下接头，所述接头含有通过接头上的反应性官能团与胞外细胞膜结合部分上的亲核基团或其他反应性取代基(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)之间的偶联反应形成的化学部分，以及通过接头上的反应性官能团与定点修饰多肽上的亲核基团之间的偶联反应形成的化学部分。
[0282]
这些偶联反应形成的化学部分的示例是由化学反应性官能团之间的反应产生的，包括亲核体/亲电体对(例如，硫醇/卤代烷基对、胺/羰基对或硫醇/α,β-不饱和羰基对等)、二烯/亲二烯体对(例如，叠氮化物/炔烃对或二烯/α,β-不饱和羰基对等)等。反应性官能团之间形成化学部分的偶联反应包括但不限于硫醇烷基化、羟基烷基化、胺烷基化、胺或羟胺缩合、肼形成、酰胺化、酯化、二硫化物形成、环加成(例如，[4 2]diels-alder环加成、[3 2]huisgen环加成等)、亲核芳族取代、亲电子芳族取代和本领域已知的或本文所述的其他反应形式。合适的接头可含有亲电子官能团，用于与胞外细胞膜结合部分(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)、定点修饰多肽或两者上的亲核官能团反应。
[0283]
在一些实施方案中，本文公开的胞外细胞膜结合部分、定点修饰多肽或两者内存在的反应性官能团是胺或硫醇部分。某些胞外细胞膜结合部分具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。通过用还原剂诸如dtt(二硫苏糖醇)处理，可以使胞外细胞膜结合部分反应以与接头试剂缀合。因此，理论上每个半胱氨酸桥将形成两个反应性硫醇亲核体。通过赖氨酸与2-亚氨基硫杂环戊烷(traut试剂)反应导致胺转化为硫醇，可以将另外的亲核基团引入胞外细胞膜结合部分(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)中。通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如，制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的
突变抗体)，可以将反应性硫醇基团引入胞外细胞膜结合部分(抗原结合蛋白、配体或cpp)中。美国专利第7,521,541号教示了通过引入反应性半胱氨酸氨基酸来工程化抗体。
[0284]
适于合成如本文公开的共价缀合物的接头包括但不限于反应性官能团，诸如马来酰亚胺或卤代烷基。这些基团可以存在于接头或交联试剂中，除其他事项外，诸如4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-甲酸琥珀酰亚胺酯(smcc)、碘乙酸n-琥珀酰亚胺酯(sia)、磺基-smcc、间马来酰亚胺苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯(mbs)、磺基-mbs和碘乙酸琥珀酰亚胺酯，其描述于例如liu等人,18:690-697,1979中，由于涉及用于共价缀合的接头，而将该文献的公开内容通过引用并入本文。
[0285]
在一些实施方案中，附接至接头的反应性官能团中的一者或两者是马来酰亚胺、叠氮化物或炔烃。含马来酰亚胺的接头的一个示例是不可切割的基于马来酰亚胺基己酰基的接头。doronina等人,bioconjugate chem.17:14-24,2006描述了此类接头，由于涉及用于共价缀合的接头，而将该文献的公开内容通过引用并入本文。
[0286]
在一些实施方案中，反应性官能团是-(c＝o)-或-nh(c＝o)-，使得接头可以通过酰胺或脲部分与胞外细胞膜结合部分或定点修饰多肽连接，分别起因于-(c＝o)-或-nh(c＝o)-基团与胞外细胞膜结合部分或定点修饰多肽或两者的氨基反应。
[0287]
在一些实施方案中，反应性官能团是n-马来酰亚胺基、卤化n-烷基氨基、磺酰氧基n-烷基氨基、碳酸基团、磺酰卤基团、硫醇基团或其衍生物、包含内部碳-碳三键的炔基、(het-ero)环炔基、双环[6.1.0]非4-yn-9-yl基团、包含内部碳-碳双键的烯基、环烯基、四嗪基、氮杂基、膦基、氧化腈基团、硝酮基团、腈亚胺基团、重氮基、酮基团、(o-烷基)羟基氨基、肼基团、卤化n-马来酰亚胺基、1,1-双(磺酰基甲基)甲基羰基或其消除衍生物、羰酰卤基团或联烯基酰胺(allenamide)基团，这些基团中的每一个都可以是任选地取代的。在一些实施方案中，反应性官能团包括环烯基、环炔基或任选取代的(杂)环炔基。
[0288]
适于制备本文公开的缀合物的合适二价接头试剂的示例包括但不限于4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸n-琥珀酰亚胺酯(smcc)、作为smcc的“长链”类似物的n-琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-胺基己酸酯)(lc-smcc)、κ-马来酰亚胺基十一酸n-琥珀酰亚胺酯(kmua)、γ-马来酰亚胺基丁酸n-琥珀酰亚胺酯(gmbs)、ε-马来酰亚胺基己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(emc)、m-马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯(mbs)、n-(α-马来酰亚胺基甲氧基)-琥珀酰亚胺酯(amas)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(smph)、4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸n-琥珀酰亚胺酯(smpb)和n-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(pmpi)。包含基于卤代乙酰基的部分的交联试剂包括n-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(siab)、n-碘乙酸琥珀酰亚胺酯(sia)、n-溴乙酸琥珀酰亚胺酯(sba)和3-(溴乙酰胺基)丙酸n-琥珀酰亚胺酯(sbap)。
[0289]
本领域技术人员将认识到，本文公开的化学基团、部分和特征中的任一者或多者可以以多种方式组合，以形成可用于将如本文公开的胞外细胞膜结合部分与如本文公开的定点修饰多肽缀合的接头。可与本文所述的组合物和方法结合使用的另外的接头描述于例如美国专利申请公布第2015/0218220号中，由于涉及适于共价缀合的接头，而将该专利的公开内容通过引用并入本文。
[0290]
iii.tage剂的定点修饰多肽
[0291]
tage剂包含定点修饰多肽，诸如核酸引导核酸内切酶(例如，rna引导核酸内切酶
(例如，cas9)或dna引导核酸内切酶)，其识别靶细胞中的核酸序列。
[0292]
本发明公开的组合物和方法中使用的定点修饰多肽是特异性的，因为多肽本身或相关分子识别并靶向特定的核酸序列或一组类似序列(即，一个或多个靶序列)。在一些实施方案中，定点修饰多肽(或其相关分子)识别包含可在一个或多个位置简并的保守碱基或基序的在序列上类似的序列。
[0293]
在特定实施方案中，定点修饰多肽在其靶序列外的一个或多个特定位置(即，修饰位点)处修饰多核苷酸。由特定定点修饰多肽修饰的一个或多个修饰位点通常也对特定序列或相似序列组具有特异性。在这些实施方案的一些中，定点修饰多肽修饰包含可在一个或多个位置简并的保守碱基或基序的在序列上类似的序列。在其他实施方案中，定点修饰多肽相对于所述一个或多个靶序列修饰在特定位置内的序列。例如，定点修饰多肽可以修饰所述一个或多个靶序列上游或下游特定数量的核酸内的序列。
[0294]
如本文所用，关于定点修饰多肽，术语“修饰”意指修饰位点中至少一个核苷酸的任何插入、缺失、取代或化学修饰，或可选地邻近靶位点的基因的表达变化。所述修饰位点中至少一个核苷酸的取代可能是由于碱基编辑结构域的募集，诸如胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶结构域(参见例如eid等人(2018)biochem j 475(11):1955-1964，该文献整体并入本文)。
[0295]
邻近靶位点的基因的表达变化可能是由于转录激活结构域或转录阻遏结构域募集到基因的启动子区域或共价修饰dna或组蛋白的表观遗传修饰结构域的募集以改变组蛋白结构和/或染色体结构而不改变dna序列，导致相邻基因的基因表达发生变化。术语“修饰”还涵盖将可缀合至定点修饰多肽或相关分子(例如，grna)的可检测标记募集到靶位点，从而允许检测特定核酸序列(例如，疾病相关序列)。
[0296]
在一些实施方案中，定点修饰多肽是核酸酶或其变体，并且包含核酸酶或其变体的剂因此在本文中称为基因编辑细胞靶向(tage)剂。如本文所用，“核酸酶”是指切割多核苷酸链的骨架中的磷酸二酯键的酶。用于本发明公开的组合物和方法的合适核酸酶可以具有核酸内切酶和/或核酸外切酶活性。核酸外切酶从多核苷酸链的一端一次切割一个核苷酸。核酸内切酶通过切割多核苷酸链内的磷酸二酯键而不是多核苷酸链两端处的磷酸二酯键来切割多核苷酸链。核酸酶可以切割rna多核苷酸链(即，核糖核酸酶)和/或dna多核苷酸链(即，脱氧核糖核酸酶)。
[0297]
核酸酶切割多核苷酸链，产生切割位点。如本文所用，术语“切割”是指多核苷酸链的骨架内的磷酸二酯键的水解。通过本发明公开的tage剂的核酸酶进行的切割可以是单链或双链的。在一些实施方案中，dna的双链切割是通过用两种核酸酶切割来实现的，其中每种核酸酶切割dna的单链。核酸酶的切割可导致钝端或交错末端。
[0298]
适于本发明公开的组合物和方法的核酸酶的非限制性示例包括大范围核酸酶，诸如归巢核酸内切酶；限制性核酸内切酶，诸如iis型核酸内切酶(例如，foki))；锌指核酸酶；转录激活因子样效应子核酸酶(talen)和核酸引导核酸酶(例如，rna引导核酸内切酶、dna引导核酸内切酶或dna/rna引导核酸内切酶)。
[0299]
如本文所用，“大范围核酸酶”是指长度大于12个碱基对的靶序列处结合dna的核酸内切酶。大范围核酸酶作为异源二聚体与双链dna结合。用于本发明公开的组合物和方法的合适的大范围核酸酶包括归巢核酸内切酶，诸如包含该氨基酸基序的属于laglidadg
(seq id no:44)家族的那些或其变体。
[0300]
如本文所用，“锌指核酸酶”或“zfn”是指包含与来自核酸外切酶或核酸内切酶(诸如限制性核酸内切酶或大范围核酸酶)的核酸酶结构域融合的锌指dna结合结构域的嵌合蛋白。锌指dna结合结构域由用以稳定独特的结构的锌离子结合。
[0301]
如本文所用，“转录激活因子样效应子核酸酶”或“talen”是指包含如下dna结合结构域的嵌合蛋白，所述dna结合结构域包含与来自外切核酸酶或核酸内切酶(诸如限制性核酸内切酶或核酸内切酶)的核酸酶结构域融合的多个tal结构域重复。tal结构域重复可以衍生自变形菌门黄单胞菌属(xanthomonas)的tale蛋白质家族。tal结构域重复是33-34个氨基酸的序列，具有高变的第12个和第13个氨基酸，被称为重复可变双残基(rvd)。rvd赋予靶序列结合的特异性。tal结构域重复可以通过合理或实验手段工程化，以产生具有特定靶序列特异性的变体talen(参见例如boch等人(2009)science326(5959):1509-1512以及moscou和bogdanove(2009)science326(5959):1501，这些文献各自通过引用整体并入)。talen对dna的切割需要两个位于非特异性间隔子区域侧翼的dna靶序列，其中每个dna靶序列都由talen单体结合。在一些实施方案中，talen包含紧凑型talen，其是指包含dna结合结构域的核酸内切酶，其中一个或多个tal结构域重复以任何方向与归巢核酸内切酶的任何部分融合(例如，i-tevi、mmei、enda、end1、i-basi、i-tevii、i-teviii、i-twoi、mspi、mvai、nuca和nucm)。紧凑型talen的优势在于它们不需要二聚化以具有dna加工活性，因此仅需要单一靶位点。
[0302]
如本文所用，“核酸引导核酸酶”是指基于与核酸酶缔合的引导核酸(即，引导rna或grna、引导dna或gdna、或引导dna/rna杂交体)与靶序列之间的互补性(完全或部分)指导至特定靶序列的核酸酶。引导rna与靶序列之间的结合用以将核酸酶募集到靶序列附近。适于本发明公开的组合物和方法的核酸引导核酸酶的非限制性示例包括来自原核生物(例如细菌、古细菌)的天然存在的规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)相关(cas)多肽或其变体。在原核生物内发现的crispr序列是衍生自入侵病毒的多核苷酸片段的序列，并且用于在随后的感染期间识别类似病毒，并通过crispr相关(cas)多肽切割病毒多核苷酸，所述多肽用作rna引导核酸酶切割病毒多核苷酸。如本文所用，“crispr相关多肽”或“cas多肽”是指在天然存在的crispr系统内的crispr序列附近发现的天然存在的多肽。某些cas多肽用作rna引导核酸酶。
[0303]
至少有两类天然存在的crispr系统，1类和2类。一般而言，本发明公开的组合物和方法的核酸引导核酸酶是2类cas多肽或其变体，鉴于2类crispr系统包含具有核酸引导核酸酶活性的单个多肽，而1类crispr系统需要蛋白质复合物以具有核酸酶活性。已知的2类crispr系统至少有3种类型，ii型、v型和vi型，其中有多个亚型(亚型ii-a、ii-b、ii-c、va、vb、vc、vi-a、vi-b和vi-c，以及其他未定义的或假定的子类型)。一般而言，ii型和v-b型系统除crrna外还需要tracrrna才具有活性。相比之下，v-a型和vi型仅需要crrna才具有活性。所有已知的ii型和v型rna引导核酸酶靶向双链dna，而所有已知的vi型rna引导核酸酶靶向单链rna。ii型crispr系统的rna引导核酸酶在本文和文献中被称为cas9。在一些实施方案中，本发明公开的组合物和方法的核酸引导核酸酶是ii型cas9蛋白或其变体。用作rna引导核酸酶的v型cas多肽不需要tracrrna来靶向和切割靶序列。在本文和文献中，va型crispr系统的rna引导核酸酶被称为cpf1；vb型crispr系统被称为c2c1；vc型crispr系统被
称为cas12c或c2c3；via型crispr系统被称为c2c2或cas13a1；vib型crispr系统被称为cas13b；并且vic型crispr系统被称为cas13a2。在某些实施方案中，本发明公开的组合物和方法的核酸引导核酸酶是va型cpf1蛋白或其变体。用作核酸引导核酸酶的天然存在的cas多肽及其变体是本领域已知的，并且包括但不限于化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)cas9、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)cas9、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)cas9、新凶手弗朗西斯菌(francisella novicida)cpf1或者shmakov等人(2017)nat rev microbiol 15(3):169-182；makarova等人(2015)nat rev microbiol 13(11):722-736；和美国专利第9790490号(这些各自整体并入本文)中描述的那些。2类v型crispr核酸酶包括cas12和cas12的任何亚型，诸如cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas12f、cas12g、cas12h和cas12i。包含cas13的2类vi型crispr核酸酶可包含在tage剂中，以便切割rna靶序列。
[0304]
本发明公开的组合物和方法的核酸引导核酸酶可以是天然存在的核酸引导核酸酶(例如，化脓性链球菌cas9)或其变体。变体核酸引导核酸酶可以是包含氨基酸取代、缺失或添加的工程化的或天然存在的变体，例如，所述氨基酸取代、缺失或添加改变一个或多个核酸酶结构域的活性，将核酸引导核酸酶与赋予修饰特性(例如，转录激活结构域、表观遗传修饰结构域、可检测标记)的异源结构域融合，修饰核酸酶的稳定性，或修饰核酸酶的特异性。
[0305]
在一些实施方案中，核酸引导核酸酶包含一个或多个突变，以改善对靶位点的特异性和/或胞内微环境中的稳定性。例如，当蛋白质是cas9(例如，spcas9)或修饰的cas9时，使rec2结构域的从n175到r307(包括端点)的任何或所有残基缺失可能是有益的。可发现较小或较低分子量的核酸酶版本更有效。在一些实施方案中，核酸酶相对于所述核酸酶的天然存在形式包含至少一个取代。例如，当蛋白质是cas9或修饰的cas9时，使c80或c574(或其同源物，在具有插入缺失(indel)的修饰的蛋白质中)突变可能是有益的。在cas9中，理想的取代可以包括c80a、c80l、c80i、c80v、c80k、c574e、c574d、c574n、c574q(按任何组合)中的任一个，特别是c80a。可以包含取代以减少核酸酶的胞内蛋白质结合和/或增加靶位点特异性。另外或可选地，可以包含取代以减少组合物的脱靶毒性。
[0306]
核酸引导核酸酶通过其与引导核酸(例如，引导rna(grna)、引导dna(gdna))的缔合而针对特定靶序列。核酸引导核酸酶通过非共价相互作用与引导核酸结合，从而形成复合物。多核苷酸靶向核酸通过包含与靶序列的序列互补的核苷酸序列为复合物提供靶标特异性。复合物的核酸引导核酸酶或者与其融合或以其他方式缀合的结构域或标记提供位点特异性活性。换言之，核酸引导核酸酶被引导至靶多核苷酸序列(例如染色体核酸中的靶序列；染色体外核酸中的靶序列，例如游离型核酸、微环；线粒体核酸中的靶序列；叶绿体核酸中的靶序列；质粒中的靶序列)，因为它与多核苷酸靶向引导核酸的蛋白质结合区段缔合。
[0307]
因此，引导核酸包含两个区段，即“多核苷酸靶向区段”和“多肽结合区段”。“区段”意指分子的区段/节段/区域(例如，rna中的一段连续核苷酸)。区段还可以指复合物的区域/节段，使得区段可以包含多于一个分子的区域。例如，在一些情况下，多核苷酸靶向核酸的多肽结合区段(如下所述)仅包含一个核酸分子，并且多肽结合区段因此包含该核酸分子的一个区域。在其他情况下，dna靶向核酸的多肽结合区段(如下所述)包含沿着互补区域杂交的两个单独的分子。
[0308]
多核苷酸靶向区段(或“多核苷酸靶向序列”或“引导序列”)包含与靶序列(例如，靶dna的互补链)内的特定序列互补(完全或部分)的核苷酸序列。多肽结合区段(或“多肽结合序列”)与核酸引导核酸酶相互作用。一般而言，核酸引导核酸酶对靶dna的位点特异性切割或修饰发生在由(i)核酸的多核苷酸靶向序列与靶dna之间的碱基配对互补性、(ii)靶dna中的短基序(称为原型间隔子相邻基序(pam))确定的位置处。
[0309]
原型间隔子相邻基序可以具有不同长度并且可以与靶序列相距可变距离，尽管pam通常在距靶序列约1至约10个核苷酸内，包括距靶序列约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个核苷酸。pam可以在靶序列的5'或3'。通常，pam是约3-4个核苷酸的共有序列，但在特定实施方案中，其长度可为2、3、4、5、6、7、8、9或更多个核苷酸。用于鉴定给定rna引导核酸酶的优选pam序列或共有序列的方法是本领域已知的并且包括但不限于karvelis等人(2015)genome biol 16:253描述的pam耗减测定，或pattanayak等人(2013)nat biotechnol 31(9):839-43公开的测定，这些文献各自通过引用整体并入。
[0310]
多核苷酸靶向序列(即，引导序列)是与所关注的靶序列直接杂交的核苷酸序列。引导序列被工程化为与所关注的靶序列完全或部分互补。在各个实施方案中，引导序列可包含约8个核苷酸至约30个核苷酸或更多。例如，引导序列的长度可以为约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，引导序列的长度为约10至约26个核苷酸，或长度为约12至约30个核苷酸。在特定实施方案中，引导序列的长度为约30个核苷酸。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法最佳比对时，引导序列与其对应的靶序列之间的互补程度为约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多，或大于约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多。在特定实施方案中，引导序列不含二级结构，其可使用本领域已知的任何合适的多核苷酸折叠算法预测，包括但不限于mfold(参见例如zuker和stiegler(1981)nucleic acids res.9:133-148)和rnafold(参见例如gruber等人(2008)cell 106(1):23-24)。
[0311]
在一些实施方案中，引导核酸包含两个单独的核酸分子(“激活因子-核酸”和“靶向物-核酸”，参见下文)并且在本文中被称为“双分子引导核酸”或“两分子引导核酸”。在其他实施方案中，主题引导核酸是单核酸分子(单多核苷酸)并且在本文中被称为“单分子引导核酸”、“单引导核酸”或“sgna”。术语“引导核酸”或“gna”是包含性的，指双分子引导核酸和单分子引导核酸(即，sgna)两者。在其中引导核酸是rna的那些实施方案中，grna可以是双分子引导rna或单引导rna。同样，在其中引导核酸是dna的那些实施方案中，gdna可以是双分子引导dna或单引导dna。
[0312]
示例性的双分子引导核酸包括crrna样(“crispr rna”或“靶向物-rna”或“crrna”或“crrna重复”)分子和对应的tracrrna样(“反式作用crispr rna”或“激活因子-rna”或“tracrrna”)分子。crrna样分子(靶向物-rna)包含引导rna的多核苷酸靶向区段(单链)和形成引导rna的多肽结合区段的dsrna双链体的一半的一段核苷酸(“双链体形成区段”)两者，在本文中也称为crispr重复序列。
[0313]
术语“激活因子-核酸”或“激活因子-na”在本文中用于意指双分子引导核酸的tracrrna样分子。术语“靶向物-核酸”或“靶向物-na”在本文中用于表示双分子引导核酸的crrna样分子。术语“双链体形成区段”在本文中用于意指激活因子-na或靶向物-na的一段核苷酸，其通过与对应激活因子-na或靶向物-na分子的一段核苷酸杂交而有助于dsrna双链体的形成。换言之，激活因子-na包含与对应靶向物-na的双链体形成区段互补的双链体形成区段。因此，激活因子-na包含双链体形成区段，而靶向物-na包含引导核酸的双链体形成区段和dna靶向区段两者。因此，主题双分子引导核酸可以由任何对应的激活因子-na和靶向物-na对组成。
[0314]
激活因子-na包含含有如下核苷酸序列的crispr重复序列，所述核苷酸序列包含具有足够互补性以与激活因子-na杂交的区域(引导核酸的多肽结合区段的另一部分)。在各个实施方案中，crispr重复序列可包含约8个核苷酸至约30个核苷酸或更多。例如，crispr重复序列的长度可以为约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法最佳比对时，crispr重复序列与其对应的tracr序列的抗重复区之间的互补程度为约或大于约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多。
[0315]
对应的tracrrna样分子(即，激活因子-na)包含形成引导核酸的多肽结合区段的双链双链体的另一部分的一段核苷酸(双链体形成区段)。换言之，crrna样分子的一段核苷酸(即crispr重复序列)与tracrrna样分子的一段核苷酸(即抗重复序列)互补并杂交以形成引导核酸的多肽结合结构域的双链双链体。crrna样分子另外提供单链dna靶向区段。因此，crrna样和tracrrna样分子(作为对应的对)杂交形成引导核酸。给定crrna或tracrrna分子的确切序列是crispr系统和其中发现所述rna分子的物质的特征。主题双分子引导rna可以包含任何对应的crrna和tracrrna对。
[0316]
反式激活样crisprrna或tracrrna样分子(在本文中也称为“激活因子-na”)包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列包含具有足够互补性以与crrna的crispr重复序列杂交的区域，其在本文中称为抗重复区。在一些实施方案中，tracrrna样分子进一步包含具有二级结构(例如，茎环)的区域，或者在与其对应的crrna杂交时形成二级结构。在特定实施方案中，tracrrna样分子的与crispr重复序列完全或部分互补的区域在所述分子的5'端，并且所述tracrrna样分子的3'端包含二级结构。具有二级结构的该区域通常包含几种发夹结构，包括nexus发夹，其被发现与抗重复序列相邻。nexus发夹通常在发夹茎的底部具有保守的核苷酸序列，其中在tracrrna的许多nexus发夹中发现基序unannc。tracrrna的3'端通常有在结构和数量上可以变化但通常包含富含gc的rho非依赖性转录终止子发夹，随后在3'端有一串u'的终止发夹。参见例如briner等人(2014)molecular cell 56:333-339，briner和barrangou(2016)cold spring harb protoc；doi:10.1101/pdb.top090902以及美国公布第2017/0275648号，这些各自通过引用整体并入本文。
[0317]
在各个实施方案中，与crispr重复序列完全或部分互补的tracrrna样分子的抗重复区包含约8个核苷酸至约30个核苷酸或更多。例如，tracrrna样抗重复序列与crispr重复序列之间的碱基配对区域的长度可以为约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、
约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法最佳比对时，crispr重复序列与其对应的tracrrna样抗重复序列之间的互补程度为约或大于约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多。
[0318]
在各个实施方案中，整个tracrrna样分子可包含从约60个核苷酸至多于约140个核苷酸。例如，tracrrna样分子的长度可以为约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140个或更多个核苷酸。在特定实施方案中，tracrrna样分子的长度为约80至约100个核苷酸，包括约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98、约99和约100个核苷酸。
[0319]
主题单分子引导核酸(即，sgna)包含彼此互补的两段核苷酸(靶向物-na和激活因子-na)，通过间插核苷酸(“接头”或“接头核苷酸”)共价连接并杂交形成蛋白质结合区段的双链核酸双链体，从而产生茎环结构。靶向物-na和激活因子-na可以通过靶向物-na的3'端和激活因子-na的5'端共价连接。可选地，靶向物-na和激活因子-na可以通过靶向物-na的5'端和激活因子-na的3'端共价连接。
[0320]
单分子dna靶向核酸的接头可具有从约3个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，接头的长度可以为约3个核苷酸(nt)至约90nt、约3nt至约80nt、约3nt至约70nt、约3nt至约60nt、约3nt至约50nt、约3nt至约40nt、约3nt至约30nt、约3nt至约20nt或约3nt至约10nt，包括但不限于约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，单分子dna靶向核酸的接头是4nt。
[0321]
示例性单分子dna靶向核酸包含杂交形成双链双链体的两段互补的核苷酸，连同与特定靶序列杂交的引导序列。
[0322]
已知针对大多数用作核酸引导核酸酶的cas蛋白的适当的天然存在的crrna(以及在一些实施方案中，tracrrna)的同源对，通过测序和分析cas核酸引导核酸酶蛋白的侧翼序列以通过搜索已知的抗重复编码序列或其变体来鉴定tracrrna编码序列、从而鉴定tracrrna序列，已发现或可以确定用于具有核酸引导核酸酶活性的特定天然存在的cas蛋白的所述同源对。tracrrna的抗重复区包含ds蛋白结合双链体的一半。包含ds蛋白结合双链体的一半的互补重复序列称为crispr重复。已知的crispr核酸引导核酸酶所利用的crispr重复和抗重复序列是本领域已知的并且可以在例如万维网上的crispr数据库(crispr.i2bc.paris-saclay.fr/crispr/)处找到。
[0323]
单引导核酸或双引导核酸可以化学合成或通过体外转录合成。用于确定核酸引导核酸酶与引导核酸之间的序列特异性结合的测定是本领域已知的并且包括但不限于表达的核酸引导核酸酶和引导核酸之间的体外结合测定，所述核酸引导核酸酶和引导核酸可以用可检测标记(例如，生物素)标签化并在下拉检测测定使用，其中通过可检测标记(例如，用链霉亲和素珠)捕获核蛋白复合物。具有与引导核酸无关的序列或结构的对照引导核酸可用作核酸引导核酸酶与核酸的非特异性结合的阴性对照。
[0324]
在一些实施方案中，dna靶向rna、grna或sgrna或者编码dna靶向rna、grna或sgrna
的核苷酸序列包含核苷酸序列的修饰。在一些情况下，sgrna(例如，截短的sgrna)包含与靶核酸互补的第一核苷酸序列和与cas多肽相互作用的第二核苷酸序列。在其他情况下，sgrna包含一个或多个修饰的核苷酸。在一些情况下，第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列中的一个或多个核苷酸是修饰的核苷酸。
[0325]
在一些实施方案中，修饰的核苷酸包含核糖基团、磷酸酯基团、核碱基或其组合中的修饰。在一些情况下，核糖基团中的修饰包括在核糖基团的2'位置处的修饰。在一些情况下，在核糖基团的2'位置的修饰选自2'-o-甲基、2'-氟、2'-脱氧、2'-o-(2-甲氧基乙基)及其组合。在其他情况下，磷酸酯基团中的修饰包括硫代磷酸酯修饰。在其他实施方案中，修饰的核苷酸选自由以下组成的组：2'-核糖3'-硫代磷酸酯(s)、2'-o-甲基(m)核苷酸、2'-o-甲基3'-硫代磷酸酯(ms)核苷酸、2'-o-甲基3'-thiopace(msp)核苷酸及其组合。
[0326]
在某些实施方案中，本发明公开的组合物和方法的定点修饰多肽包括用作切口酶的核酸酶变体，其中与野生型核酸酶相比，所述核酸酶包含导致所述核酸酶仅能够切割双链核酸分子的单链或完全缺乏核酸酶活性(即，核酸酶失活)的突变。
[0327]
用作切口酶的核酸酶，诸如核酸引导核酸酶，仅包含单个起作用的核酸酶结构域。在这些实施方案的一些中，另外的核酸酶结构域已突变，使得该特定结构域的核酸酶活性被减少或消除。
[0328]
在其他实施方案中，核酸酶(例如，rna引导核酸酶)完全缺乏核酸酶活性，并且在本文中被称为核酸酶失活。在这些实施方案的一些中，核酸酶内的所有核酸酶结构域都已突变，使得所述多肽的所有核酸酶活性都已被消除。可以使用本领域已知的任何方法将突变引入定点核酸酶的一个或多个核酸酶结构域中，包括美国公布第2014/0068797号和美国专利第9,790,490号所阐述的那些方法，这些专利各自通过引用整体并入。
[0329]
核酸酶结构域内的减少或消除核酸酶活性的任何突变都可用于产生具有切口酶活性的核酸引导核酸酶或核酸酶失活的核酸引导核酸酶。此类突变是本领域已知的，包括但不限于化脓链球菌cas9的ruvc结构域内的d10a突变或hnh结构域内的h840a突变或者当与化脓链球菌cas9进行最大同源性比对时在另一种核酸引导核酸酶内的类似位置处的突变。化脓性链球菌cas9的核酸酶结构域内的可突变以产生切口酶或核酸酶失活蛋白的其他位置包括g12、g17、e762、n854、n863、h982、h983和d986。可产生切口酶或核酸酶失活蛋白的核酸引导核酸酶的核酸酶结构域内的其他突变包括当与新凶手弗朗西斯菌cpf1蛋白进行最大同源性比对时，新凶手弗朗西斯菌cpf1蛋白的d917a、e1006a、e1028a、d1227a、d1255a、n1257a、d917a、e1006a、e1028a、d1227a、d1255a和n1257a突变，或者在另一种核酸引导核酸酶内的一个或多个类似位置处的突变(美国专利第9,790,490号，该专利通过引用整体并入)。
[0330]
包含核酸酶失活结构域的定点修饰多肽可进一步包含能够修饰多核苷酸的结构域。可与核酸酶失活结构域融合的修饰结构域的非限制性示例包括但不限于转录激活或阻遏结构域、碱基编辑结构域和表观遗传修饰结构域。在其他实施方案中，包含核酸酶失活结构域的定点修饰多肽进一步包含可帮助检测靶序列的存在的可检测标记。
[0331]
可以与核酸酶失活结构域融合的表观遗传修饰结构域可用于共价修饰dna或组蛋白以改变组蛋白结构和/或染色体结构，而不改变dna序列本身，从而导致基因表达的变化(上调或下调)。可以由定点修饰多肽诱导的表观遗传修饰的非限制性示例包括组蛋白残基
的以下改变及其逆反应：精氨酸或赖氨酸残基的苏素化、甲基化，赖氨酸残基的乙酰化或泛素化，丝氨酸和/或苏氨酸残基的磷酸化；以及dna的以下改变及其逆反应：胱氨酸残基的甲基化或羟甲基化。因此，表观遗传修饰结构域的非限制性示例包括组蛋白乙酰转移酶结构域、组蛋白去乙酰化结构域、组蛋白甲基转移酶结构域、组蛋白去甲基化酶结构域、dna甲基转移酶结构域和dna去甲基化酶结构域。
[0332]
在一些实施方案中，定点多肽包含转录激活结构域，其通过与转录控制元件和/或转录调节蛋白(诸如转录因子或rna聚合酶)的相互作用激活至少一个相邻基因的转录。合适的转录激活结构域是本领域已知的，并且包括但不限于vp16激活结构域。
[0333]
在其他实施方案中，定点多肽包含转录阻遏因子结构域，其还可与转录控制元件和/或转录调节蛋白(诸如转录因子或rna聚合酶)相互作用，以减少或终止至少一个相邻基因的转录。合适的转录阻遏结构域是本领域已知的，并且包括但不限于iκb和krab域。
[0334]
在仍其他实施方案中，包含核酸酶失活结构域的定点修饰多肽进一步包含可帮助检测靶序列的存在的可检测标记，所述靶序列可以是疾病相关序列。可检测标记是可以可视化或以其他方式观察到的分子。可检测标记可以与核酸引导核酸酶融合为融合蛋白(例如，荧光蛋白)，或者可以是缀合至核酸酶多肽的小分子，其可以以可视化方式或通过其他方式检测到。可与本发明公开的核酸引导核酸酶融合为融合蛋白的可检测标记包括任何可检测的蛋白结构域，包括但不限于可用特异性抗体检测的荧光蛋白或蛋白结构域。荧光蛋白的非限制性示例包括绿色荧光蛋白(例如，gfp、egfp、zsgreen1)和黄色荧光蛋白(例如，yfp、eyfp、zsyellow1)。小分子可检测标记的非限制性示例包括放射性标记，诸如3h和
35
s。
[0335]
核酸引导核酸酶可以作为tage剂的一部分，作为包含结合到其引导核酸的核酸引导核酸酶的核蛋白复合物递送至细胞。可选地，核酸引导核酸酶作为tage剂递送，并且引导核酸单独提供。在某些实施方案中，可以将引导rna作为rna分子引入靶细胞中。引导rna可以在体外转录或化学合成。在其他实施方案中，将编码引导rna的核苷酸序列引入细胞中。在这些实施方案的一些中，编码引导rna的核苷酸序列与启动子(例如，rna聚合酶iii启动子)可操作地连接，所述启动子可以是天然启动子或与编码引导rna的核苷酸序列是异源的。
[0336]
在某些实施方案中，定点多肽可包含另外的氨基酸序列，诸如至少一个核定位序列(nls)。核定位序列增强定点多肽向细胞核中的转运。输入核中的蛋白质与核孔复合物内的一种或多种蛋白质(诸如输入蛋白/核周蛋白)结合，通常与赖氨酸和精氨酸残基结合最佳。核定位的最佳表征通路涉及与输入蛋白-α蛋白结合的短肽序列。这些核定位序列通常包含多段碱性氨基酸，并且考虑到输入蛋白-α上有两个这样的结合位点，两个由至少10个氨基酸分隔的碱性序列可以构成一个二分nls。第二个最具特征的核输入通路涉及与输入蛋白-β1蛋白结合的蛋白质，诸如hiv-tat和hiv-rev蛋白，它们分别使用序列rkkrrqrrr(seq id no:11)和rqarrnrrrrwr(seq id no:39)与输入蛋白-β1结合。其他核定位序列是本领域已知的(参见例如lange等人,j.biol.chem.(2007)282:5101-5105)。nls可以是定点多肽的天然存在的nls或异源nls。如本文所用，在提及序列时，“异源”是如下的序列，源自外来物种，或者如果来自相同物种，则所述序列通过有意的人为干预在组成和/或基因组座位上从其天然形式进行了实质修饰。可用于增强定点多肽的核定位的nls序列的非限制性示例包括sv40大t-抗原和c-myc的nls。在某些实施方案中，nls包含氨基酸序列pkkkrkv
(seq id no:10)。
[0337]
定点多肽可包含多于一个nls，诸如两个、三个、四个、五个、六个或更多个nls序列。多个nls中的每一个在序列上都可以是唯一的，或者使用的可以是具有相同nls序列的多于一个nls。nls可以在定点多肽的氨基末端(n-末端)、羧基末端(c-末端)或所述多肽的n-末端和c-末端两者上。在某些实施方案中，定点多肽在其n-末端包含四个nls序列。在其他实施方案中，定点多肽在定点多肽的c末端包含两个nls序列。在仍其他实施方案中，定点多肽在其n-末端包含四个nls序列并且在其c-末端包含两个nls序列。
[0338]
在某些实施方案中，定点多肽包含细胞穿透肽(cpp)，其诱导连接的蛋白质或肽通过细胞质膜的吸收。通常，cpp诱导进入细胞，因为它们的一般形状和倾向于自组装成跨膜孔或倾向于有几个带正电荷的残基，它们与带负电荷的磷脂外膜相互作用，诱导膜弯曲，这进而激活了内化。示例性可渗透肽包括但不限于转运肽、pep1、mpg、p-vec、map、cady、polyr、hiv-tat、hiv-rev、穿膜肽、r6w3、p22n、dpv3、dpv6、k-fgf和c105y，并在van den berg和dowdy(2011)current opinion in biotechnology 22:888-893以及farkhani等人(2014)peptides 57:78-94中进行了综述，这些文献各自通过引用整体并入本文。
[0339]
与nls一起或作为nls的替代，定点多肽可包含另外的异源氨基酸序列，诸如本文别处描述的可检测标记(例如，荧光蛋白)或纯化标签，以形成融合蛋白。纯化标签是可用于从混合物(例如，生物样品、培养基)中分离蛋白质或融合蛋白的任何分子。纯化标签的非限制性示例包括生物素、myc、麦芽糖结合蛋白(mbp)和谷胱甘肽-s-转移酶(gst)。
[0340]
本发明公开的组合物和方法可用于通过引入修复的序列特异性双链断裂(通过例如易错非同源末端连接(nhej)、微同源介导的末端连接或可选末端连接(alt-ej)通路)来编辑基因组(mmej)，以在特定基因组位置处引入突变。由于修复过程的易错性质，双链断裂的修复会导致对靶序列的修饰。可选地，供体模板多核苷酸可以在引入的双链断裂的修复过程中整合到靶序列中或与靶序列交换，导致外源供体序列的引入。因此，所述组合物和方法可进一步包含可含有侧翼同源端的供体模板多核苷酸。在这些实施方案的一些中，供体模板多核苷酸通过如本文别处所述的接头连接至tage剂(例如，供体模板多核苷酸通过可切割接头与定点多肽结合)。
[0341]
在一些实施方案中，供体序列改变原始靶序列，使得新整合的供体序列不会被核酸引导核酸酶识别和切割。供体序列可以包含与靶序列侧翼的序列具有实质序列同一性的侧翼序列，以通过同源定向修复增强供体序列的整合。在其中核酸引导核酸酶产生双链交错断裂的特定实施方案中，供体多核苷酸的侧翼可以是相容的突出端，允许在双链断裂修复期间通过非同源修复过程掺入供体序列。
[0342]
iv.tage剂的胞外细胞膜结合部分
[0343]
可用作tage剂的胞外细胞膜结合部分的结合剂的示例包括但不限于抗原结合多肽，诸如抗体、细胞穿透肽(cpp)、配体或任何其组合。下面提供了关于这些结合剂的更多细节。此外，胞外细胞膜结合部分，诸如配体和抗原结合多肽，不仅允许受体介导的tage剂进入，而且在某些情况下，所述部分还介导细胞的生物学(例如，通过改变胞内信号转导通路)，其可用于治疗用途。
[0344]
抗原结合多肽
[0345]
抗原结合多肽靶向与细胞膜缔合的胞外抗原并提供递送定点修饰多肽的特异性。
可包含在本文所述的tage剂中的抗原结合多肽的示例包括但不限于抗体、抗体的抗原结合片段或抗体模拟物。
[0346]
抗体和抗原结合片段
