取代的萘二酰亚胺及其用途的制作方法

取代的萘二酰亚胺及其用途
发明领域
1.本发明涉及萘二酰亚胺、ndi以及合成它们的方法。ndi具有dna-四链体(quadruplex)结合和稳定活性，并且具有治疗胰腺癌、前列腺癌和其他人类癌症的潜力。
2.发明背景
3.在wo2009/068916中，我们描述了三取代和四取代的萘二酰亚胺和用于生产它们的方法。被三取代的例示产物中没有一个在核心配体上的均等和极性位置处具有不同的氨基官能配体。据称适用于生产三取代化合物的方法基于以下方案(schematic)：
[0004][0005]
其中r1是任选取代的烷基或芳基并且n是0或1。在实践中，产生四取代(n＝1)和三取代(n＝0)的化合物的混合物。所有取代基(即r1基团)是相同的。
[0006]
说明书描述了从以上使用的二溴化合物的二氯取代类似物开始来生产四取代化合物的方法。所述方法在一个步骤中进行，在这种情况下，相同的h2nr1试剂在两个酸酐基团和两个-氯-取代的碳处发生反应以在产物上提供4个相同的r1取代基，或者在两个步骤中进行，其中在第一步骤中，第一试剂h2nr2在两个酸酐基团处发生反应，并且在第二步骤中，第二试剂h2nr3在两个氯-取代的碳原子处发生反应。在酰亚胺取代基上和/或在芳环上具有碱性取代基的化合物具有很强的dna四链体结合特性。
[0007]
在wo2017/103587中，我们描述了三取代的萘二酰亚胺以及用于生产它们的方法。据称适用于生产三取代化合物的方法基于以下方案：
[0008][0009]
其中y是h或br，基团r
12
是相同的并且选自由直链和支链c
1-6
烷二基组成的组，r
13
选自由h和c
1-6
烷基组成的组，r
14
选自由直链和支链c
1-6
烷二基和c
7-12
芳烷二基组成的组，x2选自由卤素、r
11
、nr
152
、conr
162
、coor
17
、sh和cor
18
组成的组，r
11
选自由h、任选取代的c
1-6
烷基、任选取代的c
5-7
环烷基、c
5-7
杂环烷基和芳基组成的组，各个r
15
选自由h、c
1-6
烷基、芳基和c
7-12
芳烷基组成的组，或者基团r
15
连同它们所连接的n原子一起形成5-7个原子的饱和杂环，各个r
16
选自由h和c
1-6
烷基组成的组，或者基团r
16
连同它们所连接的n原子一起形成5-7元杂环，r
17
选自由任选取代的c
1-6
烷基、c
7-12
芳烷基和芳基组成的组，r
18
选自由任选取代的c
1-6
烷基、c
7-12
芳烷基和芳基组成的组，并且其中所述br原子或者所述br原子中的一个或各个br被胺试剂的亲核性胺氮取代以形成取代的ndi化合物。
[0010]
在wo2009/068916，us2014-0275065a，以及hampel s.m.等人,bioorg.med.chem.lett.(2010)20,6459-6463，micco.m.等人,j.med.chem.(2013)56,2959-2974，collie,g.w.等人,j.a.c.s.(2012)134,2723-2731，gunaratnam,m.等人,j.med.chem.(2009)52,3774-3783，gunaratnam,m.等人，bioorg.med.chem.(2011)19,7151-7157和mitchell,t.等人,biochemistry(2013)52,1429-1436中已经测试了四取代的产物(包括具有与基团r3不同的基团r2的产物)与端粒的四链体以及在一些基因的启动子区中发现的那些的结合特性。数据显示了多种蛋白质的有效下调，其基因的启动子被二酰亚胺靶向，并且因此导致来自一组癌细胞系的多个细胞系的生长抑制。我们在这些出版物中
提议了进一步研究改变取代基的性质以及阳离子取代基中的叔胺基团的碱性对结合特异性和强度的影响，并且通过癌症(包括胰腺癌)的测试模型来研究化合物在癌症治疗中的潜力。
[0011]
在scientific reports(2015)5:11385中，ohnmacht,s.a.等人公开了4,9-双((3-(4-甲基哌嗪-1-基)-丙基)氨基)-2,7-双(3-吗啉基丙基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮(也称为mm41)在人胰腺癌的小鼠模型中在体内的活性。
[0012]
nadai,m.等人在int.j.oncol.(2015)46,369-380中公开了三取代的萘二酰亚胺化合物，其具有在每个酰亚胺氮原子处取代的2-二甲基氨基乙基并且具有在ndi核心上的4-位处取代的2-(4-羟基-3-二甲基氨基甲基苯基)乙基氨基作为第三取代基。其具有使端粒g-四链体(gq)稳定的活性，从而导致端粒功能障碍和端粒酶下调。一组细胞系上的全局基因表达显示出与癌症的端粒功能和机制有关的基因的调节。然而，作者得出的结论是，仍然缺乏g-4s在细胞环境中的生物学相关性的直接证据(marchetti等人,jmed chem,2018,61(6),pp.2500-2517)。
[0013]
由nadai等人报道的三取代化合物的合成在doria等人,org biomol.chem,(2012)10,2798-2806中公开。
[0014]
发明概述
[0015]
本发明人令人惊奇地发现，四取代的萘二酰亚胺化合物上的侧链的特定基团导致二酰亚胺化合物与gq的改善的结合，从而导致改善的抗癌活性。
