一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法与流程

技术特征：
1.一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、利用纤维素酶解液对植物组织进行初次降解，使细胞保持原始形态，制得细胞悬液；s2、计算所述细胞悬液中细胞浓度并检测细胞活性不低于90%；s3、分离所述细胞悬液中不同的亚细胞群；s4、利用纤维素酶解液对同一亚细胞群进行降解，以形成去除细胞壁的原生质体，离心收集细胞沉淀样品；s5、不同亚细胞群的细胞沉淀样品经smart-seq建库测序；s6、以建库获得的cdna为模版，采用荧光定量pcr检测目标基因在不同亚细胞群内的表达量，以进行验证。2.如权利要求1所述的一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法，其特征在于，在所述s1和s4中，所述纤维素酶解液包括以下原料组分：3wt%纤维素酶、1.5wt%离析酶、0.3wt%果胶酶、0.25wt%牛血清蛋白，余量为甘露醇、伽马乙磺酸钠、氨苄青霉素钠和无菌水，所述甘露醇占纤维素酶解液的8w/v%，每6ml纤维素酶解液中配比含有1mm伽马乙磺酸钠，每1l纤维素酶解液中配比含有0.01g氨苄青霉素钠。3.如权利要求2所述的一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法，其特征在于，所述离析酶为离析酶r-10，所述果胶酶为果胶酶y-23。4.如权利要求2所述的一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法，其特征在于，所述纤维素酶的制备方法为：将纤维素酶、离析酶、果胶酶、牛血清蛋白、甘露醇和伽马乙磺酸钠混合后，置于温度为50℃-60℃的水浴锅中，水浴时间为10min-30min，随后用无菌水定容至设定体积，加入氨苄青霉素钠，过滤后制得纤维素酶解液。5.如权利要求1所述的一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法，其特征在于，在所述s1中，所述植物组织为豆科或葫芦科类植物组织。6.如权利要求1所述的一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法，其特征在于，在所述s1中，所述植物组织为花生叶片细丝，所述花生叶片细丝的制备方法为：将花生种子中的胚状体取出，放置于培养基中培养，待胚状体生长出第一片真叶，取下花生胚状体伸展出的第一片真叶，切割成细丝，浸泡在8wt%甘露醇溶液中备用。7.如权利要求1所述的一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法，其特征在于：在所述s1中，所述纤维素酶解液初次降解植物组织的条件为：摇床处理0.5h-2h，速率为40转/min
ꢀ‑
45转/min，温度为25℃-30℃。8.如权利要求1所述的一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法，其特征在于，在所述s4中，所述纤维素酶解液降解同一亚细胞群的条件为：摇床处理1h-3h，速率为40转/min
ꢀ‑
45转/min，温度为25℃-30℃。9.如权利要求1所述的一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法，其特征在于，在所述s2中，采用台盼蓝染色检测细胞悬液中细胞活性，将细胞悬液与0.4wt%台盼蓝母液按体积比为9：1混合，显微镜观察并计算细胞活性。10.如权利要求7所述的一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法，其特征在于，在所述s3中，采用步骤s2中台盼蓝染色后的细胞悬液作为花生叶片样品，采用微吸
管分离并去除所述花生叶片样品中的死细胞，随后分离不同亚细胞群的细胞。

技术总结
本发明公开一种植物组织单细胞转录组测序结果的高通量验证方法，涉及基因测序领域。包括以下步骤：S1、纤维素酶解液降解植物组织制得细胞悬液；S2、测得细胞悬液中细胞浓度和细胞活性；S3、分离细胞悬液中不同亚细胞群；S4、纤维素酶解液对同一亚细胞群进行降解；S5、细胞沉淀样品经SMART-seq建库测序；S6、以建库获得的cDNA为模版，采用荧光定量PCR检测目标基因表达量，以进行验证。本申请采用纤维素酶解液先后两次降解细胞壁，以便分离不同亚细胞群细胞，SMART-seq建库后进行荧光定量PCR检测在单细胞以及亚细胞水平上进行基因表达量的高通量验证，试验周期短，试验成本降低，验证操作简便、高效快速。高效快速。高效快速。


技术研发人员：刘浩 洪彦彬
受保护的技术使用者：广东省农业科学院作物研究所
技术研发日：2021.10.18
技术公布日：2022/2/8