一种植物来源外泌体的中试提取方法及其应用与流程

1.本发明属于生物技术和生物工程领域，涉及一种通用的植物来源外泌体提取和富集纯化的方法，所述方法可以用于放大生产。


背景技术：

2.近年来研究发现植物能够分泌一种囊泡小体，直径在40-100nm，命名为外泌体，其包含蛋白质、mrna、mirna等物质，具有细胞间信息流和物质运输等重要功能。外泌体被广泛关注用于天然治疗载体，也具有明确的减轻组织损伤程度、促进损伤组织形态学及功能学修复的作用。例如拟南芥叶子中的外泌体含有多种抗氧化成分，可以用于化妆品等产品中。
3.现有植物外泌体提取主要采用榨汁后超离加蔗糖密度梯度离心的方法，制备方法包括超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、超滤法、体积排阻色谱、免疫亲和法。前四种方法基于外泌体独特的密度、尺寸等物理学参数实现提取，外泌体含量低，提取量少，难以放大规模，设备费用昂贵(例如专利文献cn112352951 a)。还有报道采用浸泡加抽真空的提取方法来制备外泌体，但该方法不利于量产(例如专利文献cn 111139215 a)。这些方法都是实验室小试水平的提取制备方法，不能应用于工业化生产。
4.综上，植物来源外泌体制备方法的建立和应用在抗氧化、组织修复和组织再生中具有重要意义和前景。然而，目前尚缺乏对植物外泌体的高效提取方法，限制了植物外泌体的进一步应用。


技术实现要素：

5.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种植物来源外泌体的生成、提取、富集、纯化的方法，所述方法可以用于中试放大生产。该方法简单，易于控制，提取率高，既适用于新鲜采摘的植物，也适用于通过不同方式干燥处理后保存的植物。通过本发明的方法，便可高质量、高得率地获得外泌体，可用于日化用品和药品等领域。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面是提供一种植物来源外泌体的提取方法，所述方法包括：取植物材料，加入缓冲液经震荡，使植物材料中的外泌体释放到缓冲液中，离心，收集上清，通过微滤中空纤维柱进行微滤除杂，通过超滤中空纤维柱进行超滤浓缩，获得所述植物来源外泌体。其中，所述缓冲液为pbs缓冲液。
7.本发明所述方法中，所述震荡的条件选自如下特征中的一个或多个：
8.(a)以植物材料的初始质量为准计算缓冲液的加入量，其中所述植物材料的初始质量(g)与缓冲液的体积(ml)比值为1:1～1:5；
9.(b)所述震荡的温度为15℃～30℃；
10.(c)所述震荡的时间为18-48小时；
11.(d)所述震荡的转速为50-150rpm；
12.(e)所述震荡在通气环境下进行。
13.本发明所述方法中，所述离心的条件为：
14.(a)所述离心的转速为2000-20000rpm；和/或，
15.(b)所述离心的时间为10-60min。
16.本发明所述方法中，所述微滤中空纤维柱的过滤精度为0.1-0.8um。
17.本发明所述方法中，所述超滤浓缩的条件选自如下特征中的一个或多个：
18.(a)采用100-500kda超滤中空纤维柱进行超滤浓缩；
19.(b)所述超滤浓缩是指浓缩至原微滤后获得的液体体积的1/10-1/20；
20.(c)所述超滤浓缩后还包括超速离心纯化的步骤，所述超速离心的参数为4℃，140000g，60-120min。
21.本发明所述方法中，在所述震荡前还包括均质获得均质液，去除死细胞、细胞残渣的步骤；
22.其中，所述均质是指将植物材料粉碎成直径1厘米以下的碎片；
23.其中，所述去除死细胞、细胞残渣的步骤通过将所述均质液经纱布过滤、梯度低速离心或滤膜过滤中的一种或几种方式实现。
24.本发明所述方法中，在所述超滤浓缩后还包括沉淀、重悬和分装的步骤，包括如下特征中的一个或多个：
25.(a)所述沉淀是指，所述浓缩液与peg8000/nacl混匀后，在2-8℃条件下沉淀；
26.(b)所述浓缩液与peg8000/nacl的体积比为3:1-8:1；