[0016]
因此，在本发明的第一方面，提供了一种新的式i的化合物：
[0017][0018]
l在苯环的间位或对位并且选自由(ch2)
1-6
和(ch2)
1-5
nh组成的组；
[0019]
r1选自由任选取代的c
5-7
环烷基、任选取代的含氮的5-7元杂环烷基和nr9r
10
组成的组；
[0020]
r2和r4独立地选自由直链和支链c
1-6-烷二基组成的组；
[0021]
r3、r9和r
10
独立地选自由h或c
1-6
烷基组成的组；
[0022]
x选自由卤素、or5、nr
62
、conr
72
、coor8、h和cor8组成的组；
[0023]
r5选自由h、c
1-6
烷基、c
4-7
环烷基、4-7元杂环烷基和芳基组成的组；
[0024]
r6选自由h、c
1-6
烷基、芳基和c
7-12-芳烷基组成的组，或者基团r6连同它们所连接的n原子一起形成含n的饱和的4-7元杂环基；
[0025]
基团r7各自选自h和c
1-6
烷基，或者基团r7连同它们所连接的n原子一起形成4-7元杂环基；
[0026]
r8选自由c
1-6
烷基、c
7-12
芳烷基和芳基组成的组；以及
[0027]
其盐、水合物和溶剂化物。
[0028]
本发明进一步提供了在治疗动物的方法中使用以治疗癌症或抑制实体瘤的生长或者减小实体瘤(例如胰腺和前列腺肿瘤)的大小的新化合物。
[0029]
本发明还提供了含有所述新化合物和稀释剂或载体的组合物。组合物优选地是药物组合物并且载体则是药用的。
[0030]
在本发明的第二方面，提供了一种合成根据本发明的第一方面的取代的萘二酰亚胺化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0031]
i)在亲核取代反应中使式iv的化合物与式v的化合物反应：
[0032][0033]
hn(r3)(r4x)
[0034]
式iv
[0035]
其中式iii的化合物中的至少一个br被式iv的化合物中的亲核性胺氮取代；
[0036]
ii)使式v的化合物与式vi的化合物反应，所述式v的化合物可从由式iii和式iv的亲核取代反应产生的产物获得：
[0037][0038]
其中在式vi的苯基与在式v的化合物中连接有br的苯基之间形成芳基-芳基键，其中lg和br是离去基团，从而制备式i的化合物；并且优选地
[0039]
iii)从由式v和式vi的反应产生的产物中分离式i的化合物；
[0040]
其中l、x和r1至r4是如对于本发明的第一方面的式i所定义的。
[0041]
附图
[0042]
图1：示出了利用本发明的化合物和比较化合物治疗的小鼠中的胰腺癌肿瘤中的肿瘤消退。
[0043]
发明详述
[0044]
定义
[0045]
如本文所使用的，除非另有说明，否则“烷基”、“环烷基”、“杂环烷基”、“杂环基”、“芳基”和“芳烷基”可以是一价的或二价的。
[0046]
如本文所使用的，除非另有说明，否则“芳基”意指单环、二环或三环的一价或二价(适当时)芳族基团，诸如苯基、联苯基、萘基、蒽基，其可以任选地被至多三个取代基取代。
[0047]
如本文所使用的，除非另有说明，否则“任选取代的”是具有选自以下各项的组的取代基中的一个：c
1-c6烷基、羟基、c
1-c3羟基烷基、c
1-c3烷氧基、c
1-c3卤代烷氧基、氨基、c
1-c3单烷基氨基、c
1-c3双烷基氨基、c
1-c3酰基氨基、c
1-c3氨基烷基、单(c
1-c3烷基)氨基c
1-c3烷基、双(c
1-c3烷基)氨基c
1-c3烷基、c
1-c
3-酰基氨基、c
1-c3烷基磺酰基氨基、卤素、硝基、氰基、三氟甲基、羧基、c
1-c3烷氧基羰基、氨基羰基、单c
1-c3烷基氨基羰基、双c
1-c3烷基氨基羰
基、-so3h、c
1-c3烷基磺酰基、氨基磺酰基、单c
1-c3烷基氨基磺酰基和双c
1-c
3-烷基氨基磺酰基。
[0048]
如本文所使用的，除非另有说明，否则“杂环烷基”和“杂环基”是含有至多4个选自氧、氮和硫的杂原子的碳环基团。它们可以是二环的或单环的。它们优选是饱和的。如果杂环是二价连接基团，则该杂环可以通过碳原子或者通过杂原子中的一个(例如n)连接至相邻基团。杂环的实例是吡咯烷、哌嗪和吗啉。
[0049]
本发明的优选基团
[0050]
在本发明的第一方面，l优选是(ch2)
1-6
，优选(ch2)
1-4
，更优选(ch2)
1-3
，还更优选(ch2)
1-2
，甚至更优选(ch2)。优选地l在苯基的对位。当r1是任选取代的含氮的5-7元杂环烷基或nr9r
10
时，优选的是，r1经由r1的氮原子与l接合。
[0051]
设想了l或r1包含碱性氮原子。因此，r1可以是包含碱性氮原子的任何基团。r1优选是含氮的5-7元杂环烷基，优选含氮的5-6元杂环烷基，更优选含氮的5元杂环烷基。优选地，含氮的5-7元杂环烷基的氮是杂环烷基中的唯一杂原子。在另一个方面，含氮的5-7元杂环烷基包含第二杂原子，诸如氧原子。
[0052]
合适地，含氮的5-7元杂环烷基选自由吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基组成的组，优选吡咯烷基。合适地，l是(ch2)并且r1是吡咯烷基。
[0053]
合适地，r1是nr9r
10
。r9和r
10
独立地选自由h或c
1-6
烷基组成的组，优选c
1-6
烷基，更优选c
2-4
烷基，甚至更优选c
2-3
