一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法与流程

1.本发明涉及基因测序的技术领域，尤其涉及一种植物单细胞转录组测序结果的高通量验证方法。


背景技术：

2.单细胞rna测序（single-cell rna sequencing，scrna-seq）技术作为一项革命性工具，在单细胞水平上对转录组进行分析，单细胞研究的核心是划分细胞群体以及检测细胞群体间的差异表达基因。通过scrna-seq获得高通量的单细胞转录组数据后，仍然需要对不同亚细胞群内scrna-seq鉴定到的基因进行验证。利用原位组织学验证是目前流行的研究策略，也是对单细胞测序结果筛选出的有价值分子的空间分布定位回溯以及结果真实性的验证。scrna-seq检测的基因表达量在组织器官不同亚细胞群内的检测，可通过rna原位杂交、或者免疫荧光染色等方法，但都存在试验要求高、试验周期长、检测通量过低且检测结果不理想的问题。
3.rna原位杂交是利用标记的反义rna为探针，与组织切片杂交，从而原位的显示rna的表达部位和相对丰度，rna原位杂交是研究基因在组织细胞群内表达的重要方法。rna原位杂交实验要求比较高，总体缺点在于：制作组织玻片；设计基因的反义rna探针最为关键，探针设计要求特异性较高；整个试验周期比较长（3-5天）；通量太低，每次一个探针只能针对一个基因，每张组织玻片上一次只能检测一个基因。
4.免疫荧光染色是在蛋白水平的验证实验，同rna 原位杂交验证实验一样可以对单细胞转录组测序鉴定的目标基因表达量结果予以验证，也可以进行观察目标基因对应的细胞群在组织中的空间定位，不仅如此还能观察蛋白在细胞内的定位，根据不同的细胞器定位进行后续的功能研究提供线索。免疫荧光染色存在的缺点在于：制作组织玻片；可能需要购买多家公司的抗体进行验证实验，抗体不够特异很难开展实验，缺少特定的植物抗体库，每个植物基因可能都需要去做特异的抗体；由于细胞内表达rna和蛋白的翻译不是绝对的线性相关，因此rna水平和蛋白水平可能不一致，导致基因表达量很高，但是蛋白水平上检测不够理想。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法，以解决目前转录测序结果操作不便、试验周期长以及通量低的技术问题。
6.为了解决上述技术问题，本发明目的提供了一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法，包括以下步骤：s1、利用纤维素酶解液对植物组织进行初次降解，使细胞保持原始形态，制得细胞悬液；s2、计算所述细胞悬液中细胞浓度并检测细胞活性不低于90%；s3、分离所述细胞悬液中不同的亚细胞群；
s4、利用纤维素酶解液对同一亚细胞群进行降解，以形成去除细胞壁的原生质体，离心收集细胞沉淀样品；s5、不同亚细胞群的细胞沉淀样品经smart-seq建库测序；s6、以建库获得的cdna为模版，采用荧光定量pcr检测目标基因在不同亚细胞群内的表达量，以进行验证。
7.作为优选方案，在所述s1和s4中，所述纤维素酶解液包括以下原料组分：3wt%纤维素酶、1.5wt%离析酶、0.3wt%果胶酶、0.25wt%牛血清蛋白，余量为甘露醇、伽马乙磺酸钠、氨苄青霉素钠和无菌水，所述甘露醇占纤维素酶解液的8w/v%，每6ml纤维素酶解液中配比含有1mm伽马乙磺酸钠，每1l纤维素酶解液中配比含有0.01g氨苄青霉素钠。
8.作为优选方案，所述离析酶为离析酶r-10，所述果胶酶为果胶酶y-23。
9.作为优选方案，所述纤维素酶的制备方法为：将纤维素酶、离析酶、果胶酶、牛血清蛋白、甘露醇和伽马乙磺酸钠混合后，置于温度为50℃-60℃的水浴锅中，水浴时间为10min-30min，随后用无菌水定容至设定体积，加入氨苄青霉素钠，过滤后制得纤维素酶解液。
10.作为优选方案，在所述s1中，所述植物组织为豆科或葫芦科类植物组织。
11.作为优选方案，在所述s1中，所述植物组织为花生叶片细丝，所述花生叶片细丝的制备方法为：将花生种子中的胚状体取出，放置于培养基中培养，待胚状体生长出第一片真叶，取下花生胚状体伸展出的第一片真叶，切割成细丝，浸泡在8wt%甘露醇溶液中备用。
12.作为优选方案，在所述s1中，所述纤维素酶解液初次降解植物组织的条件为：摇床处理0.5h-2h，速率为40转/min