[0347]
在某些实施方案中，本文提供的tage剂包含作为抗体或其抗原结合片段的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽与定位在靶细胞膜上或与特定组织缔合的胞外分子(例如，蛋白质、聚糖、脂质)特异性结合。被抗体或其抗原结合片段特异性结合的胞外分子可以是抗原，诸如但不限于hla-dr、cd3、cd20、cd11a、cd22、cd25、cd32、cd33、cd44、cd47、cd54、cd59、cd70、cd74、achr、ctla4、cxcr4、egfr、her2、epcam、pd-1或fap1。在某些实施方案中，抗原是cd22。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分与cd3特异性结合。针对本发明的tage剂中的抗体、其抗原结合片段的其他示例性靶标包括：(i)肿瘤相关抗原；(ii)细胞表面受体；(iii)cd蛋白及其配体，诸如cd3、cd4、cd8、cd19、cd20、cd22、cd25、cd32、cd33、cd34、cd40、cd44、cd47、cd54、cd59、cd70、cd74、cd79a(cd79a)和cd79p(cd79b)；(iv)erbb受体家族的成员，诸如egf受体、her2受体、her3受体或her4受体；(v)细胞粘附分子，诸如lfa-1、mac1、p150,95、vla-4、icam-1、vcam和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如，抗cd11a、抗cd18或抗cd11b抗体)；(vi)生长因子，诸如vegf；ige；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(ob)受体；mpl受体；ctla4；蛋白c、br3、c-met、组织因子、β7等。可以被所述抗体或其抗原结合片段靶向的抗原的其他示例包括细胞表面受体，诸如chen和flies.nature reviews immunology.13.4(2013):227中描述的那些，将该文献通过引用并入本文。
[0348]
用于本文描述的tage剂中的抗原结合多肽也可对某种细胞类型具有特异性。例如，抗原结合多肽(诸如抗体或其抗原结合部分)可以与存在于造血细胞(hsc)的细胞表面上的抗原结合。在hsc上发现的抗原的示例包括但不限于cd34、emcn、cd59、cd90、c-kit、cd45或cd49f。可以通过在细胞的胞外表面上表达或展示的抗原被抗原结合多肽结合并因此由tage剂进行基因编辑的其他细胞类型包括中性粒细胞、t细胞、b细胞、树突细胞、巨噬细胞和成纤维细胞。
[0349]
示例性抗体(或其抗原结合片段)包括选自(但不限于)抗hla-dr抗体、抗cd3抗体、抗cd20抗体、抗cd22抗体、抗cd11a抗体、抗cd25抗体、抗cd32抗体、抗cd33抗体、抗cd44抗体、抗cd47抗体、抗cd54抗体、抗cd59抗体、抗cd70抗体、抗cd74抗体、抗achr抗体、抗ctla4抗体、抗cxcr4抗体、抗egfr抗体、抗her2抗体、抗epcam抗体、抗pd-1抗体、或抗fap1抗体的那些。针对这些不同靶标的示例性抗体描述于下文序列表中的seq id no:58至159中。
[0350]
在一个实施方案中，tage剂包含抗原结合多肽，其为抗cd22抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，抗cd22抗体选自依帕珠单抗(也称为hl22，参见例如美国专利第5789554号；美国申请第20120302739号；由novus biologicals出售，目录号nbp2-75189(日期2019年3月3日)、贝妥莫单抗(参见例如美国专利第us8420086号)、rfb4(参见例如美国专利第us7355012号)、sm03(参见例如zhao等人,clin drug investig(2016)36:889-902)、nci m972(参见例如us8591889、us9279019、us9598492)、或nci m971(参见例如us7456260、us8591889、us9279019、us9598492)。
[0351]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd22抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd22抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:152所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:153所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗
cd22抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:152所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:153所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0352]
在一些实施方案中，tage剂包含抗原结合多肽，为抗cd11a抗体或其抗原结合片段。cd11a(也称为整联蛋白，αl；淋巴细胞功能相关抗原1；α多肽；或itgal；uniprot登录号p20701)是参与细胞粘附和淋巴细胞共刺激信号传导的一种整联蛋白。cd11a是如下的两种组分之一，其与cd18一起形成在白细胞上表达的淋巴细胞功能相关抗原1。在某些实施方案中，抗cd11a抗体是依法珠单抗(描述于例如wo1998023761或美国专利第6,652,855号中，这些专利各自通过引用特此并入)。
[0353]
在一个实施方案中，抗cd11a抗体包含含有抗cd11a抗体依法珠单抗的cdr1、cdr2和cdr3的重链可变区，以及含有抗cd11a抗体依法珠单抗的cdr1、cdr2和cdr3的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd11a抗体包含抗cd11a抗体依法珠单抗的重链可变区和抗cd11a抗体依法珠单抗的轻链可变区。
[0354]
在一些实施方案中，tage剂包含抗原结合多肽，其为抗cd25抗体或其抗原结合片段。cd25(也称为白细胞介素-2受体α链，il2ra；uniprot登录号p01589)是一种i型跨膜蛋白，存在于激活的t细胞、激活的b细胞、一些胸腺细胞、髓前体细胞和少突胶质细胞上。白细胞介素2(il2)受体α(il2ra)和β(il2rb)链与共同的γ链(il2rg)一起形成高亲和力il2受体。在某些实施方案中，抗cd25抗体是达利珠单抗(描述于例如美国专利第7,361,740号中，该专利特此通过引用并入)。
[0355]
在一个实施方案中，抗cd25抗体包含含有抗cd25抗体达珠单抗的cdr1、cdr2和cdr3的重链可变区，以及含有抗cd25抗体达珠单抗的cdr1、cdr2和cdr3的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd25抗体包含抗cd25抗体达珠单抗的重链可变区和抗cd11a抗体达珠单抗的轻链可变区。
[0356]
在某些实施方案中，tage剂包含抗原结合多肽，其为抗fap抗体或其片段。成纤维细胞激活蛋白(fap，也称为seprase)是脯氨酰寡肽酶家族的膜结合丝氨酸蛋白酶，具有后脯氨酰内肽酶活性。fap针对肿瘤微环境(例如，肿瘤基质)的有限表达使其成为治疗各种肿瘤的靶标的有吸引力的治疗候选物。在某些实施方案中，抗fap抗体选自西罗珠单抗/bibh1(描述于wo 99/57151，mersmann等人,int j cancer 92,240-248(2001)；schmidt等人,eur j biochem 268,1730-1738(2001)；wo 01/68708、wo 2007/077173中)、f19(描述于wo 93/05804中，atcc编号hb 8269，由r&d systems出售，目录号：mab3715)、os4(描述于w
ü
est等人,j biotech 92,159-168(2001)中)。其他抗fap抗体描述于例如美国专利第8568727号、美国专利第8999342号、美国申请第20160060356号、美国申请第20160060357号和美国专利第us9011847号中，这些专利各自通过引用并入本文。
[0357]
在一个实施方案中，tage剂包含抗fap抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗fap抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:144所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:145所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗fap抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:144所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:145所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0358]
在某些实施方案中，tage剂包含抗原结合多肽，其为抗ctla4抗体或其片段。ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4)，也称为cd152(分化簇152)，是蛋白质受体免疫球蛋白超家族的成员，并用作免疫检查点以下调免疫反应。ctla4在t淋巴细胞表面表达，在早期激活的cd8 t细胞表面瞬时表达，并在调节性t细胞上组成型表达。在某些实施方案中，抗ctla4抗体选自伊匹单抗(商品名：描述于美国专利第6984720号、美国专利第605238号、美国专利第8017114号、美国专利第8318916号和美国专利第8784815号中)。其他抗ctla4抗体描述于例如美国专利第9714290号、美国专利第10202453号和美国公布第20170216433号中，这些专利各自通过引用并入本文。
[0359]
在一个实施方案中，抗ctla4抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:146所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:147所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗ctla4抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:146所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:147所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。前述序列对应于抗ctla4抗体伊匹单抗。
[0360]
在一个实施方案中，抗ctla4抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:148所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:149所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗ctla4抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:148所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:149所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。前述序列对应于抗ctla4抗体曲美木单抗。
[0361]
在某些实施方案中，tage剂包含抗原结合多肽，其为抗cd44抗体或其片段。cd44是一种普遍存在的细胞表面糖蛋白，在许多癌症中高表达，并通过将cd44募集到细胞表面来调节转移。在某些实施方案中，抗cd44抗体选自rg7356(描述于pct公布：wo2013063498a1中)。其他抗ctla4抗体描述于例如美国公布第20170216433号、美国公布第20070237761a1号和美国公布第us20100092484号中，这些专利各自通过引用并入本文。
[0362]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd44抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd44抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:74所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:75所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd44抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:74所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:75所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0363]
在某些实施方案中，tage剂包含抗原结合多肽，其为抗cd54抗体或其片段。cd54是一种细胞表面糖蛋白，可与白细胞功能相关抗原1(cd11a/cd18[lfa-1])结合。cd54调节白细胞与内皮细胞的lfa-1依赖性粘附和涉及细胞与细胞接触的免疫功能。抗cd54抗体描述于例如美国专利第7943744号、美国专利第5773293号、美国专利第8623369号、pct公布第w091/16928号和美国公布第us20100092484号中，这些专利各自通过引用并入本文。
[0364]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd54抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd54抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:130所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:131所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗
cd54抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:130所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:131所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0365]
在某些实施方案中，tage剂包含抗原结合多肽，其为抗cd33抗体或其片段。cd33或siglec-3(唾液酸结合ig样凝集素3、siglec3、siglec-3、gp67、p67)是唾液酸结合受体家族的髓特异性成员，并在髓祖细胞上高表达但在分化的细胞中处于低得多的水平。在某些实施方案中，抗cd33抗体选自林妥珠单抗(也称为克隆hum195，描述于美国专利第9079958号中)、2h12(描述于美国专利第9587019号中)。其他cd33抗体已描述于例如美国专利第7,342,110号；美国专利第7,557,189号；美国专利第8,119,787号；美国专利第8,337,855号；美国专利第8,124,069号；美国专利第5,730,982号；美国专利第7,695,71号；wo2012074097；wo2004043344；wo1993020848；wo2012045752；wo2007014743；wo2003093298；wo2011036183；wo1991009058；wo2008058021；wo2011038301；hoyer等人,(2008)am.j.clin.pathol.129,316-323；rollins-raval和roth,(2012)histopathology 60,933-942)；p
é
rez-oliva等人,(2011)glycobiol.21,757-770)；ferlazzo等人(2000)eur j immunol.30:827-833；vitale等人,(2001)proc natl acad sci usa.98:5764-5769；jandus等人,(2011)biochem.pharmacol.82,323-332；o'reilly和paulson,(2009)trends pharmacol.sci.30,240-248；jurcic,(2012)curr hematol malig rep 7,65-73以及ricart,(2011)clin.cancer res.17,6417-6427中，这些各自通过引用并入本文。
[0366]
在某些实施方案中，tage剂包含抗原结合多肽，其为抗cd22抗体或其片段。在某些实施方案中，抗cd22抗体是抗cd22抗体依帕珠单抗(也称为hl22，参见例如美国专利第5789554号、美国申请第20120302739号；由novus biologicals出售，目录号nbp2-75189(日期2019年3月3日)或包含与依帕珠单抗抗体对应的抗原结合区的抗cd22抗体。依帕珠单抗抗体是衍生自抗体ll2(epb-2)的人源化抗体，这是一种针对raji burkitt淋巴瘤细胞产生的鼠抗cd22 igg2a。
[0367]
在一个实施方案中，抗cd22抗体包含含有抗cd22抗体依帕珠单抗的cdr1、cdr2和cdr3的重链，以及含有抗cd22抗体依帕珠单抗的cdr1、cdr2和cdr3的轻链可变区。
[0368]
在一个实施方案中，tage剂包含抗原结合多肽，其为抗cd3抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，抗cd3抗体是莫罗单抗(也称为okt3；由biolegend出售，目录号317301或317302(日期2019年3月3日))、维西珠单抗(参见例如美国专利第5834597号、美国专利第7381803号、美国申请第20080025975号)、奥昔组单抗(参见例如wo2007145941)、或dow2(参见例如wo2014129270)。
[0369]
在某些实施方案中，tage剂包含抗cd3抗体，其中抗cd3抗体是抗cd3抗体莫罗单抗(也称为okt3；由biolegend出售，目录号317301或317302(日期2019年3月3日))或包含与莫罗单抗对应的抗原结合区的抗cd3抗体。
[0370]
在一个实施方案中，抗cd3抗体包含含有抗cd3抗体莫罗单抗的cdr1、cdr2和cdr3的重链，以及含有抗cd3抗体莫罗单抗的cdr1、cdr2和cdr3的轻链可变区。
[0371]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd3抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd3抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:120所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:121所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd3
抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:120所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:121所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0372]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd45抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd45抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:58所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:59所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd45抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:58所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:59所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0373]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd48抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd48抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:60所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:61所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd45抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:60所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:61所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0374]
在一个实施方案中，tage剂包含抗tim3抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗tim3抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:62所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:63所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗tim3抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:62所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:63所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0375]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd73抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd73抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:64所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:65所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd73抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:64所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:65所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0376]
在一个实施方案中，tage剂包含抗tigit抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗tigit抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:66所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:67所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗tigit抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:66所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:67所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0377]
在一个实施方案中，tage剂包含抗ccr4抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗ccr4抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:68所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:69所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗ccr4抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:68所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:69所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
l1抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:84所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:85所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0385]
在一个实施方案中，tage剂包含抗ox40抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗ox40抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:86所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:87所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗ox40抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:86所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:87所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0386]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd11a抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd11a抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:88所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:89所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd11a抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:88所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:89所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0387]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd40l抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd40l抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:90所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:91所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd40l抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:90所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:91所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0388]
在一个实施方案中，tage剂包含抗ifnar1抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗ifnar1抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:92所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:93所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗ifnar1抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:92所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:93所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0389]
在一个实施方案中，tage剂包含抗转铁蛋白抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗转铁蛋白抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:94所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:95所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗转铁蛋白抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:94所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:95所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0390]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd80抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd80抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:96所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:97所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd80抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:96所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:97所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
1bb抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:110所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:111所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0398]
在一个实施方案中，tage剂包含抗gitr抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗gitr抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:112所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:113所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗gitr抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:112所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:113所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0399]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd27抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd27抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:114所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:115所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd27抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:114所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:115所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0400]
在一个实施方案中，tage剂包含抗nkg2a抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗nkg2a抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:116所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:117所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗nkg2a抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:116所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:117所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0401]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd25抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd25抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:118所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:119所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd25抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:118所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:119所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0402]
在一个实施方案中，tage剂包含抗tlr2抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗tlr2抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:122所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:123所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗tlr2抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:122所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:123所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0403]
在一个实施方案中，tage剂包含抗pd1抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗pd1抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:124所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:125所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗pd1抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:124所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:125所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0404]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd2抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd2抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:126所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:127所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd2抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:126所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:127所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0405]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd52抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd52抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:128所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:129所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd52抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:128所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:129所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0406]