27.(c)所述离心转速为2000-8000rpm；
28.(d)所述离心的时间为5-40min；
29.(e)在重悬后，包括过滤除菌的步骤，所述过滤除菌采用0.22-0.45um滤膜实现；
30.(f)在重悬后，包括在重悬液中加入海藻糖然后冻干的步骤，所述海藻糖的浓度为5-10％。
31.本发明另一方面是提供根据上文所示方法获得的植物来源外泌体。
32.本发明另一方面是提供所述植物来源外泌体在制备日化用品或药品中的应用。
33.如上所述，本发明的植物来源外泌体的提取方法，包括以下有益效果：
34.(1)通过利用均质、震荡、超滤、浓缩的方式，实现对植物外泌体的高特异性提取，操作简单，提取速度快，提取率高，方法简单，易于控制，成本低，适于大规模生产。可以有效扩大外泌体生产制备规模，从数千克原料扩展到数百千克原材料，满足大批量化妆品和药品等的制备需求。
35.(2)对材料来源限制性显著降低，可同时处理植物的各部分，既适用于新鲜植物，也适用于经过不同方式处理的干燥的植物。
36.(3)在均质匀浆后通过粗过滤步骤，将死细胞和杂质去除，能够有助于改善后续步骤对外泌体的提取操作。采用pbs缓冲液对植物进行震荡，提取外泌体，在高效提取外泌体的同时，能更好地维持植物外泌体的结构稳定性。
37.(4)通过改变pbs缓冲液的条件，获得具有完整囊泡结构的外泌体，能更好的维持植物外泌体的结构稳定性，保持外泌体的形态。
38.(5)本发明方法无需其它提纯步骤，仅通过对植物的直接处理便可高效获得所述外泌体。
39.(6)制得的植物外泌体在抗氧化、细胞修复、组织再生中，可以达到很好的美容或
治疗效果，用于日化产品或药品中，具有良好的应用前景和研究价值。
附图说明
40.图1本发明从植物中提取外泌体的工艺流程图。
41.图2为实施例1制备的外泌体的粒子追踪分析仪粒径分析结果图，横坐标表示粒径(nm),纵坐标表示每毫升颗粒数(10^9)；其中，图上从左至右标注的数值依次为45、110、164、230、283、395、818。
42.图3为实施例2制备的外泌体的粒子追踪分析仪粒径分析结果图，横坐标表示粒径(nm),纵坐标表示每毫升颗粒数(10^9)；其中，图上从左至右标注的数值依次为171、495、680。
43.图4为实施例3制备的外泌体的粒子追踪分析仪粒径分析结果图，横坐标表示粒径(nm),纵坐标表示每毫升颗粒数(10^9)；其中，图上从左至右标注的数值依次为140、186、230、479、562。
44.图5为实施例1制备的外泌体透射电镜形态观察图。
45.图6为实施例2制备的外泌体透射电镜形态观察图。
46.图7为实施例3制备的外泌体透射电镜形态观察图。
具体实施方式
47.本发明针对现有技术中植物外泌体提取及应用上存在的各种缺陷，通过采用缓冲液进行震荡的方式，提供了一种从植物中提取外泌体的方法、根据该方法获得的外泌体及其应用。该方法适用于新鲜或干燥形式的各种来源的药用和化妆品用的植物，包括根、茎、叶、花、果实等各部位样品。本发明能更好的维持植物外泌体结构稳定，保持外泌体的形态，应用于抗氧化、细胞修复或组织再生等领域，可以达到更好的治疗或美容效果。本发明所述方法是一种通用的植物来源的外泌体生成、提取、富集、纯化的方法，所述方法适于中试放大生产。
48.本发明首先提供了一种外泌体的提取方法，所述方法包括：取植物的任意部位，然后加入缓冲液经震荡，使材料中的外泌体经浸泡与渗透处理尽量释放到缓冲液中，离心收集上清，然后分别通过不同孔径的中空纤维柱进行超滤，超滤浓缩，获得所需外泌体。
49.具体地，所述方法在均质前还可以包括清洗、粉碎的步骤，在获得外泌体后，还可以包括重悬、分装的步骤；具体地，所述方法包括均质、过滤、震荡、清洗、均质、过滤、震荡、离心、超滤、超滤浓缩、重悬、分装。提取过程示意图如图1所示。
50.(1)清洗
51.取植物材料，进行清洗；
52.(2)均质
53.将所述植物材料粉碎，进行均质，获得均质液；
54.(3)过滤
55.过滤均质液，去除死细胞和/或残渣；
