谷氨酸转运蛋白抑制剂在制备用于预防和治疗慢性低灌注脑损伤药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及谷氨酸转运蛋白抑制剂在制备用于预防和治疗慢性低灌注脑损伤药物中的应用，属于医药技术领域。


背景技术：

2.脑部慢性低灌注是造成脑动脉硬化、血管性痴呆、阿尔茨海默病等多种疾病的共同病理学过程，发病早期以认知功能减退为主要表现，最终可能导致进展性神经功能损害。现有研究认为脑部慢性低灌注导致部分脑区供血供氧不足，造成海马与皮层神经元大量凋亡、组织能量代谢障碍、氧化应激性损伤、血脑屏障通透性增加导致血管源性脑水肿、小胶质细胞激活与炎症因子大量释放导致神经炎症、星形胶质细胞增殖与少突胶质细胞凋亡导致脑白质损伤等。上述病理过程单独或组合共同作用最终造成脑神经功能损伤。
3.谷氨酸转运蛋白（eaat）主要存在于神经、神经元及神经胶质细胞浆膜上,对胞外谷氨酸浓度进行调节,在维持细胞正常的生理状态、避免神经元过度兴奋方面起着重要作用。其在慢性低灌注造成的脑损伤的病理过程中的作用尚不清楚。
4.现有的治疗药物都是某些程度上可缓解脑部慢性低灌注造成的脑损伤，包括它汀类药物用于改善血管内皮细胞功能、减轻血管炎症反应等；胆碱酯酶抑制剂等提高乙酰胆碱水平，改善慢性低灌注造成的认知功能；环氧化酶-2抑制剂等抑制环氧合酶-2，抑制小胶质细胞活化、减轻脑白质损害；自由基清除剂等通过抗自由基、改善氧化性损伤；部分中药制剂具有益气活血等改善脑部慢性低灌注造成的脑损伤。
5.上述药物均是通过改善脑部慢性低灌注造成的某些病理损伤，进而延缓脑损伤进程。尚未有针对谷氨酸转运蛋白的功能进行调节进而研究其在慢性低灌注造成的脑损伤的作用。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种谷氨酸转运蛋白抑制剂在制备治疗脑部慢性低灌注药物中的用途。
7.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种谷氨酸转运蛋白抑制剂在制备治疗脑部慢性低灌注药物中的应用，所述谷氨酸转运蛋白抑制剂在制备改善脑部慢性低灌注脑损伤的药物中的应用。所述模型为小鼠双侧颈动脉夹闭法构建脑部慢性低灌注模型，所述谷氨酸转运蛋白抑制剂为l-trans-pyrrolidine-2,4-dicarboxylic acid，pdc。
8.谷氨酸转运蛋白抑制剂（化学名：左旋-反式吡咯烷-2,4-二羧酸）分子结构式如下：
本发明对所述谷氨酸转运蛋白抑制剂在药物的含量没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述药物的剂型优选为溶液。
9.基于上述，本发明优选通过改善海马区与皮层神经元凋亡来治疗脑部慢性低灌注。
10.基于上述，本发明优选通过提高脑部谷胱甘肽的浓度，抑制因脑部慢性低灌注造成的氧自由基损伤来治疗脑部慢性低灌注。
11.基于上述，本发明优选通过减少细胞活力的降低、减少乳酸脱氢酶的释放和减少神经元凋亡中的一种或几种来治疗脑部慢性低灌注。在本发明中，所述细胞优选包括ht22小鼠海马神经元细胞系。
12.基于上述，本发明优选通过减少细胞ros水平，减轻氧自由基损伤来治疗脑部慢性低灌注。在本发明中，所述细胞优选包括ht22小鼠海马神经元细胞系。
13.本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说：本发明将现有谷氨酸转运蛋白抑制剂pdc发掘出了新的药用价值，将其应用于制备治疗脑部慢性低灌的药物方面，从而为制备治疗脑部慢性低灌的药物提供了一种新来源。
附图说明
14.图1神经功能学评分。慢性低灌注小鼠对照组和模型组中，分别双侧脑室注射无菌生理盐水、pdc溶液 2μg/只，每天给药1次，连续7天后，检测小鼠转棒实验和新事物识别实验结果统计图，n=8-12，
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p《0.05，
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p《0.01；图2 western blot检测皮层与海马神经元凋亡情况。慢性低灌注小鼠对照组和模型组中，分别双侧脑室注射无菌生理盐水、pdc溶液 2μg/只，每天给药1次，连续7天后，皮层与海马部位的凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和total caspase-3的表达水平。n=6，
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p《0.05，