在一个实施方案中，tage剂包含抗egfr抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗egfr抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:132所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:133所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗egfr抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:132所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:133所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0407]
在一个实施方案中，tage剂包含抗igf-1r抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗igf-1r抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:134所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:135所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗igf-1r抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:134所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:135所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0408]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd30抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd30抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:136所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:137所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd30抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:136所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:137所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0409]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd19抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd19抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:138所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:139所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd19抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:138所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:139所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0410]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd34抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd34抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:140所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:141所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗
cd34抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:140所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:141所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0411]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd59抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd59抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:142所阐述的氨基酸残基的重链可变区以及含有seq id no:143所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd59抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:142所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:143所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0412]
在一个实施方案中，tage剂包含抗cd47抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗cd47抗体或其抗原结合部分包含含有seq id no:158所阐述的氨基酸残基的重链可变区和含有seq id no:159所阐述的氨基酸残基的轻链可变区。在一个实施方案中，抗cd47抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no:158所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的重链可变区以及含有seq id no:159所阐述的cdr1、cdr2和cdr3结构域的轻链可变区。cdr可以根据kabat编号确定。
[0413]
在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段包含具有与本文在seq id no:58至159之一(包括引用的参考文献中的序列)中公开的抗体或其抗原结合片段至少95％、96％、97％或99％同一的氨基酸序列的可变区。可选地，抗体或其抗原结合片段包含本文公开的抗体或其抗原结合片段的cdr，其中本文所述可变区的框架区具有与本文在seq id no:58至159之一(包括引用的参考文献中的序列)中公开的抗体至少95％、96％、97％或99％同一的氨基酸序列。在此具体引用的序列和公开内容通过引用明确并入。
[0414]
在一些实施方案中，tage剂包含与在选自以下的细胞的表面上表达的蛋白结合的抗原结合多肽：造血干细胞(hsc)、造血祖干细胞(hpsc)、自然杀伤细胞、巨噬细胞、dc细胞、非dc髓细胞、b细胞、t细胞(例如，激活的t细胞)、成纤维细胞或其他细胞。在一些实施方案中，t细胞是cd4或cd8 t细胞。在某些实施方案中，t细胞是调节性t细胞(t reg)或效应t细胞。在一些实施方案中，t细胞是肿瘤浸润t细胞。在一些实施方案中，细胞是造血干细胞(hscso或造血祖细胞(hpsc)。在一些实施方案中，巨噬细胞是m1或m2巨噬细胞。
[0415]
在某些实施方案中，tage剂的抗原结合蛋白是抗原结合片段。这种片段的示例包括但不限于结构域抗体、纳米抗体、单抗体、scfv、fab、bite、双抗体、dart、微型抗体、f(ab')2、或胞内抗体。
[0416]
在一个实施方案中，tage剂的抗原结合多肽是纳米抗体。
[0417]
在一个实施方案中，纳米抗体是抗mhcii纳米抗体。在一个实施方案中，抗mhcii纳米抗体包含seq id no:154的氨基酸序列。
[0418]
在一个实施方案中，纳米抗体是抗egfr纳米抗体。在一个实施方案中，抗egfr纳米抗体包含seq id no:155的氨基酸序列。
[0419]
在一个实施方案中，纳米抗体是抗her2纳米抗体。在一个实施方案中，抗her2纳米抗体包含seq id no:156的氨基酸序列。
[0420]
在一个实施方案中，tage剂包含结构域抗体和定点修饰多肽。结构域抗体(dab)是抗体的小功能结合单元，对应于人抗体的重链(vh)或轻链(vl)的可变区。结构域抗体的分
子量为大约13kda。domantis开发了完全人vh和vl dab的一系列大型且高度功能性的文库(每个文库有多于100亿个不同的序列)，并使用这些文库选择对治疗靶标具有特异性的dab。与许多常规抗体相反，结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中很好地表达。可以通过参考美国专利第6,291,158号、第6,582,915号、第6,593,081号、第6,172,197号、第6,696,245号；美国序列第2004/0110941号；欧洲专利申请第1433846号和欧洲专利0368684&0616640；wo05/035572、wo04/101790、wo04/081026、wo04/058821、wo04/003019和wo03/002609来获得结构域抗体及其生产方法的进一步细节，这些专利各自通过引用整体并入本文。
[0421]
在一个实施方案中，tage剂包含纳米抗体和定点修饰多肽。纳米抗体是抗体衍生的治疗蛋白，其含有天然存在的重链抗体的独特结构和功能特性。这些重链抗体含有单个可变结构域(vhh)和两个恒定结构域(ch2和ch3)。重要的是，克隆和分离的vhh结构域是完全稳定的多肽，其含有原始重链抗体的完全抗原结合能力。纳米抗体与人抗体的vh结构域具有高同源性，并且可以进一步人源化而没有任何活性损失。重要的是，纳米抗体具有低免疫原性潜力，这已在用纳米抗体前导化合物进行的灵长类动物研究中证实。
[0422]
纳米抗体将常规抗体的优势与小分子药物的重要特征组合。与常规抗体一样，纳米抗体显示出高靶标特异性、对其靶标的高亲和力以及低的固有毒性。然而，像小分子药物一样，它们可以抑制酶并容易接近受体裂缝。此外，纳米抗体极其稳定，可以通过注射以外的方式施用(参见例如wo 04/041867，其通过引用整体并入本文)并且易于制造。纳米抗体的其他优势包括由于它们的小尺寸而识别不常见或隐藏的表位，归因于其独特的三维药物型式灵活性、半衰期调整以及药物发现的便利性和速度而高亲和性和选择性地结合到蛋白质靶标的腔或活性位点中。
[0423]
纳米抗体由单个基因编码并且可以在原核或真核宿主中产生，例如大肠杆菌(e.coli)(参见例如美国专利第6,765,087号，该专利通过引用整体并入本文)、霉菌(例如曲霉属或木霉属)和酵母菌(例如酵母属(saccharomyces)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、汉逊酵母属(hansenula)或毕赤酵母属(pichia))(参见例如美国专利第6,838,254号，该专利通过引用整体并入本文)。生产过程是可扩展的，并已经生产了数公斤的量的纳米抗体。由于纳米抗体与常规抗体相比表现出优异的稳定性，因此它们可以配制成保质期长、即用型的溶液。
[0424]
纳米克隆方法(参见例如wo 06/079372，其通过引用整体并入本文)是基于b细胞的自动化高通量选择生成针对所需靶标的纳米抗体的专有方法，并且可以在本发明的上下文中使用。
[0425]
在一个实施方案中，tage剂包含单抗体和定点修饰多肽。单抗体是另一种抗体片段技术，但该技术基于去除igg4抗体的铰链区。铰链区的缺失导致分子大小基本上是传统igg4抗体的一半，并且具有单价结合区而不是igg4抗体的二价结合区。还众所周知的是，igg4抗体是惰性的，并且因此不与免疫系统相互作用，这可能有利于治疗不需要免疫反应的疾病，并且这种优势被传递给单抗体。例如，单抗体可能起作用以抑制或沉默、但不杀死它们所结合的细胞。此外，与癌细胞结合的单抗体不会刺激它们增殖。此外，由于单抗体的大小为传统igg4抗体的约一半，因此它们可能在较大的实体瘤中显示出更好的分布与潜在有利的功效。单抗体以与完整igg4抗体相似的速率从体内清除，并且能够以与完整抗体相
似的亲和力结合其抗原。单抗体的进一步细节可以通过参考专利申请wo2007/059782获得，该专利申请通过引用整体并入本文。
[0426]
在一个实施方案中，tage剂包含亲和体和定点修饰多肽。亲和体分子代表一类基于58氨基酸残基蛋白结构域(衍生自葡萄球菌蛋白a的igg结合结构域之一)的亲和蛋白。这三个螺旋束结构域已被用作构建组合噬菌粒文库的支架，可以使用噬菌体展示技术从中选择靶向所需分子的亲和体变体(nord k,gunneriusson e,ringdahl j,stahl s,uhlen m,nygren p a,binding proteins selected from combinatorial libraries of anα-helical bacterial receptor domain,nat biotechnol 1997；15:772-7.ronmark j,gronlund h,uhlen m,nygren p a,human immunoglobulin a(iga)-specific ligands from combinatorial engineering of protein a,eur j biochem 2002；269:2647-55)。亲和体分子的简单、稳健的结构与其低分子量(6kda)组合使其适于多种应用，例如，作为检测试剂(ronmark j,harmon m,nguyen t等人,construction and characterization of affibody-fc chimeras produced in escherichia coli,j immunol methods 2002；261:199-211)，以及用以抑制受体相互作用(sandstorm k,xu z,forsberg g,nygren p a,inhibition of the cd28-cd80 co-stimulation signal by a cd28-binding affibody ligand developed by combinatorial protein engineering,protein eng 2003；16:691-7)。亲和体及其生产方法的进一步细节可通过参考美国专利第5,831,012号，该专利通过引用整体并入本文。
[0427]
在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段、或抗体模拟物可以与定位在靶细胞膜上或与特定组织缔合的胞外分子(例如，蛋白质、聚糖、脂质)特异性结合，kd为至少约1
×
10-4
、1
×
10-5
、1
×
10-6
m、1
×
10-7
m、1
×
10-8
m、1
×
10-9
m、1
×
10-10
m、1
×
10-11
m、1
×
10-12
m或更多；和/或与抗原结合，亲和力为其对非特异性抗原的亲和力的至少两倍。这种结合可导致抗原介导的表面相互作用。然而，应当理解，结合蛋白可能能够特异性结合两个或更多个序列上相关的抗原。例如，本发明的结合多肽可以特异性结合抗原的人和非人(例如，小鼠或非人灵长类)直向同源物两者。
[0428]
在一些实施方案中，抗体、其抗原结合片段、或抗体模拟物结合半抗原，进而特异性结合胞外细胞表面蛋白(例如，靶向细胞受体的cas9-抗体-半抗原)。
[0429]
抗原与抗体之间的结合或亲和力可以使用本领域已知的多种技术来确定，例如但不限于平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(elisa)；kinexa,rathanaswami等人analytical biochemistry,第373卷:52-60,2008；或放射免疫测定(ria))，或通过表面等离子体共振测定或其他基于动力学的测定的机制(例如，biacore.rtm.分析或octet.rtm.分析(fortebio))，以及诸如间接结合测定、竞争性结合测定荧光共振能量转移(fret)、凝胶电泳和色谱法(例如，凝胶过滤)等的其他方法。这些和其他方法可以利用被检查的一种或多种组分上的标记，和/或采用多种检测方法，包括但不限于显色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详述可以见于paul,w.e.编,fundamental immunology,第4版,lippincott-raven,philadelphia(1999)，该文献着重于抗体-免疫原相互作用。竞争性结合测定的一个示例是放射免疫测定，其包括将标记抗原与所关注的抗体在渐增量的未标记抗原的存在下一起孵育，并且检测结合至标记抗原的抗体。所关注的抗体对特定抗原的亲和力和结合解离速率可由斯卡查德绘图分析(scatchard plot analysis)的数据确定。与
第二抗体的竞争也可以使用放射免疫测定来确定。在这种情况下，抗原与缀合至标记化合物的所关注的抗体在渐增量的未标记第二抗体的存在下一起孵育。
[0430]
本文所述的抗体或其抗原结合片段可以处于全长抗体、双特异性抗体、双可变结构域抗体、多链或单链抗体、和/或特异性结合胞外分子的结合片段的形式，所述胞外分子包括但不限于fab、fab'、(fab')2、fv)、scfv(单链fv)、替代抗体(包括替代轻链构建体)、单结构域抗体、骆驼化抗体等。它们也可以属于或衍生自任何同种型，包括例如iga(例如，iga1或iga2)、igd、ige、igg(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)或igm。在一些实施方案中，抗体是igg(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)。
[0431]
在一个实施方案中，抗体是阿昔单抗(reopro；cd41)、安非他明(lemtrada，campath；cd52)、阿利鲁单抗(abrilumab)(整联蛋白α4β7)、培戈-阿拉赛珠单抗(alacizumab pegol)(vegfr2)、安非他明(lemtrada，campath；cd52)、阿尼鲁单抗(anifrolumab)(干扰素α/β受体)、阿泊珠单抗(hla-dr)、阿普卢妥单抗(aprutumab)(fgfr2)；阿塞珠单抗(l-选择素或cd62l)、阿特珠单抗(atezolizumab)(tecentriq；pd-l1)、阿维鲁单抗(avelumab)(bavencio；pd-l1)、阿妥昔珠单抗(azintuxizumab)(cd319)；巴利昔单抗(simulect；cd25)、bcd-100(pd-1)、贝克图莫单抗(bectummomab)(lymphoscan；cd22)、贝兰妥单抗(belantamab)(bcma)；贝利木单抗(benlysta；baff)、贝玛妥珠单抗(bemarituzumab)(fgfr2)、贝那利珠单抗(benralizumab)(fasenra；cd125)、博司利单抗(bersanlimab)(icam-1)、比玛卢单抗(bimagrumab)(acvr2b)、比伐单抗美登素(cd44 v6)、布来鲁单抗(bleselumab)(cd40)、兰妥莫单抗(blinatumomab)(blincyto；cd19)、布索珠单抗(blosozumab)(sost)；本妥昔单抗(brentuximab)(adcentris；cd30)、布隆妥珠单抗(brontictuzumab)(缺口1)、卡比利珠单抗(cabiralizumab)(csf1r)、卡米丹鲁单抗(camidanlumab)(cd25)、坎利珠单抗(camrelizumab)(pd-1)、卡罗妥昔单抗(carotuximab)(内皮糖蛋白)、卡妥索单抗(removab；epcam，cd3)、维多珠单抗(cd4)；塞米匹利单抗(cemipilimab)(libtayo；pcdc1)、西利单抗(cetrelimab)(pd-1)、西妥昔单抗(erbitux；egfr)、赛必妥单抗(cibisatamab)(ceacam5)、西姆单抗(cirmtuzumab)(ror1)、西妥木单抗(cixutumumab)(igf-1受体，cd221)、克立昔单抗(cd4)、考妥昔单抗(coltuximab)(cd19)、可那木单抗(conatumumab)(trail-r2)、达塞珠单抗(cd40)、达克珠单抗(daclizumab)(zenapax；cd25)、达罗托珠单抗(dalotuzumab)(igf-1受体，cd221)、培戈-达匹利珠单抗(dapirolizumab pegol)(cd154，cd40l)、达妥木单抗(daratumumab)(darzalex；cd38)、登赛珠单抗(demcizumab)(dll4)、地宁妥珠单抗(denintuzumab)(cd19)、迪妥昔珠单抗(depatuxizumab)(egfr)、曲齐妥单抗(drozitumab)(dr5)；ds-8201(her2)、德戈妥珠单抗(deligotuzumab)(erbb3，her3)、度匹鲁单抗(dupilumab)(il-4rα)、度伐鲁单抗(durvalumab)(imfinzi；pd-l1)、度妥昔珠单抗(duvortuxizumab)(cd19，cd3e)、依法利珠(cd11a)，依更妥单抗(elgemtumab)(erbb3，her3)；依妥珠单抗(elotuzumab)(slamf7)、依米妥珠单抗(emactuzumab)(csf1r)、埃纳波单抗(enapotamab)(axl)、依那妥珠单抗(enavatuzumab)(tweak受体)、培戈-恩莫单抗(enlimonomab pegol)(icam-1，cd54)、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)(cd276)、依诺苏单抗(enoticumab)(dll4)、依帕珠单抗(cd22)、厄利珠单抗(itgb2，cd18)、厄妥索单抗(rexomun；her2/neu，cd3)、伊瑞西珠(abergin；整联蛋白αvβ3)、艾替吉利单抗(etigilimab)(tigit)、依曲利珠单抗(etrolizumab)(整联蛋白
β7)、艾韦单抗(乙型肝炎表面抗原)、法索单抗(neutrospec；cd15)、法拉莫单抗(干扰素受体)、法妥珠单抗(farletuzumab)(叶酸受体1)、fbta05(lymphomun，cd20)、菲巴珠单抗(fibatuzumab)(肝配蛋白受体a3)、非格单抗(figitumumab)(igf-1受体，cd221)、伏妥珠单抗(flotetuzumab)(il 3受体)；福雷芦单抗(foralumab)(cd3ε)；伏妥昔单抗(futuximab)(egfr)、加利昔单抗(cd80)、甘妥单抗(gancotamab)(her2/neu)、加尼妥单抗(ganitumab)(igf-1受体，cd221)、加维莫单抗(cd147，基础免疫球蛋白)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)(mylotarg；cd33)、高米昔单抗(cd23，ige受体)、伊利尤单抗(ianalumab)(baff-r)、伊巴丽珠单抗(trogarzo；cd4)、ibi308(pd-1)、替伊莫单抗(cd20)、艾芦库单抗(icrucumab)(vegfr-1)、伊波妥珠单抗(ifabotuzumab)(epha3)、艾妥珠单抗(iladatuzumab)(cd97b)、伊马曲单抗(imgatuzumab)(egfr)、英度妥单抗(indusatumab)(gucy2c)、英比利珠单抗(inebilizumab)(cd19)、英妥木单抗(intetumumab)(cd51)、伊诺莫单抗(cd25)、英妥珠单抗(inotuzumab)(besponsa；cd22)、伊匹单抗(yervoy；cd152)、iomab-b(cd45)、伊拉土木单抗(cd30)、艾萨妥昔单抗(isatuximab)(cd38)、伊斯卡单抗(iscalimab)(cd40)、艾司妥单抗(istiratumab)(igf1r，cd221)、伊利珠单抗(itolizumab)(alzumab，cd6)、凯利昔单抗(cd4)、拉妥昔单抗(laprituximab)(egfr)、来马索单抗(nca-90，粒细胞抗原)、伦维尔单抗(lenvervimab)(乙型肝炎表面抗原)、莱朗单抗(leronlimab)(ccr5)、来沙木单抗(trail-r2)、利韦单抗(乙型肝炎表面抗原)、罗妥昔珠单抗(losatuxizumab)(egfr，erbb1，her1)、利洛托单抗(lilotomab)(cd37)、林妥珠单抗(cd33)、利瑞鲁单抗(lirilumab)(kir2d)、洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab)(cd56)、鲁卡木单抗(cd40)、培戈-鲁利珠单抗(lulizumab pegol)(cd28)、鲁昔单抗(cd23，ige受体)、鲁妥珠单抗(lumretuzumab)(erbb3，her3)、鲁帕妥单抗(lupartumab)(lypd3)、马帕木单抗(trail-r1)、玛格妥昔单抗(margetuximab)(her2)、马司莫单抗(t细胞受体)、马夫利列单抗(mavrilimumab)(gmcsf受体α-链)、马妥珠单抗(egfr)、米妥昔单抗(mirvetuximab)(叶酸受体α)、莫多妥昔单抗(modotuximab)(egfr胞外结构域iii)、莫加木里单抗(mogamulizumab)(ccr4)、莫那利珠单抗(monalizumab)(nkg2a)、莫苏奈图单抗(mosunetuzumab)(cd3e，ms4a1，cd20)、帕磨西替单抗(moxetumomab pasudotox)(cd22)、莫罗单抗-cd3(cd3)、那可单抗(nacolomab)(c242抗原)、那妥昔单抗(naratuximab)(cd37)、那呐妥单抗(narnatumab)(mst1r)、那他珠单抗(tysabri，整联蛋白α4)、那昔妥单抗(naxitamab)(c-met)、奈昔木单抗(necitumumab)(egfr)、奈莫利珠单抗(nemolizumab)(il31ra)、尼妥珠单抗(theracim，theraloc；egfr)、尼塞韦单抗(nirsevimab)(rsvfr)、纳武单抗(nivolumab)(pd-1)、奥比珠单抗(obinutuzumab)(cd20)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)(cd20)、奥瑞珠单抗(cd20)、奥度莫单抗(lfa-1，cd11a)、奥美单抗(cd20)、奥拉妥单抗(olaratumab)(pdgf-rα)、奥姆布单抗(omburtamab)(cd276)、奥那妥珠单抗(onartuzumab)(人散射因子受体激酶)、昂妥昔珠单抗(ontuxizumab)(tem1)、奥伐利单抗(onvatilimab)(vsir)、奥匹努单抗(opicinumab)(lingo-1)、奥昔珠单抗(cd3)、奥乐妥珠单抗(otlertuzumab)(cd37)、奥塞芦单抗(oxelumab)(ox-40)、帕尼单抗(egfr)、帕提图单抗(patitumab)(erbb3，her3)、pdr001(pd-1)、派姆单抗(pembrolizumab)(keytruda，pd-1)、培妥珠单抗(omnitarg，her2/neu)、匹地利珠单抗(pidilizumab)(pd-1)、匹那妥珠单抗(pinatuzumab)(cd22)、洛扎利珠单抗(plozalizumab)(ccr2)、波加利单抗(pogalizumab)(tnfr超家族成员4)、波妥珠单抗(polatuzumab)(cd79b)、普里兹单抗
(prilizimab)(cd4)、pro 140(ccr5)、雷米珠单抗(cyramza；vegfr2)、拉伐加利单抗(ravagalimab)(cd40)、瑞拉利单抗(relatlimab)(lag3)、利努苏单抗(rinucumab)(血小板衍生的生长因子受体β)；利妥昔单抗(rituzimab)(mabthera，rituzan；cd20)、罗妥木单抗(robatumumab)(igf-1受体，cd221)、罗来度单抗(roledumab)(rhd)、罗维珠单抗(leukarrest；cd11，cd18)、洛利昔珠单抗(rozanolixizumab)(fcgrt)、卢利珠单抗(antova；cd154，cd40l)、sa237(il-6r)、沙西妥珠单抗(sacituzumab)(trop-2)、沙马珠单抗(samalizumab)(cd200)、沙马妥单抗(samrotamab)(lrrc15)、沙利珠单抗(satralizumab)(il6受体)、瑟瑞妥单抗(seribantumab)(erbb3，her3)、赛特鲁单抗(setrusumab)(sost)、sgn-cd19a(cd19)、shp647(黏膜地址素细胞黏附分子)、西利珠单抗(cd2)、斯妥尤单抗(sirtratumab)(slitrk6)、斯巴达单抗(spartalizumab)(pdcd1，cd279)、硫索单抗(nca-90，粒细胞抗原)、舒他伏单抗(suptavumab)(rsvfr)、他贝芦单抗(tabalumab)(baff)、他度珠单抗(整联蛋白α
iib
β3)塔妥珠单抗(talacotuzumab)(cd123)、帕他普莫单抗(cd19)、他瑞妥单抗(tarextumab)(notch受体)、他伐利单抗(tavolimab)(cd134)、特立妥珠单抗(telisotuzumab)(hgfr)、替奈昔单抗(cd40)、替泊地塔单抗(tepoditamab)(树突细胞相关凝集素2)、替妥木单抗(teprotumomab)(igf-1受体，cd221)、特鲁罗单抗(tetulomab)(cd37)、tgn1412(cd28)、替布利珠单抗(tibulizumab)(baff)、替加珠单抗(tigatuzumab)(trail-r2)、替米妥珠单抗(timigutuzumab)(her2)、替瑞利尤单抗(tiragotumab)(tigit)、替雷利珠单抗(tislelizumab)(pcdc1，cd279)、托珠单抗(actemra，roactemra；il-6受体)、托木妥昔单抗(tomuzotuximab)(egfr，her1)、托利珠单抗(toralizumab)(cd154，cd40l)、托西莫单抗(bexxar；cd20)、托维妥单抗(tovetumab)(pdgfra)、曲妥珠单抗(herceptin；her2/neu)；曲妥珠单抗(kadcyla；her2/neu)；曲利珠单抗(tregalizumab)(cd4)、托眉力木单抗(ctla4)、乌妥昔单抗(ublituximab)(ms4a1)、乌洛鲁单抗(ulocuplumab)(cxcr4，cd184)、乌瑞芦单抗(urelumab)(4-1bb，cd137)、乌托鲁单抗(utomilumab)(4-1bb，cd137)、他伐达妥昔单抗(vadastuximab talirine)(cd33)、伐纳利单抗(vanalimab)(cd40)、伐迪克单抗(vantictumab)(卷曲受体)、伐利鲁单抗(varlilumab)(cd27)、伐特利珠单抗(vatelizumab)(itga2，cd49b)、维多珠单抗(entyvio；整联蛋白α4β7)、维妥珠单抗(cd20)、维森库单抗(vesencumab)(nrp1)、维西珠单抗(nuvion；cd3)、伏巴利珠单抗(vobarilizumab)(il6r)、伏洛昔单抗(整联蛋白α5β1)、伏莱利珠单抗(vonlerolizumab)(cd134)、伏派利单抗(vopratelimab)(cd278，icos)、xmab-5574(cd19)、扎鲁木单抗(humax-egfr；egfr)、扎木单抗(humax-cd4；cd4)、扎土希单抗(zatuximab)(her1)、泽妥珠单抗(zenocutuzumab)(erbb3，her3)、齐拉木单抗(ziralimumab)(cd147，基础免疫球蛋白(basigin))；佐贝图西单抗(zolbetuximab)(密封蛋白18同工型2)、佐莫单抗(zolimomab)(cd5)、3f8(gd2神经节苷脂)、阿德木单抗(epcam)、阿妥莫单抗(hybri-ceaker；cea)、阿麦妥单抗(amatuximab)(间皮素)、麻安莫单抗(tag-72)、阿奈妥单抗(anetumab)(msln)、阿西莫单抗(cea)、阿托木单抗(rhesus因子)；巴土昔单抗(磷脂酰丝氨酸)、贝索单抗(scintimun；cea相关抗原)、坎妥珠单抗(cantuzumab)(muc1)、卡帕珠单抗(caplacizumab)(cablivi；vwf)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)(hpam4-cide；muc1)、考曲妥珠单抗(codrituzumab)(磷脂酰肌醇聚糖3)、立赞利珠单抗(crizanlizumab)(选择素p)、克罗特度单抗(crotedumab)(gcgr)、狄诺塞单抗
(dinutuximab)(unituxin；gd2神经节苷脂)、依美昔单抗(gd3神经节苷脂)；依决洛单抗(epcam)；依来努单抗(elezanumab)(rgma)、弗加迪浦单抗(fgatipotuzumab)(muc1)、格巴妥木单抗(glembatumumab)(gpnmb)、伊戈伏单抗(indimacis-125；ca-125)、imab362(cldn18.2)、伊普利单抗(imaprelimab)(mcam)、英克拉珠单抗(inclacumab)(选择素p)、英妥昔单抗(indatuximab)(sdc1)、拉贝珠单抗(cea-cide，cea)、利法妥珠单抗(lifastuzumab)(磷酸钠协同转运蛋白)、明瑞莫单抗(tag-72)、米妥莫单抗(gd3神经节苷脂)、莫罗木单抗(rhesus因子)、那莫单抗(naptumomab)(5t4)、莫妥珠单抗(oportuzumab monatox)(epcam)、奥戈伏单抗(ca-125)、潘科曼单抗(pankomab)(muc1的肿瘤特异性糖基化)、喷托莫单抗(theragyn，muc1)、雷妥莫单抗(racotumomab)(vaxira，ngna神经节苷脂)、雷曲妥单抗(radretumab)(纤连蛋白额外结构域-b)、瑞法珠单抗(refanezumab)(髓磷脂相关糖蛋白)、索土珠单(上皮唾蛋白(episialin))；trbs07(gd2神经节苷脂)、西莫白介素单抗(epcam)、朗妥昔单抗(loncastuximab)(cd19)、米拉图珠单抗(cd74)、沙妥莫单抗喷地肽(tag-72)、索非妥珠单抗(sofituzumab)(ca-125)、索利图单抗(epcam)、阿比妥珠单抗(cd51)、阿达木单抗(humira；tnf-α)、布罗达单抗(brodalumab)(siliq；il-17受体)、阿姆白介素-2-瑟妥珠单抗(cergutuzumab amunaleukin)(cea)、高利单抗(simponi；tnf-α)、英夫利昔单抗(remicade；tnf-α)、伐利苏单抗(varisacumab)(vegfr2)、萨瑞鲁单抗(sarilumab)(kevzara，il-6r)、司妥昔单抗(sylvant；可溶的il-6、il-6r)、或阿维西珠单抗(avicixizumab)(dll4，vegfa)。关于特定抗体的前一句中公开的针对细胞表面靶标的抗体或抗原结合蛋白也被考虑作为细胞表面上的靶标，例如her2。
[0432]
在其他实施方案中，可用于本文公开的组合物和方法中的抗体是已知内化并作为抗体药物缀合物(adc)有效的抗体。可用于本文所述的tage剂中的此类抗体的示例包括但不限于阿奈妥单抗(mesothelin)、奥鲁图单抗(aorutumab)(fgfr2)、阿妥昔珠单抗(slamf7)、贝兰妥单抗(tnfrsf17)、比伐单抗(cd44v6)、本妥昔单抗(cd30)、卡米丹鲁单抗(cd25)、坎妥珠单抗(canag)、坎妥珠单抗(canag)、克利妥珠单抗(muc1)、考非妥珠单抗(ptk7)、考妥昔单抗(cd19)、地宁妥珠单抗(cd19)、迪妥昔珠单抗(egfr)、埃纳波单抗(axl)、恩弗妥单抗(nectin-4)、依帕珠单抗(cd22)、吉妥珠单抗(cd33)、格巴妥木单抗(gpnmb)、赫妥珠单抗(hertuzumab)(her2)、艾妥珠单抗(cd79b)、英妥昔单抗(cd138)、英度珠单抗(gcc)、英妥珠单抗(cd22)、拉贝珠单抗(cea-cam4)、拉迪妥珠单抗(liv-1)、拉妥昔单抗(egfr)、利法妥珠单抗(slc34a2)、朗妥昔单抗(cd19)、洛沃妥珠单抗(cd56)、洛萨妥西单抗(egfr)、鲁帕妥单抗(lypd3)、伊拉土木单抗(cd30)、米拉图珠单抗(cd74)、米妥昔单抗(psma)、那妥昔单抗(cd37)、匹那妥珠单抗(cd22)、波妥珠单抗(cd79b)、洛伐妥珠单抗(rovalpituzumab)(dll3)、沙西妥珠单抗(tacstd2)、沙马妥单抗(lrrc15)、斯妥尤单抗(sltrk6)、索非妥珠单抗(粘蛋白16)、特立妥珠单抗(c-met)、替索妥单抗(tf)、曲妥珠单抗(erbb2)、伐达妥昔单抗(cd33)、万多妥珠单抗(steap1)、或沃瑟妥珠单抗(cd70)。本文还考虑针对前一句中提及的靶标的抗体。已显示是有效adc靶标的另外的细胞表面靶标包括但不限于kaag-1、prlr、dlk1、enpp3、flt3、adam-9、cd248、内皮素受体etb、her3、tm4sf1、slc44a4、5t4、axl、ror2、ca9、cfc1b、mt1-mmp、hgfr、cxcr4、tim-1、cd166、cd163、gpc2、金黄色葡萄球菌(s.aureus)、叶酸受体、fxyd5、cd20、ca125、amhrii、bcma、cdh-6、cd98、sail、cldn6、cldn18.2、egfrviii、α-v整联蛋白、cd123、hla-dr、cd117、fgfr、epha、cd205、cd276、
cd99、globo h、mtx3、mtx5、p-钙粘蛋白、sstr2、efna4、缺口3trop2、神经节苷脂gd3、folh1、ly6e、cea-cam5、lamp1、le(y)、cd352、er-α36、stn、叶酸受体α、铜绿假单胞菌抗原、cd38、h-铁蛋白、slea、nka、cd147、ofp、slitrk5、ephrina4、vegfr2、gcl、ceacam1、ceacam6或napi2b。
[0433]
本文所述的抗体或其抗原结合片段可以处于全长抗体、双特异性抗体、双可变结构域抗体、多链或单链抗体、和/或特异性结合如下胞外分子的结合片段的形式，包括但不限于fab、fab'、(fab')2、fv)、scfv(单链fv)、替代抗体(包括替代轻链构建体)、单结构域抗体、骆驼化抗体等。它们也可以属于或衍生自任何同种型，包括例如iga(例如，iga1或iga2)、igd、ige、igg(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)或igm。在一些实施方案中，抗体是igg(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)。在某些实施方案中，抗原结合多肽是多特异性蛋白质，诸如多特异性(例如，双特异性)抗体。