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45转/min，温度为25℃-30℃。
13.作为优选方案，在所述s4中，所述纤维素酶解液降解同一亚细胞群的条件为：摇床处理1h-3h，速率为40转/min
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45转/min，温度为25℃-30℃。
14.作为优选方案，在所述s2中，采用台盼蓝染色检测细胞悬液中细胞活性，将细胞悬液与0.4wt%台盼蓝母液按体积比为9：1混合，显微镜观察并计算细胞活性。
15.作为优选方案，在所述s3中，采用步骤s2中台盼蓝染色后的细胞悬液作为花生叶片样品，采用微吸管分离并去除所述花生叶片样品中的死细胞，随后分离不同亚细胞群的细胞。
16.相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：1、由于叶片组织由无数单细胞组成，在单细胞或亚细胞水平上无法用荧光定量pcr直接进行检测，本技术采用纤维素酶解液预先降解细胞，以便分离不同的亚细胞群细胞，随后再次经纤维素酶解液降解形成原生质体后，可以利用smart-seq建库提取同一亚细胞群的cdna，以此为模版对目标基因的表达进行荧光定量pcr检测。区别于目前采用植物组织水平上的基因表达量验证技术，本技术在单细胞以及亚细胞水平上进行基因表达量的高通量验证，可以同时验证多个目标基因的表达水平，试验周期短，试验成本降低，验证操作简便、高效快速。
附图说明
17.图1：为本发明实施例中一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法在步骤6-9的实验流程示意图；
图2：为本发明实施例中花生叶片单细胞测序产生的基因表达量结果；图3：为本发明实施例中一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法在步骤9中smart-seq建库后的荧光定量pcr检测结果。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.实施例一一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法，植物组织可以为豆科或葫芦科类的植物组织，例如花生、大豆、豌豆、菜豆、南瓜、冬瓜、哈密瓜、黄瓜等植物的叶片组织，在本实施例中，选取花生叶片组织作为检测样品，包括以下验证步骤：1、花生叶片材料的制备：1.1、将花生种子采用70wt%乙醇溶液进行消毒灭菌后，利用无菌水清洗三次以上，将花生种子的子叶摘除，并将胚状体取出；1.2、将胚状体放置于1/2ms琼脂糖培养基中，培养一周时间，待胚状体生长出第一片真叶，用锋利的刀片取下花生胚状体伸展出的第一片真叶，切割成约1-2毫米的细丝，混合约5棵花生叶片作为一次试验，将全部花生叶片细丝浸泡在8wt%甘露醇溶液中备用。
20.2、配置30ml纤维素酶解液：2.1、将3wt%纤维素酶、1.5wt%离析酶r-10、0.3wt%果胶酶y-23、0.25wt%牛血清蛋白、8w/v%甘露醇和5mm伽马乙磺酸钠混合，所有溶液中均不添加有ca2 和mg2 ，随后置于50℃-60℃的水浴锅中，优选为55℃，水浴时间为10min-30min，优选为10min，冷却至室温，用无菌水定容至30ml；2.2、随后加入30微升浓度为0.01g/ml的氨苄青霉素钠，纤维素酶解液用注射器吸取后，装载过滤除菌的0.45μm滤头，过滤除菌后的纤维素酶解液备用。
21.3、纤维素酶解法初次降解细胞壁，细胞保持原始形态：3.1、将步骤1中浸泡在8wt%甘露醇溶液的花生叶片细丝取出，用40微米的细胞筛过滤，随后用8wt%甘露醇溶液洗涤花生叶片细丝三次以上，以去除细胞碎片；3.2、将洗涤后的花生叶片细丝放入15ml步骤2获得的纤维素酶解液中，并置于摇床处理30min，控制温度为28℃，速率为45转/min。
22.4、计算细胞悬液的浓度：取出步骤3处理后的细胞悬液，提取上清液5ml-10ml，在本实施例中优选为5ml，用40微米的细胞筛过滤上清液，随后取20μl过滤后的上清液置于玻片上，显微镜下利用血球计数板计算花生叶片细胞的个数，根据计数结果将上清液稀释至易于显微操作的密度，约为0.5-1