烷基。合适地，nr9r
10
是二乙基氨基、二丙基氨基或乙基丙基氨基。
[0054]
在另一个实施方案中，l包含碱性氮原子。合适地，l是(ch2)
1-5
nh，优选(ch2)
1-3
nh，更优选(ch2)
1-2
nh，甚至更优选(ch2)nh并且r1是c
5-7
环烷基，优选c5环烷基。优选地，l在苯基的对位。
[0055]
式i中的两个r2基团彼此相同。r2优选是直链c
2-4-烷二基，最优选直链c
3-烷二基。r4可以与r2相同或可以与r2不同，并且优选是直链或支链c
2-4-烷二基，最优选c
2-烷二基。
[0056]
x优选包括胺基，即x优选是nr
62
或conr
72
，进一步优选nr
62
。基团r6和r7连同它们所连接的n原子一起优选地形成含n的饱和的4-7元杂环基，进一步优选含n的饱和的5元杂环基。在这样的化合物中，其中两个基团r6连接而形成杂环的那些是优选的，因为它们看起来在癌细胞系测试中具有可用的细胞毒性活性。x最优选是饱和的吡咯烷基。
[0057]
优选地，式i具有以下式ii的结构：
[0058][0059]
其中l和r1是如对于式i所定义的，其中优选基团中的任一个如以上所概述。
[0060]
合适地，化合物选自由以下各项组成的组：
[0061]
2,7-双(3-吗啉基丙基)-4-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)-9-(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮；
[0062]
4-(4-(吗啉基甲基)苯基)-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮；
[0063]
2,7-双(3-吗啉基丙基)-4-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)-9-(3-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮；
[0064]
2,7-双(3-吗啉基丙基)-4-(4-(哌啶-1-基甲基)苯基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮；
[0065]
4-(4-((二乙基氨基)甲基)苯基)-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮；
[0066]
4-(4-((环戊基氨基)甲基)苯基)-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮；
[0067]
4-(4-(氮杂环庚烷-1-基甲基)苯基)-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮；
[0068]
4-溴-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮；以及
[0069]
其盐、水合物和溶剂化物。
[0070]
在本发明的第二方面，式iv至式viii的l、x和r1至r4优选是如以上对于作为本发明的第一方面的式i的l、x和r1至r4的优选特征所定义的。
[0071]
本发明的方法包括在芳族亲核取代反应中使式iii的溴化萘二酰亚胺与式iv的胺试剂反应的第一步骤，由此溴原子被氨基n(r3)(r4x)替代。起始二酰亚胺是二溴化合物，并且芳族亲核取代反应可能导致两个溴原子被胺基团替代或者它们中的仅一个被替代(即式v的化合物)，但是优选的是溴中的仅一个被替代，并且必须产生至少一种式v的化合物。优选的是例如通过使用柱色谱来分离单取代和双取代的萘二酰亚胺的混合物。
[0072]
在第二步骤中，在取代反应中使第一步骤中产生的式v的化合物与式vi的试剂反应，由此经由lg(离去基团)最初连接的碳原子，溴原子被式vi中的苯基替代。在一个方面，lg可以是硼酸基团，然而，技术人员将理解存在多种方式来进行取代反应并且在式v和vi之间形成芳基-芳基键。因此，产生了至少一种式i的化合物。
[0073]
优选地，在另一个步骤中，通过使用柱色谱来分离式i的化合物。
[0074]
优选地，所使用的柱色谱的具体形式选自凝胶和快速柱色谱。
[0075]
本发明的化合物可以以药用组合物的形式提供。本发明的化合物，尤其是当以酸加成盐的形式(例如其中一些或所有碱性胺基团转化为盐形式)存在时，是水溶性的并且具有大致中性的ph。因此，这些盐适合以水溶液形式施用，所述水溶液将适用于静脉内施用。药物水溶液优选包含1至500mg/l的化合物。
[0076]
本发明的化合物可以以适合制成药物组合物的形式提供，例如以干燥的可再水合的形式提供，例如与载体或稀释剂一起提供。这样的干燥形式可以通过结晶和/或蒸发产生。备选地，化合物可以作为浓缩物存在，例如在用于在施用前稀释的水或有机药用溶剂中。
[0077]
如本文所使用的，药用盐是与药用酸或碱的盐。药用酸包括无机酸(诸如盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸或硝酸)和有机酸(诸如柠檬酸、富马酸、马来酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、酒石酸、苯甲酸、乙酸、甲磺酸、乙磺酸、水杨酸、硬脂酸、苯磺酸或对甲苯磺酸)二者。药用碱包括碱金属(例如钠或钾)和碱土金属(例如钙或镁)氢氧化物和有机碱(诸如烷基胺、芳基胺或杂环胺)。