[0434]
在一个实施方案中，抗原结合蛋白是双特异性分子，其包含来自与细胞的胞外细胞膜上的靶标结合的第一抗体的第一抗原结合位点和具有不同结合特异性的第二抗原结合位点，诸如对细胞的胞外细胞膜上的第二靶标的结合特异性，即双特异性抗体，其中第一和第二抗原结合位点不交叉阻断彼此结合第一或第二抗原。上文提供了靶抗原的示例。因此，考虑tage剂包含结合两种抗原的双特异性分子，包括本文所述的那些，例如ctla4和cd44。
[0435]
示例性双特异性抗体分子包含(i)两种抗体，一种对第一抗原具有特异性，另一种对缀合在一起的第二靶标具有特异性，(ii)具有对第一抗原和第二抗原有特异性的一条链或臂以及对第二抗原有特异性的第二链或臂的单一抗体，(iii)对第一抗原和第二抗原具有特异性的单链抗体，例如通过额外的肽接头串联连接的两个scfv；(iv)双可变结构域抗体(dvd-ig)，其中每条轻链和重链包含两个通过短肽键串联的可变结构域(wu等人,generation and characterization of a dual variable domain immunoglobulin(dvd-igtm)molecule,antibody engineering,springer berlin heidelberg(2010))；(v)化学连接的双特异性(fab')2片段；(vi)tandab，它是两个单链双抗体的融合物，产生对每个靶抗原都有两个结合位点的四价双特异性抗体；(vii)柔性抗体，它是scfv与双抗体的组合，产生多价分子；(viii)所谓的“停靠和锁定”分子，基于蛋白激酶a中的“二聚化和停靠结构域”，当应用于fab时，可以产生三价双特异性结合蛋白，其由连接到不同的fab片段的两个同一fab片段组成；(ix)所谓的蝎(scorpion)分子，包含例如融合到人fc区两个末端的两个scfv；以及(x)双抗体。
[0436]
用于制备双特异性抗体的平台的示例包括但不限于bite(micromet)、dart(macrogenics)、fcab和mab.sup.2(f-star)、fc工程化的igg1(xencor)或duobody(基于fab臂交换，genmab)。
[0437]
不同类的双特异性抗体的示例包括但不限于不对称的igg样分子，其中分子的一侧含有至少一种抗体的fab区或fab区的部分，而分子的另一侧含有至少一种其他抗体的fab区或fab区的部分；在这一类中，也可能存在fc区的不对称性，用于所述分子的两个部分的特异性连接；对称的igg样分子，其中所述分子的两侧各自含有至少两种不同抗体的fab区或fab区的部分；igg融合分子，其中全长igg抗体与额外的fab区或fab区的部分融合；fc融合分子，其中单链fv分子或稳定的双抗体与fcγ区或其部分融合；fab融合分子，其中不
同的fab片段融合在一起；基于scfv和双抗体的分子，其中不同的单链fv分子或不同的双抗体彼此融合或融合至另一蛋白质或载体分子。
[0438]
不对称的igg样分子的示例包括但不限于triomab/quadroma(trion pharma/fresenius biotech)、杵臼(knobs-into-holes)(genentech)、crossmab(roche)和静电匹配分子(amgen)、luz-y(genentech)、链交换工程化结构域体(emd serono)、biclonic(merus)和duobody(genmab a/s)。
[0439]
对称的igg样分子的示例包括但不限于双靶向(dt)-ig(gsk/domantis)、二合一抗体(genentech)、交联mab(karmanos cancer center)、mab2(f-star)和covx体(covx/pfizer)。
[0440]
igg融合分子的示例包括但不限于双可变结构域(dvd)-ig(abbott)、igg样双特异性分子(imclone/eli lilly)、ts2ab(medimmune/az)和bsab(zymogenetics)、hercules(biogen idec)和tvab(roche)。
[0441]
fc融合分子的示例包括但不限于scfv/fc融合物(academic institution)、scorpion(emergent biosolutions/trubion，zymogenetics/bms)、双亲和重靶向技术(fc-dart)(macrogenics)和双(scfv)
2-fab(中国国家抗体药物研究中心(national research center for antibody medicine
‑‑
china))。
[0442]
v类双特异性抗体的示例包括但不限于f(ab)2(medarex/amgen)、双重作用或双fab(genentech)、停靠和锁定抗体(dnl)(immunomedics)、二价双特异性抗体(biotecnol)和fab-fv(ucb-celltech)。基于scfv和双抗体的分子的示例包括但不限于双特异性t细胞衔接器(bite)(micromet)、串联双抗体(tandab)(affimed)、双亲和重靶向技术(dart)(macrogenics)、单链双抗体(academic)、tcr样抗体(ait，receptorlogics)、人血清白蛋白scfv融合物(merrimack)和com body(epigen biotech)。
[0443]
可与本文所述的组合物和方法结合使用的抗体、抗原结合片段或抗体模拟物包括上述抗体及其抗原结合片段，以及上述那些非人抗体和抗原结合片段的人源化变体和与上述那些结合相同表位的抗体或抗原结合片段，如例如通过竞争性抗原结合测定评估的。
[0444]
本文所述的抗体或结合片段还可包括改变抗体和/或片段特性的修饰和/或突变。工程化抗体以包含任何修饰的方法是本领域众所周知的。这些方法包括但不限于通过对编码抗体或所述抗体的至少恒定区的制备dna分子进行定点(或寡核苷酸介导的)诱变、pcr诱变和盒式诱变而进行的制备。定点诱变是本领域众所周知的(参见例如carter等人,nucleic acids res.,13:4431-4443(1985)和kunkel等人,proc.natl.acad.sci.usa,82:488(1987))。pcr诱变也适于制备起始多肽的氨基酸序列变体。参见higuchi,pcr protocols,第177-183页(academic press,1990)；以及vallette等人,nuc.acids res.17:723-733(1989)。用于制备序列变体的另一种方法即盒式诱变是基于wells等人,gene,34:315-323(1985)描述的技术。
[0445]
抗体或其片段可以使用重组方法和组合物来生产，例如，如美国专利第4,816,567号所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体vl的氨基酸序列和/或包含抗体vh的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了一种或多种包含这样的核酸的载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含这样的核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含
(例如，已用以下转化)：(1)包含编码含有抗体vl的氨基酸序列和含有抗体vh的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码含有抗体vl的氨基酸序列的核酸的第一载体和编码含有抗体vh的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞或淋巴细胞(例如，y0、ns0、sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了一种制备抗cll-1抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达所述抗体的条件下，培养如上提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
[0446]
对于抗体(或抗体片段)的重组生产，将编码抗体的核酸(例如，如上所述)分离，并插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够与编码所述抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，将此类核酸容易地分离并进行测序。
[0447]
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利第5,648,237号、第5,789,199号和第5,840,523号。(另外参见charlton,methods in molecular biology,第248卷(b.k.c.lo编,humana press,totowa,n.j.,2003),第245-254页，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达。)表达后，抗体可从细菌细胞糊状物中以可溶部分分离，并可进一步纯化。
[0448]
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是可用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他示例是由sv40(cos-7)转化的猴肾cv1系；人胚胎肾系(293或293细胞，如graham等人,j.gen virol.36:59(1977)所述)；幼仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠支持细胞(tm4细胞，如例如mather,biol.reprod.23:243-251(1980)所述)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck；水牛鼠肝细胞(brl 3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hep g2)；小鼠乳腺肿瘤(mmt 060562)；tri细胞(如mather等人,annals n.y.acad.sci.383:44-68(1982)所述)；mrc 5细胞；和fs4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞(urlaub等人,proc.natl.acad.sci.usa 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，诸如y0、ns0和sp2/0。有关适于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如,methods in molecular biology,第248卷(b.k.c.lo编,humana press,totowa,n.j.),第255-268页(2003)。
[0449]
抗体模拟物
[0450]
tage剂可以包含能够结合所关注的抗原的抗体模拟物。如下详述，已经开发了多种抗体片段和抗体模拟技术并且在本领域中广为人知。通常，本文所述的抗体模拟物与抗体在结构上无关，并且包括艾得奈可汀、亲和体、darpin、抗运载蛋白、高亲合性多聚体、万能抗体、适体和smips。抗体模拟物使用结合结构，在模拟传统抗体结合的同时，所述结合结构通过不同的机制产生并发挥作用。gill和damle(2006)17:653-658中综述了这些可选结构中的一些。
[0451]
在一个实施方案中，tage剂包含艾得奈可汀分子和定点修饰多肽。艾得奈可汀分子是衍生自纤连蛋白的一个或多个结构域的工程化结合蛋白。纤连蛋白在人体中天然存在。它作为不溶性糖蛋白二聚体存在于胞外基质中，并且也作为接头蛋白。它也以可溶形式作为二硫化物连接的二聚体存在于血浆中。纤连蛋白的血浆形式由肝脏细胞(肝细胞)合
成，并且ecm形式由软骨细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和一些上皮细胞制成。如前所述，纤连蛋白可以作为细胞粘附分子天然发挥作用，或者它可以通过在胞外基质中进行接触来介导细胞的相互作用。典型地，纤连蛋白由三个不同的蛋白质模块构成，即i型、ii型和iii型模块。有关纤连蛋白功能结构的综述，请参见pankov和yamada(2002)j cell sci.；115(pt 20):3861-3，hohenester和engel(2002)21:115-128，以及lucena等人(2007)invest clin.48:249-262。
[0452]
在一个实施方案中，通过改变由分布在两个β折叠之间的多个β链组成的天然蛋白质，艾得奈可汀分子衍生自纤连蛋白iii型结构域。取决于起源组织，纤连蛋白可包含多个iii型结构域，它们可以表示为例如1fn3、2fn3、3fn3等。10fn3结构域含有整联蛋白结合基序，并进一步含有连接β链的三个环。可以认为这些环对应于igg重链的抗原结合环，并且它们可以通过以下讨论的方法改变以特异性结合所关注的靶标。优选地，可用于本发明目的的纤连蛋白iii型结构域是表现出与编码纤连蛋白iii型分子的结构的序列的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性的序列，可以从蛋白质数据库(protein data bank(pdb)，rcsb.org/pdb/home/home.do)访问，访问码：1ttg。艾得奈可汀分子也可以衍生自10fn3相关分子的聚合物，而不是简单的单体10fn3结构。
[0453]
尽管天然10fn3结构域典型地与整联蛋白结合，但适于成为艾得奈可汀分子的10fn3蛋白会发生改变，以便与所关注的抗原结合。在一个实施方案中，10fn3分子的改变包含β链的至少一个突变。在一个优选实施方案中，连接10fn3分子的β链的环区被改变以结合所关注的抗原。
[0454]
10fn3的改变可以通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于易错pcr、定点诱变、dna改组或本文已提及的其他类型的重组诱变。在一个示例中，编码10fn3序列的dna的变体可以在体外直接合成，之后在体外或体内转录和翻译。可选地，可以使用标准方法从基因组中分离或克隆天然10fn3序列(如在例如美国专利申请第20070082365号中执行的)，然后使用本领域已知的诱变方法进行突变。
[0455]
在一个实施方案中，靶抗原可以固定在固体支持物上，诸如柱树脂或微量滴定板中的孔。然后将靶标与潜在结合蛋白的文库接触。所述文库可以包含通过10fn3序列的诱变/随机化或通过10fn3环区(非β链)的诱变/随机化而衍生自野生型10fn3的10fn3克隆或艾得奈可汀分子。在一个优选实施方案中，文库可以是通过szostak等人,美国专利第6,258,558号和美国专利第6,261,804号；szostak等人,wo989/31700；和roberts&szostak(1997)94:12297-12302所述的技术产生的rna-蛋白融合物文库。文库也可以是dna-蛋白文库(例如，如lohse,美国专利第6,416,950号和wo 00/32823所述的)。然后将融合物文库与固定的靶抗原一起孵育，并洗涤固体支持物以去除非特异性结合部分。然后在严格条件下洗脱紧密结合物，并使用pcr扩增遗传信息或建立新的结合分子文库以重复所述过程(有或没有另外的诱变)。可以重复选择/诱变过程直到获得对靶标具有足够亲和力的结合物。用于本发明的艾得奈可汀分子可以使用由adnexus(briston-myers squibb公司)采用的profusion
tm
技术工程化。profusion技术是基于上文提及的技术建立的(例如，roberts&szostak(1997)94:12297-12302)。产生改变的10fn3结构域的文库和选择可用于本发明的适当结合物的方法在以下美国专利和专利申请文件中完整描述，并通过引用并入本文：美
国专利第7,115,396号；第6,818,418号；第6,537,749号；第6,660,473号；第7,195,880号；第6,416,950号；第6,214,553号；第6623926号；第6,312,927号；第6,602,685号；第6,518,018号；第6,207,446号；第6,258,558号；第6,436,665号；第6,281,344号；第7,270,950号；第6,951,725号；第6,846,655号；第7,078,197号；第6,429,300号；第7,125,669号；第6,537,749号；第6,660,473号；以及美国专利申请第20070082365号；第20050255548号；第20050038229号；第20030143616号；第20020182597号；第20020177158号；第20040086980号；第20040253612号；第20030022236号；第20030013160号；第20030027194号；第20030013110号；第20040259155号；第20020182687号；第20060270604号；第20060246059号；第20030100004号；第20030143616号；和第20020182597号。可以使用本领域已知的其他方法(诸如噬菌体展示、核糖体展示或酵母表面展示)完成在纤连蛋白iii型结构域(诸如10fn3)中产生多样性，随后进行选择步骤，例如lipovsek等人(2007)journal of molecular biology 368:1024-1041；sergeeva等人(2006)adv drug deliv rev.58:1622-1654；petty等人(2007)trends biotechnol.25:7-15；rothe等人(2006)expert opin biol ther.6:177-187；和hoogenboom(2005)nat biotechnol.23:1105-1116。
[0456]
本领域技术人员应当理解，上文引用的方法参考文献可用于从除优选的10fn3结构域之外的蛋白质衍生抗体模拟物。可用于通过上文提及的方法产生抗体模拟物的另外的分子包括但不限于人纤连蛋白模块1fn3-9fn3和11fn3-17fn3，以及来自非人动物和原核生物的相关fn3模块。另外，也可以使用来自与10fn3具有序列同源性的其他蛋白质的fn3模块，诸如腱生蛋白和波动蛋白(undulin)。具有免疫球蛋白样折叠(但具有与vh结构域无关的序列)的其他示例性蛋白质包括n-钙粘蛋白、icam-2、肌联蛋白、gcsf受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、e-钙粘蛋白和抗生素色蛋白。具有相关结构的其他结构域可衍生自髓鞘膜粘附分子p0、cd8、cd4、cd2、i类mhc、t细胞抗原受体、cd1、vcam-1的c2和i-组结构域、肌球蛋白结合蛋白c的i-组免疫球蛋白折叠、肌球蛋白结合蛋白h的i-组免疫球蛋白折叠、端素蛋白的i-组免疫球蛋白折叠、端蛋白(telikin)、ncam、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、催乳素受体、gc-sf受体、干扰素-γ受体、β-半乳糖苷酶/葡糖醛酸酶、β-葡糖醛酸酶和转谷氨酰胺酶。可选地，可以利用包含一个或多个免疫球蛋白样折叠的任何其他蛋白质来建立艾得奈可汀样结合部分。例如，可以使用程序scop鉴定此类蛋白(murzin等人,j.mol.biol.247:536(1995)；lo conte等人,nucleic acids res.25:257(2000)。
[0457]
在一个实施方案中，tage剂包含适体和定点修饰多肽。在本文公开的组合物和方法中使用的“适体”包含由肽或核苷酸制成的适体分子。肽适体与核苷酸适体共享许多特性(例如，小尺寸和以高亲和力结合靶分子的能力)，并且它们可以通过具有与用于产生核苷酸适体的那些方法类似的原理的选择方法产生，例如baines和colas.2006.drug discov today.11(7-8):334-41；和bickle等人2006.nat protoc.1(3):1066-91，这些文献通过引用并入本文。
[0458]
在某些实施方案中，适体是结合特定分子靶标的小核苷酸聚合物。适体可以是单链或双链核酸分子(dna或rna)，但基于dna的适体最常见的是双链。适体核酸没有确定的长度；然而，适体分子最常见的长度在15与40个核苷酸之间。
[0459]
适体通常形成复杂的三维结构，这决定了它们对靶分子的亲和力。与简单抗体相
比，适体可以提供许多优势，主要是因为它们几乎可以完全在体外进行工程化和扩增。此外，适体通常诱导很少或不诱导免疫反应。
[0460]
适体可以使用多种技术产生，但最初是使用体外选择(ellington和szostak.(1990)nature.346(6287):818-22)和selex方法(通过指数富集对配体进行系统进化)(schneider等人1992.j mol biol.228(3):862-9)开发的，这些文献的内容通过引用并入本文。制造和使用适体的其他方法已经公布，包括klussmann.the aptamer handbook functional oligonucleotides and their applications.isbn:978-3-527-31059-3；ulrich等人2006.comb chem high throughput screen 9(8):619-32；cerchia和de franciscis.2007.methods mol biol.361:187-200；ireson和kelland.2006.mol cancer ther.2006 5(12):2957-62；美国专利第5,582,981号；第5,840,867号；第5,756,291号；第6,261,783号；第6,458,559号；第5,792,613号；第6,111,095号；以及美国专利申请美国公布第us20070009476a1号；美国公布第us20050260164a1号；美国专利第7,960,102号；和美国公布第us20040110235a1号，这些都通过引用并入本文。
[0461]
selex方法显然是最受欢迎的方法，并以三个基本步骤进行。首先，从候选核酸分子文库中选择以结合特定分子靶标。其次，将对靶标具有足够亲和力的核酸与未结合物分离。第三，扩增结合的核酸，形成第二文库，并重复该过程。在每次重复时，选择对靶分子具有越来越高的亲和力的适体。在以下出版物中对selex方法进行了更全面的描述，这些出版物通过引用并入本文：bugaut等人2006.4(22):4082-8；stoltenburg等人2007biomol eng.2007 24(4):381-403；和gopinath.2007.anal bioanal chem.2007.387(1):171-82。
[0462]
在一个实施方案中，tage剂包含darpin和定点修饰多肽。darpin(设计的锚蛋白重复蛋白)是抗体模拟drp(设计的重复蛋白)技术的一个示例，开发该技术是为了利用非抗体多肽的结合能力。重复蛋白(诸如锚蛋白或富含亮氨酸的重复蛋白)是普遍存在的结合分子，与抗体不同，它们出现在胞内和胞外。它们独特的模块化架构的特征是重复的结构单元(重复)，它们堆叠在一起形成细长的重复结构域，展示可变和模块化的靶标结合表面。基于这种模块性，可以产生具有高度多样化结合特异性的多肽的组合文库。该策略包括展示可变表面残基的自相容重复及其随机组装到重复结构域中的共有设计。
[0463]
darpin可以在细菌表达系统中以非常高的产量产生，并且它们属于已知的最稳定的蛋白质。已经选择了对广泛的靶蛋白(包括人受体、细胞因子、激酶、人蛋白酶、病毒和膜蛋白)有高度特异性的高亲和力darpin。可以获得具有个位数纳摩尔至皮摩尔范围内的亲和力的darpin。
[0464]
darpin已用于广泛的应用，包括elisa、夹心elisa、流式细胞分析(facs)、免疫组织化学(ihc)、芯片应用、亲和纯化或western印迹。darpin还被证明在胞内区室中具有高度活性，例如作为与绿色荧光蛋白(gfp)融合的胞内标志物蛋白。进一步使用darpin抑制病毒进入，ic50在pm范围内。darpin不仅是阻断蛋白质-蛋白质相互作用的理想选择，也是抑制酶的理想选择。蛋白酶、激酶和转运蛋白已被成功抑制，最常见的是变构抑制模式。在肿瘤上非常快速和特异性的富集以及非常有利的肿瘤与血液比率使darpin非常适合体内诊断或治疗方法。
[0465]
关于darpin和其他drp技术的另外的信息可以在美国专利申请公布第2004/0132028号和国际专利申请公布第wo 02/20565号中找到，这两者都特此通过引用整体并
入。
[0466]
在一个实施方案中，tage剂包含抗运载蛋白和定点修饰多肽。抗运载蛋白是一种另外的抗体模拟技术，但在这种情况下，结合特异性衍生自脂质运载蛋白，这是一个在人体组织和体液中天然大量表达的低分子量蛋白质的家族。脂质运载蛋白已经进化为在体内执行一系列与化学敏感或不溶性化合物的生理转运和储存相关的功能。脂质运载蛋白具有稳健的内在结构，包括高度保守的β-桶，它在蛋白质的一个末端支持四个环。这些环形成结合口袋的入口，分子这一部分的构象差异解释了个体脂质运载蛋白之间结合特异性的变化。
[0467]
虽然由保守的β-折叠框架支持的高变环的整体结构让人联想到免疫球蛋白，但脂质运载蛋白在大小方面与抗体有很大不同，由160-180个氨基酸的单多肽链组成，所述多肽链比单免疫球蛋白结构域略大。
[0468]
在一个实施方案中，tage剂包含脂质运载蛋白和定点修饰多肽。克隆脂质运载蛋白并且使它们的环经受工程化以建立抗运载蛋白。已经生成了结构上多样的抗运载蛋白文库，并且抗运载蛋白展示允许选择和筛选结合功能，随后表达和产生可溶性蛋白，以便在原核或真核系统中进行进一步分析。研究已成功证明，可以开发出对可分离出的几乎任何人靶蛋白具有特异性的抗运载蛋白，并且可以获得纳摩尔或更高范围内的结合亲和力。
[0469]
抗运载蛋白也可被格式化为双重靶向蛋白，即所谓的双运载蛋白。双运载蛋白使用标准制造工艺将两个单独的治疗靶标结合在一个易于产生的单体蛋白中，同时保持靶标特异性和亲和力，而不管其两个结合结构域的结构方向如何。
[0470]
通过单分子调节多个靶标在已知涉及多于一个单一致病因素的疾病中特别有利。此外，双价或多价结合形式(诸如双运载蛋白)在靶向疾病中的细胞表面分子、介导对信号转导通路的激动作用或、通过细胞表面受体的结合和聚类诱导增强的内化作用方面具有重大潜力。此外，双运载蛋白的高内在稳定性可与单体抗运载蛋白相比，为双运载蛋白提供灵活的配制和递送潜力。
[0471]
关于抗运载蛋白的另外的信息可以在美国专利第7,250,297号和国际专利申请公布第wo 99/16873号中找到，这两者都特此通过引用整体并入。
[0472]
在本发明的上下文中有用的另一种抗体模拟技术是高亲合性多聚体。高亲合性多聚体是通过体外外显子改组和噬菌体展示从人胞外受体结构域的一大家族进化而来的，产生具有结合和抑制特性的多结构域蛋白。与常规的单表位结合蛋白相比，连接多个独立的结合结构域已显示可以建立亲合力并导致亲和力和特异性改善。其他潜在优势包括在大肠杆菌中简单有效地生产多靶标特异性分子，改善的热稳定性和对蛋白酶的抗性。已经获得了针对多个靶标具有亚纳摩尔亲和力的高亲合性多聚体。
[0473]
关于高亲合性多聚体的另外的信息可以在美国专利申请公布第2006/0286603号、第2006/0234299号、第2006/0223114号、第2006/0177831号、第2006/0008844号、第2005/0221384号、第2005/0164301号、第2005/0089932号、第2005/0053973号、第2005/0048512号、第2004/0175756号中找到，所有这些都特此通过引用整体并入。
[0474]
在一个实施方案中，tage剂包含万能抗体和定点修饰多肽。万能抗体是另一种抗体模拟技术，其可用于本发明的上下文中。万能抗体是3-5kda的小蛋白质，与》15％半胱氨酸一起形成高二硫化物密度支架，替换典型蛋白质具有的疏水核心。用少量二硫化物替换构成疏水核心的大量疏水性氨基酸会产生更小、更亲水(更少聚集和非特异性结合)、更耐
蛋白酶和更耐热并且具有较低密度的t细胞表位的蛋白质，因为对mhc呈递贡献最大的残基是疏水的。众所周知，所有这四种特性都影响免疫原性，预计它们一起会导致免疫原性大幅下降。
[0475]
万能抗体的灵感来自于由水蛭、蛇、蜘蛛、蝎子、蜗牛和海葵生产的天然可注射生物药物，这些药物已知表现出出乎意料的低免疫原性。从选择的天然蛋白质家族开始，通过设计和筛选，将大小、疏水性、蛋白水解抗原加工和表位密度最小化至远低于天然可注射蛋白质的平均水平。
[0476]
鉴于万能抗体的结构，这些抗体模拟物提供了多功能形式，包括多价、多特异性、多种多样的半衰期机制、组织靶向模块、以及抗体fc区的不存在。此外，万能抗体在大肠杆菌中以高产率产生，并且由于其亲水性和小尺寸，万能抗体是高度可溶的，并且可以配制成高浓度。万能抗体具有罕见的热稳定性(可以煮沸)并提供延长的保质期。
[0477]
关于万能抗体的另外的信息可以在美国专利申请公布第2007/0191272号中找到，该申请特此通过引用整体并入。
[0478]
在一个实施方案中，tage剂包含smip和定点修饰多肽。smip
tm
(small modular immunopharmaceuticals-trubion pharmaceuticals)被工程化以维持和优化靶标结合、效应子功能、体内半衰期和表达水平。smips由三个不同的模块化结构域组成。首先，它们含有可以由任何赋予特异性的蛋白质(例如，细胞表面受体、单链抗体、可溶性蛋白质等)组成的结合结构域。其次，它们含有用作结合结构域与效应子结构域之间的灵活接头并且还有助于控制smip药物的多聚化的铰链结构域。最后，smips含有可衍生自包含fc结构域的多种分子或其他专门设计的蛋白质的效应子结构域。设计的模块性允许简单构建具有各种不同结合、铰链和效应子结构域的smip，提供了快速和可定制的药物设计。
[0479]
关于smip的更多信息(包括如何设计它们的示例)可以在zhao等人(2007)blood 110:2569-77和以下美国专利申请第20050238646号；第20050202534号；第20050202028号；第20050202023号；第20050202012号；第20050186216号；第20050180970号；和第20050175614号中找到。
[0480]
上文提供的抗体片段和抗体模拟技术的详细描述并非旨在成为本说明书上下文中可使用的所有技术的全面列表。例如，但也并非限制，可以在本发明的上下文中使用的多种另外的技术包括可选的基于多肽的技术，诸如qui等人,nature biotechnology,25(8)921-929(2007)(该文献特此通过引用整体并入)中概述的互补决定区的融合；以及基于核酸的技术，诸如美国专利第5,789,157号、第5,864,026号、第5,712,375号、第5,763,566号、第6,013,443号、第6,376,474号、第6,613,526号、第6,114,120号、第6,261,774和第6,387,620号(所有这些专利都特此通过引用并入)中描述的rna适体技术。
[0481]
配体
[0482]
配体结合与细胞膜缔合的胞外分子并提供递送定点修饰多肽的特异性。可包含在tage剂中的配体的示例在下文中描述。
[0483]
在某些实施方案中，本文提供的tage剂包含一种或多种配体，其是指能够与细胞上或细胞中的另一分子结合的分子，所述分子包括一种或多种细胞表面受体，并且包括诸如蛋白质、激素、神经递质、细胞因子、生长因子、细胞粘附分子或营养素等的分子。还考虑了本文所述的配体的结合片段，例如，其中所述片段与配体的对应受体结合。
[0484]
可用于本文的tage剂中的配体包括能够结合细胞表面受体的任何分子。可用于本文的配体的示例包括例如干扰素(诸如i、ii、iii型)；肽；淋巴因子(诸如il-2、il-3、il-4、il-6)、gm-csf(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，也称csf-3)、mcsf(巨噬细胞集落刺激因子1，也称为csf-1)、干扰素-γ(ifn-.γ.)；激素，诸如胰岛素、trh(促甲状腺激素释放激素)、msh(黑素细胞刺激激素)、类固醇激素(诸如雄激素和雌激素)、黑素细胞刺激激素(msh)；生长因子和集落刺激因子，诸如表皮生长因子(egf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、转化生长因子(tgf)(诸如tgfα、tgfβ)、胰岛素和胰岛素样生长因子(igf-i、igf-ii)g-csf、m-csf和gm-csf；牛痘生长因子(vgf)；成纤维细胞生长因子(fgf)；较小分子量的蛋白质、多肽、肽和肽激素(诸如铃蟾肽、胃泌素、胃泌素释放肽)；血小板衍生的生长因子；白细胞介素和细胞因子，诸如白细胞介素2(il-2)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素7(il-7)、白细胞介素(il-15)、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)；维生素，诸如叶酸；载脂蛋白和糖蛋白，诸如转铁蛋白；糖结合蛋白或脂蛋白，诸如凝集素；细胞营养转运分子；gpcr配体(例如，趋化因子)、a2a激动剂、免疫肿瘤学受体(例如，tigit)、小分子抑制剂(诸如前列腺特异性膜抗原(psma)抑制剂和小分子酪氨酸激酶抑制剂(tki))；非肽或任何其他细胞结合分子或物质，诸如生物活性聚合物(dhar等人,proc.natl.acad.sci.2008,105,17356-61)；树状聚合物(lee等人,nat.biotechnol.2005,23,1517-26；almutairi等人；proc.natl.acad.sci.2009,106,685-90)；纳米粒子(liong等人,acs nano,2008,19,1309-12；medarova等人,nat.med.2007,13,372-7；javier等人,bioconjugate chem.2008,19,1309-12)；脂质体(medinai等人,curr.phar.des.2004,10,2981-9)。可用于本文的配体或由配体结合的靶标的示例以及配体的进一步描述一般公开于bryant&stow(2005).traffic,6(10),947-953；olsnes等人(2003).physiological reviews,83(1),163-182；和planque,n.(2006).cell communication and signaling,4(1),7中，该文献通过引用并入本文。在某些实施方案中，本文的tage剂中包含的配体选自il2、csf-1、csf-2、ccl2、ccl5、ccl7、ccl8、ccl13、ccl16、igf2、il7、il15、ifnγ、tcr/dc4、或pd-l1。在某些实施方案中，配体是il-2或其功能片段。在某些实施方案中，所述配体是ifnγ或其功能片段。在某些实施方案中，所述配体是csf-2或其功能片段。在一些实施方案中，配体是本文所述的配体的突变和/或重组形式。在某些实施方案中，配体是哺乳动物配体，例如人配体、非人灵长类配体或小鼠配体。
[0485]
可用于本文的tage剂的配体包括能够特异性结合细胞表面受体或细胞表面分子的那些。被配体特异性结合的胞外分子可包括但不限于il2ra(cd25)、ifngr(cd119)、ccr2(cd192)、li(cd74)或pd-1(cd279)。在某些实施方案中，配体结合表面分子，具有得到证明的细胞质释放和/或核运输。
[0486]
在一些实施方案中，配体靶向的胞外分子是hla-dr、cd3、cd20、cd11a、cd22、cd25、cd32、cd33、cd44、cd47、cd54、cd59、cd70、cd74、achr、ctla-4、cxcr4、egfr、her2、epcam、pd-1、或fap1。针对本发明的tage剂中的配体的其他示例性靶标包括：(i)肿瘤相关表面分子；(ii)细胞表面受体；(iii)cd蛋白及其配体，诸如cd3、cd4、cd8、cd19、cd20、cd22、cd25、cd32、cd33、cd34、cd40、cd44、cd47、cd54、cd59、cd70、cd74、cd79a(cd79a)和cd79p(cd79b)；(iv)erbb受体家族的成员，诸如egf受体、her2受体、her3受体或her4受体；(v)细胞粘附分子，诸如lfa-1、mac1、p150,95、vla-4、icam-1、vcam和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基；
(vi)生长因子，诸如vegf；ige；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(ob)受体；mpl受体；ctla-4；蛋白c、br3、c-met、组织因子、β7等。可以被本文的配体靶向的分子的其他示例包括细胞表面受体，诸如chen和flies.nature reviews immunology.13.4(2013):227中描述的那些，将该文献通过引用并入本文。可以被配体结合的细胞表面受体的其他示例包括免疫球蛋白基因超家族成员(例如cd2、cd3、cd4、cd8、cd19、cd20、cd22、cd28、cd30、cd37、cd38、cd56、cd70、cd79、cd90、cd125、cd152/ctla-4、pd-1或icos)、tnf受体超家族成员(例如cd27、cd40、cd95/fas、cd134/ox40、cd137/4-1bb、inf-r1、tnfr-2、rank、taci、bcma、骨保护素、apo2/trail-r1、trail-r2、trail-r3、trail-r4和apo-3)、整联蛋白、细胞因子受体、趋化因子受体、主要组织相容性蛋白、凝集素(c型、s型或i型)或补体控制蛋白。
[0487]
在某些实施方案中，tage剂包含配体白介素2(il-2或il2)，诸如人il-2(uniprot登录号p60568，参见例如seq id no:9或seq id no:161)。在一些情况下，配体包含含有seq id no:161的氨基酸序列的人il-2多肽。在一些情况下，配体包含含有与seq id no:161具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的il-2多肽。在一些情况下，配体包含含有seq id no:163的氨基酸序列的小鼠il-2多肽。在一些情况下，配体包含含有与seq id no:163具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的il-2多肽。
[0488]
在某些情况下，il-2是il2-d10-sk(参见例如seq id no:8或162)。在一些情况下，配体包含含有seq id no:162的氨基酸序列的il2-d10-sk多肽。在一些情况下，配体包含含有与seq id no:162具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的il2-d10-sk多肽。
[0489]
在一些情况下，tage剂包含与spytag(例如，对应于seq id no:46的spytag)连接的il-2。例如，在一些实施方案中，spytag与il-2的n-末端连接(spytag-il-2)。在其他实施方案中，spytag与il-2的c-末端连接(il-2-spytag；参见例如seq id no:8或9)。
[0490]
在一些情况下，tage是通过将(1)与spytag(例如，il-2-spytag或spytag-il-2)连接的il-2复合到(2)与spycatcher(例如，seq id no:47所阐述的spycatcher)连接的定点修饰多肽而形成的，诸如spycatcher-cas9(seq id no:6)或cas9-spycatcher(seq id no:7)。在一些实施方案中，tage剂进一步包含被hrv-3c蛋白酶识别的氨基酸序列(即hrv_3c位点；seq id no:160)。在一些实施方案中，tage剂另外包含his标签(例如，seq id no:42)。在一些实施方案中，tage剂包含seq id no:48所阐述的6xhis-hrv_3c-mil2-spytag。在一些实施方案中，tage剂包含seq id no:49所阐述的6xhis-hrv_3c-hil2(sk)-spytag。在一些实施方案中，tage剂包含seq id no:50所阐述的hil2(wt)(6xhis-hrv_3c-hil2(wt)-spytagv2。