×
105个/ml。
23.5、台盼蓝染色观察细胞活性：5.1、称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，制得4wt%台盼蓝母液，4℃保存；
5.2、使用时，用pbs将4wt%台盼蓝母液的质量分数稀释至0.4wt%，取1ml的步骤3获得的细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以体积比为9:1混合混匀，染色1min后，取10μl显微镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞呈无色透明状，并计算细胞活性，活细胞数达到90%以上开展后续试验。
24.6、微吸管分离花生叶片细胞：6.1、微吸管制备：使用显微注射针拉制仪将加热的玻璃毛细管拉细，采用二步法，分别设置两次不同的温度参数将毛细管拉长，制备的微吸管内径约100μm，并将微吸管与口吸管连接备用；6.2、将步骤5制得的1ml混合有台盼蓝染色剂的细胞悬液倒入35mm培养皿中，倒置显微镜下，根据细胞形态的差异，于10倍物镜视野下找到微吸管针尖，移动针尖至目标形态细胞附近，轻吸口吸管给予负压，目标细胞缓慢移动至微吸管针尖内部，将微吸管再次放入含有1ml纤维素酶解液的2ml离心管中，通过正压释放细胞。根据植物叶片细胞形态，可通过直接观察，在显微镜下挑去未被台盼蓝染色的不同亚细胞群，例如叶肉的海绵组织细胞（椭圆状），叶肉栅栏组织细胞（长棒状），表皮细胞（不规则形状），每个细胞群约200个细胞。
25.7、纤维素酶解液二次分解同一亚细胞群的细胞壁，使细胞成为去除细胞壁的原生质体：7.1、每个亚细胞群内含有约200个细胞，将同一亚细胞群加入1.5ml纤维素酶解液中，并置于摇床处理1.5小时，控制温度为28℃，速率为45转/min；7.2、处理时间结束后，以350g离心力为标准冷冻离心5min，去除上清的纤维素酶解液，剩余细胞沉淀留作备用。
26.8、smart-seq建库：利用smart-seq ht kit建库试剂盒处理步骤7获得的细胞沉淀，对亚细胞群的rna进行反转为第一条单链cdna，利用pcr与随机引物，以反转录的cdna为模版，继续扩增放大15个反应，使终浓度约为100ng/μl。
27.9、荧光定量pcr检测目标基因在不同亚细胞群内的表达量：以建库获得的不同亚细胞群cdna作为模板，荧光定量pcr反应体系为 20
µ
l，采用abi stepone plus系统，使用sybr premix extaq（takara，中国大连）进行pcr反应，用2-δδ
ct法计算目标基因在各亚细胞群内的相对表达量，可用rbcs（rbcs-f：aagtagactaccttctaagg，rbcs-r：tccttgatgacctgacctga）作为内参基因，在本实施例方案中，目标基因挑选ahl23、dreb1d、erf4、gos3、nac002、sap3、uaf30和erf15作为试验，目标基因的引物序列如表1所示，每个样品进行三个重复，数据用平均值
±
标准差表示，结果如图3所示。
28.表1-荧光定量pcr中目标基因的引物序列基因名称正向引物反向引物ahl23atccaagaacaagcccaagcacctgccgtggagcgtgactdreb1dacctatcaatagcaagagtgtctatataggtttcacttggtgerf4agagcagcaccgtcgaatcttgcgtcgaggtacagagcctgctgos3agcttgacaactgtccaggagcctgaactaggaaggtagacnac002gtgacgacagattatatgtactaccgttcgtgagtgtggcatc
sap3ccacgcagaacctctgctccagaagatgacgaatcgatcgctuaf30aggaagcctcttcaggtctgtctgcttgagagcctgggtterf15ttctatgctgctgaggatgatatgtcttgtgtccagtttcttctrbcsaagtagactaccttctaaggtccttgatgacctgacctga以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。