一种耐亚硫酸根重组葡萄汁酵母的制备方法与流程

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种耐亚硫酸根的重组葡萄汁酵母及其制备方法。


背景技术：

2.葡萄酒品质在一定程度上取决于发酵过程的酵母种类或菌株特性。除了常见的酿酒酵母之外，葡萄汁酵母(saccharomyces uvarum)因其具低温发酵能力和能产生特殊的香味也常被用于葡萄酒酿造中。众所周知，亚硫酸盐是被广泛使用的一种防腐剂，对许多微生物有毒害作用，在发酵的过程中，在酵母的作用下还可使葡萄酒产生特殊的风味，目前还没有化合物可以完全代替这种添加剂。但在酿酒酵母细胞中，亚硫酸盐不仅会破坏细胞结构，还会与一些酶或代谢物结合，阻碍细胞正常的代谢活动，在发酵后期会严重影响酿酒菌株的发酵效率。因此，葡萄酒酿造酵母抗亚硫酸盐性被认为是葡萄酒酿造中非常重要的性状。
3.met4p是一种转录因子，属于亮氨酸拉链蛋白家族。met4p能够刺激甲氨酸生物合成通路中met基因转录的正转作用因子，参与met28和met30的转录激活，通过组装met4-met28-met31和met4-met28-met32复合物，诱导谷胱甘肽的合成等方式进行抗硫胁迫。因此，met4p在酿酒酵母受到硫胁迫时能够发挥重要的调节细胞稳态的主调控作用，但该基因在葡萄汁酵母中，其耐亚硫酸盐机理研究还未见报道。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的是提供一种耐亚硫酸根重组葡萄汁酵母的制备方法，以解决背景技术中存在的问题。
5.为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：
6.一种耐亚硫酸根的重组葡萄汁酵母，所述葡萄汁酵母过表达met4基因，所述met4基因碱基序列如seqidno.1所示。
7.进一步的，本发明还提供了一种耐亚硫酸根重组葡萄汁酵母的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)met4基因表达载体的构建：将ncoi、bglii酶切后并纯化后的pgem-t-met4小片段构建进同样被这两种酶酶切后的pcambia1301，形成pcambia1301-met4重组质粒，并测序验证；
9.(2)基因转化：通过电转化将pcambia1301-met4转移到大肠杆菌dh5α中，涂在含有潮霉素(hyg)的lb培养基上进行扩培，收获细胞，提取并纯化质粒，将葡萄汁酵母感受态细胞和纯化后的质粒放入体积比为10∶1的电击杯中，使用eppendorf电穿孔仪在1500v下混合并电击5ms，室温静置后，加入yep培养基，然后在28℃条件下放置1h，在28℃和200rpm的摇床中培养2h后，在含hyg和亚硫酸盐的ypd培养基平板上挑选并获得转化后的葡萄汁酵母。
10.优选的，所述步骤(2)中，将含pcambia1301-met4转移到大肠杆菌dh5α后进行扩培的方法包括以下步骤：涂在含有10mg/ml hyg的lb固体培养基平板上，并在37℃条件下培养
过夜，将大的转化菌落挑入含10mg/ml hyg的3ml lb液体培养基中，并在37℃条件下培养过夜，收获细胞，提取并纯化质粒；所述lb固体培养基以质量比计包括：1％酵母提取物、1％胰蛋白胨、2％琼脂和0.5％氯化钠；所述lb液体培养基以质量比计包括：1％酵母提取物、1％胰蛋白胨和0.5％氯化钠。
11.优选的，所述步骤(2)中，yep培养基以质量比计包括：1％酵母提取物，1％蛋白胨，0.5％氯化钠，ph 7.5；ypd培养基以质量比计包括：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％琼脂和2％葡萄糖。
12.本发明通过将碱基序列如seqid no.1所示的met4基因转入葡萄汁酵母中，得到的重组葡萄汁酵母耐亚硫酸根能到40mm，比起始菌株的20mm要高50％。
13.本发明中，由于所用载体pcambia1301上含有潮霉素(hyg)抗性基因，故可用潮霉素抗性来筛选转化子。也就是说葡萄汁酵母本身不具备潮霉素抗性，而转化子因导入了hyg抗性基因，使得其转化子具有潮霉素抗性，所以在含有潮霉素的培养基上只有导入了外源基因的转化子可以生长。在本发明中由于met4基因的导入，使得转化子的耐硫能力得以提升，再加上载体中携带的选择标记潮霉素抗性基因，使得转化子具有抗潮霉素的能力。因此，在含有潮霉素和较高浓度亚硫酸盐的ypd培养基上能生长出来的克隆，即为过表达met4基因的转化子。用该方法筛选出的转化子pcr阳性率为100％。