56.(4)震荡
57.向经步骤(3)处理后的均质液中加入缓冲液，震荡，使外泌体释放到缓冲液中；同
时，细胞在培养过程中，植物细胞会继续产生大量外泌体；
58.(5)离心
59.将震荡后的混合液离心，收集上清液；
60.(6)微滤除杂
61.采用微滤中空纤维柱去除上清液中的细胞或细胞碎片；
62.(7)超滤浓缩
63.采用超滤中空纤维柱对外泌体进行浓缩；
64.(8)重悬
65.向所述浓缩液中加入peg8000/nacl，混匀，放置；
66.(9)重悬、分装
67.离心，收集沉淀，用生理盐水重悬，分装。
68.步骤(1)中，所述植物的合适部位可以根据能够提取较多外泌体的目的进行选取，如根、茎、叶、花、果实等。
69.步骤(1)中，所述植物可以是细胞含有外泌体的任何植物，包括可食用植物或药用植物，包括但不限于是百合、沙棘、肉苁蓉、番茄、生姜、柠檬、西蓝花、葡萄、红景天、蒲公英、金银花、甘草、人参、小麦、向日葵、拟南芥、西瓜、橄榄、瓜子、胡萝卜、葡萄柚、椰汁、柑橘、芦荟、樱花、牛油果、龙胆草、薰衣草、百合、薄荷、睡莲、虎头兰、龙舌兰、欧洲龙牙草、牡丹、玫瑰、葡萄、芦荟、黄瓜、苹果。优选地，所述植物选自百合、沙棘、肉苁蓉中的一种或几种。
70.步骤(1)中，进行清洗的液体可以是水或缓冲液，所述水可以是自来水、蒸馏水、矿物质水、纯净水等；所述缓冲液可以是pbs缓冲液。优选为自来水。所述清洗的次数可以根据需要进行，如清洗2次或以上。清洗后，还可以包括晾干或烘干的步骤。
71.步骤(2)中，所述均质可以在例如榨汁机或粉碎机中进行。所述均质后，植物碎片的大小可以根据植物的特性来决定，如粉碎成直径1厘米以下的碎片。可以根据需要重复进行，以将材料打碎成合适大小。
72.步骤(3)中，该步骤为除去待提取均质液中的死细胞和/或细胞残渣，可通过将所述待提取均质液经纱布过滤或经梯度低速离心、或经滤膜过滤中的一种或几种方式实现。通过该步骤，可以提高后续步骤的提取效率，反之，若不进行死细胞和/或细胞残渣的去除，或者由于处理不彻底，则后续提取过程由于伴随大量残渣，会降低外泌体的提取纯度和提取率。
73.所述纱布可以是任何能够实现死细胞、细胞残渣过滤的纱布。
74.所述梯度低速离心具体可按照如下步骤进行：500g离心5min，1000g离心5min，2000g离心10min。
75.所述滤膜可为0.2～0.5μm滤膜，如滤膜为0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm。
76.步骤(4)中，所述缓冲液选自pbs缓冲液、hbss、dpbs、复方氯化钠注射液；优选地，为pbs缓冲液。所述pbs缓冲液ph为7.2-7.4。
77.步骤(4)中，以初始植物材料的质量为准计算缓冲液的加入量，其中初始植物的质量(g)与缓冲液的体积(ml)比值为1:1～1:5；两者的比值具体可以为1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8、1:2.0、1:2.2、1:2.4、1:2.6、1:2.8、1:3.0、1:3.2、1:3.4、1:3.6、1:3.8、1:4.0、1:4.2、1:4.4、1:4.6、1:4.8、1:5.0。优选地，为1:2-1:5。进一步优选地，为1:2或1:5。
78.步骤(4)中，本发明将均质后的待提取植物于缓冲液中震荡，以提取植物外泌体，该方法不仅适用于新鲜植物，也适用于经过干燥处理的植物。所提取获得的植物外泌体的结构完整、轮廓清晰。缓冲液震荡的条件需精确控制，如温度、时间和转速等：
79.若震荡的温度太高，则分泌到缓冲液中的外泌体结构容易受到影响，易变性，且细胞不能高效产生外泌体。若震荡的温度太低，则外泌体不易分泌到缓冲液中或植物细胞生命活动太慢，不能高效产生外泌体。作为优选，所述震荡在22-30℃及低温下进行，具体可以为，4℃～30℃、4℃～8℃、8℃～12℃、12℃～14℃、14℃～16℃、16℃～18℃、18℃～20℃、20℃～22℃、22℃～25℃、24℃～26℃、26℃～28℃、28℃～30℃。进一步优选地，所述震荡在22-25℃条件下进行。