[0491]
在某些实施方案中，tage剂包含配体干扰素γ(ifnγ)，诸如人ifnγ(uniprot登录号p01579；seq id no:165)。在一些情况下，配体包含含有seq id no:165的氨基酸序列的人ifnγ多肽。在一些情况下，配体包含含有与seq id no:165具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的ifnγ多肽。在一些情况下，配体包含含有seq id no:164的氨基酸序列的小鼠ifnγ多肽。在一些情况下，配体包含含有与seq id no:164具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的ifnγ多肽。
[0492]
在一些情况下，tage剂包含与spytag(例如，对应于seq id no:46的spytag)连接的ifnγ。例如，在一些实施方案中，spytag与ifnγ的n-末端连接(spytag-ifnγ)。在其他实施方案中，spytag与ifnγ的c-末端连接(ifnγ-spytag)。
[0493]
在一些情况下，tage是通过将(1)与spytag(例如，ifnγ-spytag或spytag-ifnγ)连接的ifnγ复合到(2)与spycatcher(例如，seq id no:47所阐述的spycatcher)连接的定点修饰多肽而形成的，诸如spycatcher-cas9(seq id no:6)或cas9-spycatcher(seq id no:7)。在一些实施方案中，tage剂进一步包含被hrv-3c蛋白酶识别的氨基酸序列(即hrv_3c位点；seq id no:160)。在一些实施方案中，tage剂另外包含his标签(例如，seq id no:42)。在某些实施方案中，tage剂包含seq id no:51所阐述的6xhis-hrv_3c-spytag-mifnγ。
[0494]
在一些实施方案中，配体是集落刺激因子(csf)，诸如csf-1(例如，人csf-1)、csf-2(例如，人csf-2)或csf-3(例如，人csf-3)。
[0495]
在某些实施方案中，tage剂包含配体集落刺激因子1(csf-1，例如人csf-1，uniprot登录号p09603)。人csf-1具有三种已知的同工型，如seq id no:166-168所阐述。在一些情况下，配体包含人csf-1多肽，其包含seq id no:166-168中任一个的氨基酸序列。在一些情况下，配体包含csf-1多肽，其包含与seq id no:166-168中任一个具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0496]
在一些情况下，tage剂包含与spytag(例如，对应于seq id no:46的spytag)连接的csf-1。例如，在一些实施方案中，spytag与csf-1的n-末端连接(spytag-csf-1)。在其他实施方案中，spytag与csf-1的c-末端连接(csf-1-spytag)。
[0497]
在一些情况下，tage是通过将(1)与spytag(例如，csf-1-spytag或spytag-csf-1)连接的csf-1同(2)与spycatcher(例如，seq id no:47所阐述的spycatcher)连接的定点修饰多肽复合而形成的，诸如spycatcher-cas9(seq id no:6)或cas9-spycatcher(seq id no:7)。在一些实施方案中，tage剂进一步包含被hrv-3c蛋白酶识别的氨基酸序列(即hrv_3c位点；seq id no:160)。在一些实施方案中，tage剂另外包含his标签(例如，seq id no:42)。
[0498]
在某些实施方案中，tage剂包含配体集落刺激因子2(csf-2，例如人csf-2，uniprot登录号p04141)。在一些情况下，配体包含含有seq id no:169的氨基酸序列的人csf-2多肽。在一些情况下，配体包含含有与seq id no:169具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的csf-2多肽。
[0499]
在一些情况下，tage剂包含与spytag(例如，对应于seq id no:46的spytag)连接的csf-2。例如，在一些实施方案中，spytag与csf-2的n-末端连接(spytag-csf-2)。在其他实施方案中，spytag与csf-2的c-末端连接(csf-2-spytag)。
[0500]
在一些情况下，tage是通过将(1)与spytag(例如，csf-2-spytag或spytag-csf-2)连接的csf-2同(2)与spycatcher(例如，seq id no:47所阐述的spycatcher)连接的定点修饰多肽复合而形成的，诸如spycatcher-cas9(seq id no:6)或cas9-spycatcher(seq id no:7)。在一些实施方案中，tage剂进一步包含被hrv-3c蛋白酶识别的氨基酸序列(即hrv_3c位点；seq id no:160)。在一些实施方案中，tage剂另外包含his标签(例如，seq id no:42)。
[0501]
在某些实施方案中，tage剂包含配体集落刺激因子3(csf-3)，诸如人csf-3(uniprot登录号p09919)。人csf-3具有三种已知的同工型，如seq id no:170-172所阐述。在一些情况下，配体包含人csf-3多肽，其包含seq id no:170-172中任一个的氨基酸序列。在一些情况下，配体包含csf-3多肽，其包含与seq id no:170-172中任一个具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，配体包含含有seq id no:173的氨基酸序列的小鼠csf-3多肽。在一些情况下，配体包含含有与seq id no:173具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的csf-3多肽。
[0502]
在一些情况下，tage剂包含与spytag(例如，对应于seq id no:46的spytag)连接的csf-3。例如，在一些实施方案中，spytag与csf-3的n-末端连接(spytag-csf-3)。在其他实施方案中，spytag与csf-3的c-末端连接(csf-3-spytag)。
[0503]
在一些情况下，tage是通过将(1)与spytag(例如，csf-3-spytag或spytag-csf-3)连接的csf-3同(2)与spycatcher(例如，seq id no:47所阐述的spycatcher)连接的定点修饰多肽复合而形成的，诸如spycatcher-cas9(seq id no:6)或cas9-spycatcher(seq id no:7)。在一些实施方案中，tage剂进一步包含被hrv-3c蛋白酶识别的氨基酸序列(即hrv_3c位点；seq id no:160)。在一些实施方案中，tage剂另外包含his标签(例如，seq id no:42)。在某些实施方案中，tage剂包含seq id no:52所阐述的csf-3(csf-3-hrv_3c-fc)。
[0504]
可选地，适于本文的配体可包含与本文公开的配体氨基酸序列中任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。此类变体配体蛋白应具有配体活性，诸如保持与其对应受体的结合活性的能力和/或介导细胞摄取分子货物(例如，包含一种或多种位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)的氨基酸序列)的能力。可以通过多种方式测试变体配体的活性，诸如通过将其与荧光蛋白(例如，gfp)共价连接并测量从与配体-荧光蛋白复合物接触的细胞发出的荧光程度，或通过使用本领域已知的结合测定来测试配体与受体或细胞的结合。
[0505]
在一些实施方案中，tage剂包含与在选自以下的细胞的表面上表达的蛋白结合的配体：造血干细胞(hsc)、造血祖干细胞(hpsc)、自然杀伤细胞、巨噬细胞、dc细胞、非dc髓细胞、b细胞、t细胞(例如，激活的t细胞)、成纤维细胞或其他细胞。在一些实施方案中，t细胞是cd4或cd8 t细胞。在某些实施方案中，t细胞是调节性t细胞(t reg)或效应t细胞。在一些实施方案中，t细胞是肿瘤浸润t细胞。在一些实施方案中，细胞是造血干细胞(hscso或造血祖细胞(hpsc)。在一些实施方案中，巨噬细胞是m1或m2巨噬细胞。
[0506]
另外，tage剂可包含核定位序列，例如sv40大t抗原nls(pkkkrkv(seq id no:10))和核质蛋白nls(krpaatkkagqakkkk(seq id no:24))。其他nls是本领域已知的；参见例如cokol等人,embo rep.2000年11月15日；1(5):411-415；freitas和cunha,curr genomics.2009december；10(8):550-557。在一些实施方案中，tage剂包含一个或多个nls，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个nls。在某些实施方案中，tage剂包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个nls)c-末端nls和一个或多个(例如、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个nls)n-末端nls。
[0507]
一种或多种配体可位于位点特异性修饰多肽的n-末端或c-末端以形成本文的tage剂。可选地，一种或多种配体可位于位点特异性修饰多肽的n-末端和c-末端。仍可选
地，一种或多种配体可位于位点特异性修饰多肽的氨基酸序列内。包含多于一种配体的本文实施方案可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种配体，或5-10、5-20或10-20种配体。与位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)融合的配体可以相同或不同(例如，2、3、4种或更多种不同类型的配体)。一种或多种配体可以直接融合到位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)的氨基酸序列，和/或可以融合到与位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)融合的一个或多个异源结构域(例如，nls)。
[0508]
配体可以通过共价或非共价策略与位点特异性修饰多肽连接。共价连接配体和位点特异性修饰多肽的方法是本领域已知的，例如，如本文进一步描述的，化学交联或克隆融合蛋白。货物与包含极性和非极性结构域的短两亲配体之间的非共价偶联是通过静电和疏水相互作用建立的。
[0509]
在一个实施方案中，配体与位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)之间的融合可以直接通过肽键，以形成本文的tage剂。可选地，配体与位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)之间的融合可以通过中间氨基酸序列进行。中间氨基酸序列的示例包括合适的接头序列，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，诸如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和/或脯氨酸。合适的氨基酸接头在美国专利第8,580,922号和第5,990,275号中公开，这些专利通过引用并入本文。中间氨基酸序列的其他示例可以包括一种或多种其他类型的蛋白质和/或结构域。例如，标志物蛋白(例如，诸如本文公开的那些中的任一种的荧光蛋白)或nls肽可包含在中间氨基酸序列中。
[0510]
可选地，位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)和至少一种配体在tage剂中可以通过交联(化学交联)共价连接。本文的交联是指通过一个或多个共价键化学连接两个或更多个分子(位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)和至少一种配体(在这种情况下))的过程。可以使用本领域已知的任何数量的方法进行交联，诸如美国专利申请公布第2011/0190813号、美国专利第8,642,744号和bioconjugate techniques,第2版(g.t.hermanson,academic press,2008)(这些都通过引用并入本文)中公开的那些。出于将配体与位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)交联的目的，可以修饰和/或合成配体和/或位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)以在其n-末端、c-末端和/或氨基酸侧基处含有合适的蛋白质连接基团。本文进一步描述了化学交联剂的示例。
[0511]
位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)和本文的至少一种配体可以使用本领域已知的多种方法在tage剂中彼此非共价连接。尽管不旨在受任何特定理论或机制的约束，但考虑位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)与至少一种配体之间的非共价键可归因于静电、范德华力和/或疏水力。
[0512]
位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)与本文的至少一种配体可以使用本领域已知的多种生物缀合工具在tage剂中彼此非共价或共价连接(参见例如rabuka,david.current opinion in chemical biology 14.6(2010):790-796，该文献特此通过引用并入)。为了形成tage剂，位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)可以通过生物缀合分子与配体复合。生物缀合分子的示例包括但不限于spycatcher标签、halo标签、分选酶、单体亲和素或snap标签。在一个实施方案中，生物缀合分子选自cbp、mbp、gst、poly(his)、生物素/链霉亲和素、v5标签、myc标签、ha标签、ne标签、his标签、flag标签、halo标签、snap标签、fc标签、nus标签、bccp、硫氧还蛋白、snooprtag、spytag、spycatcher、isopeptag、sbp标签、s标签、avitag、钙
调蛋白。
[0513]
在一些实施方案中，配体或位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)包含化学标签。例如，化学标签可以是snap标签、clip标签、halotag或tmp标签。在一个示例中，化学标签是snap-标签或clip-标签。snap和clip融合蛋白使几乎任何分子都能特异性地、共价附接到所关注的蛋白质。在另一个示例中，化学标签是halotag。halotag涉及一种模块化蛋白质标签化系统，该系统允许将不同分子连接到单个基因融合物上，无论是在溶液中、在活细胞中还是化学固定细胞中。在另一个示例中，化学标签是tmp-标签。
[0514]
在一些实施方案中，配体或位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)包含表位标签。例如，表位标签可以是多组氨酸标签，诸如六组氨酸标签(seq id no:42)或十二组氨酸(seq id no:43)、flag标签、myc标签、ha标签、gst标签或v5标签。
[0515]
取决于缀合方法，配体或位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)可以各自被工程化以包含互补结合对，使得配体和位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)在接触时能够稳定缔合。示例性的缀合部分配对包括(i)链霉亲和素结合肽(链霉亲和素结合肽；sbp)和链霉亲和素(stv)，(ii)生物素和ema(增强型单体亲和素)，(iii)spytag(st)和spycatcher(sc)，(iv)halo标签和halo标签配体，(v)和snap标签，(vi)myc标签和抗myc免疫球蛋白，(vii)flag标签和抗flag免疫球蛋白，以及(ix)ybbr标签和辅酶a群。
[0516]
在本文的某些方面，位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)和本文的至少一种配体可以使用本领域已知的多种方法在tage剂中彼此非共价连接。尽管不旨在受任何特定理论或机制的约束，但考虑位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)与至少一种配体之间的非共价键可归因于静电、范德华力和/或疏水力。
[0517]
在一些实施方案中，配体(例如，il-2、ifnγ或csf-2)是伴随定点修饰多肽反式递送的。
[0518]
在某些实施方案中，多于一种类型的配体(例如，2、3、4种或更多种不同类型的配体)可以共价或非共价连接至位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)。例如，可用于制备此类复合物的配体与位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)的比率(摩尔比)可为至少约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1 15:1、20:1、30:1、40:1或50:1。在其他方面，与位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)蛋白非共价连接的配体的平均数量可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25种，或至少5-10、5-15、5-20或5-25种。
[0519]
在另一方面，本文提供了一种修饰靶细胞的基因组的方法，所述方法包括使所述靶细胞与本文所述的包含配体的靶向活性基因编辑(tage)剂接触。在某些实施方案中，所述靶细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述哺乳动物细胞是小鼠细胞、非人灵长类动物细胞或人细胞。在某些实施方案中，包含配体的tage剂中的定点修饰多肽在基因组的靶区域处产生切割位点，从而修饰基因组。在某些实施方案中，所述基因组的靶区域是靶基因。
[0520]
在某些实施方案中，包括使用本文所述的tage剂(例如，包含配体的tage剂)的方法有效于修饰靶基因的表达。在某些实施方案中，所述方法有效于相对于参考水平，增加所述靶基因的表达。在某些实施方案中，所述方法有效于相对于参考水平，降低所述靶基因的表达。
[0521]
细胞穿透肽(cpp)
[0522]
本发明包括可用于将基因编辑多肽(即定点修饰多肽)递送至靶细胞的靶向活性基因编辑(tage)剂。特别地，定点修饰多肽包含允许蛋白质缀合至细胞穿透肽(cpp)的缀合部分，所述细胞穿透肽在靶细胞的胞外膜内内化。这种靶标特异性允许将定点修饰多肽递送至细胞。此类细胞可与疾病相关的特定组织或细胞类型相关。因此，tage剂提供了一种可以修饰靶细胞的基因组的方法。
[0523]
在一个实施方案中，tage剂包含识别crispr序列的核酸引导核酸内切酶(例如，rna引导核酸内切酶或dna引导核酸内切酶)，诸如cas9，以及cpp。可用于本发明的tage剂中的cpp的示例在本文中进一步描述。
[0524]
tage剂内的蛋白质(即，至少定点多肽和cpp)被稳定缔合，使得cpp将定点修饰多肽指导至细胞表面，并且定点修饰多肽被内化到靶细胞中。在某些实施方案中，cpp与细胞表面结合，使得定点修饰多肽与cpp一样被靶细胞内化。
[0525]
在具体实施方案中，内化是指至少0.01％、至少0.05％、至少0.1％、至少0.5％、至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％的肽或组合物内化定位到细胞的细胞质中(例如，在1小时、2小时、3小时、4小时或更长时间内)。
[0526]
细胞穿透肽(cpp)可促进细胞摄取缀合分子，诸如本文提供的tage剂中的一种或多种位点特异性修饰多肽。在某些实施方案中，cpp的特征还在于能够促进分子缀合物移动穿过或横贯穿透脂质双层、胶束、细胞膜、细胞器膜(例如，核膜)、囊泡膜、或细胞中的一者或多者。可包含在tage剂中的cpp的示例在下文中描述。
[0527]
本文提供的tage剂包含一种或多种细胞穿透肽(cpp)，其是指长度典型地为约5-60个氨基酸残基的肽，它可促进分子货物、特别是一种或多种tage剂或其位点特异性修饰多肽的细胞摄取。这种位点特异性修饰多肽可以通过共价或非共价键与一种或多种cpp缔合。在某些实施方案中，cpp的特征还在于能够促进分子货物移动穿过/横贯穿透脂质双层、胶束、细胞膜、细胞器膜、囊泡膜、或细胞壁中的一者或多者。在某些实施方案中，本文的cpp可以是阳离子的、两亲的或疏水的。可用于本文的cpp的示例以及对cpp的进一步描述总体上在以下中公开：ahmad等人(2015).biochimica et biophysica acta(bba)-biomembranes,1848(2),544-553；becker-hapak等人(2001).methods,24(3),247-256；caron等人(2004).biochemical and biophysical research communications,319(1),12-20；chauhan,a.,tikoo,a.,kapur,a.k.,&singh,m.(2007).journal of controlled release,117(2),148-162；choi等人(2010).pnas,107(43),18575-18580；del’guidice等人(2018).plos one,13(4),e0195558；gautam等人(2015).european journal of pharmaceutics and biopharmaceutics,89,93-106；gautam等人(2016).scientific reports,6,26278；hatakeyama等人(2009).journal of controlled release,139(2),127-132；illien等人(2016).scientific reports,6,36938；kosuge等人(2008).bioconjugate chemistry,19(3),656-664；lim等人(2012).molecules and cells,34(6),577-582；matsui等人(2003).current protein and peptide science,4(2),151-157；salomone等人(2012).journal of controlled release,163(3),293-303；sudo等人(2017).journal of controlled release,255,1-11；komin等人(2017).advanced drug delivery reviews,110,52-64；borrelli,antonella等人molecules 23.2(2018):295；
milletti,francesca.drug discovery today 17.15-16(2012):850-860，将其通过引用并入本文。此外，存在经过实验验证的cpp的数据库(cppsite，gautam等人,2012)。本发明的tage剂的cpp可以是任何已知的cpp，诸如cppsite数据库中显示的cpp。
[0528]
可用于本文的tage剂中的cpp包括但不限于蛋白质衍生的cpp，包括tat蛋白和穿膜肽；嵌合cpp，例如衍生自神经肽甘丙肽n-末端与肥大脱粒肽毒素结合的转运蛋白；和合成cpp，包括由与假肽骨架结合的合成核酸类似物形成的寡精氨酸或肽核酸(pna)。
[0529]
在一些实施方案中，cpp是两亲性(amphiphilic或amphipathic)cpp。例如，两亲性cpp可以包含含有极性/带电残基和非极性疏水残基交替模式的氨基酸序列。可选地，两亲性cpp可以表征为同时具有亲水性和亲脂性。
[0530]
在一些实施方案中，cpp是阳离子或聚阳离子cpp。例如，阳离子或聚阳离子cpp可以包含具有高相对丰度(至少60％)的带正电荷的氨基酸(诸如赖氨酸(k)、精氨酸(r)和/或组氨酸(h))的氨基酸序列。
[0531]
在一些实施方案中，cpp是疏水性或亲脂性cpp。例如，疏水性或亲脂性cpp可包含大部分残基或仅非极性残基具有低净电荷和/或疏水性氨基酸基团的氨基酸序列。
[0532]
在一些实施方案中，本文所述的tage剂可包含一种或多种选自以下的cpps：nls、tat、tat-nls、his-tat-nls(htn)、tat-ha、s19-tat、cm18、cm18-tat、hph1、l17e、imt-p8、imt-p8(c14s)、tdp、tdp-kdel(seq id no:17)、穿膜肽、polyr、aurein、lah4-l1、lmwp、pardaxin、s10、s18、s19、s85、vectofusin1、或zf5.3。在某些实施方案中，tage剂包含一种或多种选自表1的cpp。
[0533]
表1.示例性cpp
[0534]
[0535][0536]
在特定实施方案中，cpp是包含人免疫缺陷病毒的转录反式激活因子(tat)的tat相关肽(例如，tat、tat-ha、s19-tat)。例如，tat相关肽或其变体可在序列rkkrrqrrr(seq id no:11)的n-末端或c-末端包含一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15个或更多个)另外的氨基酸。在一些实施方案中，tat相关肽可包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)不破坏tat序列的细胞穿透特性的氨基酸插入、缺失或取代(例如，保守氨基酸取代)。可选地，cpp可以是非tat相关肽，诸如nls、hph1、穿膜肽、tdp、tdp-kdel(seq id no:17)、aurein、imt-p8、l17e或polyr cpp。
[0537]
在某些实施方案中，tage剂包含tat肽和一种或多种另外的cpp，诸如nls。例如，tage剂可以包含tat肽和一个或多个nls，任选地与一种或多种his标签组合，从而形成his-tat-nls(htn)融合物。在一些实施方案中，tage剂包含seq id no:24的htn肽。htn融合物的示例在实施例43中进一步描述。
[0538]
在一些实施方案中，cpp是内体逃逸剂。例如，内体逃逸剂可以是tdp或tdp-kdel(seq id no:17)。
[0539]
可选地或另外，tage剂可包含充当核定位序列的cpp，例如sv40大t抗原nls(pkkkrkv(seq id no:10))和核质蛋白nls(krpaatkkagqakkkk(seq id no:38))。其他nls
是本领域已知的；参见例如cokol等人,embo rep.2000年11月15日；1(5):411-415；freitas和cunha,curr genomics.2009december；10(8):550-557。例如，在一些实施例中，nls是c-myc-nls(paakrvkld,seq id no:57)。在一些实施方案中，tage剂包含一个或多个nls，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个nls。在某些实施方案中，tage剂包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个nls)c-末端nls和一个或多个(例如、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个nls)n-末端nls。
[0540]
例如，本文的cpp可以是约5-30、5-25、5-20、10-30、10-25或10-20个氨基酸残基的长度。作为其他示例，cpp可以是约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基的长度。在本文的又另外的方面，cpp的长度可高达约35、40、45、50、55或60个氨基酸残基。
[0541]
可选地，适于本文的cpp可包含与本文公开的cpp氨基酸序列(例如，选自表1的cpp序列)中任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。此类变体cpp蛋白应具有cpp活性，诸如介导分子货物(例如，包含一种或多种位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)的氨基酸序列)的细胞摄取的能力。可以通过多种方式测试变体cpp的活性，诸如通过将其与荧光蛋白(例如，gfp)共价连接并测量从与cpp-荧光蛋白复合物接触的细胞发出的荧光程度。
[0542]
一种或多种cpp可位于位点特异性修饰多肽的n-末端或c-末端以形成本文的tage剂。可选地，一种或多种cpp可位于位点特异性修饰多肽的n-末端和c-末端。仍可选地，一种或多种cpp可位于位点特异性修饰多肽的氨基酸序列内。包含多于一种cpp的本文实施方案可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种cpp，或5-10、5-20或10-20种cpp。与位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)融合的cpp可以相同或不同(例如，2、3、4种或更多种不同类型的cpp)。例如，在一些实施方案中，一种或多种tat肽和一种或多种nls肽包含在本文所述的tage剂中(例如，如在本文所述的his-tat-nls或htn融合物中发现的)。一种或多种cpp可以直接融合到位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)的氨基酸序列，和/或可以融合到与位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)融合的一个或多个异源结构域(例如，nls)。
[0543]
cpp可以通过共价或非共价策略与位点特异性修饰多肽连接。共价连接cpp和位点特异性修饰多肽的方法是本领域已知的，例如，如本文进一步描述的，化学交联或克隆融合蛋白。货物与包含极性和非极性结构域的短两亲cpp之间的非共价偶联是通过静电和疏水相互作用建立的。
[0544]
在一个实施方案中，cpp与位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)之间的融合可以直接通过肽键或异肽键，以形成本文的tage剂。此外，cpp与本文的tage剂的缀合部分(例如，spytag)之间的融合可直接通过肽键或异肽键。可选地，cpp与位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)之间的融合可以通过中间氨基酸序列进行。中间氨基酸序列的示例包括合适的接头序列，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，诸如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和/或脯氨酸。合适的氨基酸接头在美国专利第8,580,922号和第5,990,275号中公开，这些专利通过引用并入本文。中间氨基酸序列的其他示例可以包括一种或多种其他类型的蛋白质和/或结构域。例如，标志物蛋白(例如，诸如本文公开的那些中的任一种的荧光蛋白)可包含在中间氨基酸序列中。
[0545]
可选地，位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)和至少一种cpp在tage剂中可以通过交联(化学交联)共价连接。本文的交联是指通过一个或多个共价键化学连接两个或更多个分子(位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)和至少一种cpp(在这种情况下))的过程。可以使用本领域已知的任何数量的方法进行交联，诸如美国专利申请公布第2011/0190813号、美国专利第8,642,744号和bioconjugate techniques,第2版(g.t.hermanson,academic press,2008)(这些都通过引用并入本文)中公开的那些。出于将cpp与位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)交联的目的，可以修饰和/或合成cpp和/或位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)以在其n-末端、c-末端和/或氨基酸侧基处含有合适的蛋白质连接基团。本文进一步描述了化学交联剂的示例。
[0546]
在本文的某些方面，位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)和本文的至少一种cpp可以使用本领域已知的多种方法在tage剂中彼此非共价连接。尽管不旨在受任何特定理论或机制的约束，但考虑位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)与至少一种cpp之间的非共价键可归因于静电、范德华力和/或疏水力。
[0547]
在某些实施方案中，多于一种类型的cpp(例如，2、3、4种或更多种不同类型的cpp)可以共价或非共价连接至位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)。例如，可用于制备此类剂的cpp与位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)的比率(摩尔比)可为至少约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1 15:1、20:1、30:1、40:1或50:1。在其他方面，与位点特异性修饰多肽(例如，核酸酶)蛋白非共价连接的cpp的平均数量可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25种，或至少5-10、5-15、5-20或5-25种。
[0548]
在另一方面，本文提供了一种修饰靶细胞的基因组的方法，所述方法包括使所述靶细胞与本文所述的包含cpp的靶向活性基因编辑(tage)剂接触。在某些实施方案中，所述靶细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述哺乳动物细胞是小鼠细胞、非人灵长类动物细胞或人细胞。在某些实施方案中，包含cpp的tage剂中的定点修饰多肽在基因组的靶区域处产生切割位点，从而修饰基因组。在某些实施方案中，所述基因组的靶区域是靶基因。
[0549]
在某些实施方案中，包括使用本文所述的tage剂(例如，包含cpp的tage剂)的方法有效于修饰靶基因的表达。在某些实施方案中，所述方法有效于相对于参考水平，增加所述靶基因的表达。在某些实施方案中，所述方法有效于相对于参考水平，降低所述靶基因的表达。
[0550]
类配对
[0551]
在某些实施方案中，tage剂包含两种或更多种胞外细胞膜结合剂，例如cpp和抗体、cpp和配体、或配体和抗体。这种配对可以包括与细胞表面上的靶分子结合的剂，例如抗体/配体配对。在某些实施方案中，类配对可改善定点修饰多肽的内化。例如，在某些实施方案中，类配对包括包含处于任何排列的cpp、抗原结合多肽(例如，抗体)和定点修饰多肽的tage剂。细胞结合部分的类配对的其他组合包括处于任何排列的配体、cpp和定点修饰多肽。在一个实施方案中，tage剂包含处于任何排列的抗体、肽细胞表面tcr和定点修饰多肽。
[0552]
在一些实施方案中，tage剂包含一种或多种cpp和一种或多种抗原结合多肽。在某些实施方案中，tage剂包含两种或更多种cpp和一种或多种抗原结合多肽。在其他实施方案
中，tage剂包含四种或更多种cpp和一种或多种抗原结合多肽。在一些实施方案中，tage剂包含六种或更多种cpp和一种或多种抗原结合多肽。在一些实施方案中，tage剂包含八种或更多种cpp和一种或多种抗原结合多肽。
[0553]
在一些实施方案中，tage剂包含一种或多种cpp和一种或多种配体。在某些实施方案中，tage剂包含两种或更多种cpp和一种或多种配体。在其他实施方案中，tage剂包含四种或更多种cpp和一种或多种配体。在一些实施方案中，tage剂包含六种或更多种cpp和一种或多种配体。在一些实施方案中，tage剂包含八种或更多种cpp和一种或多种配体。
[0554]
在一些实施方案中，tage剂包含一种或多种抗原结合多肽和一种或多种配体。
[0555]
在一些实施方案中，tage剂包含一种或多种抗原结合多肽、一种或多种cpp和一种或多种配体。
[0556]
tage剂构建体
[0557]
在一些实施方案中，tage剂从n-末端到c-末端的顺序包含胞外细胞膜结合部分和定点修饰多肽(例如，cas9)。
[0558]
在一些实施方案中，tage剂从n-末端到c-末端的顺序包含定点修饰多肽(例如，cas9)和胞外细胞膜结合部分。
[0559]
在一些实施方案中，tage剂从n末端到c末端的顺序包含第一胞外细胞膜结合部分、定点修饰多肽(例如，cas9)和第二胞外细胞膜结合部分。
[0560]
在一些实施方案中，tage剂从n-末端到c-末端的顺序包含cpp、定点修饰多肽(例如，cas9)和两个核定位信号(例如，2x sv40 nls)。例如，tage剂可包含含有本文所述的cpp的cpp-cas9-2xnls构建体。
[0561]
在一些实施方案中，tage剂从n-末端到c-末端的顺序包含配体、定点修饰多肽(例如，cas9)和两个核定位信号(例如，2x sv40 nls)。例如，tage剂可包含配体-cas9-2xnls构建体，其包含本文所述的配体。
[0562]
在一些实施方案中，tage剂从n-末端到c-末端的顺序包含配体、两个核定位信号(例如，2x sv40 nls)和定点修饰多肽(例如，cas9)。例如，tage剂可包含配体-2xnls-cas9构建体，其包含本文所述的配体。
[0563]
在一些实施方案中，tage剂从n-末端到c-末端的顺序包含定点修饰多肽(例如，cas9)、两个核定位信号(例如，2x sv40 nls)和spycatcher。例如，tage剂可包含cas9-2xnls-spycatcher构建体，进而可缀合至与spytag连接的胞外细胞膜结合部分(例如，抗体或配体)。
[0564]
在一些实施方案中，tage剂从n-末端到c-末端的顺序包含spycatcher、定点修饰多肽(例如，cas9)和两个核定位信号(例如，2x sv40 nls)。例如，tage剂可包含spycatcher-cas9-2xnls构建体，进而可缀合至与spytag连接的胞外细胞膜结合部分(例如，抗体或配体)。
[0565]
在一些实施方案中，tage剂从n-末端到c-末端的顺序包含通过选自表2的肽接头(例如，基因融合物)或化学接头连接在一起的一系列多肽。在一些实施方案中，表2所阐述的构建体进一步包含在指定多肽之间的一个或多个肽接头。在某些实施方案中，表2所阐述的构建体还包含对应于hrv 3c蛋白酶切割位点的肽序列(例如，seq id no:160)。
[0566]
表2：tage剂的示例
[0567]
[0568][0569]
在一些实施方案中，tage剂包含第一系列多肽(例如，第一融合物，诸如选自表2的融合物)和第二系列多肽(例如，第二融合物，诸如选自表2的融合物)，其中第一和第二融合物以非共价方式或共价方式稳定缔合，例如通过互补缀合部分(诸如spycatcher/spytag或halo/halo标签)。
[0570]
在一些实施方案中，tage包含缀合至spycatcher-cas9(wt)-2xnls(从n-末端到c-末端的顺序)的抗体-spytag融合物(从n-末端到c-末端的顺序)。
[0571]