[0078]
为避免疑义，本发明还包括在体内反应生成本发明的化合物的前药。
[0079]
根据本发明的组合也可以与其他药剂联合使用以抑制不希望的和不受控制的细胞增殖，例如抗体。化合物可以与抗体偶联或作为两个单独的组分施用。
[0080]
本发明的化合物和包含它们的组合物可以通过任何途径施用。在一个实施方案中，可以将包含本发明的化合物的药物组合物配制成适合口服、直肠、肠胃外、鼻内或经皮施用或者通过吸入或通过栓剂施用的形式。典型的施用途径是肠胃外、鼻内或经皮施用或者通过吸入施用。对于肿瘤的化学疗法，组合物最方便地是静脉内施用。
[0081]
当用作用于现有肿瘤的治疗时，本发明的化合物可以使用为化学治疗剂开发的方案进行施用。
[0082]
本发明的化合物和组合物可用于治疗患有癌症的受试者。一类特定的癌症被认为是实体瘤，其中可以鉴定癌性物质的实体肿块。另一类包括血液学癌症，其被认为是影响血液系统的癌症。
[0083]
可以使用本发明的化合物和组合物治疗的具体癌症类型包括但不限于前列腺癌、胰腺癌、小细胞肺癌或胃肠癌。在一个优选的实施方案中，癌症是前列腺癌或胰腺癌。
[0084]
本发明的化合物和组合物可用于治疗以抑制实体瘤的生长，或者减小实体瘤的大
小，例如其中肿瘤是胰腺或前列腺肿瘤。
[0085]
合适地，待治疗的受试者是动物，优选人。
[0086]
因此，提供了一种治疗方法，所述方法包括向受试者施用本发明的化合物或药物组合物以治疗癌症，特别是上文已经描述的那些癌症。
[0087]
还提供了本发明的化合物或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症，特别是上文已经描述的那些癌症。
[0088]
在所附实施例中进一步举例说明本发明。
实施例
[0089]
一系列的四取代的萘二酰亚胺已被合成，并且作为g-四链体配体和潜在的抗癌剂进行了评价。
[0090]
化学
[0091]
除非另有说明，否则所有的化学品、试剂和溶剂均从商业来源购买并且按原样使用。除非指定了无水溶剂，否则溶剂为商用hplc级，在这种情况下，使用aldrich
‘
sure seal’无水溶剂。使用指定的洗脱剂在预装二氧化硅(230-400目，40-63μm)柱上进行柱色谱。
[0092]1h nmr光谱在bruker avance iii光谱仪上在400mhz下获得，使用残留的未氘化溶剂作为参照。
[0093]
使用酸性或碱性方法进行分析型lcms，如下所述：
[0094]
酸性，hplc：waters x-select csh c18，2.5μm，4.6
×
30mm柱，利用在mecn中的0.1％甲酸于在水中的0.1％甲酸中的梯度洗脱。5-95％的在mecn中的0.1％甲酸的梯度以2.5ml/min在0.00-3.00分钟发生，其中以4.5ml/min在3.01-3.5分钟进行冲洗。柱重新平衡至5％mecn以2.5ml/min在3.60-4.00分钟进行。使用agilent 1260infinity或agilent 1200vwd在254nm测量洗脱峰的uv光谱。使用以正/负切换运行的agilent 6120或agilent 1956msd或者以正模式或负模式运行的agilent 6100msd来测量质谱。
[0095]
碱性，hplc：waters x-select beh c18，2.5μm，4.6
×
30mm柱，利用在10mm碳酸氢铵水溶液中的mecn的梯度洗脱。5-95％mecn的梯度以2.5ml/min在0.00-3.00分钟发生，其中以4.5ml/min在3.01-3.5分钟进行冲洗。柱重新平衡至5％mecn以2.5ml/min在3.60-4.00分钟进行。使用agilent 1260infinity或agilent 1200vwd在254nm测量洗脱峰的uv光谱。使用以正/负切换运行的agilent 6120或agilent 1956msd或者以正模式或负模式运行的agilent 6100msd来测量质谱。
[0096]
备选地，使用酸性或碱性方法进行分析型uplc/ms，如下所述：
[0097]
酸性，uplc：waters acquity csh c18，1.7μm，2.1
×
30mm柱，利用在mecn中的0.1％甲酸于在水中的0.1％甲酸中的梯度洗脱。梯度以保持在0.0-0.11分钟的5％mecn的起点构建。5-95％的梯度在0.11-2.15分钟发生，其中在2.15-2.56分钟进行冲洗。柱重新平衡至5％mecn在2.56-2.83分钟进行。使用acquity pda测量洗脱峰的uv光谱，并且使用具有esi正/负切换的acquity qda检测器记录质谱。
[0098]
碱性uplc：waters acquity beh c18，1.7μm，2.1
×
30mm柱，利用在10mm碳酸氢铵水溶液中的mecn的梯度洗脱。梯度以保持在0.0-0.11分钟的5％mecn的起点构建。5-95％的
基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮
[0105][0106]