80.若震荡时间不足，则无法充分使得外泌体分泌到缓冲液中，也无法使得植物细胞产生更多的外泌体；若震荡时间过长，则可能导致已分泌到缓冲液中的部分外泌体结构和性质受到影响，活性降低或变性。作为优选，所述震荡的时间为18-48小时，具体可以为，18-20、20-22、22-24、24-26、26-28、28-30、30-32、32-34、34-36、36-38、38-40、40-42、42-44、44-46、46-48小时。优选地，为24-48小时，更具体可以为24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44小时。进一步优选为24小时、36小时或48小时。
81.若震荡的转速太高，则容易产生较高的剪切力，会对外泌体的结构造成影响；若震荡的转速太低，则细胞容易黏连，获取氧气受阻，致使细胞不能高效产生外泌体。作为优选，所述震荡的转速为50-150rpm。可以为，50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150rpm。优选地，为90-120rpm；具体为90、100、110、120rpm。
82.上述震荡的温度、时间和转速，对于外泌体高效产生和分泌具有至关重要的影响。多种因素相互影响和促进，才能使得最终获得的外泌体具有很高的提取率。
83.步骤(4)中，所述震荡在通气环境下进行。可以通入空气或氧气以维持一定的氧气浓度，所述适宜的氧气浓度可以根据需要进行调整。如将氧气调整为5％、21％。作为优选地，使用通气发酵罐代替摇瓶进行外泌体提取。
84.步骤(4)中，加入所述缓冲液后，细胞中的外泌体会释放到缓冲液中。同时，植物细胞在缓冲液的环境中，还可以不断产生外泌体(此时缓冲液发挥植物细胞培养基例如ms培养基，ls培养基，b5培养基等的作用)。作为优选地，所述还可以向包含植物的缓冲液中加入抑菌剂抑制细菌的生长，如青霉素、链霉素等。
85.步骤(5)中，所述离心的转速为2000-20000rpm，可以为2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-6000、6000-8000、8000-10000、10000-12000、12000-14000、14000-16000、16000-18000、18000-20000rpm。优选地，为5000-10000rpm。进一步优选地，为5000rpm。
86.步骤(5)中，所述离心的时间为10-60min，可以为，10、20、30、40、50、60min。优选地，为30min。更进一步优选地，所述离心在5000rpm条件下离心20-40min。
87.步骤(5)中，所述离心可以在离心机中进行。将所述震荡的混合物进行离心，使外泌体进入上清液中，即得包含外泌体的上清液。若离心力过大或离心时间过长，则产生对植物外泌体结构造成破坏，产生过多杂质或残渣；若离心力过低或时间过短，则无法充分分离外泌体。
88.步骤(6)中，所述微滤中空纤维柱的过滤精度为0.1-0.8um，可以为0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80um。优选地，为
0.30-0.60um。进一步优选地，为0.45um。
89.步骤(7)中，采用100-500kda超滤中空纤维柱进行超滤浓缩，具体可以为100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500kda。优选地，为300-500kda。更优选地，为300、400、500kda。