在一些实施方案中，tage包含缀合至(spycatcher-cas9(wt)-2xnls)2(从n-末端到c-末端的顺序)的抗体-spytag融合物(从n-末端到c-末端的顺序)。
[0572]
在一些实施方案中，tage包含缀合至cas9(wt)-2xnls-spycat cher-4xnls(从n-末端到c-末端的顺序)的抗体-spytag融合物(从n-末端到c-末端的顺序)。
[0573]
在一些实施方案中，tage包含缀合至cas9(wt)-2xnls-spycat cher-htn(从n-末端到c-末端的顺序)的抗体-spytag融合物(从n-末端到c-末端的顺序)。
[0574]
在一些实施方案中，tage包含缀合至4xnls-spycatcher-cas9(wt)-2xnls(从n-末端到c-末端的顺序)的抗体-spytag融合物(从n-末端到c-末端的顺序)。
[0575]
在一些实施方案中，tage包含缀合至htn-spycatcher-cas9(wt)-2xnls(从n-末端到c-末端的顺序)的抗体-spytag融合物(从n-末端到c-末端的顺序)。
[0576]
在一些实施方案中，tage包含缀合至spycatcher-cas9(wt)-2xnls(从n-末端到c-末端的顺序)的配体-spytag融合物(从n-末端到c-末端的顺序)。
[0577]
在一些实施方案中，tage包含缀合至cas9(wt)-2xnls-spycat cher-4xnls(从n-末端到c-末端的顺序)的配体-spytag融合物(从n-末端到c-末端的顺序)。
[0578]
在一些实施方案中，tage包含缀合至cas9(wt)-2xnls-spycat cher-htn(从n-末端到c-末端的顺序)的配体-spytag融合物(从n-末端到c-末端的顺序)。
[0579]
在一些实施方案中，tage包含缀合至htn-spycatcher-cas9(wt)-2xnls(从n-末端到c-末端的顺序)的配体-spytag融合物(从n-末端到c-末端的顺序)。
[0580]
v.使用方法
[0581]
本文所述的tage剂可用于修饰靶细胞的基因组。该方法包括使靶细胞与本文公开的tage剂接触，使得至少定点修饰多肽被内化到细胞中并且随后修饰靶细胞的基因组(或靶核酸)。此类方法可在体外环境、离体或体内使用，包括用于治疗用途，其中对有需要的受试者的基因组的修饰导致治疗疾病或病症。
[0582]
本文所述的tage剂可用于将定点修饰多肽靶向展示所关注的抗原的任何细胞。细胞可以是真核细胞，包括但不限于哺乳动物细胞。可被本发明的tage剂靶向(并对其基因组进行修饰)的哺乳动物细胞的示例包括但不限于小鼠细胞、非人灵长类动物细胞或人细胞。
[0583]
在某些情况下，tage剂可用于离体或体内编辑特定细胞类型，诸如造血干细胞(hsc)、造血祖干细胞(hpsc)、自然杀伤细胞、巨噬细胞、dc细胞、非dc髓细胞、b细胞、t细胞(例如，激活的t细胞)、成纤维细胞或其他细胞。在一些实施方案中，t细胞是cd4或cd8 t细胞。在某些实施方案中，t细胞是调节性t细胞(t reg)或效应t细胞。在一些实施方案中，t细胞是肿瘤浸润t细胞。在一些实施方案中，细胞是造血干细胞(hsc)或造血祖细胞(hpsc)。在一些实施方案中，巨噬细胞是m0、m1或m2巨噬细胞。在一些实施方案中，tage剂用于编辑选自以下的多个(例如，两个或更多个)细胞类型：造血干细胞、造血祖干细胞(hpsc)、自然杀伤细胞、巨噬细胞、dc细胞、非dc髓细胞、b细胞、t细胞(例如，激活的t细胞)和成纤维细胞。
[0584]
在一些实施方案中，tage剂包含cpp，并且所述方法包括使t细胞(例如，人t细胞)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含cpp，并且所述方法包括使巨噬细胞(例如，人巨噬细胞)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含cpp，并且所述方法包括使hsc(例如，人hsc)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含cpp，并且所述方法包括使受试者骨髓中的细胞与tage剂接触。在一些实施方案中，细胞不是造血干细胞(例如，成纤维细胞、巨噬细胞、成骨细胞、破骨细胞或内皮细胞)。
[0585]
在一些实施方案中，tage剂包含至少四个nls，并且所述方法包括使t细胞(例如，人t细胞)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含至少四个nls，并且所述方法包括使巨噬细胞(例如，人巨噬细胞)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含cpp，并且所述方法包括使hsc(例如，人hsc)与tage剂接触。
[0586]
在一些实施方案中，tage剂包含至少六个nls，并且所述方法包括使t细胞(例如，
人t细胞)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含至少四个nls，并且所述方法包括使巨噬细胞(例如，人巨噬细胞)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含至少六个nls，并且所述方法包括使hsc(例如，人hsc)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含至少六个nls，并且所述方法包括使成纤维细胞(例如，人成纤维细胞)与tage剂接触。
[0587]
在一些实施方案中，tage剂包含his-tat-nls(htn)肽，并且所述方法包括使t细胞(例如，人t细胞)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含htn肽，并且所述方法包括使巨噬细胞(例如，人巨噬细胞)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含htn肽，并且所述方法包括使hsc(例如，人hsc)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含htn肽，并且所述方法包括使成纤维细胞(例如，人成纤维细胞)与tage剂接触。
[0588]
在一些实施方案中，tage剂包含imt-p8肽，并且所述方法包括使t细胞(例如，人t细胞)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含imt-p8，并且所述方法包括使巨噬细胞(例如，人巨噬细胞)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含imt-p8，并且所述方法包括使hsc(例如，人hsc)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含imt-p8肽，并且所述方法包括使成纤维细胞(例如，人成纤维细胞)与tage剂接触。
[0589]
在一些实施方案中，tage剂包含配体，并且所述方法包括使t细胞(例如，人t细胞)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含配体，并且所述方法包括使巨噬细胞(例如，人巨噬细胞)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含配体，并且所述方法包括使hsc(例如，人hsc)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含配体，并且所述方法包括使成纤维细胞(例如，人成纤维细胞)与tage剂接触。
[0590]
在一些实施方案中，tage剂包含il-2配体，并且所述方法包括使t细胞(例如，人t细胞，诸如cd4 t细胞或cd8 t细胞)与tage剂接触。
[0591]
在一些实施方案中，tage剂包含ifnγ，并且所述方法包括使巨噬细胞(例如，人巨噬细胞)与tage剂接触。
[0592]
在一些实施方案中，tage剂包含mcs-f，并且所述方法包括使巨噬细胞(例如，人巨噬细胞)与tage剂接触。
[0593]
在一些实施方案中，tage剂包含抗体，并且所述方法包括使t细胞(例如，人t细胞)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含抗体，并且所述方法包括使巨噬细胞(例如，人巨噬细胞)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含抗体，并且所述方法包括使hsc(例如，人hsc)与tage剂接触。在一些实施方案中，tage剂包含抗体，并且所述方法包括使成纤维细胞(例如，人成纤维细胞)与tage剂接触。
[0594]
在一些实施方案中，tage剂包含抗fap抗体，并且所述方法包括使成纤维细胞(例如，人成纤维细胞)与tage接触。
[0595]
在一些实施方案中，tage剂包含抗ctla-4抗体，并且所述方法包括使t细胞(例如，人t细胞)与tage剂接触。
[0596]
在一些实施方案中，tage剂包含抗cd25抗体，并且所述方法包括使t细胞(例如，人t细胞)与tage剂接触。
[0597]
在一些实施方案中，tage剂包含抗cd11a抗体，并且所述方法包括使t细胞(例如，人t细胞)与tage剂接触
[0598]
在某些实施方案中，tage剂的定点修饰多肽在靶细胞的基因组的靶区域处产生切
割位点，随后修饰细胞的基因组并影响基因表达。因此，在一个实施方案中，基因组的靶区域是靶基因。在某些实施方案中，定点修饰多肽修饰靶细胞的基因组的能力提供了修饰靶基因的表达的方式。可以根据标准方法确定靶核酸(例如基因)的表达水平。在某些情况下，本文公开的方法有效于相对于参考水平，增加靶基因的表达。可选地，在其他情况下，本文公开的方法能够相对于参考水平，降低靶基因的表达。可以使用非特异性引导rna/定点修饰多肽在标准测定中确定参考水平，其中可以相对于对照，测量靶核酸(例如，基因)的增加或降低。
[0599]
定点修饰多肽的内化可以根据标准内化测定以及以下实施例中描述的那些来测定。在一个实施方案中，至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少8％、至少9％、至少10％或至少15％的定点修饰多肽在tage剂与胞外细胞结合抗原接触的给定时间(例如，一小时、两小时、三小时或多于三小时)内被细胞内化。例如，在某些实施方案中，定点修饰多肽在tage剂与胞外细胞结合抗原接触的一小时内被靶细胞以比对照剂(例如，未缀合的(即，没有抗原结合多肽的)定点修饰多肽)更高的效率内化。
[0600]
可以使用本领域已知的任何内化测定来评估tage剂或其组分的内化。例如，tage剂或其组分的内化可以通过将可检测标记(例如，荧光染料)附接到肽(和/或要转染的货物)或通过将肽与报告分子融合来评估，因此一旦发生细胞摄取，就能够进行检测，例如，通过facs分析或通过特异性抗体检测。在一些实施方案中，tage剂的一种或多种组分缀合至具有可淬灭信号的报告分子。例如，如实施例5中所述，基于alexa-488标记的tage剂组分(例如，蛋白质组分或核酸引导物)的检测，可利用基于facs的内化测定，随后将标记组分与细胞在给定的时间段内孵育，之后比较使用或不使用抗a488抗体淬灭的情况下获得的结果。被靶细胞内化的标记分子受到保护，免于被抗a488抗体淬灭，并且因此在淬灭后保留了比对照更强的alexa488信号。相比之下，未内化并因此保留在细胞表面上的标记分子易于被抗a488抗体淬灭，并且因此相对于未淬灭的对照，展示出减少的alexa488信号。
[0601]
本文所述的tage剂可用于将定点修饰多肽靶向可由给定的胞外细胞膜结合蛋白(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)靶向的任何细胞。细胞可以是真核细胞，包括但不限于哺乳动物细胞。可被本发明的tage剂靶向(并对其基因组进行修饰)的哺乳动物细胞的示例包括但不限于小鼠细胞、非人灵长类动物细胞或人细胞。真核细胞可以是(i)在生物体/组织中体内存在，(ii)在组织或细胞组中离体存在，或(iii)以体外状态存在的细胞。在某些情况下，本文的真核细胞可以如其以分离状态(例如，体外细胞、培养细胞)或未分离状态(例如，在受试者中，例如哺乳动物，诸如人、非人灵长类或小鼠)存在的那样。在某些实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞，诸如人细胞。
[0602]
tage剂编辑靶细胞中的靶核酸(例如，基因)的能力可以根据本领域已知的方法确定，包括例如表型测定或测序测定。此类测定可确定与被tage剂编辑的靶细胞的基因或核酸相关的标志物的存在或不存在。例如，如以下实施例中所述，可使用cd47流式细胞术测定来确定tage剂进行基因编辑的功效。在cd47流式细胞术测定中，tage剂靶向靶细胞中的内源性cd47基因序列，其中编辑由靶细胞的细胞表面缺乏cd47表达来证明。可以在细胞群体中测量cd47的水平，并将其与对照tage剂进行比较，其中使用非靶向引导rna作为同一类型靶细胞中的阴性对照。例如，相对于对照的cd47水平降低指示tage剂的基因编辑。在某些情况下，在测试测定中，相对于对照的至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少
20％、至少25％、至少30％、至少35％等的降低指示核酸(例如，基因)被tage剂编辑。本文还考虑了前述百分比的范围。可以确定tage剂的核酸(例如，基因)编辑活性的其他方式包括本领域已知的基于序列的测定(例如，扩增子测序)。
[0603]
在可选实施方案中，tage剂靶向靶细胞中的内源性序列，其中编辑由用以解释tdtomato、荧光(gfp)等报告分子的靶细胞的细胞表面或胞内标志物的表达增加来证明。在此类实施方案中，例如通过流式细胞术检测到的相对于对照的标志物水平增加指示tage剂的基因编辑。在某些情况下，在测试测定中，相对于对照的至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％等的细胞表面标志物增加指示核酸(例如，基因)被tage剂编辑。在某些情况下，在测试测定中，相对于对照的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多等的细胞表面标志物表达增加指示核酸(例如，基因)被tage剂编辑。例如，可使用荧光标志物表达的增加(例如，tdtomato荧光系统)来测量tage剂编辑的增加。本文还考虑了前述百分比的范围。可以确定tage剂的核酸(例如，基因)编辑活性的其他方式包括本领域已知的基于序列的测定(例如，扩增子测序)。
[0604]
在一些实施方案中，tage剂靶向靶细胞中编码细胞表面蛋白的内源性基因序列(例如，cd47)，并且编辑由在靶细胞的细胞表面上缺乏细胞表面蛋白表达的靶细胞的百分比来证明。在一些实施方案中，如通过流式细胞术检测的，例如相对于对照的缺乏细胞表面蛋白表达的靶细胞的百分比指示tage剂的基因编辑。在某些情况下，如通过测试测定检测的，靶细胞群体中至少0.05％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％等的靶细胞中不存在细胞表面蛋白(例如，cd47)指示核酸(例如，基因)被tage剂编辑。本文还考虑了前述百分比的范围。在一些情况下，在测试测定中，相对于对照，不存在细胞表面蛋白(例如，cd47)的靶细胞的百分比增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多指示核酸(例如，基因)被tage剂编辑。可以确定tage剂的核酸(例如，基因)编辑活性的其他方式包括本领域已知的基于序列的测定(例如，扩增子测序)。
[0605]
在可选的实施方案中，靶细胞中的内源性序列被tage剂靶向，其中编辑由基因编辑水平相对于对照(例如，未编辑的靶细胞)的倍数变化来证明。在一个实施方案中，如通过流式细胞术检测的，细胞表面标志物的某一倍数增加或降低将指示相对于对照(例如，具有非靶向引导rna的tage剂，或作为阴性对照的缺乏抗原结合多肽的tage剂)的核酸(例如，基因)编辑。在某些情况下，相对于对照的细胞表面标志物水平的倍数增加为至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少1-5倍、至少1-4倍、至少2-5倍等。在某些情况下，在测试测定中，相对于对照的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多等的细胞表面标志物表达增加指示核酸(例如，基因)被tage剂编辑。在某些情况下，在测试测定中，相对于对照的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多等的细胞表面标志物的表达降低指示核酸(例如，基因)被tage剂编辑。这种倍数增加或降低(取决于由tage剂促进的核酸编辑的结果)将指示核酸(例如，基因)被tage剂编辑。在某些情况下，在测试测定中，相对于对照的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多等的细胞表面标志物表达增加指示核酸(例如，基因)被tage剂编辑。本文还考虑了前述倍数变化的范围。可以确定tage剂的核酸(例如，基因)编辑活性的其他方式包括本领域已知的基于序列的测定(例
如，扩增子测序)。
[0606]
对于将蛋白质(例如，抗体或配体)递送至细胞的方法，可以使用本领域已知的任何方法由编码变体蛋白的核酸生产蛋白质(例如通过共价或非共价键)，或在合适的宿主细胞中表达。用于生产蛋白质的许多方法是本领域已知的。例如，可以在酵母、细菌、昆虫细胞系、植物、转基因动物或培养的哺乳动物细胞中产生和纯化蛋白质；参见例如palomares等人,"production of recombinant proteins:challenges and solutions,"methods mol biol.2004；267:15-52。此外，胞外细胞膜结合蛋白(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)可以连接到促进转移到细胞中的部分，例如脂质纳米粒子，任选地与一旦蛋白质在细胞内就进行切割的接头一起。
[0607]
在一些实施方案中，胞外细胞膜结合蛋白(例如，抗原结合蛋白、配体或cpp)可以通过内吞过程，将位点特异性修饰多肽递送至细胞。这种过程的示例可包括巨胞饮作用、网格蛋白介导的内吞作用、小窝/脂筏介导的内吞作用和/或受体介导的内吞作用机制(例如，清道夫受体介导的摄取、蛋白聚糖介导的摄取)。
[0608]
例如，一旦位点特异性修饰多肽在细胞内，它就可以横贯细胞器膜，诸如核膜或线粒体膜。在某些实施方案中，位点特异性修饰多肽包含至少一个(例如，至少1、2、3、4个或更多个)核靶向序列(例如，nls)。在其他实施方案中，横贯细胞器膜(诸如核膜或线粒体膜)的能力不取决于核靶向序列的存在。因此，在一些实施方案中，位点特异性修饰多肽不包含nls。
[0609]
在一些实施方案中，将tage剂离体施用于细胞，诸如造血干细胞(hsc)或造血祖干细胞(hspc)。例如，在将本文提供的tage剂(例如，tage-cpp剂)离体施用于hsc时，然后可以将tage编辑的hsc移植到需要造血干细胞移植的受试者中。
[0610]
在某些实施方案中，可以例如通过局部施用，向受试者施用本文所述的tage剂。在一些实施方案中，可以经真皮、皮下、静脉内、肌肉内、眼内、骨内或瘤内，向受试者施用tage剂。
[0611]
可以以治疗有效量(例如，用以实现治疗或预防受试者疾病的基因组编辑水平的量)，向受试者施用tage剂。例如，可以向患有癌症(例如，结肠癌或黑素瘤)、眼病或干细胞病症的受试者施用治疗有效量的tage剂。治疗有效量可取决于递送方式，例如，tage剂是局部施用(例如，通过真皮内(例如，在小鼠的情况下，通过胁腹或耳朵)、瘤内、骨内、眼内或肌肉内注射)或全身施用的。
[0612]
本文所述的tage剂可以配制成与预期的施用途径(诸如通过真皮内、瘤内、骨内、眼内或肌肉内注射)相容。可使用溶液、悬浮液、分散剂或乳液进行此类施用，并可包括无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或硫酸氢钠；缓冲剂，诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节张力的剂，诸如氯化钠或葡聚糖。可用酸或碱调节ph，诸如盐酸或氢氧化钠。制剂可以被封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。在某些实施方案中，药物组合物包含tage剂和药学上可接受的载体。
[0613]
tage剂可以包含在试剂盒、容器、包装或分配器中，以及适于将组合物递送给受试者的医疗装置，诸如通过真皮内、瘤内、骨内、眼内或肌肉内注射。包含在试剂盒中的组合物可以在任何种类的容器中供应，使得不同组分的寿命可以被保持并且不会被容器的材料吸
附或改变。例如，密封的玻璃安瓿或小瓶可包含已在中性非反应气体(诸如氮气)下包装的本文所述的组合物。安瓿可由任何合适的材料组成，诸如玻璃、有机聚合物(诸如聚碳酸酯、聚苯乙烯等)、陶瓷、金属或典型地用于容纳试剂的任何其他材料。合适的容器的其他示例包括由与安瓿类似的物质制成的瓶子，以及由诸如铝或合金等箔衬里的内部组成的封套。其他容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器等。一些容器可能具有无菌的可重新密封的口，诸如具有可以被皮下注射针反复刺穿的塞子的瓶子。
[0614]
可以根据治疗目标，通过一个途径，向受试者施用tage剂。可使用多种途径将tage剂递送至所需细胞或组织，包括全身或局部递送。
[0615]
在某些实施方案中，向患有癌症(诸如结肠癌或黑素瘤)的受试者施用tage剂。在一些实施方案中，癌症是，例如，黑素瘤、泌尿生殖系统癌症、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、白血病、肝癌、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、牙龈癌、舌癌、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、骨髓瘤、脑癌、结肠癌、肉瘤或膀胱癌。癌症可以是原发性癌症或转移性癌症。在某些实施方案中，tage剂可以例如以有效于编辑肿瘤中的一种或多种细胞类型(例如，巨噬细胞、cd4 t细胞、cd8 t细胞或成纤维细胞)的量直接注射到受试者的肿瘤中(即，通过瘤内注射)。例如，可使用本公开的tage剂通过瘤内施用tage剂来治疗受试者(例如，人)的实体瘤。
[0616]
在一些实施方案中，tage剂可以用针(诸如turner活检针或chiba活检针)直接注射到实体瘤中。例如，当治疗肺中的实体瘤时，可以使用支气管镜或其他能够插入支气管的装置在胸腔内施用tage剂。可通过使用广泛可用的经支气管抽吸针直接注射支气管树可及的肿块。还可以使用本领域的技术人员已知的穿透肿瘤组织的任何合适方法，将tage剂植入实体瘤内。此类技术可包括在肿瘤中开一个口并将tage剂定位在肿瘤中。
[0617]
在其他实施方案中，可将tage剂注射到受试者的骨髓中(即，骨内注射)。可使用骨内递送编辑受试者的骨髓细胞(例如，造血干细胞(hsc))。当骨内递送时，可使用本公开的tage剂治疗受试者(例如，人)的干细胞病症，其中以提供针对干细胞病症的治疗的方式修饰骨髓细胞(诸如，hscs)。干细胞病症的示例包括但不限于可通过自体移植治疗的病症，包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。可以用本文公开的组合物和方法治疗的干细胞病症的另一个示例是
[0618]
血红蛋白病。
[0619]
在又另外的实施方案中，可以将tage剂以有效于编辑视网膜下细胞(例如，视网膜色素上皮(rpe)或光感受细胞)的量直接注射到受试者(例如，人)的眼部区室中。例如，可使用本公开的tage剂，通过眼内施用tage剂(例如，通过视网膜下注射)来治疗受试者(例如，人)的眼病。
[0620]
基于cpp的tage剂特别有利于局部递送，如下文的实施例中所述，例如实施例48(骨内)、实施例49(眼内)和实施例51(瘤内)。在一个实施方案中，可以通过局部递送，向人类受试者施用包含cpp的tage剂或者包含cpp和配体或抗原结合多肽(例如，抗体)的类配对tage剂。局部递送是指递送至身体的特定位置，其中tage剂将在其递送至的区域内起作用，而非全身起作用。包含作为胞外膜结合部分的cpp的tage剂的局部递送的示例包括局部施用、眼部递送、关节内递送、心脏内递送、真皮内递送、皮内递送、骨内递送、鞘内递送或吸
入。
[0621]
在一个实施方案中，通过全身施用，向人类受试者施用包含配体或抗原结合多肽(例如，抗体或其抗原结合片段)的tage剂，或包含配体或抗原结合多肽(例如，抗体或其抗原结合多肽)的类配对tage剂。包含配体或抗原结合多肽(例如，抗体或其抗原结合片段)、胞外膜结合部分的tage剂的全身递送的示例包括静脉内注射或腹膜内注射。
[0622]
实施例
[0623]
通过参考以下实施例将更全面地理解本发明。然而，它们不应被解读为限制本发明的范围。所有文献和专利引用均通过引用并入本文。
[0624]
除非另有指示，否则在整个实施例中使用的构建体(例如，cas9-2xnls)名称中的符号
“‑”
是指基因融合。构建体名称中的符号“＝”或“:”(例如，cas9-蛋白a:抗体；抗体-spytag＝spycatcher-cas9)是指由两个缀合部分(例如，蛋白a和抗体的fc区，spycatcher和spytag；或halo和halo标签)之间的相互作用介导的缀合。
[0625]
实施例1.cas9-2xnls-蛋白a的设计与生产
[0626]
构建包含2个核定位信号和蛋白a的cas9融合物(cas9(c80a)-2xnls-蛋白a，下文也称为“cas9-2xnls-蛋白a”或“cas9-pa”，除非另有指示；seq id no:3)并根据以下步骤从大肠杆菌纯化。
[0627]
将含有表达cas9-2xnls-蛋白a的载体的大肠杆菌在37℃于选择性tb培养基中培养，伴以》200rpm的振荡。在0.6-0.8的od600下，cas9-2xnls-蛋白a的表达在16℃用1mm iptg过夜诱导或在37℃下诱导3小时。随后通过在4℃以4000xg离心20分钟收获培养物。每升细胞用20ml冷裂解缓冲液(50mm tris ph 8、500mm nacl、10mm咪唑、1x蛋白酶抑制剂、0.025％tx-100)重悬，并通过超声裂解细胞。将碎片在4℃以15000xg沉淀40分钟。
[0628]
将裂解物施于5ml ninta fastflow预填充柱上。用至少5倍体积的ninta洗涤缓冲液(50mm tris ph 8、500mm nacl、10mm咪唑)洗涤柱子。然后用至少5倍体积的tx-100缓冲液(50mm tris ph8、500mm nacl、10mm咪唑、0.025％tx-100)洗涤柱子。随后用ninta洗涤缓冲液洗涤柱子直至完成。洗涤由布拉德福德试剂(bradford reagent)监测。将样品在ninta洗脱缓冲液(50mm tris ph 8、500mm nacl、300mm咪唑)中洗脱，并通过布拉德福德试剂监测。通常，所有蛋白质都用4个柱体积的ninta洗脱缓冲液洗脱。
[0629]
测量洗脱液中的蛋白质浓度，并以1:90w/w的蛋白酶:洗脱液添加hrv 3c蛋白酶。将洗脱液转移到透析盒中，并在1l的透析缓冲液(50mm tris ph 8、300mm nacl)中于4c透析过夜。将透析液施于在过夜透析缓冲液中平衡的5ml ninta柱，并收集流过物。将此步骤重复第二次。用约5ml的过夜透析缓冲液洗涤柱子以确保收集所有流过蛋白。然后将样品用无盐缓冲液(20mm hepes ph 7.5、10％甘油)以1:1v/v稀释使盐浓度降至约150mm，并离心10分钟以4000rpm沉淀任何沉淀的蛋白质。
[0630]
将可溶性蛋白质施于在离子交换(iex)缓冲液a(20mm hepes ph 7.5、150mm kcl、10％甘油)中平衡的hitrap sp柱，并通过从iex缓冲液a到b(20mm hepes ph 7.5、1.5m kcl、10％甘油)的20cv线性梯度以5ml/min流速洗脱(akta pure)。将sp柱在0.5m naoh中洗涤，以确保没有来自其他纯化的内毒素残留。
[0631]
将cas9-2xnls-蛋白a用峰值约33ms/cm或约22％iex缓冲液b从sp柱上洗脱下来。将级分合并并用30kda离心浓缩器浓缩至约0.5ml。
[0632]
将蛋白质在s200 increase 10/300柱(在尺寸排除缓冲液(20mm hepes ph 7.5、200mm kcl、10％甘油)中平衡)上分离。将s200柱在0.5m naoh中洗涤，以确保没有来自其他纯化的内毒素残留。洗脱cas9-蛋白a，峰值约12ml。浓缩蛋白质并储存在-80c。
[0633]
纯化后，将样品与选择性内毒素去除树脂一起孵育，直到内毒素水平适当地低(例如，通常为0.1eu/剂量)。
[0634]
纯化cas9-2xnls-蛋白a融合物，终浓度为大约1mg/l。
[0635]
实施例2.cas9-2xnls-蛋白a的体外dna切割
[0636]
通过体外dna切割测定评估单独的cas9-2xnls-蛋白a(cas9-pa)或与抗cd3抗体结合的cas9-2xnls-蛋白a(“cas9-pa:α-cd3”)的dna切割。
[0637]
通过组合1ul的5x缓冲液(100mm hepes ph 7.5、1m kcl、25％甘油、25mm mgcl2)、2.5ul的1um cas9、0.6ul的5um重折叠引导rna(grna；0.6nm终浓度)和0.9ul水，来重构500nm的cas9-pa:α-cd3。将重构的cas9 rnp在37℃孵育10分钟，以允许cas9 grna结合。为了评估dna切割，将100nm的每种cas9 rnp与100nm的dsdna靶标在37℃孵育30分钟。对cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)进行评估，用作对照。
[0638]
将1ul的20mg/ml蛋白酶k添加到反应中并在50℃孵育15分钟。在片段分析仪毛细管电泳(ce)仪器上分离之前，淬灭反应保持在4℃。根据制造商的建议，用22ul的te缓冲液稀释2ul反应物并通过毛细管电泳进行分析。一式三份运行切割反应，从条带强度中减去背景。切割百分比用以下等式量化：％切割＝(切割产物的总摩尔数)/(底物的总摩尔数)。结果表示为相对于cas9(c80a)内部对照的％切割。
[0639]
如图2所示，cas9-pa:α-cd3实现了与cas9(c80a)-2xnls相似的dna切割水平。
[0640]
实施例3.核转染后通过cas9-2xnls-蛋白a进行的离体dna编辑
[0641]
为了评估cas9-2xnls-蛋白a(“cas9-2xnls-蛋白a”或“cas9-pa”)离体编辑dna的能力，将25pm的cas9-2xnls-蛋白a或cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)通过核转染引入受刺激的人t细胞中。
[0642]
为了分离受刺激的人t细胞，首先从血沉棕黄层中分离pbmc(来自stemcell的sepmate分离方案)。然后将t细胞从pbmc分离(来自stemcell的easysep分离方案)到t细胞培养基(x-vivo-15培养基、5％fbs、50um 2-巯基乙醇、10um n-乙酰基l-半胱氨酸和1％penn-strepp)中。为了刺激t细胞，将t细胞以1x106细胞/ml的浓度转移到烧瓶中的t细胞培养基里并将刺激试剂(每ml 200u ml-1
il-2、5ng ml-1
il-7、5ng ml-1
il-15、和immunocult可溶性cd3/cd28 25ul)添加到t细胞中。刺激72小时后，准备好用于核感染的t细胞。
[0643]
接下来，通过将50um cas9-2xnls-蛋白a与25um靶向cd47基因的重折叠单引导rna(cd47sg2)在cas9缓冲液中在37℃孵育10分钟，使cas9-2xnls-蛋白a与引导rna复合，以制备cas9-2xnls-蛋白a:grna rnp。
[0644]
为了评估cas9-2xnls-蛋白a(cas9-pa)rnp离体编辑dna的能力，将25pm的cas9-2xnls-蛋白a rnp或cas9(c80a)rnp通过核转染引入受刺激的人t细胞中。核转染后，使用采用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出评估cd47下调。最后，从细胞中分离dna并通过扩增子测序进行分析。如图3所示，cas9-2xnls-蛋白a rnp在受刺激的人t细胞中展示出离体编辑。
[0645]
实施例4.体外结合测定以评估cas9-pa:抗体剂的形成
[0646]
为了评估cas9-2xnls-蛋白a(“cas9-pa”)与抗体复合的能力，将cas9-pa与抗cd3抗体以2:1抗体:cas9比混合。通过尺寸排阻色谱法在s200尺寸排阻柱上对单独的cas9pa、单独的抗cd3抗体或cas9-pa和抗cd3抗体的混合物进行分析。
[0647]
如图4所示，cas9-pa可以结合抗cd3抗体，从而形成cas9pa:抗体剂。
[0648]
实施例5.抗体和cas9-pa:抗体内化测定
[0649]
通过基于facs的内化测定评估抗体和tage剂内化。
[0650]
基于facs的内化测定
[0651]
基于facs的内化测定是基于alexa-488标记分子(例如蛋白质或rna引导物)与细胞孵育给定时间段后对标记分子的检测，并比较使用或不使用抗a488抗体进行淬灭所获得的结果。被细胞内化的标记分子被抗a488抗体保护免于淬灭，因此在淬灭后保留相比于对照更强的alexa488信号。相比之下，未内化并因此保留在细胞表面上的标记分子易于被抗a488抗体淬灭，并且因此相对于未淬灭的对照，展示出减少的alexa488信号。
[0652]
本文所述的alexa-488标记蛋白(例如，cas9或抗体)是使用thermofisher出售的nhsester-alexa488(货号#a37563)与蛋白质上可及的赖氨酸缀合来制备的。为了制备alexa-488标记蛋白，将16000pmol的nhs酯-alexa488与1000pmol的蛋白质在ph8.5的补充有10％碳酸氢钠的尺寸排阻缓冲液(20mm hepes ph 7.5、200mm kcl和10％甘油)中在室温下孵育1小时。用10mm tris ph 8淬灭过量的未结合nhs酯，并使用hitrap脱盐柱去除过量的染料。
[0653]
alexa-488标记的引导rna是通过从idt购买的定制tracrrna与5’标记的alexa488制备的。tracrrna与crisprrna复合。首先，通过组合1x重折叠缓冲液、25um crisprrna和25um alexa-488-tracrrna来制备重折叠引导rna。将重折叠反应加热至70c 5分钟，然后平衡至室温。随后，将20mm mgcl2添加到反应中并在50c加热5分钟，然后平衡至室温。然后将标记的引导rna与cas9复合(1.3:1cr/trrna:cas9比)。
[0654]
一旦标记分子制备好后，使用所关注的分子绘制滴定曲线以找到最佳量，从而实现良好的染色而无不相关细胞的背景。然后根据以下方法制备细胞。收集细胞并重悬，使其浓度为500,000-100万个细胞/100ul(500万-1000万/ml)。将fc阻断剂(fc block)添加到细胞中(对于小鼠1:100，对于人5ul/样品)并在冰上孵育15分钟。向每个孔中添加100ul细胞，以300xg悬沉3分钟，并且然后将细胞重悬于80ul的10％rpmi中。如有必要，刺激细胞以使表面标志物上调。然后根据下文的洗涤方法或下一章节中的连续标记方法，将细胞暴露于标记的分子。
[0655]“洗除”法包括首先将所有样品与488标记分子在4c孵育，以允许表面结合。然后在将细胞移至37c之前将分子洗除。这样，只有最初结合到表面的分子才被内化。对于洗除法，将20ul的a488-分子添加到80ul rpmi/fbs中的细胞里，并在冰上孵育30分钟。然后，将100ul的pbs添加到孔顶部，并将细胞以300xg旋转3分钟。将细胞重悬于100ul的rpmi 10％fbs中。将4c样品和对照保持在冰上，而将37c样品移到单独的板并孵育设定的时间(例如，15分钟、60分钟或更长时间(例如，3小时))。第一时间点完成后(即，15分钟)，取出板或细胞并保持在冰上。
[0656]
相比之下，连续法涉及将细胞移至37c(或将它们保持在4c)并从一开始就添加488标记分子。这允许在整个37c孵育期间持续摄取分子。将4c样品保持在冰上，而将37c样品在
37c下孵育。然后在适当的时间将a488标记分子添加到样品中，所述添加从最长的时间点样品开始(即，首先将488标记分子添加到3小时样品中；2小时后(剩余1小时)，将488分子添加到60分钟样品中，然后在2.75小时后(剩余0.25小时)，将488分子添加到15分钟样品中。在最后一个时间点之后，将所有样品移回冰上。以下实验采用连续法。
[0657]
最后，将样品用抗a488抗体淬灭并染色以用于facs分析。在悬沉之前，每个样品被分成两半，为每个时间点提供两个50ul样品。将板以300xg悬沉3分钟。然后，将50ul的macs缓冲液(pbs、2％fbs、2mm edta)添加到所有未淬灭的孔中。接下来，将50ul的抗a488淬灭主混合物添加到所有被淬灭的孔中。最后，向所有样品中添加50ul的facs混合物。然后将样品在冰上孵育30分钟。然后将100ul的macs缓冲液添加到每个孔中，之后将细胞在4c以300xg悬沉3分钟。将细胞重悬于170ul macs缓冲液和10ul 7aad中。孵育5分钟后，将样品在attune nxt流式细胞仪上运行。可选地，可以在分析前通过将细胞重悬于100ul的4％pfa(于pbs中)中、在室温下孵育10分钟、在顶部添加100ul的pbs、悬沉、并将细胞重悬于180ul的pbs中来固定细胞。在此之后，可以在第二天分析细胞。
[0658]
抗体内化
[0659]
为了鉴定可能在cas9-2xnls-蛋白a(“cas9-pa”):抗体剂中起作用的候选抗体，首先评估抗体在没有cas9-pa的情况下的内化能力。在小鼠和人细胞群体(例如，b细胞、髓细胞、t细胞、激活的t细胞、上皮细胞)中评估了具有不同靶标(即cd22、cd33、cd3、cxcr4、cd25、cd54、cd44和egfr)的多种抗体的内化。如表3所示，鉴定了被多种人小鼠免疫细胞内化的抗cd22、抗cd33、抗cd3、抗cxcr4、抗cd54和抗cd44抗体。
[0660]
表3.抗体内化
[0661][0662]
特别地，通过将每种抗体添加到pbmc来评估抗cd3(18nm)或抗cd22(100nm)抗体的内化率。在指定温度下在指定时间后，用抗a488抗体淬灭外部a488信号。通过facs鉴定特定细胞群体。如图5a和5b所示，识别cd3和cd22的抗体以不同的速率内化。
[0663]
tage剂内化
[0664]
接下来，在基于facs的内化测定中评估了与cas9-2xnls-蛋白a(“cas9-pa”)复合的候选抗体的内化。用cas9-pa上或抗体上的a488标记评估了与人igg1或抗cd22抗体复合的cas9-pa。对单独的抗cd22抗体进行评估，用作对照。
[0665]
首先，通过将10nm的每种蛋白质添加到pbmc并在冰上染色30分钟来评估细胞结
合。如图6a所示，将cas9-pa与抗cd22复合会增加对b细胞的结合，但不会增加对t细胞的结合。
[0666]
接下来，将10nm的每种蛋白质添加到pbmc并淬灭后，针对cd45、cd3和cd19对细胞进行染色。如图6b所示，cas9-pa在与抗cd22复合时可以被内化，而cas9-pa没有被内化。如图6c所示，cas9-pa:抗cd22仅结合在b细胞上并内化，而不与同一细胞库中的t细胞结合并内化。因此，cas9-pa:抗体剂在递送至大量pbmc时展示出被b细胞有效内化。
[0667]
实施例6.抗体和cas9-pa:抗体内化测定
[0668]
为了评估不同淬灭方法在实施例5中描述的基于facs的内化测定中的功效，通过基于facs的内化测定评估了抗体(抗cd3抗体)、cas9-2xnls-蛋白a(“cas9-pa”)rnp或tage剂(cas9-pa:抗cd3抗体rnp(“cas9pa:cd3”)内化，其中报告信号(a488或atto550)通过肝素洗涤(2000u/ml)、酸洗涤(ph 3.5)、或抗a488抗体淬灭。对于每种rnp，报告信号(a488或atto500)缀合至引导rna。通过基于facs的活/死测定进一步评估每种淬灭方法对cd45 细胞的毒性，其中fvde506 细胞(死细胞)的水平由facs确定(图7d)。如图7d所示，酸淬灭和肝素淬灭比常规淬灭具有更大的毒性。