将4-溴-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮(202mg，0.284mmol)和(4-(吗啉基甲基)苯基)硼酸(188mg，0.852mmol)在二噁烷(4ml)中的搅拌混合物用碳酸钾(568μl的2m水溶液，1.135mmol)处理并且脱气。添加s-phos pd g3(6.64mg，8.52μmol)并且将混合物再次脱气，然后整体加热至80℃(模块温度，预加热的)。在18小时之后，使混合物冷却，然后用水(10ml)和nahco3饱和水溶液(10ml)稀释并且用dcm(2
×
20ml)萃取。将合并的有机物用na2so4干燥并且蒸发。柱色谱(12g buchi flashpure，预吸附的，在(1:1thf:dcm)中的10-70％[9:1(1:1thf:dcm):在meoh中的7mnh3])得到中等纯的产物的两个馏分。将产物带的中心部分蒸发并且溶解在mecn(2ml)中。在约48小时之后，将其过滤并且弃去固体。同时，将来自产物带边缘的材料蒸发并且由异己烷再形成浆料。将该材料与来自上述批次的mecn液体合并，并且将所得物通过柱色谱(12g redisep gold，在dcm中的30-70％(9:1dcm:在meoh中的0.7m nh3)，加载到dcm中)纯化。将该带的中心馏分蒸发，得到产物，为亮红色玻璃状固体(50mg，22％)。
[0107]
lcms：实测值m/z 808.3(c
45h58
n7o7(mh

)要求808.4)@6.68min。1h nmr(500mhz，氯仿-d)δ10.24(t,j＝5.3hz,1h),8.50(s,1h),8.33(s,1h),7.45(d,j＝8.0hz,2h),7.32(d,j＝8.0hz,2h),4.30(t,j＝7.4hz,2h),4.15(t,j＝7.4hz,2h),3.83-3.71(m,6h),3.65-3.59(m,10h),2.95(t,j＝6.4hz,2h),2.70-2.67(m,4h),2.58-2.50(m,6h),2.47-2.40(m,10h),1.96(app p,j＝7.1hz,2h),1.90-1.84(m,6h)。
[0108]
实施例3：2,7-双(3-吗啉基丙基)-4-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)-9-(3-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮
[0109][0110]
将4-溴-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮(149mg，0.209mmol)和1-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苄基)吡咯烷(180mg，0.628mmol)在二噁烷(4ml)中的搅拌混合物用碳酸钾(419μl的2m水溶液，0.837mmol)处理并且脱气。装入s-phos pd g3(4.90mg，6.28μmol)，将混合物再次脱气并且整体加热至80℃。在16小时之后，使混合物冷却，然后用水(10ml)和nahco3饱和水溶液(10ml)稀释并且用dcm(2
×
20ml)萃取。将合并的有机物用na2so4干燥并且蒸发。柱色谱(12g redisep gold，在dcm中的30-60％(9:1dcm:在meoh中的0.7m nh3)，加载到dcm中)得到中等纯度的产物。将剩余物通过反相柱色谱(12g reveleris c-18，在水中的75-100％(在meoh中的70mm nh3))，加载到dmso中)纯化，得到纯度更好但仍不令人满意的产物。将剩余物通过反相柱色谱(12g reveleris c-18，在水中的75-100％(在meoh中的70mm nh3)，加载到dmso中)再次纯化，得到产物，为亮红色玻璃状固体(16mg，10％)。
[0111]
lcms：实测值m/z 792.4：(c
45h58
n7o6(mh

)要求792.4)@6.42min。1h nmr(500mhz，二氯甲烷-d2)δ10.26(t,j＝5.5hz,1h),8.47(s,1h),8.35(s,1h),7.47-7.37(m,2h),7.35(br s,1h),7.26(dt,j＝7.2,1.7hz,1h),4.30(t,j＝7.4,2h),4.13(t,j＝7.4hz,2h),3.82-3.65(m,4h),3.52-3.58(m,8h),2.95(t,j＝6.2hz,2h),2.69-2.66(m,4h),2.61-2.30(m,16h),1.93(p,j＝6.9hz,2h),1.89-1.75(m,10h)。
[0112]
实施例4：2,7-双(3-吗啉基丙基)-4-(4-(哌啶-1-基甲基)苯基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮
[0113][0114]
将4-溴-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮(155mg，0.218mmol)和1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苄基)哌啶(197mg，0.653mmol)在二噁烷(4ml)中的搅拌混合物用碳酸钾(436μl的2m水溶液，0.871mmol)处理并且脱气。装入s-phos pd g3(5.10mg，6.53μmol)，将混合物再次脱气并且整体加热至80℃。在16小时之后，使混合物冷却，然后用水(10ml)和nahco3饱和水溶液(10ml)稀释并且用dcm(2