90.步骤(7)中，所述超滤浓缩是指浓缩至原滤液(微滤后超滤前的溶液)体积的1/10-1/20，可以根据实际需要进行。考虑到超滤浓缩的次数和时间对于获得高活性的外泌体影响较大，若超滤浓缩次数过多或时间过长则可能对植物及其外泌体造成破坏，产生过多残渣影响后续提取，或破坏外泌体结构；若超滤浓缩过短，则无法达到理想效果。作为优选，所述超滤浓缩的结束条件为，以步骤(4)加入的缓冲液的量计，浓缩后得到的浓缩液的体积为缓冲的1/10～1/15，具体可以是1/10、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15。优选地，当浓缩液为缓冲液体积的1/10时，结束超滤。
91.步骤(7)中，所述超滤浓缩后还可以包括超速离心纯化的步骤，所述超速离心的参数为4℃，140000g，60-120min。
92.步骤(8)中，所述浓缩液与peg8000/nacl的体积比为3:1-8:1。可以为，3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1。优选地，为4:1。其中，所述peg8000/nacl具体是指20％peg8000/2.5m nacl，其作用为沉淀外泌体。
93.步骤(8)中，所述浓缩液与peg8000/nacl混匀后，在2-8℃条件下，目的是使得外泌体沉淀完全。所述温度可以为2、4、6、8℃，优选地，为4℃。所述放置的时间为18-24小时，具体可以为18、20、22、24小时。
94.步骤(9)中，所述离心转速为2000-8000rpm。可以为，2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000rpm。优选地，为3000-6000rpm；具体为3000、4000、5000、6000rpm。更进一步优选地，为4000rpm。
95.步骤(9)中，所述离心的时间为5-40min。可以为5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40min。优选地，为10-20min。更优选地，为10min、15min、20min。
96.步骤(9)中，在重悬后，还可以包括过滤除菌的步骤。所述过滤除菌可以采用滤膜过滤实现，所述滤膜如可以是0.45um和0.22um的滤膜。
97.步骤(9)中，在重悬后，还可以包括在重悬液中加入海藻糖然后冻干的步骤。所述海藻糖的浓度为5-10％。
98.本发明还提供了一种如上所述提取方法获得的植物来源外泌体。所述外泌体轮廓清晰，结构完整，粒径为80～120nm，呈现外泌体杯状囊泡结构，可用于抗氧化、细胞修复、组织再生等领域。
99.本发明还提供了所述的植物来源外泌体在制备日化用品或药品中的应用，如在制备用于抗氧化、细胞修复、组织再生的护肤品、化妆品或药品中的应用。
100.本发明还提供了一种外泌体提取试剂盒或外泌体蛋白提取试剂盒，所述试剂盒包括如上所述提取方法中所提及的提取材料。
101.本发明还提供了下述任一应用，包括：
102.i)所述提取材料在外泌体或外泌体蛋白提取中的应用；
103.ii)所述提取材料在外泌体蛋白分析或鉴定中的应用；
104.iii)所述试剂盒在外泌体或外泌体蛋白提取中的应用；
105.iv)所述试剂盒在外泌体蛋白分析或鉴定中的应用。
106.实验证明，本发明的外泌体提取方法可以实现对植物细胞中外泌体的高效提取，提取时间短，提取率高，获得的外泌体质量高，外泌体具有完整囊泡结构，呈圆形或椭圆形，本发明方法简单，易于控制，适于大规模生产等，具有广泛应用价值。
107.在一具体实施方式中，本发明所述外泌体的提取方法，主要技术步骤和参数如下：
108.1.精选目标新鲜植物或者药材，用自来水冲洗3次，再用纯化水冲洗3次，晾干/烘干。
109.2.将材料切碎或者剪碎成长度为1厘米以下的碎块，用榨汁机或者粉碎机打碎，视材料大小和打碎效果，重复次数为1-3次。
110.3.按照缓冲液：材料重量(g)与pbs体积(ml)的比例1:2-1:5加入pbs，摇床上震荡18-48小时，转速为50-150rpm，使材料中的外泌体尽量释放到缓冲液中，同时细胞在培养过程中生成大量外泌体。