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p《0.01；图3 elisa检测脑组织gsh和gssg的浓度比例。慢性低灌注小鼠对照组和模型组中，分别双侧脑室注射无菌生理盐水、pdc溶液 2μg/只，每天给药1次，连续7天后，elisa检测脑组织gsh和gssg的浓度比例。n=6，
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p《0.05，
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p《0.01；图4 elisa检测检测脑组织sod的浓度。慢性低灌注小鼠对照组和模型组中，分别双侧脑室注射无菌生理盐水、pdc溶液 2μg/只，每天给药1次，连续7天后，elisa检测脑组织sod的浓度。n=6，
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p《0.05，
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p《0.01；图5 cck8检测pdc梯度浓度处理下细胞活力。缺血缺氧诱导的ht22海马神经细胞系损伤构建的慢性低灌脑损伤体外模型中，cck8检测pdc梯度浓度处理下细胞活力。n=6；图6细胞形态评价。缺血缺氧诱导的ht22海马神经细胞系损伤构建的慢性低灌脑损伤体外模型中，明场中细胞形态评价。n=6；
图7乳酸脱氢酶的释放检测。缺血缺氧诱导的ht22海马神经细胞系损伤构建的慢性低灌脑损伤体外模型中，乳酸脱氢酶的释放检测。n=3，
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p《0.01；图8检测细胞ros含量。缺血缺氧诱导的ht22海马神经细胞系损伤构建的慢性低灌脑损伤体外模型中，细胞ros含量检测。n=3，
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p《0.01；图9检测细胞凋亡情况。缺血缺氧诱导的ht22海马神经细胞系损伤构建的慢性低灌脑损伤体外模型中，细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和total caspase-3的表达水平。n=3，
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p《0.01。
具体实施方式
15.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
16.实施例1：谷氨酸转运蛋白抑制剂pdc对小鼠脑部慢性低灌的保护作用的研究1. 试剂及动物1.1试剂：谷氨酸转运蛋白抑制剂pdc（sigma-aldrich，美国），由恒顺成生物有限公司代购。cas编号64769-66-0，pubchem识别号3868 ，纯度》 98%，其分子量为159.14，分子式为c6h9no4，保存条件：-20度、避光。
17.1.2实验动物：c57bl/6：spf级，雄性，36只，体重：18.5～22.6g，长沙斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：scxk(湘)2016-0002。动物饲养于桂林医学院附院医院spf级实验动物中心，实验动物室温度20～26℃(日温差≤4℃) ，湿度40％～70％，照明12h:12h明暗交替；1.3 动物分组：假手术组、脑部慢性低灌模型组、pdc治疗组，小鼠脑部慢性低灌模型造模后，根据组别随机分配。
18.1.4 剂量设计：组别：假手术组(sham)；脑部慢性低灌模型组（model）；pdc治疗组（pdc）；给药：假手术组与脑部慢性低灌模型组给予无菌生理盐水；pdc治疗组给予pdc溶液；给药途径： 双侧脑室注射；给药剂量：假手术组与脑部慢性低灌模型组为1μl/只，pdc治疗组为2μg/只；给药频率：每天给药1次，连续7天；动物数量：假手术组8只，脑部慢性低灌模型组12只，pdc治疗组10只。1.5试验方法：按小鼠质量用0.04ml/10g 10% 的水合氯醛腹腔注射麻醉后常规消毒颈部皮肤, 待小鼠无翻正反射后仰卧固定于手术台上, 保持呼吸通畅, 常规消毒, 经颈部做正中切口, 切开皮肤和皮下组织, 钝性分离二腹肌和胸锁乳突肌, 暴露颈动脉鞘, 然后小心分离双侧颈总动脉及迷走神经约, 并于颈总动脉下穿以零号丝线, 备用。提拉丝线, 以无创伤性微动脉夹夹闭颈总动脉阻断血流 15 min, 然后去除, 恢复灌注15 min, 如此反复3次。最后缝合皮肤, 消毒, 以青霉素肌注抗炎。
19.1.6神经功能学评分：转棒试验和新事物识别实验转棒试验：转棒试验主要在小鼠旋转仪上进行，设定初始旋转速度为4rpm，最高旋
转速度40rpm，加速过程为5min，每只小鼠运动时间上限为300s。在术前3天开始训练小鼠，按照上述的参数进行训练，每天分上午、下午两次。 ich术后7天测试小鼠，每只小鼠测量3次，每次之间休息≥30min。运动超出300s的，将小鼠取下，记录300s数据。转棒试验用于评价小鼠运动功能。