×
20ml)萃取。将合并的有机物用na2so4干燥并且蒸发。柱色谱(12g redisep gold，在dcm中的30-60％(9:1dcm:在meoh中的0.7m nh3)，加载到dcm中)得到中等纯度的产物。将剩余物通过反相柱色谱(12g reveleris c-18，在水中的75-100％(在meoh中的70mm nh3)，加载到dmso中)纯化，得到产物，为亮红色玻璃状固体(61mg，35％)。
[0115]
lcms：实测值m/z 806.3：(c
46h60
n7o6(mh

)要求805.5)@7.38min。1h nmr(500mhz，二氯甲烷-d2)δ10.25(t,j＝5.1hz,1h),8.47(s,1h),8.34(s,1h),7.43(d,j＝8.1hz,2h),7.33(d,j＝8.1hz,2h),4.29(t,j＝7.4hz,2h),4.14(t,j＝7.3hz,2h),3.75(q,j＝5.9hz,2h),3.64-3.50(m,10h),2.95(t,j＝6.2hz,2h),2.69-2.66(m,4h),2.56-2.29(m,16h),1.93(p,j＝7.0hz,2h),1.89-1.82(m,6h),1.68-1.62(m,4h),1.53-1.49(m,2h)。
[0116]
实施例5：4-(4-((二乙基氨基)甲基)苯基)-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮
[0117]
[0118]
将4-溴-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮(155mg，0.218mmol)和n-乙基-n-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苄基)乙胺(189mg，0.653mmol)在二噁烷(4ml)中的搅拌混合物用碳酸钾(436μl的2m水溶液，0.871mmol)处理并且脱气。装入s-phos pd g3(5.10mg，6.53μmol)，将混合物再次脱气并且整体加热至80℃。在16小时之后，使混合物冷却，然后用水(10ml)和nahco3饱和水溶液(10ml)稀释并且用dcm(2
×
20ml)萃取。将合并的有机物用na2so4干燥并且蒸发。柱色谱(12g buchiflashpure，在dcm中的30-60％(9:1dcm:在meoh中的1.4m nh3)，加载到dcm中)得到中等纯度的产物。将剩余物通过反相柱色谱(12g reveleris c-18，在水中的75-100％(在meoh中的70mm nh3)，加载到dmso中)纯化，得到产物，为亮红色玻璃状固体(81mg，47％)。
[0119]
lcms：实测值m/z 794.2：(c
45h60
n7o6(mh

)要求794.5)@6.93min。1h nmr(500mhz，二氯甲烷-d2)δ10.24(t,j＝5.2hz,1h),8.46(s,1h),8.32(s,1h),7.46(d,j＝8.0hz,2h),7.33(d,j＝8.0hz,2h),4.28(t,j＝7.4hz,2h),4.13(t,j＝7.4hz,2h),3.79-3.71(m,2h),3.69(s,2h),3.58-3.53(m,8h),2.94(t,j＝6.2hz,2h),2.69-2.66(m,4h),2.61(q,j＝7.1hz,4h),2.50(t,j＝6.8hz,2h),2.47-2.30(m,10h),1.93(p,j＝6.9hz,2h),1.88-1.82(m,6h),1.12(t,j＝7.1hz,6h)。
[0120]
实施例6：4-(4-((环戊基氨基)甲基)苯基)-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮
[0121][0122]
将4-溴-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮(153mg，0.215mmol)和n-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苄基)环戊胺(194mg，0.645mmol)在二噁烷(4ml)中的搅拌混合物用碳酸钾(430μl的2m水溶液，0.860mmol)处理并且脱气。装入s-phos pd g3(5.03mg，6.45μmol)，将混合物再次脱气并且整体加热至80℃。在16小时之后，使混合物冷却，然后用水(10ml)和nahco3饱和水溶液(10ml)稀释并且用dcm(2
×
20ml)萃取。将合并的有机物用na2so4干燥并且蒸发。柱色谱(12g buchiflashpure，在dcm中的30-60％(9:1dcm:在meoh中的1.4m nh3)，加载到dcm中)得到中等纯度的产物。将剩余物通过反相柱色谱(12g reveleris c-18，在水中的75-100％(在meoh中的70mm nh)，加载到dmso中)纯化，得到产
物，为亮红色玻璃状固体(29mg，17％)。
[0123]
lcms：实测值m/z 806.4：(c
46h60
n7o6(mh