14.葡萄酒在亚硫酸盐下发酵使酵母受到一连串的压力，包括渗透压、缺氧、氮耗尽和乙醇浓度增加。发酵应激反应基因在酵母发酵时，胁迫条件下表现出持续和显著的诱导作用。在本发明中，葡萄汁酵母(s.uvarum)过表达met4菌株的基因表达谱中，发酵应激反应基因和热激蛋白基因约占差异上调表达基因40％。这些基因的显著上调表达有利于s.uvarum在亚硫酸盐环境下持续发酵。
15.硫同化通路中，亚硫酸酸盐被亚硫酸盐还原酶还原，最终合成为含硫化合物。在发明中，葡萄汁酵母中过表达met4基因会上调hom3基因的表达量。上调hom3基因的表达量，可以消耗更多培养基中的亚硫酸根(即它生存环境中的亚硫酸根)，使环境中的亚硫酸根的浓度下降，进而使转化子能在含亚硫酸根量较高的情况下能续继生存或发酵，即更能耐亚硫酸根。
16.本发明受到国家自然科学基金(32160556，31760450)和云南省农业基础研究联合项目(2018fg001-038)的支持。
附图说明
17.图1 s.uvarum a9菌株及其转化体中met4基因的表达水平显示图；
18.图2转化菌株的葡萄汁发酵失重显示图；
19.图3应激相关差异基因表达热图；
20.图4 qrt-pcr分析结果图(注：1-10，分别为hom3，nrg1，vid24，apj1，btn2，hsp104，sis1，mga1，zeo1和hac1基因；因处理的标准差值用对照的相除之后的值过大，所以用log10加以处理，其余的均为log2值)。
具体实施方式
21.以下结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的说明，本发明实施例中所使
用的材料：葡萄汁酵母菌株a9(s.uvarum a9)和对照酿酒酵母菌株ec1118，大肠杆菌dh5α，以上菌株均保存于西南林业大学国家林业局西南生物多样性保护重点实验室，且与专利zl201510108971.2和zl201310738413.5中所使用的菌种一致，met4由百齐生物技术有限公司(武汉，中国)在pgem-t easy载体中合成和构建。引物由中国上海生工有限公司合成，分子试剂或试剂盒购自上海生工有限公司。
22.实施例1
23.met4基因表达载体的构建
24.将ncoi、bglii酶切后并纯化后的pgem-t-met4小片段构建进同样被这两种酶酶切后的pcambia1301，并根据sambrook，fritsch和manitis介绍的方法构建(sambrook j,fritsch ef,maniatis t.molecular cloning:a laboratory manual,new york:cold spring harbor laboratory press,1989)。然后用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,pcr)验证表达载体，并将载体送往上海生工进行测序，以检测载体构建是否成功。
25.基因转化
26.通过电转化将pcambia1301-met4转移到大肠杆菌dh5α中，然后涂在含有10mg/ml潮霉素(hyg)的lb(1％酵母提取物、1％胰蛋白胨、2％琼脂和0.5％氯化钠)平板上，并在37℃条件下培养过夜。将大的转化菌落挑入含10mg/ml hyg的3ml lb液体培养基(1％酵母提取物、1％胰蛋白胨和0.5％氯化钠)中，并在37℃条件下培养过夜。收获细胞，提取并纯化质粒。将s.uvaruma9感受态细胞和重组质粒pcambia1301-met4放入体积比为10∶1的电击杯中，使用eppendorf电穿孔仪在1500v下混合并电击5ms。杯子在室温下放置一段时间，加入少量的yep培养基(1％酵母提取物，1％蛋白胨，0.5％氯化钠，ph 7.5)，然后在28℃条件下放置1h。在28℃和200rpm的摇床中培养2h后，在含30mg/l hyg和30mm亚硫酸盐的ypd(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％琼脂和2％葡萄糖)平板上挑选转化子(即重组后的葡萄汁酵母)。
27.耐亚硫酸根性状分型
28.将不同菌株接种到含有5、10、20、40、60mm亚硫酸钠和80mm琥珀酸且ph为3.5的新鲜ypd培养基中。24h后根据菌株或菌落的生长情况记录亚硫酸盐耐受水平。
29.转基因菌株的检测
30.在含亚硫酸根培养基上长出来的转化子经pcr分析，结果表明，所有挑出的10个转化子均阳性。挑出3个在耐亚硫酸根培养基中长的较大的转化子用于rt-qpcr分析，结果表明其相对表达量比出发菌株的均值要高10.11倍(见图1)，差异达到显著(p-value《0.01)。