[0669]
在t细胞(图7a和图7b)或髓细胞(图7c)中评估了cas9-pa、抗cd3抗体或与抗cd3抗体复合的cas9-pa的内化。如图7a和图7b所示，在内化测定中，酸洗涤对于淬灭与抗a488抗体一样有效。对于髓细胞群体，对于cas9-pa染色，酸洗涤对于淬灭比抗a488抗体更有效(图7c)。
[0670]
实施例7.cas9-2xnls-蛋白a的体外dna切割
[0671]
如实施例2中所述，通过体外dna切割测定评估tage剂cas9-darpin(ec1)的dna切割。如图8所示，cas9-2xnls-darpin(ec1)实现了与cas9(c80a)相似的dna切割水平。
[0672]
实施例8.核转染后通过cas9-darpin(ec1)进行的离体dna编辑
[0673]
为了评估tage剂cas9-darpin(ec1)离体编辑dna的能力，用25pm的cas9-2xnls-darpin(ec1)(“cas9-darpin(ec1)”)rnp或cas9(c80a)rnp对受刺激的人t细胞(参见实施例3)进行核转染。将靶向cd47的引导rna与相应的tage剂缔合以形成核糖核蛋白，并将核糖核蛋白核转染到t细胞中以测试编辑。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。核转染后，使用采用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出评估cd47下调。最后，从细胞中分离dna并通过扩增子测序进行分析。如图9所示，cas9-darpin(ec1)rnp在受刺激的人t细胞中展示出离体编辑。
[0674]
实施例9.cas9-darpin(epcam)与epcam 细胞的结合
[0675]
为了评估tage剂cas9-2xnls-darpin(epcam)(“cas9-darpin(epcam)”)结合epcam 细胞的能力，在pbs中以10、25、50、100或300nm将cas9-darpin(epcam)rnp或cas9(c80a)-2xnls对照与两种不同的人上皮乳腺癌细胞系skbr-3和bt474一起孵育。如图10c所示，通过epcam抗体染色检测到skbr-3和bt474细胞表达epcam。指定rnp与用a488标记的hbb cr/tr引导物复合，并与skbr-3或bt474细胞系一起在冰上孵育30分钟。然后洗涤细胞并通过facs分析。
[0676]
如图10a和图10b所示，epcam靶向的cas9-darpin结合epcam 细胞。当细胞与高浓度的cas9-darpin(epcam)一起孵育时，尤其会检测到结合，如图10d所示。
[0677]
实施例10.cas9-darpin(epcam)的内化
[0678]
使用基于facs的内化测定评估了tage剂cas9-2xnls-darpin(epcam)(“cas9-darpin(epcam)”)在epcam bt-474细胞或skbr3细胞中的内化，其方案在实施例5中进一步描述。在淬灭前，将100nm或300nm的cas9-darpin(epcam)与bt474细胞或skbr3细胞在37℃或4℃一起孵育，保持指定时间(60分钟或30分钟)。
[0679]
如图11所示，cas9-darpin(epcam)被bt474细胞内化。
[0680]
实施例11.共孵育或核转染后通过cas9-darpin(epcam)进行的离体编辑
[0681]
通过离体编辑测定评估了tage剂cas9-2xnls-darpin(epcam)(“cas9-darpin(epcam)”)，比较了共孵育在bt474细胞中所实现的编辑水平与在skbr3细胞中所实现的编辑水平。
[0682]
通过共孵育对贴壁细胞进行离体编辑-在细胞悬浮时进行编辑
[0683]
rnp复合物是通过组合cas9-darpin(epcam)和靶向cd47的hucd47g2引导rna来制备。在组织培养板上生长的细胞通过短暂的胰蛋白酶化而被提起。通过添加至少5倍过量的完全细胞培养基来淬灭胰蛋白酶化。然后计数细胞并用细胞培养基洗涤。细胞培养基含有0-10％胎牛血清，视需要的编辑条件而定。然后通过离心使细胞沉淀并以高密度重悬于细胞培养基中。在eppendorf管中将浓缩的细胞(约500,000个细胞)与3.75um rnp混合。然后将细胞置于37℃培养箱中1小时。1小时后，将带有rnp的细胞转移到预加载有完整细胞培养基的组织培养板中。
[0684]
第二天，在达到80％-100％汇合时分裂细胞(最佳细胞密度取决于所使用的细胞类型)。共孵育后第4天和第7天，收获细胞以使用流式细胞术测量基因编辑的程度。
[0685]
结果
[0686]
如图12所示，cas9-darpin(epcam)在bt474细胞中共孵育后表现出大约1.34％的编辑，在skbr3细胞中共孵育后表现出0.7％的编辑。显示了在无rnp条件下获得的结果以供比较。作为对照，通过核转染引入的cas9-darpin(epcam)的编辑在人t细胞中得到证实(图13)。
[0687]
实施例12.cas9-halo:抗体缀合物的产生
[0688]
根据用于产生cas9-2xnls-蛋白a的类似方案(如实施例1中概述的)，构建包含与halo标签连接的cas9的tage剂(cas9-2xnls-halo(“cas9-halo”))并从大肠杆菌纯化。cas9-halo可以使用与halo配体连接的琥珀酰亚胺酯(普洛麦格p6751)缀合至任何同种型的抗体(或任何其他蛋白质)。在本实施例中，抗cd22抗体与cas9-halo复合。
[0689]
首先，如下将抗cd22抗体通过胺反应基与抗体上的赖氨酸连接而连接到卤代琥珀酰亚胺酯。将100mm的ph8.5碳酸氢钠添加到抗体中。然后，将8摩尔过量的nhsester-halo配体添加到抗体中。将缀合用10mm tris ph7.5淬灭。增加或降低摩尔过量的与抗体相关的halo配体可用于改变cas9:抗体缀合比。接下来，在脱盐柱上运行抗体缀合反应，并将抗体浓缩至》50um。
[0690]
为了将与halo配体连接的抗cd22抗体与cas9-halo缀合，将该抗体和cas9-halo以1:1.5的摩尔比组合，并在室温下孵育1小时。使用sec缓冲液(20mm hepes，ph 7.5，200mm kcl和10％甘油)中的s200 10/300increase尺寸柱将抗体-cas9缀合物与未缀合的材料分离(图14a)。8.5-11ml之间的峰含有缀合的材料。使用sds-page来鉴定cas9-抗体缀合比(图14b)。
[0691]
实施例13.cas9-halo:抗cd22抗体的内化
[0692]
使用基于facs的内化测定(使用洗除法)评估包含cas9-2xnls-halo(“cas9-halo”):抗cd22抗体的tage剂在来自健康脾脏或b16肿瘤的小鼠b细胞中的内化，其方案在实施例5中进一步描述。将20nm指定rnp(cas9-halo:抗cd22抗体、cas9-halo:igg1或cas9-halo)和a488引导rna与总脾细胞或肿瘤浸润淋巴细胞在37℃或4℃一起孵育，保持指定时间(15分钟或60分钟)。通过在cd19 b细胞上门控的facs分析评估了来自每种条件(使用和不使用淬灭)的样品。
[0693]
如图15a和15b所示，cas9-halo:抗cd22被内化到来自健康脾脏和b16肿瘤的小鼠b细胞中。
[0694]
实施例14.cas9-halo:抗cd22抗体的体外dna切割和离体编辑
[0695]
评估了包含cas9-2xnls-halo(“cas9-halo”)的tage剂的体外dna切割和离体核感染编辑活性，分别如实施例2和3中概述的。特别地，通过与dsdna一起孵育对cas9-halo、cas9-halo:抗mctla4、cas9-halo:igg1、cas9-halo:抗cd22、halo-30aa-cas9、halo-3aa-cas9进行了体外活性评估。每个构建体都展示出体外dna切割活性(图16a)。
[0696]
接下来，通过核转染将25pm的每种rnp引入受刺激的人t细胞中。将靶向cd47的引导rna与相应的tage剂缔合以形成核糖核蛋白，并将核糖核蛋白核转染到t细胞中以测试编辑。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。图16b显示了与cas9(c80a)-2xnls相比，halo复合抗体的相对编辑效率。
[0697]
实施例15.混合细胞群体中cas9-halo:抗体rnp差异内化
[0698]
在混合细胞群体中评估了包含与抗体复合的cas9-2xnls-halo(“cas9-halo”)(“cas9-halo:抗体”)的tage剂的内化、tage剂rnp内化。将从合并的b16f10肿瘤分离出的活细胞和与不同抗体(抗ctla4抗体、抗cd22抗体、igg1、mhcii-nb)复合的cas9-halo tage剂rnp混合。还评估了单独的cas9(c80a)rnp和cas9-halo rnp，用作对照。将每种带有a488标记的引导rna的rnp与肿瘤细胞在4℃和37℃下孵育1小时，之后通过facs分析(使用或不使用淬灭)评估样品。评估了每种rnp在门控的dc细胞、非dc髓细胞、b细胞、t细胞、非t/b细胞或cd45-pdpn 细胞中的内化。
[0699]
如图17所示，cas9-halo:抗体rnp在dc细胞、非dc髓细胞、b细胞、t细胞、非t/b细胞和cd45-pdpn 细胞中展示出不同的内化模式。
[0700]
实施例16.具有蛋白a缀合的抗体tage剂-内化和编辑测定
[0701]
将包含与五种不同抗体(抗cd33抗体、抗egfr抗体、抗cd25抗体、抗fap抗体或抗ctla-4抗体)之一连接的cas9-2xnls-蛋白a(“cas9-pa”)的tage剂在不同细胞类型中进行了内化和编辑测试。
[0702]
首先，进行了基于facs的内化测定以评估包含抗cd33抗体、抗egfr抗体或抗fap抗体的cas9-pa:抗体复合物的细胞内化(数据未显示；还参见实施例4)。与cas9pa:huigg1相比，包含与抗cd33抗体复合的cas9-pa的tage剂增加了cas9-pa在us937细胞中的内化，但没有达到抗体单独内化的水平。与pa:huigg1相比，包含与抗egfr抗体复合的cas9-pa的tage剂更好地介导在a431上皮细胞中的结合和内化。类似地，在人成纤维细胞中，cas9-pa:fap结合的比pa:huigg1(同种型对照)更多，并且可以驱动人成纤维细胞的cas9-pa内化。
[0703]
cas9-pa编辑(无抗体)显示出始终比单独的cas9(c80a)更少的编辑(数据未显
cas9)2结合，这与fap介导的结合一致(参见图19f中的框)。
[0720]
实施例19.人t细胞中的抗体tage剂筛选
[0721]
本研究的目的是鉴定用于工程化靶向tage剂的t细胞的抗体。在此筛选中，收集了经临床验证的针对人t细胞上靶标的抗体。在人igg1骨架上用spytag生成抗体，因此它们可以缀合至spycatcher(sc)-cas9，并验证结合和编辑。
[0722]
抗体筛选
[0723]
对于该筛选试验，在expi293细胞中克隆并表达了带有spytag的人t细胞结合抗体。expi293细胞培养物在24孔板形式中在4ml培养基中生长。在第0天，用每毫升细胞0.5ug的表达抗体重链的载体和每毫升细胞0.5ug的表达抗体轻链的载体转染3x106/ml且存活率至少95％的细胞。在第4天或当存活率降至85％之下时收获细胞，以先到者为准。将细胞以3000xg沉淀10分钟，用pbs以1:1体积:体积稀释上清液，并用0.44um过滤器过滤。如果当天不使用，上清液在4c保持过夜。
[0724]
为了纯化抗体，在如上所述制备的25ml的expi293细胞中表达每种抗体。然后将来自表达抗体的细胞的细胞裂解物施于5ml mabselect sure 5ml hitrap柱并用pbs洗涤。用50mm柠檬酸盐缓冲液洗脱抗体，合并峰级分。用1m hepes ph8将合并的洗脱液的ph调节至ph 7.5。使用30kd浓缩器浓缩最终抗体溶液。
[0725]
为了产生f(ab’)2片段，在消化缓冲液(150mm nacl和10mm na3po4，ph7.5)中平衡genovis fragit midi-spin树脂。以最终f(ab’)2所需量的两倍添加抗体以解决任何损失，并在室温下振荡消化2小时。通过sds-page分析证实消化。
[0726]
在expi293培养基中将纯化的带有spytag的抗体(ab-st)与cas9(wt)-2xnls-spycatcher-htn(“ac28”，可选地称为“sc-cas9”)混合以形成ab-st＝sc-cas9缀合物。将3x sc-cas9添加到纯化的抗体中并使其缀合45分钟。将未缀合的过量cas9用spytag(室温下5x spytag溶液持续1-2小时)“淬灭”，以使得能够阻断而没有过量cas9产生噪音。通过用高达10％expi293培养基处理pbmc来执行用pbmc进行的实验。在expi293培养基中缀合ab-st＝sc-cas9，从而避免了完全纯化缀合物的需要。
[0727]
对于该试验，鉴定了与人t细胞上的受体结合的45种抗体，并选择以进行克隆。表达了31种带有spytag的抗体以用于进一步测试。
[0728]
抗体的t细胞结合
[0729]
测试了31种带有spytag的t细胞结合抗体以用于与人t细胞结合。评估了帕利珠单抗(“pali”)和无rnp条件的未染色细胞，用作阴性对照。将激活0、2或7天的总pbmc用针对指定靶标的抗体在4c以70nm染色1小时。使用a488标记的抗人二抗来检测结合。进行了多重比较的anova分析，以将每种抗体与pali进行比较；如果抗体的染色明显多于pali，则其进入下一步骤。
[0730]
31种测试抗体中的14种与人t细胞的结合明显高于背景。鉴定出的抗体靶向以下抗原：cd11a、cd25、cd27、cd44、cd52、cd54(icam)、cd59、gitr、hla-dr、icos、ox40、pd-l1、和pd-1。使用spycatcher缀合系统的、包含抗ctla-4小鼠和人抗体(包括伊匹单抗和曲美木单抗)的tage剂以前在脾细胞和受刺激的pbmc上进行过测试。虽然这些tage剂能够内化，但未观察到编辑。除了在t细胞抗体筛选中鉴定的新抗原外，下文描述了对伊匹单抗和曲美木单抗的进一步研究。
[0731]
ab＝cas9缀合物的t细胞结合
[0732]
然后针对与cas9的缀合，选择在上一步中鉴定的14种抗体以及伊匹单抗(“ipi”)和曲美木单抗(“trem”)(总共16种抗体)。总pbmc被激活两天，然后用7或70nm的ab＝cas9缀合物染色。基于a550标记的grna的存在检测结合。将帕利珠单抗(pali)用作阴性对照。进行了多重比较的anova分析，以将每种抗体与pali进行比较；如果抗体的染色明显多于pali，则其进入下一步骤。
[0733]
如图20a所示，测试的ab＝cas9缀合物(抗体＝cas9(wt)-2xnls-spycatcher-htn(“ac28”))中的14种与t细胞的结合明显高于阴性对照(pali)。
[0734]
在使用5x“冷”抗体的70nm阻断试验中进一步评估了ab＝cas9缀合物与人t细胞的结合，以评估过量的未缀合抗体是否阻断了ab＝cas9缀合物的结合。总pbmc被激活两天，且首先用350nm未缀合的带有spytag的抗体阻断30分钟。然后用70nm的ab＝cas9缀合物对细胞进行染色。a550信号来自a550标记的引导物。基于a550信号，通过比较有和无阻断下抗体缀合物的结合量来确定阻断百分比。
[0735]
如图20b-20e所示，15种测试的tage剂(ab＝cas9)中的14种与人t细胞结合且在阻断试验中被未缀合的抗体阻断。这些结果指示，包含靶向cd11a、cd25、cd27、cd44、cd52、cd54(icam)、gitr、hla-dr、icos、ox40、pd-l1或pd-1的抗体的tage剂(ab＝cas9)可以特异性地结合人t细胞。
[0736]
实施例20.人t细胞的抗cd11a和抗cd25抗体tage剂离体编辑
[0737]
抗cd11a和抗cd25a抗体(如在实施例19中描述的t细胞筛选中鉴定的)或其抗原结合片段缀合至cas9以形成基于抗体的tage剂(cd11a＝cas9和cd25a＝cas9)。特别地，抗cd11a和抗cd25a抗体缀合至cas9(wt)-2xnls-spycatcher-4xnls(“ac26”)或cas9(wt)-2xnls-spycatcher-htn(“ac28”)。纯化了缀合物并通过共孵育测试了对人t细胞的编辑。将靶向cd47的引导rna与相应的tage剂缔合，并且将tage剂与t细胞共孵育以测试编辑。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。对来自两个不同供体的人t细胞的编辑进行了评估。测试了全长抗体和不含fc结构域的抗体片段以确定较小的分子是否具有更高的编辑。将帕利珠单抗用作阴性对照。
[0738]
如图21a和图21b所示，缀合至抗cd11a抗体或抗cd25抗体或其抗原结合片段的cas9(例如，ac26或ac28)展示出对人t细胞的编辑相对于同种型对照抗体增加。在从第二个供体获得的人t细胞中实现了类似的编辑。
[0739]
实施例21.cas9-il2的设计和纯化
[0740]
构建包含cas9(c80a)或cas9(wt)和白细胞介素2(il2)的多种tage剂生物缀合物或融合物并根据以下步骤从大肠杆菌纯化。
[0741]
cas9-il2融合物的纯化
[0742]
将含有表达通常与人il2(hil2)或小鼠il2(mil2)融合的cas9(例如，cas9-2xnls-il2(superkine)(“sk”)、cas9-2xnls-hil2(sk)、cas9-hil2(wt)、cas9-mil2(wt))或与能够帮助生物缀合il2的缀合部分融合的cas9(例如，spycatcher-cas9(c80a)-2xnls、spycatcher-cas9(c80a)、spycatcher-tdp-cas9、spycatcher-tdp-cas9-kdel(“kdel”，公开为seq id no:40))的载体的大肠杆菌在37℃于选择性tb培养基中培养，伴以》200rpm的振荡。在0.6-0.8的od600下，cas9构建体的表达在16℃用1mm iptg过夜诱导或在37℃下诱
guhcl、100mm tris ph8、10mm咪唑)。将样品在室温下旋转孵育至少1小时。定期涡旋沉淀以帮助再溶解。通过在4c以15000g离心40分钟，将剩余的细胞碎片与再溶解的包涵体分离。
[0752]
将含有变性的il2-spytag蛋白的上清液施于在再溶解缓冲液中平衡的ninta柱，并在室温下轻轻旋转孵育1小时。用再溶解缓冲液洗涤ninta柱，直到洗涤液中不再有蛋白质。将树脂与5个柱体积的ninta洗脱缓冲液一起在室温下轻轻旋转孵育30分钟。测量蛋白质浓度，然后用0.1m tris 8、10mm还原gsh和1mm gssg将蛋白质稀释到0.1mg/ml和2m guhcl的浓度。将样品在室温下轻轻搅拌过夜(》16小时)以重新折叠。然后通过以4000g离心10分钟除去不溶部分。在装载到在il2凝胶过滤缓冲液(pbs ph 7.2)中平衡的s200 increase 10/300柱上之前，可溶部分在离心浓缩器中浓缩。通过sds page检查蛋白质部分的纯度。合并并浓缩含有蛋白质的部分。添加甘油至5％终体积，并将样品在液氮中快速冷冻以在-80c下储存。
[0753]
il2-spytag:spycatcher-cas9生物缀合物的制备
[0754]
为了制备il2-spytag:spycatcher-cas9生物缀合物(例如，il2-st:spycatcher-cas9(c80)、il2-st:spycatcher-tdp-cas9、il2-st:spycatcher-tdp-cas9-kdel(“kdel”，公开为seq id no:40))，将il 2-spytag和spycatcher-cas9构建体(例如，spycatcher-cas9(c80a)-2xnls、spycatcher-cas9(c80)、spycatcher-tdp-cas9、spycatcher-tdp-cas9-kdel(“kdel”，公开为seq id no:40))在1x复合缓冲液(50mm hepes ph 7.5，200mm kcl，10％甘油)中以2:1的摩尔比混合，并在37c孵育30分钟。通过在4c以12000g离心1分钟去除任何不溶性聚集体。将样品加载到在cas9凝胶过滤缓冲液中平衡的s200 increase 10/300柱上。通过sds page检查蛋白质部分的纯度。合并含有蛋白质的部分，浓缩，并在液氮中快速冷冻以在-80c下储存。
[0755]
实施例22.cas9-il2的体外dna切割
[0756]
评估了包含cas9和il-2的各种tage剂(即cas9-il2构建体)的dna切割。通过体外dna切割测定评估了cas9-2xnls-il2、cas9-2xnls-hil2(sk)、cas9-2xnls-hil2(wt)、cas9-2xnls-mil2(wt)、spycatcher-cas9-2xnls、spycatcher-tdp-cas9、spycatcher-tdp-cas9-(kdel)(“kdel”，公开为seq id no:40)、il2-st(“il2-st”)、spycatcher-cas9-2xnls、hil2(sk)-spytag:spycatcher-tdp-cas9、il2-st:spycatcher-tdp_cas9-(kdel)(“kdel”，公开为seq id no:40))、4xnls-cas9-2xnls(“4xnls”)、gfp-cas9或cas9(c80a)。通过组合1ul的5x缓冲液(100mm hepes ph 7.5、1m kcl、25％甘油、25mm mgcl2)、2.5ul的1um cas9、0.6ul的5um重折叠引导rna(grna)和0.9ul水，来重构500nm的每种tage剂。将重构的cas9 rnp在37℃孵育10分钟，以允许cas9 grna结合。为了评估dna切割，将100nm的cas9 rnp与100nm的dsdna靶标在37℃孵育30分钟。
[0757]
用1ul的10mg/ml核糖核酸酶a淬灭反应，并在37c下进一步孵育10分钟。将1ul的20mg/ml蛋白酶k添加到反应中并在50c孵育15分钟。在片段分析仪毛细管电泳(ce)仪器上分离之前，淬灭反应保持在4c。根据制造商的建议，用22ul的te缓冲液稀释2ul反应物并通过毛细管电泳进行分析。一式三份运行切割反应，从条带强度中减去背景。切割百分比用以下等式量化：％切割＝(切割产物的总摩尔数)/(底物的总摩尔数)。结果表示为相对于cas9(c80a)内部对照的％切割。
[0758]
如图24a-24c所示，评估的各种cas9-il2构建体(包含由spycatcher/spytag系统
缀合的变体)在体外实现了dna切割。
[0759]
实施例23.通过cas9-il2对小鼠或人t细胞进行的离体dna编辑
[0760]
评估包含cas9和il-2(例如cas9-il2构建体)的tage剂在受刺激的小鼠或人t细胞中离体编辑dna的能力，如下文进一步描述。
[0761]
在小鼠t细胞中进行核感染和共孵育rnp复合物的方法
[0762]
为了分离小鼠t细胞，从杰克逊实验室(jackson laboratory)的ai9小鼠(b6.cg-gt(rosa)26sortm9(cag-tdtomato)hze/j)获得小鼠胸腺和脾脏。胸腺在胶原酶d中消化(10mg，在4ml完全培养基(rpmi1640，10％hyclone hi fbs，50umβ-巯基乙醇，1％pen-strep，rmil2(r&d)10ng/ml，rmil7(r&d)5ng/ml，rmil15(r&d)10ng/ul)中，在37c进行1小时)。然后将消化产物捣碎穿过70um过滤器。在stemcell易分离缓冲液中使用10ml注射器背面将脾脏捣碎穿过70um过滤器。将细胞以500g旋沉5分钟。吸出上清液，将细胞重悬于2ml易分离缓冲液中，然后使用countess ii进行计数。
[0763]
使用easysep
tm
小鼠t细胞分离试剂盒从合并物中纯化t细胞。再次对纯化的t细胞进行计数，然后用含有cd3/cd28和rmil2(10ng/ml)、rmil7(5ng/ml)和rmil15(10ng/ml)的小鼠dynabeads进行刺激。细胞被刺激3天。3天后，通过磁分离去除珠子并在用rnp处理(通过核转染或共孵育)之前用完全培养基洗涤一次。
[0764]
对于核转染实验，将每种条件1x106细胞重悬于20ul p3缓冲液中。将细胞和rnp(25pmol)混合物转移到nucleofector电转杯中。使用p3原代细胞4d-nucleofector tm x试剂盒s(脉冲编码dn-100)进行核转染。核转染后，将细胞和rnp混合物在室温下孵育5分钟。孵育后将80ul完整培养基添加到电转杯的每个孔中。然后将细胞转移到具有完全培养基的12孔板中。
[0765]
对于共孵育实验，将每种条件1x106细胞重悬于20ul无血清培养基(1x rpmi1640)中。rnp复合物以300pmol制备成60ul体积(5um储备液)。将细胞和rnp在8孔联管中混合，并在室温下孵育1小时。然后将混合物逐滴添加到含有完全培养基的12孔板中，在收获细胞用于tdtomato facs读出之前，将细胞在37c孵育6天。
[0766]
通过核转染对受刺激的人t细胞的离体编辑
[0767]
为了评估cas9-il2构建体或生物缀合物离体编辑dna的能力，通过核转染将指定rnp引入受刺激的人t细胞中。为了分离受刺激的人t细胞，首先从血沉棕黄层中分离pbmc(来自stemcell的sepmate分离方案)。然后将t细胞从pbmc分离(来自stemcell的easysep分离方案)到t细胞培养基(x-vivo-15培养基、5％fbs、50um 2-巯基乙醇、10um n-乙酰基l-半胱氨酸和1％penn-strepp)中。为了刺激t细胞，将t细胞以1x106细胞/ml的浓度转移到烧瓶中的t细胞培养基里并将刺激试剂(每ml 200u ml-1
il-2、5ng ml-1
il-7、5ng ml-1
il-15、和immunocult可溶性cd3/cd28 25ul)添加到t细胞中。刺激72小时后，准备好用于核感染的t细胞。
[0768]
接下来，通过将50um cas9与25um靶向cd47基因的重折叠单引导rna(cd47sg2)在cas9缓冲液中在37℃孵育10分钟，使每种cas9构建体与引导rna复合，以制备rnp。
[0769]
为了评估每种rnp离体编辑dna的能力，将受刺激的人t细胞与25pm的rnp(除非另有指示)一起孵育。核转染后，在核转染后3-10天，使用采用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出评估cd47下调。最后，从细胞中分离dna并通过扩增子测序进行分析。
[0770]
离体编辑结果
[0771]
用50nm的cas9-il2对受刺激的小鼠t细胞进行核转染。从细胞中分离dna，并通过facs分析确定的rnp切除介导的荧光激活(tdtomato)程度来检测编辑水平。如图25a所示，用cas9-il2核转染的小鼠t细胞展示出离体编辑。
[0772]
接下来，通过核转染评估4xnls-cas9、cas9-mil2 wt、cas9-hil2 wt、cas9-2xnls-il2(sk)、cas9(c80a)-2xnls或无cas9对照对受刺激的人t细胞的离体编辑。如图25b所示，4xnls-cas9-2xnls、cas9-2xnls-mil2 wt、cas9-2xnls-hil2 wt、cas9-2xnls-il2(sk)、cas9(c80a)-2xnls在人t细胞中通过核转染实现了编辑。通过流式细胞术检测到的经编辑细胞的百分比显示在图25c中。另外，还评估了使用指定rnp进行核转染后，经编辑的总t细胞、cd4 t细胞和cd8 t细胞的百分比。图25d显示了cd4和cd8 t细胞中的编辑率相似。
[0773]
实施例24.cas9-il2细胞因子活性测定
[0774]
在小鼠和人t细胞中使用体外细胞因子活性测定评估了il2在tage剂背景下保留细胞因子活性的能力。
[0775]
首先，在小鼠t细胞中使用体外细胞因子活性测定评估了il2在cas9-2xnls-il2(sk)融合物背景下保留细胞因子活性的能力。将小鼠t细胞与不同浓度的cas9-il2(sk)、重组人il-2或重组小鼠il-2一起培养24小时。然后评估细胞增殖的百分比变化。如图26a所示，cas9-2xnls-il2保留了功能性细胞因子活性，对t细胞增殖的影响与单独的重组小鼠或人il-2相当。
[0776]
接下来，用人t细胞进行细胞因子活性测定。对于该测定，将来自两个不同供体的人t细胞与包含il-2和cas9的缀合物一起孵育，并测量了活t细胞的水平。人t细胞增殖的百分比变化被测量为rnp浓度的函数。评估的缀合物包含通过spytag缀合至spycatcher-cas9(wt)-2xnls(“sc-cas9”)或cas9(wt)-2xnls-spycatcher-4xnls(“ac26”)的il-2。将无rnp条件、单独的sc-cas9和单独的ac26作为对照进行评估。另外通过反式递送的重组人il-2(“ac26 rhil-2”)的递送评估ac26。
[0777]
如图26b所示，人t细胞的增殖水平与反式提供的重组未缀合il-2诱导的生长相似。另外，il2＝cas9缀合物在人t细胞上诱导cd25表达，表明il2＝cas9缀合物具有功能性il2活性(数据未显示)。这证明il-2活性在il2＝cas9缀合物中保留并支持人t细胞的增殖。
[0778]
随后进行竞争测定以评估由il-2介导的包括il-2和cas9的缀合物的结合程度。如图28f所示，游离il2(sk)-st与il2＝sc-cas9结合竞争。尽管il-2(sk)cas9在人t细胞中有效内化，但非类配对的il-2(sk)cas9(即缺乏cpp的缀合物)并未增强人t细胞的编辑(数据未显示)。
[0779]
接下来，使用hek il-2报告细胞系在各种cas9-il2构建体或生物缀合物中评估了il2细胞因子活性。il2r报告细胞系是表达il2受体和下游信号传导组件的人细胞系(hek)。在il-2刺激后，细胞系分泌可用于定量评估il-2活性的碱性磷酸酶。报告细胞系用于评估未缀合的il2-st或缀合的il2＝cas9的生物学il-2活性以及评估il2响应细胞系统中的编辑活性(参见实施例28)。
[0780]
hek il-2报告细胞系允许基于seap的诱导评估il-2活性，这可以通过seap催化的比色反应进行评估。为了评估il2活性，将hek il-2blue细胞系(invivogen)在补充有10％fbs和pen/strep的dmem中培养。在预热的培养基中以约280,000个细胞/ml制备细胞悬浮
液。使用hi-fbs来确保不存在背景碱性磷酸酶。每孔添加20ul的每种rnp或对照。还制备了最高浓度通常为10nm的5倍系列滴定对照标准物。将50k细胞(180ul的280k/ml悬浮液)接种在96孔平底板的每孔中。将细胞在37c、5％co2下孵育20-24小时。然后将20ul细胞上清液添加到新的平底96孔板中。每孔添加180ul quanti-blue溶液并在37c孵育1-3小时。结果在读板器上在620-655nm读取。
[0781]
每种指定cas9-il2 rnp的il-2活性程度(od)作为rnp浓度的函数显示于图27a-27中。图27a-278c的结果进一步总结于表5中。这些结果证明il-2在多种cas9构建体或生物缀合物中具有活性。此外，如图27d和27e所示，il2/cpp类配对的rnp在人报告细胞系中保留了il-2活性。
[0782]
表5.hek il-2报告细胞系中cas9-il2细胞因子活性
[0783][0784]
实施例25.cas9-il2的内化
[0785]
通过基于facs的内化测定评估包含cas9和il-2(例如，cas9-il2)的tage剂的内化，如本文进一步概述的。
[0786]
基于facs的内化测定
[0787]
基于facs的内化测定是基于alexa-488标记分子(例如蛋白质或rna引导物)与细胞孵育给定时间段后对标记分子的检测，并比较使用或不使用抗a488抗体进行淬灭或通过其他淬灭方法(例如，酸洗涤)所获得的结果。被细胞内化的标记分子被抗a488抗体保护免于淬灭，因此在淬灭后保留相比于对照更强的alexa488信号。相比之下，未内化并因此保留在细胞表面上的标记分子易于被抗a488抗体淬灭，并且因此相对于未淬灭的对照，展示出减少的alexa488信号。
[0788]
本文所述的alexa-488标记蛋白(例如，cas9或抗体)是使用thermofisher出售的nhsester-alexa488(货号#a37563)与蛋白质上可及的赖氨酸缀合来制备的。为了制备alexa-488标记蛋白，将16000pmol的nhs酯-alexa488与1000pmol的蛋白质在ph8.5的补充有10％碳酸氢钠的尺寸排阻缓冲液(20mm hepes ph 7.5、200mm kcl和10％甘油)中在室温下孵育1小时。用10mm tris ph 8淬灭过量的未结合nhs酯，并使用hitrap脱盐柱去除过量的染料。
[0789]
alexa-488标记的引导rna是通过从idt购买的定制tracrrna与5’标记的alexa488制备的。tracrrna与crisprrna复合。首先，通过组合1x重折叠缓冲液、25um crisprrna和25um alexa-488-tracrrna来制备重折叠引导rna。将重折叠反应加热至70c 5分钟，然后平衡至室温。随后，将20mm mgcl2添加到反应中并在50c加热5分钟，然后平衡至室温。然后将标记的引导rna与cas9复合(1.3:1cr/trrna:cas9比)。
[0790]
一旦标记分子制备好后，使用所关注的分子绘制滴定曲线以找到最佳量，从而实现良好的染色而无不相关细胞的背景。然后根据以下方法制备细胞。收集细胞并重悬，使其浓度为500,000-100万个细胞/100ul(500万-1000万/ml)。将fc阻断剂(fc block)添加到细胞中(对于小鼠1:100，对于人5ul/样品)并在冰上孵育15分钟。向每个孔中添加100ul细胞，以300xg悬沉3分钟，并且然后将细胞重悬于80ul的10％rpmi中。如有必要，刺激细胞以使表面标志物上调。然后根据下文的洗涤方法或下一章节中的连续标记方法，将细胞暴露于标记的分子。
[0791]“洗除”法包括首先将所有样品与488标记分子在4c孵育，以允许表面结合。然后在将细胞移至37c之前将分子洗除。这样，只有最初结合到表面的分子才被内化。对于洗除法，将20ul的a488-分子添加到80ul rpmi/fbs中的细胞里，并在冰上孵育30分钟。然后，将100ul的pbs添加到孔顶部，并将细胞以300xg旋转3分钟。将细胞重悬于100ul的rpmi 10％fbs中。将4c样品和对照保持在冰上，而将37c样品移到单独的板并孵育设定的时间(例如，15分钟、60分钟或更长时间(例如，3小时))。第一时间点完成后(即，15分钟)，取出板或细胞并保持在冰上。
[0792]
相比之下，连续法涉及将细胞移至37c(或将它们保持在22c)并从一开始就添加488标记分子。这允许在整个37c孵育期间持续摄取分子。将4c样品保持在冰上，而将37c样品在37c下孵育。然后在适当的时间将a488-标记分子添加到样品中，所述添加从最长的时间点样品开始(即，首先将488标记分子添加到3小时样品中；2小时后(剩余1小时)，将488分子添加到60分钟样品中，然后在2.75小时后(剩余0.25小时)，将488分子添加到15分钟样品中。在最后一个时间点之后，将所有样品移回冰上。
[0793]
最后，将样品用抗a488抗体淬灭并染色以用于facs分析。在悬沉之前，每个样品被分成两半，为每个时间点提供两个50ul样品。将板以300xg悬沉3分钟。然后，将50ul的macs缓冲液(pbs、2％fbs、2mm edta)添加到所有未淬灭的孔中。接下来，将50ul的抗a488淬灭主混合物添加到所有被淬灭的孔中。最后，向所有样品中添加50ul的facs混合物。然后将样品在冰上孵育30分钟。然后将100ul的macs缓冲液添加到每个孔中，之后将细胞在4c以300xg悬沉3分钟。将细胞重悬于170ul macs缓冲液和10ul 7aad中。孵育5分钟后，将样品在attune nxt流式细胞仪上运行。可选地，可以在分析前通过将细胞重悬于100ul的4％pfa(于pbs中)中、在室温下孵育10分钟、在顶部添加100ul的pbs、悬沉、并将细胞重悬于180ul
的pbs中来固定细胞。在此之后，可以在第二天分析细胞。
[0794]
cas9-il2内化
[0795]
使用上述“连续”法通过基于facs的内化测定评估cas9-il2。cas9-il2用a488(rnp-ax488)标记。将rnp-ax488和引导rna与受刺激的人t细胞一起孵育，保持指定时间和温度。在指定时间之后，通过facs分析评估外部a488信号(有或没有预先用抗a488抗体淬灭)。如图28所示，cas9-il2被受刺激的人t细胞内化。
[0796]
实施例26.与cas9-il2共孵育的原代鼠免疫细胞的离体编辑
[0797]
通过离体编辑测定评估了包含cas9和il-2(例如，cas9-il2)的tage剂对鼠免疫细胞的编辑。cas9-2xnls-il2(“cas9-il2”)、包含通过spycatcher部分缀合的cas9和il-2的tage剂、或具有引导rna的cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)通过核转染或共孵育引入小鼠胸腺细胞和脾细胞中，如下文进一步概述的。
[0798]
在小鼠t细胞中进行核感染和共孵育rnp复合物的方法
[0799]
为了分离小鼠t细胞，从杰克逊实验室的ai9小鼠(b6.cg-gt(rosa)26sortm9(cag-tdtomato)hze/j)获得小鼠胸腺和脾脏。胸腺在胶原酶d中消化(10mg，在4ml完全培养基(rpmi 1640，10％hyclo ne hi fbs，50umβ-巯基乙醇，1％pen-strep，rmil2(r&d)10ng/ml，rmil7(r&d)5ng/ml，rmil15(r&d)10ng/ul)中，在37c进行1小时)。然后将消化产物捣碎穿过70um过滤器。在stemcell易分离缓冲液中使用10ml注射器背面将脾脏捣碎穿过70um过滤器。将细胞以500g旋沉5分钟。吸出上清液，将细胞重悬于2ml易分离缓冲液中，然后使用countess ii进行计数。
[0800]
使用easysep
tm
小鼠t细胞分离试剂盒从合并物中纯化t细胞。再次对纯化的t细胞进行计数，然后用含有cd3/cd28和rmil2(10ng/ml)、rmil7(5ng/ml)和rmil15(10ng/ml)的小鼠dynabeads进行刺激。细胞被刺激3天。3天后，通过磁分离去除珠子并在用rnp处理(通过核转染或共孵育)之前用完全培养基洗涤一次。
[0801]
对于共孵育实验，将300nm的具有引导rna的指定rnp添加到细胞培养基中，并与小鼠胸腺细胞共孵育。对于核转染对照，通过核转染将300pmol的具有引导rna的指定rnp引入细胞中。编辑频率被测量为rnp切除介导的荧光激活(tdtomato)程度。如图29所示，cas9-il2介导原代鼠免疫细胞的被动编辑。
[0802]
接下来，在鼠淋巴细胞中评估了cas9-il2的编辑率。如图30a所示，cas9-il2在鼠胸腺细胞和脾细胞中展示出不同的编辑率。编辑频率被测量为rnp切除介导的荧光激活的程度(％tdtomato)。
[0803]
然后构建了包含通过spycatcher部分缀合的cas9和il-2的tage剂，并评估了对小鼠脾细胞和原发性肿瘤衍生的小鼠t细胞的离体编辑。评估的缀合物包含缀合至cas9(wt)-2xnls-spycatcher-4xnls(“ac26”)的il-2(sk)-spytag。rnp与引导rna(sgjd298，除非另有指示)复合，并通过与细胞共孵育引入。使用无rnp条件或用cas9(c80a)-2xnls与非靶向rna(gbfp)复合处理作为编辑的阴性对照。
[0804]
如图30b和30c所示，与不与il-2缀合的cas9分子相比，il-2＝ac26缀合物提高了对小鼠脾t细胞的编辑。此外，il-2＝ac26缀合物编辑了原发性肿瘤衍生的小鼠t细胞(图30d)。
[0805]
实施例27.用il-2＝cas9 rnp对人t细胞和b细胞进行的离体编辑