)要求805.5)@6.57min。1h nmr(500mhz，二氯甲烷-d2)δ10.25(t,j＝5.1hz,1h),8.46(s,1h),8.34(s,1h),7.45(d,j＝7.9hz,2h),7.33(d,j＝7.9hz,2h),4.29(t,j＝7.3hz,2h),4.13(t,j＝7.4,hz,2h),3.88(s,2h),3.75(q,j＝5.9hz,2h),3.58-3.53(m,8h),3.23(p,j＝6.4hz,1h),2.95(t,j＝6.2hz,2h),2.69-2.66(m,4h),2.50(t,j＝6.8hz,2h),2.47-2.30(m,10h),1.96-1.89(m,4h),1.88-1.80(m,6h),1.79-1.72(m,2h),1.65-1.58(m,2h),1.51-1.42(m,2h)，ch2nhch没有观察到。
[0124]
实施例7：4-(4-(氮杂环庚烷-1-基甲基)苯基)-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮
[0125][0126]
将4-溴-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮(223mg，0.313mmol)和1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苄基)氮杂环庚烷(296mg，0.940mmol)在二噁烷(4ml)中的搅拌混合物用碳酸钾(627μl的2m水溶液，1.253mmol)处理并且脱气。装入s-phos pd g3(7.33mg，9.40μmol)，将混合物再次脱气并且整体加热至80℃。在16小时之后，使混合物冷却，然后用水(10ml)和nahco3饱和水溶液(10ml)稀释并且用dcm(2
×
20ml)萃取。将合并的有机物用na2so4干燥并且蒸发。柱色谱(12g buchi flashpure，在dcm中的30-60％(9:1dcm:在meoh中的1.4m nh3)，加载到dcm中)得到中等纯度的产物。将剩余物通过反相柱色谱(12g reveleris c-18，在水中的75-100％(在meoh中的70mm nh3)，加载到dmso中)纯化，得到产物，为亮红色玻璃状固体(130mg，51％)。
[0127]
lcms：实测值m/z 820.3：(c
47h62
n7o6(mh

)要求820.5)@7.69min。1h nmr(500mhz，二氯甲烷-d2)δ10.25(t,j＝5.1hz,1h),8.47(s,1h),8.34(s,1h),7.47(d,j＝7.8hz,2h),7.33(d,j＝7.8hz,2h),4.29(t,j＝7.4hz,2h),4.14(t,j＝7.3hz,2h),3.82-3.70(m,4h),3.57-3.53(m,8h),2.95(t,j＝6.2hz,2h),2.78-2.61(m,8h),2.50(t,j＝6.8hz,2h),2.47-2.30(m,10h),1.93(p,j＝7.0hz,2h),1.88-1.82(m,6h),1.73-1.68(m,8h)。
[0128]
实施例8：4-溴-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮
[0129][0130]
将4-溴-2,7-双(3-吗啉基丙基)-9-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)苯并[lmn][3,8]菲咯啉-1,3,6,8(2h,7h)-四酮(213mg，0.299mmol)和1-甲基-4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苄基)哌嗪(284mg，0.898mmol)在二噁烷(4ml)中的搅拌混合物用碳酸钾(599μl的2m水溶液，1.197mmol)处理并且脱气。装入s-phos pd g3(7.01mg，8.98μmol)，将混合物再次脱气，并且整体加热至80℃。在16小时之后，使混合物冷却，然后用水(10ml)和nahco3饱和水溶液(10ml)稀释并且用dcm(2
×
20ml)萃取。将合并的有机物用na2so4干燥并且蒸发。柱色谱(12g buchiflashpure，在dcm中的30-60％(9:1dcm:在meoh中的3.5m nh3)，加载到dcm中)得到中等纯度的产物。将剩余物通过反相柱色谱(12g reveleris c-18，在水中的75-100％(在meoh中的70mm nh3)，加载到dmso中)纯化，得到产物，为亮红色玻璃状固体(111mg，45％)。
[0131]
lcms：实测值m/z 821.2：(c
46h61
n8o6(mh

)要求821.5)@6.06min。1h nmr(500mhz，二氯甲烷-d2)δ10.25(t,j＝5.1hz,1h),8.46(s,1h),8.34(s,1h),7.43(d,j＝8.1hz,2h),7.33(d,j＝8.1hz,2h),4.29(t,j＝7.4hz,2h),4.13(t,j＝7.3hz,2h),3.75(q,j＝5.9hz,2h),3.62(s,2h),3.57-3.53(m,8h),2.95(t,j＝6.2hz,2h),2.77-2.20(m,27h),1.94(q,j＝7.1hz,2h),1.89-1.80(m,6h)。