20.新事物识别实验：实验方法如下：第一天将小鼠放入旷场箱(长
×
宽
×
高为：45 cmx45 cm x45 cm)中适应10 min。第二天在旷场箱的相反位置中放入两个大小、颜色、形状一致的物体，将小鼠按同一方向放入，记录10 min后取出小鼠。30 min后，将其中一个物体换为相同大小、不同颜色、不同形状的物体，将小鼠放入，记录并分析5 min内小鼠对两个物体的探索时间。探索标准定义为小鼠鼻子距离物体小于1 cm，小鼠爬上物体或者停留在物体上则不能计入。识别分数 (discrimination index，di)=(新事物探索时间-旧事物探索时间)／(新事物探索时间 旧事物探索时间)
×
100％。新事物识别实验用于检测小鼠的认知能力。
21.脑部慢性低灌小鼠治疗行为学评分结果如图1所示，可见经pdc治疗的脑部慢性低灌小鼠转棒试验运动时间明显长于模型组，而新事物识别分数显著高于模型组，表明pdc能够显著改善脑部慢性低灌小鼠的运动功能和认知功能，具有治疗保护作用。(*表示p小于0 .05)。
22.1.7 western blot检测皮层与海马神经元凋亡情况。
23.脑部慢性低灌导致皮层与海马区神经元的凋亡为脑部慢性低灌诱导的脑损伤的一个重要病理过程，western blot检测皮层与海马区神经元凋亡情况。取皮层与海马区脑组织进行匀浆，western blot检测了活化caspase-3的表达情况，结果如图2所示，活化caspase-3的表达在模型组明显上调，给予 pdc 2μg/只治疗，在术后7天较模型组显著减少，且差异具有统计学意义。可见 pdc治疗后能够明显减轻脑部慢性低灌导致的皮层与海马区域的神经元的凋亡。
24.1.8 酶联免疫吸附实验检测脑组织gsh (还原型谷胱甘肽)和gssg (氧化型谷胱甘肽)的浓度。
25.还原型谷胱甘肽是绝大多数活细胞中巯基的主要来源，对于维护蛋白巯基适当的氧化还原状态有重要作用，并且是动物细胞中关键的抗氧化剂。运用酶联免疫吸附实验，我们检测了脑部慢性低灌后脑组织的出gsh(还原型谷胱甘肽)和gssg(氧化型谷胱甘肽)含量的检测试的浓度。结果如图3所示，pdc治疗组gsh水平占总谷胱甘肽与模型组比，显著升高。
26.1.9 酶联免疫吸附实验检测脑组织sod的浓度。
27.超氧化物岐化酶(superoxide dismutase ,sod)能催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢(h2o2)和氧气(o2)，是生物体内一种重要的抗氧化酶。检测各处理组脑组织sod的表达水平，结果如图4所示，pdc治疗组中sod含量显著高于模型组。
28.实施例2：谷氨酸转运蛋白抑制剂pdc对缺血缺氧诱导的ht22海马神经细胞系损伤构建的慢性低灌脑损伤体外模型的保护作用。
29.2.1缺血缺氧诱导的ht22海马神经细胞系损伤构建的慢性低灌脑损伤体外模型：体外培养的ht22海马神经细胞系（武汉普诺赛生命科技有限公司，货号cl-0595），连续培养5代后，细胞分组进行处理，对照组（control）正常培养，模型组（ogd）细胞利用无糖培养基培养，并放于缺氧培养箱（thermo scientific，forma 2系列水套）内培养24小时，pdc处理
组中，细胞利用无糖培养基培养，并以pdc浓度梯度（0、1.625、3.125、6.25、12.5、52、50、100 μmol）进行处理后，并放于可变控氧（三气）co2 培养箱缺氧培养（thermo scientific，forma 2系列水套）内培养24小时后，进行后续检测。
30.2.2 cck-8检测细胞活力。
31.结果如图5所示，随着pdc浓度增加，细胞活力逐渐增加至平台区。其中50 μmol效果较好。
32.2.3 细胞形态评价从细胞形态上看，结果如图6所示，模型组细胞大量死亡，细胞皱缩变圆，神经元突起稀疏、 减少，胞体瓦解。而pdc 50 μmol处理组可显著改善细胞形态。
33.2.4 乳酸脱氢酶的释放检测运用ldh检测试剂盒检测了细胞培养上清液中乳酸脱氢酶含量，结果如图7所示，与 cck-8一致，均表明pdc 50 μmol预处理后与模型组相比，可显著减少细胞死亡。
34.2.5 检测细胞ros含量同实施例1中1.9的处理方法类似，结果如图8所示，模型组ros水平显著升高，而pdc50 μmol预处理可有效减少细胞ros含量。差异具有统计性。可见pdc50 μmol预处理后能够减少神经元氧化应激损伤。
35.2.6 检测细胞凋亡情况结果如图9所示，模型组活化caspase-3表达水平明显上调，而pdc50 μmol预处理后能够明显降低活化caspase-3的蛋白水平。
36.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。