spyc-cas9”)，或缀合至spyc-cas9、cas9-spyc-4x或4x-spyc-cas9的il2(sk)-spytag。在图33e中，评估的构建体包括4xnls-cas9(wt)-2xnls(“4xnls”)，spycatcher-tdp-cas9(“tdp”)，spycatcher-tdp-cas9-(kdel)(“kdel”；“kdel”公开为seq id no:40)，spycatcher-cas9(wt)-2xnls(“spyc”)，cas9(wt)-2xnls-spycatcher-4xnls(“ac26”，4xnls-spycatcher-cas9(wt)-2xnls(“ac32”)，或缀合至tdp、kdel(“kdel”，公开为seq id no:40)、spyc-cas9、ac26或ac32的il2(sk)-spytag。在图33f中，评估的构建体包括缀合至cas9-spycatcher(“cas9-sc”)的il2(sk)-spytag(“il2(sk)-st”)、il2(sk)-spytag＝cas9-2xnls-spycatcher-4xnls(“cas9-sc-4xnls”)。评估了cas9(c80a)-2xnls或无rnp，作为对照。
[0815]
图32a显示了在hek il2报告细胞用指定rnp进行核转染后第4天的facs测定的结果。通过核转染或共孵育编辑的细胞的百分比分别在图32b和图32c中示出。这些结果证明，评估的各种il2-cas9构建体或生物缀合物通过核转染或共孵育实现了离体编辑。
[0816]
如图32d和图32e所示，与非类配对的cas9相比，包含il2和4xnls的cas9缀合物改进了表达il2r的人报告细胞系的编辑。包含il2和4xnls缀合物(具有不同的分子拓扑结构)的两种不同cas9缀合物与具有其他肽/修饰物(如tdp和kdel(“kdel”，公开为seq id no:40)修饰物)的类配对的分子相比，改善了对表达il2r的人报告细胞系的编辑(图32e)。在一系列浓度下进一步评估了类配对的构建体之一(il2(sk)-spytag＝cas9-2xnls-spycatcher-4xnls(“cas9-sc-4xnls”))的编辑。如图32f所示，以较低浓度的cas9-sc-4xnls编辑人报告细胞系，这在缺乏4xnls的非类配对的il2-cas9中未观察到。
[0817]
实施例29.cas9 rnp稳定性
[0818]
为了评估生理条件如何影响cas9 rnp，我们检查了tage剂cas9(c80a)-2xnls rnp在小鼠血液、血浆、血清和肿瘤微环境(tme)中的稳定性。将cas9(c80a)-2xnls rnp与sgrna重组，终浓度为5um rnp。将1ul的5um cas9(c80a)-2xnls rnp稀释(终浓度为1um)到小鼠血液、血浆、血清、tme流体或缓冲液中，在实验前分离。给定流体的终浓度为80％。将rnp在靶组织中孵育10、30、60和120分钟。接下来，将溶液以1:10稀释到体外dna切割反应物中，终浓度为100nm。如实施例2中概述的进行切割反应并处理数据。将dna切割相对于在单独的缓冲液中孵育(即未经处理的rnp)实现的dna切割进行了归一化。
[0819]
如图33a所示，在血液或血浆中孵育的cas9(c80a)-2xnls的dna切割活性急剧减弱，而在血清或肿瘤微环境中孵育的cas9(c80a)-2xnls的活性则逐渐下降
[0820]
接下来，评估了cas9(c80a)-2xnls活性对ph的敏感性。将cas9(c80a)-2xnls rnp与sgrna重组，终浓度为5um rnp。将1ul的5um rnp稀释到50mm磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中，将ph调整为4、4.5、5、5.5或7.5，终浓度为1um rnp。在例如肿瘤微环境的背景下，酸性ph在生理上是相关的。将rnp在指定ph下孵育10、30、60或120分钟。将溶液用等体积的100mm hepes ph 7.5淬灭，终浓度为100nm rnp，并在体外dna切割反应中评估rnp。如实施例2中概述的进行切割反应并处理数据。将dna切割相对于通过标准反应(即未经处理的rnp)实现的dna切割进行了归一化。
[0821]
如图33b所示，在生理ph下，cas9 rnp维持体外dna切割活性。这证明rnp活性会被血浆或血液减弱，但对ph变化有抵抗力。
[0822]
实施例30.cas9 rnp生物分布
[0823]
接下来，在体内评估了tage剂cas9-2xnls-egfp的生物分布，如下文进一步概述。
[0824]
将rnp体内给药至临床前小鼠模型的方法
[0825]
rnp配制：cas9蛋白经过反复的内毒素去除纯化，直到内毒素水平低于0.1eu/600pmol。在大多数情况下，这相当于0.1eu/小鼠的最大暴露。注射前，将cas9蛋白从储存缓冲液交换到pbs ph 7.2中。cas9和sgrna在注射当天以1:1.2的比复合。所得的rnp在pbs ph 7.2的溶液中制备，并补充了1mm mgcl2，以用于随后注射。还进行了类似的配制：向相同基础溶液中添加脂染胺(lipofectamine)(rnaimax)。每次注射的rnp剂量高达600pmol，每只动物1200pmol，还进行了低至6.26pmol的rnp剂量的注射。rnp在注射当天新鲜制备，并在注射前储存在湿冰上。
[0826]
注射量和注射部位：在注射之前通过吸入氧气和异氟烷气体混合物来麻醉小鼠。在注射前至少一天，将小鼠剃毛以用于皮下、皮内和瘤内注射。通过局部或全身给药途径注射宿主小鼠。
[0827]
对于皮内注射入皮肤(例如胁腹)，注射体积为100μl的6μm的cas9 rnp，总剂量为600pmol。
[0828]
对于皮内注射入耳(例如耳舟的腹面)，注射体积为10μl的6.26μm的cas9 rnp，总剂量为62.6pmol。
[0829]
对于肌内注射(例如注射入胫骨前肌)，注射体积为10μl的10μm的cas9 rnp，总剂量为100pmol。
[0830]
对于皮下注射(例如胁腹)，注射体积为100μl的6.26μm的cas9 rnp，总剂量为626pmol。
[0831]
对于静脉内(例如眶后)注射，注射体积为100μl的6μm的cas9 rnp，总剂量为600pmol。
[0832]
对于瘤内(例如，注射入皮内植入的同基因b16f10黑色素瘤)，使用30号胰岛素注射器注射体积为20μl的30μm的cas9 rnp，总剂量为600pmol。注射的肿瘤是可触及的，并在肿瘤接种后7天注射。
[0833]
术后监测：允许动物在没有垫料的干净笼子中从麻醉中恢复并监测直到可以走动。一旦可以走动，就将小鼠送回它们的笼子里，并通过定期的日常健康检查进行监测。
[0834]
尸检和组织分析：注射cas9 rnp后7-14天对小鼠实施安乐死。收集并处理相关组织，用于下游测定。
[0835]
cas9 rnp生物分布-结果
[0836]
通过皮间或静脉注射将600pmol的cas9(c80a)-2xnls-egfp rnp(“cas9-egfp”)与sghbb引导rna一起注射入野生型c57 bl6/j小鼠中。10分钟后和60分钟后，从小鼠中收集组织(例如皮肤、淋巴结、肝脏、血液、脾脏)，并通过facs进行分析。
[0837]
如图34a和图34b所示，静脉注射指定rnp后在肝脏中检测到cas9-egfp。此外，如图35c所示，在皮内注射指定rnp后，在皮肤中的cd45 和cd45-细胞上检测到cas9-egfp。
[0838]
实施例31.cas9 rnp体内编辑
[0839]
为了检测tage剂cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)rnp是否实现了体内编辑，将63pmol指定rnp和引导rna(sghbb或sgjd298)与rnaimax一起注射到耳内，另外，还在注射后12天静脉施用(630pmol)。该体内研究根据实施例30中概述的体内给药方案进行。将来自每只动物
spycatcher-4xnls”)、ac28(cas9(wt)-2xnls-spycatcher-htn)、缀合至ac26或ac28的ifnγ、或伴随ac26反式递送的ifnγ。除非另有说明，所有rnp都与引导物sgjd298复合。
[0852]
首先，为了评估mifnγ在mifnγ＝cas9缀合物的背景下保留生物活性，用ifnγ＝cas9-cpp tage、未缀合的tage剂或未缀合的tage剂与商业重组小鼠ifnγ(反式)处理小鼠m2巨噬细胞。处理后，细胞用同种型对照抗体或针对已知由ifnγ诱导的细胞表面蛋白具有特异性的抗体进行染色。mifnγ＝cas9-cpp缀合物能够在小鼠巨噬细胞中诱导已知响应标志物(例如，mhc ii、pd-l1、cd86、cd80和来自cd206的开关)的表达，因此具有生物ifnγ活性(数据未显示)。
[0853]
然后将mifnγ＝cas9-cpp rnp与引导rna复合，并通过与鼠巨噬细胞共孵育引入。用指定tage处理小鼠m2巨噬细胞。7天后，通过流式细胞术测量编辑。如图39所示，与小鼠巨噬细胞中缺乏ifnγ的cas9＝cpp tage相比，ifnγ＝cas9-cpp类配对的tage增加了编辑。此外，当以顺式或反式提供时，mifnγ-spytag可以增强编辑。
[0854]
实施例36.用csf＝cas9 rnp对小鼠巨噬细胞进行的离体编辑
[0855]
通过离体编辑测定评估了包含缀合至小鼠集落刺激因子(“csf”)的cas9的tage剂对鼠巨噬细胞的编辑。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。评估的条件包括无rnp条件、具有非靶向sgrn a(“sgbfp htn”)的his-tat-nls-cas9(wt)-2xnls、具有靶向grna的his-tat-nls-cas9(wt)-2xnls(“htn”)、sc-cas9(“spycatcher-cas9(wt)-2xnls”)、ac28(cas9(wt)-2xnls-spycatcher-htn)、2xspytag＝(sc-cas9)2(“spymer”)、spytag-fc＝(sc-cas9)2(“fc-cas9”)、csf-fc-spytag＝(sc-cas9)2(“mscf fc-cas9”)、spytag-fc＝(ac28)2(fc＝ac28)或csf-fc-spytag＝(ac28)2(“csf fc＝ac28”)。除非另有说明，所有rnp都与引导sgjd298复合。
[0856]
将csf＝cas9-cpp rnp与引导rna复合，并通过与鼠巨噬细胞共孵育引入。用指定tage处理小鼠m2巨噬细胞。7天后，通过流式细胞术测量编辑。如图40所示，含有csf的缀合物和spymer(2xspytag＝(sc-cas9)2可以编辑鼠巨噬细胞，并且与缺乏csf的对应物(例如，fc＝cas9和fc＝ac28)相比具有更高的编辑能力
[0857]
实施例37. 4xnls-cas9的设计和纯化
[0858]
构建包含n-末端4个核定位信号(nls)(4xnls-cas9(c80a)-2xnls，也称为4xnls-cas9)的cas9融合物并根据以下步骤从细菌纯化。
[0859]
将含有表达4xnls-cas9(c80a)的所关注的载体的大肠杆菌在37℃于选择的tb培养基中培养，伴以》200rpm的振荡。在0.6-0.8的od600下，载体中多肽的表达在16℃用1mm iptg过夜诱导。随后通过在4℃以4000xg离心20分钟收获培养物。每升细胞用20ml冷裂解缓冲液重悬，并通过超声裂解细胞(总时间为5分钟，脉冲为2s on，5s off，输出为6.5)。将碎片在4c以15000xg沉淀40分钟。
[0860]
将裂解物施于5ml ninta fastflow预填充柱上。用至少5倍体积的ninta洗涤缓冲液洗涤柱子，并且然后用至少5倍体积的tx-100缓冲液洗涤柱子。用ninta洗涤缓冲液洗涤柱子直至完成。洗涤由布拉德福德试剂监测。将样品在ninta洗脱缓冲液中洗脱，并通过布拉德福德试剂监测。通常，所有蛋白质都用4个柱体积的ninta洗脱。
[0861]
测量洗脱液中的蛋白质浓度，并以1:90w/w的蛋白酶:洗脱液添加hrv 3c蛋白酶。将洗脱液转移到透析盒中，并在1l的透析缓冲液中于4c透析过夜。将透析液施于在过夜透
析缓冲液中平衡的5ml ninta柱，随后收集流过物。将此步骤重复第二次。
[0862]
将蛋白质施于在iex缓冲液a中平衡的hitrap sp柱，并通过从iex缓冲液a到b的20cv线性梯度以5ml/min流速洗脱(akta pure)。
[0863]
将4xnls-cas9用峰值约55ms/cm或约32％iex缓冲液b从sp柱上洗脱下来。将级分合并并用30kda离心浓缩器浓缩至约0.5ml。
[0864]
将蛋白质在s200 increase 10/300柱(在尺寸排除缓冲液中平衡)上分离。洗脱4xnls-cas9，峰值约12ml。浓缩蛋白质并储存在-80c。
[0865]
纯化4xnls-cas9融合物，终浓度为大约0.5mg/l。
[0866]
实施例38.cpp-cas9 rnp的体外dna切割
[0867]
通过体外dna切割测定评估包含不同cpp的多种tage剂的dna切割。通过组合1ul的5x缓冲液(100mm hepes ph 7.5、1m kcl、25％甘油、25mm mgcl2)、2.5ul的1um cas9、0.6ul的5um重折叠引导rna(grna)和0.9ul水，来重构500nm的指定rnp。将重构的cas9 rnp在37℃孵育10分钟，以允许cas9 grna结合。为了评估dna切割，将100nm的指定cas9 rnp与100nm的dsdna靶标在37℃孵育30分钟。
[0868]
用1ul的10mg/ml核糖核酸酶a淬灭反应，并在37c下进一步孵育10分钟。将1ul的20mg/ml蛋白酶k添加到反应中并在50c孵育15分钟。在片段分析仪毛细管电泳(ce)仪器上分离之前，淬灭反应保持在4c。根据制造商的建议，用22ul的te缓冲液稀释2ul反应物并通过毛细管电泳进行分析。一式三份运行切割反应，从条带强度中减去背景。切割百分比用以下等式量化：％切割＝(切割产物的总摩尔数)/(底物的总摩尔数)。结果表示为相对于cas9(c80a)内部对照的％切割。
[0869]
如图42a和图42b所示，4xnls-cas9-2xnls、his-4xnls-cas9-2xnls、htn-cas9-2xnls、tat-cas9(c80a)-2xnls、tat-ha-cas9(c80a)-2xnls、s19-cas9(c80a)-2xnls、hph1-cas9(c80a)-2xnls、l17e-cas9(c80a)-2xnls、和imt-p8-cas9(c80a)-2xnls展示出体外dna切割。
[0870]
实施例39.通过核转染对cpp-cas9 rnp进行的离体dna编辑
[0871]
为了评估包含不同cpp的各种tage剂离体编辑dna的能力，通过核转染将指定rnp引入受刺激的人t细胞中。为了分离受刺激的人t细胞，首先从血沉棕黄层中分离pbmc(来自stemcell的sepmate分离方案)。然后将t细胞从pbmc分离(来自stemcell的easysep分离方案)到t细胞培养基(x-vivo-15培养基、5％fbs、50um 2-巯基乙醇、10um n-乙酰基l-半胱氨酸和1％penn-strepp)中。为了刺激t细胞，将t细胞以1x106细胞/ml的浓度转移到烧瓶中的t细胞培养基里并将刺激试剂(每ml 200u ml-1
il-2、5ng ml-1
il-7、5ng ml-1
il-15、和immunocult可溶性cd3/cd28 25ul)添加到t细胞中。刺激72小时后，准备好用于核感染的t细胞。
[0872]
将靶向cd47的引导rna与相应的tage剂缔合以形成核糖核蛋白，并将核糖核蛋白核转染到t细胞中以测试编辑。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。接下来，通过将50um的cpp-cas9融合物与25um靶向cd47基因的重折叠单引导rna(cd47sg2)在cas9缓冲液中在37℃孵育10分钟以制备每种rnp，来将每种rnp与引导rna复合。
[0873]
为了评估cpp-cas9 rnp离体编辑dna的能力，将受刺激的人t细胞与25pm的指定cpp-cas9 rnp或cas9 c80a rnp一起孵育。核转染后，在核转染后3-10天通过fac评估cd47
下调。最后，从细胞中分离dna并通过扩增子测序进行分析。
[0874]
如图43a和图43b所示，4xnls-cas9-2xnls、his-4xnls-cas9-2xnls、htn-cas9-2xnls、tat-cas9(c80a)-2xnls、tat-ha-cas9(c80a)-2xnls、s19-cas9(c80a)-2xnls、hph1-cas9(c80a)-2xnls和l17e-cas9(c80a)-2xnls在受刺激的人t细胞中展示出离体编辑
[0875]
实施例40. 4xnls-cas9 rnp的内化
[0876]
通过基于facs的内化测定评估tage剂4xnls-cas9-2xnls(“4x-nls-cas9”)的内化，如本文进一步概述的。
[0877]
基于facs的内化测定
[0878]
基于facs的内化测定是基于alexa-488标记分子(例如蛋白质或rna引导物)与细胞孵育给定时间段后对标记分子的检测，并比较使用或不使用抗a488抗体进行淬灭所获得的结果。被细胞内化的标记分子被抗a488抗体保护免于淬灭，因此在淬灭后保留相比于对照更强的alexa488信号。相比之下，未内化并因此保留在细胞表面上的标记分子易于被抗a488抗体淬灭，并且因此相对于未淬灭的对照，展示出减少的alexa488信号。
[0879]
本文所述的alexa-488标记蛋白(例如，cas9或抗体)是使用thermofisher出售的nhsester-alexa488(货号#a37563)与蛋白质上可及的赖氨酸缀合来制备的。为了制备alexa-488标记蛋白，将16000pmol的nhs酯-alexa488与1000pmol的蛋白质在ph8.5的补充有10％碳酸氢钠的尺寸排阻缓冲液(20mm hepes ph 7.5、200mm kcl和10％甘油)中在室温下孵育1小时。用10mm tris ph 8淬灭过量的未结合nhs酯，并使用hitrap脱盐柱去除过量的染料。
[0880]
alexa-488标记的引导rna是通过从idt购买的定制tracrrna与5’标记的alexa488制备的。tracrrna与crisprrna复合。首先，通过组合1x重折叠缓冲液、25um crisprrna和25um alexa-488-tracrrna来制备重折叠引导rna。将重折叠反应加热至70c 5分钟，然后平衡至室温。随后，将20mm mgcl2添加到反应中并在50c加热5分钟，然后平衡至室温。然后将标记的引导rna与cas9复合(1.3:1cr/trrna:cas9比)。
[0881]
一旦标记分子制备好后，使用所关注的分子绘制滴定曲线以找到最佳量，从而实现良好的染色而无不相关细胞的背景。然后根据以下方法制备细胞。收集细胞并重悬，使其浓度为500,000-100万个细胞/100ul(500万-1000万/ml)。将fc阻断剂(fc block)添加到细胞中(对于小鼠1:100，对于人5ul/样品)并在冰上孵育15分钟。向每个孔中添加100ul细胞，以300xg悬沉3分钟，并且然后将细胞重悬于80ul的10％rpmi中。如有必要，刺激细胞以使表面标志物上调。然后根据下文的洗涤方法或下一章节中的连续标记方法，将细胞暴露于标记的分子。
[0882]“洗除”法包括首先将所有样品与488标记分子在4c孵育，以允许表面结合。然后在将细胞移至37c之前将分子洗除。这样，只有最初结合到表面的分子才被内化。对于洗除法，将20ul的a488-分子添加到80ul rpmi/fbs中的细胞里，并在冰上孵育30分钟。然后，将100ul的pbs添加到孔顶部，并将细胞以300xg旋转3分钟。将细胞重悬于100ul的rpmi 10％fbs中。将4c样品和对照保持在冰上，而将37c样品移到单独的板并孵育设定的时间(例如，15分钟、60分钟或更长时间(例如，3小时))。第一时间点完成后(即，15分钟)，取出板或细胞并保持在冰上。
[0883]
相比之下，连续法涉及将细胞移至37c(或将它们保持在4c)并从一开始就添加488
nucleofectortm x kit s进行核转染。核转染后，将细胞和rnp混合物在室温下孵育5分钟。孵育后，将80ul完整培养基添加到电转杯的每个孔中。然后将细胞转移到具有完全培养基(rpmi 1640、10％hyclone hi fbs、50umβ-巯基乙醇)的12孔板中。
[0894]
对于共孵育实验，将200,000个细胞(每种条件)重悬于20ul无血清培养基(1x rpmi1640)中。rnp复合物以300pmol制备，体积60ul(5um储备液)。将细胞和rnp复合物(总共80ul)在8孔联管中在室温下混合1小时。然后，将混合物逐滴添加到含有完全培养基的12孔板中。在收获细胞用于tdtomato facs读出之前，将细胞在37c孵育3天。
[0895]
在小鼠t细胞中进行核感染和共孵育rnp复合物的方法
[0896]
为了分离小鼠t细胞，从杰克逊实验室的ai9小鼠(b6.cg-gt(rosa)26sortm9(cag-tdtomato)hze/j)获得小鼠胸腺和脾脏。胸腺在胶原酶d中消化(10mg，在4ml完全培养基(rpmi 1640，10％hyclo ne hi fbs，50umβ-巯基乙醇，1％pen-strep，rmil2(r&d)10ng/ml，rmil7(r&d)5ng/ml，rmil15(r&d)10ng/ul)中，在37c进行1小时)。然后将消化产物捣碎穿过70um过滤器。在stemcell易分离缓冲液中使用10ml注射器背面将脾脏捣碎穿过70um过滤器。将细胞以500g旋沉5分钟。吸出上清液，将细胞重悬于2ml易分离缓冲液中，然后使用countess ii进行计数。
[0897]
使用easysep
tm
小鼠t细胞分离试剂盒从合并物中纯化t细胞。再次对纯化的t细胞进行计数，然后用含有cd3/cd28和rmil2(10ng/ml)、rmil7(5ng/ml)和rmil15(10ng/ml)的小鼠dynabeads进行刺激。细胞被刺激3天。3天后，通过磁分离去除珠子并在用rnp处理(通过核转染或共孵育)之前用完全培养基洗涤一次。
[0898]
对于核转染实验，将每种条件1x106细胞重悬于20ul p3缓冲液中。将细胞和rnp(25pmol)混合物转移到nucleofector电转杯中。使用p3原代细胞4d-nucleofector tm x试剂盒s(脉冲编码dn-100)进行核转染。核转染后，将细胞和rnp混合物在室温下孵育5分钟。孵育后将80ul完整培养基添加到电转杯的每个孔中。然后将细胞转移到具有完全培养基的12孔板中。
[0899]
对于共孵育实验，将每种条件1x106细胞重悬于20ul无血清培养基(1x rpmi1640)中。rnp复合物以300pmol制备成60ul体积(5um储备液)。将细胞和rnp在8孔联管中混合，并在室温下孵育1小时。然后将混合物逐滴添加到含有完全培养基的12孔板中，在收获细胞用于tdtomato facs读出之前，将细胞在37c孵育6天。
[0900]
通过共孵育对贴壁人t细胞进行离体编辑
[0901]
对于共孵育实验，在第1天，将人t细胞以将在次日产生30％-50％汇合细胞的密度接种在组织培养容器中。在第2天，制备rnp复合物，将其添加到细胞中，并孵育给定的时间段(例如，在37c下1小时)。细胞培养基含有0-10％热灭活胎牛血清，视需要的编辑条件而定。在此之后，将rnp用细胞培养基稀释，洗涤以去除过量的rnp，或者留在细胞培养基中。一旦细胞达到80％-100％汇合(最佳细胞密度取决于所使用的细胞类型)，以将在第7天再次达到80％-100％汇合的密度分裂细胞。最终，收集细胞进行测定，以测量基因编辑的速率和功能结果。基因编辑效率的检测包括流式细胞术或dna测序。
[0902]
结果
[0903]
对于鼠成纤维细胞或鼠脾t细胞的共孵育实验，将指定rnp与jd298引导物添加到细胞培养基中，如上文概述的。对于核转染对照，通过核转染将100pmol的具有jd298引导
rna的指定rnp引入细胞中。编辑频率被测量为鼠成纤维细胞(图45a)或鼠脾t细胞(图45b)中rnp切除介导的荧光激活程度(％tdtomato)。
[0904]
如图45a和图45b所示，通过核转染引入的4xnls-cas9在鼠成纤维细胞和脾t细胞中表现出稳健的编辑。在小鼠成纤维细胞中与4xnls-cas9共孵育后展示14％的编辑，在脾t细胞中与其共孵育后展示大约1％的编辑。
[0905]
接下来，在于处理前刺激的鼠胸腺细胞和脾细胞中评估了通过4xnls-cas9得到的编辑率。通过核转染将50nm指定rnp引入细胞中，并通过被动共孵育将300nm的指定rnp引入细胞中。编辑频率被测量为rnp切除介导的荧光激活的程度(％tdtomato)。如图46所示，4xnls-cas9在鼠胸腺细胞和脾细胞中展示出不同的编辑率。
[0906]
然后评估了在人t细胞中通过4xnls-cas9 rnp共孵育实现的编辑。遵循上述用于编辑贴壁细胞的方案，在人t细胞中在两种不同共孵育条件下对指定4xnls-cas9或c80a(对照)进行测试。在第一组条件下(图45c)，将300nm的4xnls-cas9或具有hbb引导物的无rnp对照与细胞一起在含有血清的培养基中孵育。在第二组条件下(图45d)，将300nm的4xnls-cas9或具有cd47g2引导物的无rnp对照与细胞一起在无血清培养基中孵育。对于核转染对照，通过核转染将25pmol的具有hbb引导rna(图45c)或cd47g2引导rna(图45d)的4xnls-cas9引入细胞中。如图456d所示，4xnls-cas9在人t细胞中实现了大约0.5％的编辑。
[0907]
实施例42.在人t细胞中通过cpp-cas9 rnp进行的离体编辑
[0908]
通过在人t细胞中共孵育评估通过包含与不同cpp(例如，4-cas9(c80a)-2sv40、tat、tat-ha、s19、hph1、l17e、imt-p8、his-tat-nls、s10、s18、s85 impt8(c143)、zf5.3、穿膜肽、aurein、lmwp、lah4、vectofusin、cm18)连接的cas9的tage剂实现的编辑。根据实施例41中描述的用于编辑贴壁细胞或小鼠成纤维细胞的方案，将3.75um的包括表6中所示cpp的cas9 rnp与人t细胞或小鼠成纤维细胞共孵育。除非另有指示，表6中测试的构建体从n-末端到c-末端包含指定cpp、cas9和2xnls(即cpp-cas9-2xnls)。在第7天通过facs分析评估经编辑的t细胞的百分比。如图50a、图50b和表6所示，多种包含cpp的cas9 rnp在人t细胞中实现了编辑，包括4xnls-cas9-2xnls、imt-p8-cas9(c80a)-2xnls、穿膜肽-cas9(c80a)-2xnls、zf5.3-cas9(c80a)-2xnls和cas9(wt)-2xnls-spycatcher-4xnls。另外，cas9-cpp变体进一步在小鼠成纤维细胞中表现出编辑，如图50c和图50d以及表6所示。
[0909]
表6.通过cpp-cas9进行的离体编辑
[0910][0911]
实施例43.在小鼠成纤维细胞中通过htn-cas9 rnp进行的离体编辑
[0912]
多种his-tat-nls(htn)构建体缀合至cas9以制备下表7中所示的缀合物。
[0913]
表7.htn构建体
[0914][0915]
通过离体编辑测定在小鼠成纤维细胞中评估htn-rnp融合物的dna编辑能力。指定htn-rnp与jd298引导rna通过共孵育引入小鼠成纤维细胞中，如下文进一步概述的。
[0916]
根据实施例5中描述的方案分离小鼠成纤维细胞。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。对于共孵育实验，将200,000个细胞重悬于20μl无血清培养基(1x rpmi-1640)中。rnp复合物以300pmol制备，体积60μl(5μm储备液)。将细胞和rnp复合物(总共80μl)在8
孔联管中在室温下混合1小时。然后，将混合物逐滴添加到含有完全培养基的12孔板中。在37℃下孵育3天后，收获细胞并通过流式细胞术分析以评估荧光激活程度(％tdtomato)，作为rnp介导的dna编辑程度的读出。未与rnp共孵育的细胞作为阴性对照。
[0917]
如图47所述，htn-rnp展示出小鼠成纤维细胞的离体编辑，这通过与htn-rnp共孵育的成纤维细胞中tdtomato表达与对照细胞相比的增加而证明。
[0918]
实施例44.在小鼠bmdm中通过htn-cas9 rnp进行的离体编辑
[0919]
接下来，通过离体编辑测定在小鼠骨髓衍生的巨噬细胞(bmdm)中评估了tage剂htn-cas9融合物的dna编辑能力。将具有引导rna(hbb引导物或jd298引导物)的指定htn-cas9 rnp(cas9与htn连接)或cas9(c80a)-2xnls(对照)通过共孵育引入小鼠bmdm中，如下文进一步概述的。
[0920]
为了分离小鼠bmdm，收获了来自ai9小鼠(n＝8)的股骨和胫骨。通过在膝关节处切割分离股骨和胫骨，并使用1-ml注射器和25号针头用培养基冲洗这些骨。然后将骨髓细胞上下吸移，使细胞成为单细胞悬浮液。接下来，使细胞通过细胞粗滤器进入50ml锥形管中。用另外5ml培养基洗涤粗滤器。以300xg旋转5分钟后，弃去上清液。通过添加4ml红细胞裂解缓冲液裂解红细胞，在冰上孵育7分钟，并通过添加培养基(终体积为50ml)淬灭。在默认设置下使用countess ii对骨髓细胞进行计数。在补充有50ng/ml小鼠重组mcsf 440e6的培养基中调整浓度为10
×
106个细胞/ml；90％为活细胞。将细胞以每孔大约5ml铺于6孔板中(每板大约10％e6/ml)。然后将细胞在37c、5％co2下孵育7天，并通过向培养物中添加5ml补充有mcsf的新鲜培养基每2-3天补给一次。
[0921]
对于共孵育实验，将500,000个分化的bmdm(未极化(m0)或极化(m1或m2))铺于96孔板中。在第0天，将75pmol复合rnp添加到细胞中。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。在37℃下孵育6天后，收获细胞并通过流式细胞术分析以评估荧光激活程度(％tdtomato)，作为rnp介导的dna编辑程度的读出。未与rnp共孵育的细胞(例如，与cas9(c80a)-2xnls和引导rna(hbb引导物或jd298引导物)共孵育的细胞，或与单独的引导rna共孵育的细胞)作为阴性对照。
[0922]
如图48所述，htn-cas9 rnp展示出增强的m2分化的bmdm的离体编辑，这通过与htn-cas9 rnp共孵育的m2巨噬细胞中tdtomato表达与对照细胞相比的增加而证明。
[0923]
实施例45.在人t细胞中通过htn-cas9 rnp进行的离体编辑
[0924]
通过与原代人t细胞共孵育对通过tage剂4xnls-cas9-2xnls(“4xnls-cas9”)或his-tat-nls(htn)-cas9-2xnls(“htn-cas9”)实现的编辑进行评估。根据实施例41中描述的用于编辑贴壁细胞的方案，将包含指定cpp的cas9 rnp与原代人t细胞共孵育。将靶向cd47的引导rna与相应的tage剂缔合以形成核糖核蛋白，并将核糖核蛋白核转染到t细胞中以测试编辑。使用流式细胞术测量表面cd47损失的表型读出来测量编辑。如图51所示，与4xnls或htn融合的cas9 rnp在原代人t细胞中实现了编辑。
[0925]
实施例46.通过4xnls-cas9 rnp进行的体内编辑
[0926]
通过体内编辑研究评估4xnls-cas9-2xnls(“4xnls-cas9”)，该研究根据实施例30中概述的方案进行。具体而言，将600pmol(6μm)的4xnls-cas9或cas9(c80a)-2xnls(“c80a”)与对照引导rna(sgbfp)或靶向引导rna(sgjd298)通过双侧皮内胁腹注射给ai9小鼠。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。施用后7天，从每只小鼠收获组织并通过
2xnls(“sc-cas9”)用作对照。通过facs分析评估经编辑的cd11b

fr/80

tam、cd8

t细胞、cd4

t细胞、nk

细胞或pdpn

细胞的百分比，以检测rnp切除介导的tdtomato荧光激活。如图55所示，相对于cas9(c80a)-2xnls，用4xnls-cas9-2xnls或cas9(wt)-2xnls-spycatcher-4xnls(“sc-4xnls”)观察到增强的编辑。
[0940]
实施例51.瘤内注射后通过cpp-tage进行的体内编辑
[0941]
在mc38ova模型(结肠癌模型)或b16f10模型(黑素瘤模型)中瘤内注射后，评估cpp-tage rnp(4xnls-cas9-2xnls(“4xnls”)或cas9(c80a)-2xnls(“c80a”))的体内编辑。在mc38ova或b16f10模型的肿瘤注射后8-12天，将包含靶向sgrna(sgjd298)或非靶向对照sgrna(sgbfp)的cpp-tage rnp进行瘤内注射。使用tdtomato荧光报告系统测量基因编辑。评估具有rnp切除介导的荧光激活的细胞的百分比(％tdtomato)，以确定每个肿瘤模型中的编辑率。评估了几种肿瘤微环境(tme)细胞类型的原位编辑。
[0942]
如图56a和图56b所示，在黑素瘤和结肠癌模型两者中，在巨噬细胞、cd4 t细胞、cd8 t细胞和成纤维细胞类型中都观察到了通过cpp-tage进行的编辑。这些结果证明，关键的tme细胞类型是通过cpp-tage原位编辑的。
[0943]
实施例52.用cpp-cas12a rnp对成纤维细胞进行的离体编辑
[0944]
通过与小鼠成纤维细胞共孵育评估包含缀合至cas12a(氨基酸球菌属物种cas 12a；uniprot登录号：u2umq6-1)的具有mhprt grna的细胞穿透肽(cpp)的cpp tage剂实现的编辑。将包含缀合至cpp的cas12a的rnp与细胞共孵育。cpp tage包括his-4xnls-cas12(wt)-2xnls(“4xnls-cas12a”)；his-cas12(wt)-4xnls-2xnls(“cas12a-4xnls”)；his-tat-nls-cas12(wt)-2xnls(“htn-cas12a”)；或his-cas12(wt)-htn v1(肝素早期高峰；“cas12a-htn v1”)和his-cas12(wt)htn v2(肝素晚期高峰；“cas12a-htn v2”)。his-cas12a-2xnls和encas12a(即his-cas12(e174r/s542r/k548r)-2xnls)用作比较物。使用t7核酸内切酶i测量靶基因组编辑和编辑效率。如图57所示，用包含4xnls的cas12a(his-4xnls-cas12(wt)-2xnls(“4xnls-cas12a”)或his-cas12(wt)-4xnls-2xnls(“cas12a-4xnls”))观察到增强的编辑。
[0945]
实施例53.通过流式细胞术与扩增子测序进行的离体编辑测量的比较
[0946]
在先前的实施例中，在某些情况下，通过使用流式细胞术得到的表型读出来评估离体编辑(参见例如实施例3、8、14、17、18、20、23、27、28、39、45或47)。与标准扩增子测序方法相比，流式细胞术提供了一种快速检测编辑的方式。为了确定通过流式细胞术获得的编辑测量与通过测序获得的编辑测量的关联程度，通过流式细胞术和下一代测序(ngs)两者评估tage剂编辑的t细胞或成纤维细胞(通过共孵育或核转染)。
[0947]
包含cas9(c80a)-2xnls或4xnls-cas9(c80a)-2xnls的tage剂与靶向cd47或cd44的sgrna复合，以形成核糖核蛋白(rnp)。非靶向sgrna用作阴性对照(sgbfp；bfp是人类基因组中不存在的基因)。
[0948]
tage剂对成纤维细胞的编辑通过与每种tage剂的共孵育或用其进行的核转染进行评估。
[0949]
为了评估通过共孵育对成纤维细胞的编辑，使人真皮成纤维细胞在组织培养板上生长。将rnp添加到96孔圆底超低附着组织培养板的孔中。添加30ul适当的rnp，以达到5um的rnp浓度。从组织培养板中收获人真皮成纤维细胞，并以20x106个细胞/ml重悬于成纤维
细胞生长培养基中。向含有rnp的孔中添加10ul成纤维细胞。每个孔中的最终条件是：40ul体积；3.75um rnp；200,000个细胞/孔，5x106个细胞/ml。在37摄氏度下孵育板1小时。孵育后，将每个样品转移到含有960ul成纤维细胞生长培养基的12孔组织培养板的一个孔中，每孔的终体积为1ml。三天后，将细胞从板中取出并转移到6孔组织培养板的孔中。再过三天(共孵育后6天)，收获细胞并将其分成两半。使用一半细胞进行基因组dna分离并处理用于下一代测序(ngs)，并将一半细胞处理用于流式细胞术，如下文概述的。
[0950]
为了评估通过核转染对成纤维细胞的编辑，使人真皮成纤维细胞在组织培养板上生长。将rnp添加到96孔圆底超低附着组织培养板的孔中。将5ul适当的rnp添加到每个孔中，以达到5um的rnp浓度。从组织培养板中收获人真皮成纤维细胞，并以10x106个细胞/ml重悬于lonza核转染缓冲液p4中。向含有rnp的孔中添加20ul成纤维细胞。每个孔中的最终条件是：25ul体积；1um rnp；200,000个细胞/孔，8x106个细胞/ml。将与rnp混合的细胞转移到lonza 4d nucleofector的核转染盒的孔中。使用lonza 4d nucleofector，使用仪器代码ds-137对细胞进行核转染。核转染后，将每个样品转移到含有975ul成纤维细胞生长培养基的12孔组织培养板的一个孔中，每孔的终体积为1ml。三天后，将细胞从板中取出并转移到6孔组织培养板的孔中。再过三天(共孵育后6天)，收获细胞并将其分成两半。使用一半细胞进行基因组dna分离并处理用于下一代测序(ngs)，并将一半细胞处理用于流式细胞术，如下文所述的。
[0951]
tage剂对t细胞的编辑通过与每种tage剂的共孵育进行评估。将人t细胞在含有cd3和cd28交联抗体的t细胞培养基中培养4天，用于刺激t细胞。刺激4天后，收获细胞并以20x106个细胞/ml重悬于t细胞生长培养基中。将rnp添加到96孔圆底超低附着组织培养板的孔中。将30ul适当的rnp添加到每个孔中，以达到5um的rnp浓度。向含有rnp的孔中添加10ul t细胞。每个孔中的最终条件是：40ul体积；3.75um rnp；200,000个细胞/孔，5x106个细胞/ml。在37摄氏度下孵育板1小时。孵育后，每个样品用160ul t细胞生长培养基稀释。在接下来的六天里，向细胞补给新鲜培养基，并扩大到更大的孔体积，视需要的标准t细胞生长条件而定。共孵育后再过六天，收获细胞并将其分成两半。使用一半细胞进行基因组dna分离并处理用于下一代测序(ngs)，并将一半细胞处理用于流式细胞术。
[0952]
首先，使用采用流式细胞术测量表面cd47或cd44损失的表型读出来测量编辑。通过标准流式细胞术方法处理细胞，并用针对人cd44和cd47蛋白的抗体染色。在流式细胞仪上分析样品。通过分析cd44或cd47染色降低的细胞的频率来测量基因编辑。与用非靶向(sgbfp)rnp处理的细胞相比，分析用cd44靶向rnp编辑的细胞的cd44染色。与用非靶向(sgbfp)rnp处理的细胞相比，对用cd47靶向rnp编辑的细胞进行cd47染色分析。
[0953]
接下来，使用下一代测序测量编辑。将从至少10,000个细胞/样品中分离的基因组dna通过pcr扩增。pcr引物包含基因特异性区域和含有适配子的区域，以使得能够进行基于illumina的测序。使用illumina测序仪对每个样品进行测序。将每个样本的测序读数与人基因组靶区域的基因组dna序列进行比对。对每个样品的未修饰序列以及含有插入和缺失突变(插入缺失)的序列进行计数。基因编辑被测量为每个样本对应rnp靶位点的插入缺失突变频率。
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对于每个样本，将通过流式细胞术测量的基因编辑与通过ngs测量的基因编辑进行比较。
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如图58a所示，通过流式细胞术测量的编辑百分比与跨基因和细胞类型的扩增子测序关联。在具有较低编辑程度的细胞中，通过流式细胞术和测序获得的编辑测量也关联(图58b)。
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这些结果指示，表型流式细胞仪读出是扩增子测序测定的代表，其中任何一个都可用于确定tage剂对基因编辑的功效。图58a和图58b中提供的结果还表明，与通过跨不同细胞类型、sgrna和编辑效率进行测序获得的编辑测量相比，流式细胞术测定可能将基因编辑水平低估2至4倍。
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表8：序列表
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