111.优选方案，使用植物细胞培养基代替pbs，例如ms培养基，ls培养基，b5培养基等。优选方案，pbs或者培养基中加入抑菌剂或者青链霉素。优选方案，震荡时温度为22-25℃。优选方案，转速为90-120rpm。优选方案，使用通气发酵罐代替摇瓶进行大量制备。
112.4.将混合液用离心机5000rpm离心20-40min收集上清。
113.5.上清液用0.45um的中空纤维柱过滤。
114.6.滤液用100-500kda的中空纤维柱浓缩到原体积的1/10-1/20。
115.7.浓缩液中加入1/5体积的peg8000/nacl，混匀，4℃，放置18-24小时。离心，4000rpm，10-20min，收集沉淀，用适量生理盐水重悬。此产品可用作各类化妆品原料。
116.优选方案，6中的浓缩液用超离方法纯化，参数为4℃，140000g，60-120min。优选方案，7步骤产生的外泌体，用0.45um和0.22um的滤膜过滤用以除菌。优选方案，重悬液中加入5-10％的海藻糖，将外泌体冻干，可于4℃或者-20℃长期保存。
117.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
118.须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
119.此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
120.当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和
科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
121.除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecular cloning：a laboratory manual，second edition，cold spring harbor laboratory press，1989and third edition，2001；ausubel等，current protocols in molecular biology，john wiley&sons，new york，1987and periodic updates；the series methods in enzymology，academic press，san diego；wolffe，chromatin structure and function，third edition，academic press，san diego，1998；methods in enzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarman and a.p.wolffe，eds.)，academic press，san diego，1999；和methods in molecular biology，vol.119，chromatin protocols(p.b.becker，ed.)humana press，totowa，1999等。
122.本发明实施例中采用的bradford法测定蛋白浓度的实验原理是：
123.考马斯亮蓝(cbb)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。可查阅常用试剂盒说明书中记载的方法进行测定，例如生工，碧云天等。
124.以下实施例中，均设置三次重复实验，结果取平均值。
125.以下实施例中的pbs缓冲液是指称取8g nacl，0.2g kcl，1.44g na2hpo4，0.24g kh2po4，定容为1l，hcl调节ph值为7.2-7.4，121℃高压灭菌20min配置的缓冲液。
126.以下实施例中的peg8000/nacl是指称取400g peg8000，45g nacl，定容为1l，121℃高压灭菌20min配置的缓冲液。
127.实施例1：百合外泌体制备