31.表1met4转基因菌株及其起始菌株的基因型和亚硫酸盐抗性能力
32.strainhyg510204060a9-
‑‑
a9-met4 -33.通过表1可看出，转该基因是可以提升葡萄汁酵母的耐亚硫酸根能力的，说明met4基因的转化子耐亚硫酸根能到40mm。
34.发酵的前3天，met4转化子发酵液的失重量明显高于出发菌株的。随着发酵时间的推进，虽然met4转化子发酵液的失重量还是比出发菌株的高一些，但是差异值却逐渐缩小。这说明，在发酵前期met4转化子在含20mm亚硫酸钠的葡萄汁中发酵能力显著高于出发菌株
(见图2)。而随着时间的推进，由于糖类物质逐渐被消耗掉，met4转化子与出发菌株发酵液的失重量逐渐拉近，但met4转化子发酵液的失重量还是高于出发菌株。这说明，在发酵后期，met4转化子在含亚硫酸根葡萄汁中的发酵能力也是高于出发菌株的。
35.实施例2
36.pcr分析
37.dna样品按照nardi et al.(2010)的方法制备。从s.uvarum菌株a9的met4转化株中随机选择10个候选菌落进行pcr分析。pcr反应混合液(25μl)包括0.2μl的5u/μltaq酶，10mm的dntp取0.5μl，10μm的引物取1μl，dna模板取2μl，2.5μl10
×
pcr缓冲(包括mg
2
)和17.8μl的dh2o。
38.pcr所用引物为
39.hyg-f:5'-tgctgctccatacaagccaa-3'；
40.hyg-r:5'-accgcaaggaatcggtcaat-3'。
41.pcr反应按以下程序进行：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s，循环35次；72℃延伸60s，最后再72℃最终延伸8min，根据刘小珍等人(2018)的方法测定pcr产物的产量。
42.核糖核酸提取和cdna合成
43.在液体ypd中培养24h后，再在含亚硫酸根培养基中处理10分钟。收集酵母菌株。将酵母细胞在液氮中研磨，用qiagen试剂盒提取rna。然后使用takara反转录试剂盒将核糖核酸样品反转录成cdna。该样品，用于进一步的rt-qpcr分析和转录组分析。
44.rt-qpcr分析
45.根据陈等人描述的方法进行rt-qpcr分析，引物见表2。使用abi7500荧光定量pcr仪，所用的pcr程序如下：95℃预热10min；95℃加热30s，60℃退火1min，40个循环；融化曲线分析:95℃预热15s，60℃加热30s，95℃退火15s。act1作为参考基因(表2)，每个基因重复三次。
46.表2用于rt-qpcr及pcr分析的引物
[0047][0048]
注：rt，为rt-qpcr分析；r，内参基因reference gene。
[0049]
转录组分析
[0050]
rna-seq由nextomics biosciences co.ltd.使用illumina hiseq
tm
进行下一代测序；用于比较菌株的差异表达基因则由illumina truseq rna-seq试剂盒制备rna样品。rna-seq的数据已提交至大数据中心的基因组序列档案。根据labb
é
等人描述的方法进行转录组组装、序列比对、基因正位测定和基因集富集分析。使用log2(fpkm 1)值，用软件r 3.0.2绘制了差异基因表达热图。
[0051]
发酵失重量分析
[0052]
将转基因菌株a9-met4与起始菌株a9、ec1118一起接种在含20mm亚硫酸钠和80mm琥珀酸且ph3.5的15g葡萄汁(葡萄采自阿子营，盘龙区，昆明，中国)中发酵。将初期装有菌株的培养皿进行称重，记录其重量为w0，每隔1d称重，共测量7次为w
1-7
，每1d失重量为w＝wn-w
n-1
。依据这些数据，用excel进行作图。
[0053]
转录组差异基因分析
[0054]
转录组测序后，产生了超过2.5亿个高质量的读取，每个重复获得超过400万个高质量基因数据。计算每百万个reads到转录本每千个碱基上的reads个数。a9酵母中只有1.1％fpkm值介于0-1中，a9-met4中2.5％fpkm值介于0-1中。a9酵母中86.1％fpkm值高于10，a9-met4中75.8％fpkm值高于10。这些结果证明了所获得reads质量高。
[0055]