[0132]
生物物理和细胞生物学数据
[0133]
细胞增殖测定
[0134]
celltiteraqueous单溶液细胞增殖测定(invitrogen)是一种用于在增殖或细胞毒性测定中确定活细胞的数量的比色法。celltiteraqueous单溶液试剂含有新型四唑鎓化合物[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2h-四唑鎓，内盐；mts]和电子偶联试剂(吩嗪硫酸乙酯(phenazine ethosulfate)；pes)。pes具有增强的化学稳定性，这使得其可以与mts结合而形成稳定的溶液。mts四唑鎓化合物(owen试剂)被细胞生物还原为可溶于组织培养基的有色甲产物。测定通过如下方式进行：将少量的celltiteraqueous单溶液试剂直接添加到培养孔中，温育1-4小时，然后利用96孔读板仪记录在490nm的吸光度。如通过在490nm的吸光度测量的甲产物的量与培养物中的活细胞的数量直接成正比。试剂盒按照制造商的说明使用。在mia-paca2细胞中与每个实施例化合物温育96小时后，使用mts cell titre 96 aqueous单溶液细胞增殖测定
(promega ltd)来测量每个样品的细胞增殖。
[0135]
相对于dmso处理的对照样品的平均值，计算抑制百分比。
[0136][0137][0138]
表1—用于实施例1至8的胰腺癌细胞系组的细胞生长抑制数据；来自96小时mts测定的ic
50
(nm)值。数据表明，实施例1至8显示出不同的抑制癌细胞生长的能力。特别地，实施例化合物1是该组中活性最高的。
[0139]
体内异种移植功效研究
[0140]
为了研究，将体重大约25-32g的5-7周龄小鼠植入并且购自charles river。胰腺肿瘤细胞植入程序涉及使用22号针将mia-paca2细胞(1
×
107个，在matrigel中)皮下植入到小鼠的后胁(rear flank)上。评价的参数包括：肿瘤大小和动物体重。肿瘤体积每周测量三次，并且体重每周测量至少3次。对于功效研究中的动物，当肿瘤达到大约50mm3时，随机进行到治疗组的分配。将动物(带有mia-paca2肿瘤的雌性无胸腺裸鼠)静脉内(iv)给药，持续28天，每周两次，对于c1的剂量为10mg/kg和15mg/kg，并且对于实施例1的剂量为0.5mg/kg和1.0mg/kg(考虑了其10倍大的细胞效力)。每组包含8只动物。本研究中使用的所有方案均已获得适当的动物福利和伦理审查委员会的批准，并且所有程序均根据uk animal(scientific procedures)act 1986(1986年英国动物(科学程序)法案)的指南进行。结果显示在下表和图1中。
[0141][0142][0143]
表2—实施例1与现有技术化合物c1(参考wo2017/103587a1)相比的基本性质和体外gq结合数据
[0144]
[0145][0146]
表3—实施例1与现有技术化合物c1(参考wo2017/103587a1)相比的胰腺癌细胞系组的细胞生长抑制数据；来自96小时srb测定的ic
50
(nm)值，如在我们先前的出版物和公开内容中详述的。数据表明，实施例1在抑制癌细胞生长的能力方面是显著更有效的化合物，并且其药理学性质至少是相当的。
[0147]
图1中的曲线图示出了在28天静脉内施用、接着是28天测量(由axis bioservices进行)之后，在mia-paca2模型中的异种移植数据。显示的数据是直到第23天n＝8以及到研究结束n＝4的平均值
±
sd。数据表明，即使以每周一次给药的方案，与比较化合物c1或已知的抗癌药物吉西他滨(gemcitabine)相比，实施例1的化合物显著更多地抑制胰腺肿瘤的生长和减小肿瘤的大小。此外，实施例1和给药时间安排是良好耐受的，并未显示出不良影响的迹象。起始肿瘤体积为0.4mm3。实施例1在所检查的两种剂量方案(每周1次和每周2次，两者均为1mg/kg的剂量)中均具有活性。在给药期结束时，在肿瘤体积方面，两者都具有5/8的完全消退。在完全消退队列中，给药后28天之后，肿瘤已完全消失并且未见再生长。c1和实施例1组中的少数肿瘤并未显示出完全消退，但是确实显示出肿瘤生长的减少，从而导致与赋形剂对照组相比一致地更小的体积。
[0148]
xtt测定
[0149]
cyquant xtt细胞活力测定(invitrogen)是一种完整的、优化的测定，其产生存活哺乳动物细胞的一致的比色检测。测定试剂盒由两种试剂组成，即xtt试剂(2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2h-四唑鎓-5-甲酰苯胺)和电子耦合试剂。xtt试剂用于评估作为细胞氧化还原电位的函数的细胞活力，而电子耦合试剂改善测定的动态范围。试剂盒按照制造商的说明使用。
[0150][0151][0152]
表4—实施例1与现有技术化合物c1(参考wo2017/103587a1)以及临床批准的激素前列腺癌治疗剂阿比特龙和恩杂鲁胺相比的前列腺癌细胞系组的细胞生长抑制数据；来自72小时xtt测定的ic50(nm)值。数据表明，当与c1相比时，实施例1的化合物在一组前列腺癌
细胞系中(尤其是在转移性和非雄激素依赖性pc-3系中)具有高活性，并且当与临床上使用的两种药物相比时甚至更是如此。
[0153]
总之，本发明的化合物在大量癌细胞系中显示出抗肿瘤活性。