128.称取新鲜百合(包括茎、叶、花)1千克，用自来水冲洗3次，再用纯化水冲洗3次，晾干。切碎，加入榨汁机中，加入pbs缓冲液2000ml，匀浆2次。用纱布过滤大的残渣。置于摇瓶中，在摇床上震荡24小时，温度为22℃，转速为100rpm。将混合液用离心机5000rpm离心30min，收集上清。上清液用0.45um的中空纤维柱超滤，然后过滤液再用500kda的中空纤维柱超滤浓缩到300ml。加入75ml的peg8000/nacl，混匀，4℃冰箱内放置24小时。4000rpm，4℃，离心10min，收集沉淀，用30ml生理盐水重悬，0.22um滤器过滤除菌。置于-80℃冰箱储存。用bradford法测定蛋白浓度，计算总的外泌体含量为6.12
±
0.1g。
129.图2为实施例1制备的外泌体的粒子追踪分析仪粒径分析结果图，横坐标表示粒径(nm),纵坐标表示每毫升颗粒数(10^9)。由图可知，平均粒径大小为111nm，测定浓度为3.85
×
10^9
±
5.03
×
10^8个/ml。
130.图5为实施例1制备的外泌体透射电镜形态观察图。由图可知，制备外泌体为圆形或者椭圆形的杯状结构。
131.对比例1：百合外泌体制备(超速离心法)
132.称取新鲜百合(包括茎、叶、花)50克，用自来水冲洗3次，再用纯化水冲洗3次，晾干。切碎，加入榨汁机中，加入pbs缓冲液100ml，匀浆2次。用纱布过滤大的残渣。置于摇瓶中，在摇床上震荡24小时，温度为22℃，转速为100rpm。将混合液用离心机5000rpm离心30min，收集上清。12000rpm离心30min，收集上清。上清用超速离心机140000g，4℃，离心90min，收集沉淀，用2ml生理盐水重悬，0.22um滤器过滤除菌。置于-80℃冰箱储存。用bradford法测定蛋白浓度，计算总的外泌体含量为0.14
±
0.05g(每千克百合：约2.8g)。
133.对比例2：百合外泌体制备(沉淀法)
134.称取新鲜百合(包括茎、叶、花)1千克，用自来水冲洗3次，再用纯化水冲洗3次，晾干。切碎，加入榨汁机中，加入pbs缓冲液2000ml，匀浆2次。用纱布过滤大的残渣。将混合液用离心机5000rpm离心30min，收集上清，体积为1600ml。加入400ml的peg8000/nacl，混匀，4℃冰箱内放置24小时。4000rpm，4℃，离心10min，收集沉淀，用15ml生理盐水重悬，0.22um滤器过滤除菌。置于-80℃冰箱储存。用bradford法测定蛋白浓度，计算总的外泌体含量为3.75
±
0.21g。
135.实施例2：沙棘外泌体制备
136.称取新鲜沙棘果2千克，用自来水冲洗3次，再用纯化水冲洗3次，晾干。加入榨汁机中，加入pbs缓冲液4000ml，匀浆3次。用纱布过滤大的残渣。置于摇瓶中，在摇床上震荡24小时，温度为25℃，转速为120rpm。将混合液用离心机5000rpm离心30min，收集上清。上清液用0.45um的中空纤维柱超滤，然后过滤液再用300kda的中空纤维柱超滤浓缩到400ml。加入100ml的peg8000/nacl，混匀，4℃冰箱内放置24小时。4000rpm，4℃，离心15min，收集沉淀，用40ml生理盐水重悬，0.22um滤器过滤除菌。置于-80℃冰箱储存。用bradford法测定蛋白浓度，计算总的外泌体含量为6.95
±
0.13g。
137.图3为实施例2制备的外泌体的粒子追踪分析仪粒径分析结果图，横坐标表示粒径(nm),纵坐标表示每毫升颗粒数(10^9)。由图可知，平均粒径大小为188.2nm，测定浓度为2.47
×
10^9
±
6.23
×
10^7个/ml。
138.图6为实施例2制备的外泌体透射电镜形态观察图。由图可知，制备外泌体为圆形或者椭圆形的杯状结构。
139.对比例3：沙棘外泌体制备(超速离心法)