在亚硫酸盐存在的情况下，由于高基础基因表达水平而非特异基因诱导而产生的适应机制似乎是调节菌株抗性的原因。a9-met4与a9菌株转录组相对比，共对比出92个差异基因，其中有90个上调基因，2个下调基因。这些差异基因被注释到分子功能、细胞组分和生物过程三大功能类(图3)。差异表达的细胞成分相关基因主要涉及含蛋白质复合物、细胞解剖实体、细胞内。分子功能基因包括与绑定、催化活性、转录调节活性、转运活性、蛋白质折叠伴侣有关的基因。以及与细胞过程、代谢过程、生物调控、对刺激的反应有关的生物过程相关基因。与发酵应激反应、蛋白质折叠、rna聚合酶ⅱ转录调控相关基因表达上调，例如：hom3、nrg1、vid24。与nadph合成相关亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因mis1下调。
[0056]
对参与应激反应的基因进行表达热图分析(图3)。与原始a9菌株相比，表达差异最多的八个基因是hom3、hsp30、nrg1、vid24、apj1、yap6、hsp104、fes1。这些基因的差异性表达可能与亚硫酸盐耐受性增强有关。
[0057]
表3 a9-met4和a9基因表达水平比较
[0058]
[0059][0060]
note:*发酵应激基因
[0061]
由表3分析，在半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路中，编码天冬氨酸激酶(hom3，ec：2.7.2.4)的基因在亚硫酸盐环境下差异表达。天冬氨酸激酶是蛋氨酸生物合成的第一步酶。本研究中，hom3是差异表达量最高的基因，这可能表明过表达met4葡萄汁酵母通过提高蛋氨酸合成途径中hom3基因表达量，从而调节蛋氨酸合成，最终增强其亚硫酸盐适应性。
[0062]
经过rt-qpcr分析得到图4，转化子与出发菌株均用相同的方法处理，处理的时间也相同，但在转化子中参与亚硫酸根消耗的基因(如hom3)及应激相关基因(如hsp104)的表达却上调显著。这说明过表达met4基因的过表达，会促进参与亚硫酸根消耗的基因及应激相关基因的表达，进而达到提升葡萄汁酵母的耐亚硫酸根能力的目的。
[0063]
本研究通过转基因和rt-qpcr发现met4基因的转化子与起始菌株相比，met4基因的表达水平显著提升，且亚硫酸盐的耐受水平也明显提升。met4的不同表达水平可能是在转化菌株和原始菌株观察到不同亚硫酸盐耐受性的重要原因之一。
[0064]
在sgd数据库中进行对比后，我们发现过表达met4 s.uvarum a9菌株基因表达谱与酿酒酵母met4互作基因没有任何重叠部分，表明s.uvarum a9菌株的met4基因与酿酒酵母met4基因功能明显不同。通过基因序列比较，s.uvarum met4基因与酿酒酵母met4基因末端都包含一个碱性亮氨酸拉链结构域(bzip)，但s.uvarum met4约有17％dna序列与酿酒酵母met4不同，编码蛋白差异约有20％，这种差异可能是导致met4基因功能变化的主要原因。
[0065]
葡萄酒在亚硫酸盐下发酵使酵母受到一连串的压力，包括渗透压、缺氧、氮耗尽和乙醇浓度增加。发酵应激反应基因在酵母发酵时，胁迫条件下表现出持续和显著的诱导作用。在本研究中，s.uvarum过表达met4菌株的基因表达谱中，发酵应激反应基因和热激蛋白基因约占差异上调表达基因40％。这些基因的显著上调表达有利于s.uvarum在亚硫酸盐环境下持续发酵。本研究中，过表达met4基因菌株相比于原始菌株，rna聚合酶ii相关基因上调，与nadph合成相关亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因mis1下调。原因可能是由于met4基因对rna聚合酶ii对转录的正调控功能，亚硫酸盐对与nadph生成或利用相关的酶产生毒性作用。
[0066]
硫同化通路中，亚硫酸酸盐被亚硫酸盐还原酶还原，最终合成为含硫化合物。在本研究中，s.uvarum中过表达met4基因会上调hom3基因的表达量。我们认为，上调hom3基因的
表达量，可以消耗更多培养基中的亚硫酸根(即它生存环境中的亚硫酸根)，使环境中的亚硫酸根的浓度下降，进而使转化子能在含亚硫酸根量较高的情况下能续继生存或发酵，即更能耐亚硫酸根。此外，部分人群对亚硫酸盐过敏。亚硫酸盐过敏人群在接触亚硫酸盐后，常见的症状有鼻塞、头疼、呼吸困难、恶心、眩晕、腹痛等。本发明得到的葡萄汁酵母转化子会消耗掉其发酵环境中的亚硫酸根，进而使其发酵产品对亚硫酸盐过敏人群的不良反应会进一步降低。
[0067]
本发明受到国家自然科学基金(32160556，31760450)和云南省农业基础研究联合项目(2018fg001-038)支持。