140.称取新鲜沙棘100克，用自来水冲洗3次，再用纯化水冲洗3次，晾干。切碎，加入榨汁机中，加入pbs缓冲液200ml，匀浆2次。用纱布过滤大的残渣。置于摇瓶中，在摇床上震荡24小时，温度为22℃，转速为100rpm。将混合液用离心机5000rpm离心30min，收集上清。12000rpm离心30min，收集上清。上清用超速离心机140000g，4℃，离心90min，收集沉淀，用2ml生理盐水重悬，0.22um滤器过滤除菌。置于-80℃冰箱储存。用bradford法测定蛋白浓度，计算总的外泌体含量为0.18
±
0.04g(每千克沙棘：约5.6g)。
141.对比例4：沙棘外泌体制备(沉淀法)
142.称取新鲜沙棘2千克，用自来水冲洗3次，再用纯化水冲洗3次，晾干。切碎，加入榨汁机中，加入pbs缓冲液4000ml，匀浆2次。用纱布过滤大的残渣。将混合液用离心机5000rpm离心30min，收集上清，体积为3200ml。加入800ml的peg8000/nacl，混匀，4℃冰箱内放置24小时。4000rpm，4℃，离心10min，收集沉淀，用40ml生理盐水重悬，0.22um滤器过滤除菌。置
于-80℃冰箱储存。用bradford法测定蛋白浓度，计算总的外泌体含量为4.35
±
0.28g。
143.实施例3：肉苁蓉外泌体制备
144.称取干燥的肉苁蓉1千克，用自来水冲洗3次，再用纯化水冲洗3次，晾干。加入榨汁机中，加入pbs缓冲液5000ml，匀浆3次。用纱布过滤大的残渣。置于摇瓶中，在摇床上震荡48小时，温度为24℃，转速为100rpm。将混合液用离心机5000rpm离心30min，收集上清。上清液用0.45um的中空纤维柱超滤，然后过滤液再用300kda的中空纤维柱超滤浓缩到500ml。加入125ml的peg8000/nacl，混匀，4℃冰箱内放置24小时。4000rpm，4℃，离心20min，收集沉淀，用50ml生理盐水重悬，0.22um滤器过滤除菌。置于-80℃冰箱储存。用bradford法测定蛋白浓度，计算总的外泌体含量为8.33
±
0.21g。
145.图4为实施例3制备的外泌体的粒子追踪分析仪粒径分析结果图，横坐标表示粒径(nm),纵坐标表示每毫升颗粒数(10^9)。由图可知，平均粒径大小为217.1nm，测定浓度为3.94
×
10^9
±
4.93
×
10^8个/ml。
146.图7为实施例3制备的外泌体透射电镜形态观察图。由图可知，制备外泌体为圆形或者椭圆形的杯状结构。
147.对比例5：肉苁蓉外泌体制备(超速离心法)
148.称取干燥的肉苁蓉50g，用自来水冲洗3次，再用纯化水冲洗3次，晾干。加入榨汁机中，加入pbs缓冲液250ml，匀浆3次。用纱布过滤大的残渣。置于摇瓶中，在摇床上震荡48小时，温度为24℃，转速为100rpm。将混合液用离心机5000rpm离心30min，收集上清。12000rpm离心30min，收集上清。上清用超速离心机140000g，4℃，离心90min，收集沉淀，用2ml生理盐水重悬，0.22um滤器过滤除菌。置于-80℃冰箱储存。用bradford法测定蛋白浓度，计算总的外泌体含量为0.22
±
0.05g(每千克肉苁蓉：约4.4g)。
149.对比例6：肉苁蓉外泌体制备(沉淀法)
150.称取干燥的肉苁蓉1千克，用自来水冲洗3次，再用纯化水冲洗3次，晾干。切碎，加入榨汁机中，加入pbs缓冲液5000ml，匀浆2次。用纱布过滤大的残渣。将混合液用离心机5000rpm离心30min，收集上清，体积为4000ml。加入1000ml的peg8000/nacl，混匀，4℃冰箱内放置24小时。4000rpm，4℃，离心10min，收集沉淀，用50ml生理盐水重悬，0.22um滤器过滤除菌。置于-80℃冰箱储存。用bradford法测定蛋白浓度，计算总的外泌体含量为3.85
±
0.32g。
151.综上所述，本发明植物外泌体的提取方法能够高效、高质量、高得率地对外泌体进行提取，相对于现有提取方法，具有显著提高的效果。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
152.以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。