GAB2小干扰RNA片段及其应用的制作方法

gab2小干扰rna片段及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，更具体地说，涉及一种gab2小干扰rna片段及其应用。


背景技术：

2.在妇科恶性肿瘤中，卵巢癌的发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，位居第三位，但死亡率一直高居女性生殖系统恶性肿瘤首位。由于其解剖位置特殊，深藏于盆腔，发病机制还不完全明了。
3.在卵巢癌进展过程中，某些基因的表达发生变化，是卵巢癌发生发展的关键基因，成为卵巢癌治疗的潜在靶点。人类gab2编码基因定位于11q13.4-q13.5，蛋白分子量为97-100kd，在人体内广泛表达，尤其是在脑、肾、肺、心、睾丸及卵巢中表达量较高。gab2结构主要包括三个部分：n末端的ph结构域，中间富含脯氨酸的prd模序及c端能与sh2结构域结合的多个酪氨酸残基。gab2蛋白作为支架蛋白与多种受体结合，进而参与多种信号转导途径，如pi3k/akt、shp2/erk及jak/stat等，与肿瘤的生物学行为密切相关。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种gab2小干扰rna片段。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述gab2小干扰rna片段作为抗卵巢癌的药物的应用。
5.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种gab2小干扰rna片段，是核酸序列如下的双链rna分子：
7.正义序列：5
′‑
cagcagaggaagugagauutt-3
′
，
8.反义序列：5
′‑
aaucucacuuccucugcugtt-3
′
。
9.所述的gab2小干扰rna片段在制备抗卵巢癌药物中的应用。
10.进一步地，所述的抗卵巢癌药物是降低卵巢癌细胞增殖能力的药物。
11.进一步地，所述的抗卵巢癌药物是抑制卵巢癌细胞增殖或侵袭相关基因表达的药物。
12.进一步地，所述卵巢癌细胞增殖或侵袭相关基因表达的药物为bcl2基因、n-cadherin基因、vimentin基因、twist基因或snail基因。
13.一种抗卵巢癌药物，含有权利要求1所述gab2小干扰rna片段或表达所述gab2小干扰rna片段的载体或表达所述gab2小干扰rna片段的病毒颗粒。
14.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
15.本发明基于卵巢癌细胞具有异常的活力和增殖能力，发明一段小干扰片段gab2针对卵巢癌细胞a2780进行转染，通过免疫印迹明确gab2的表达，证明了小干扰片段可在卵巢癌中发挥功能。进而利用多种功能手段分析其对卵巢癌细胞侵袭、存活和增殖能力的抑制作用。在细胞生物学层面证明了此干扰片段具有显著地促凋、抑制卵巢癌存活和增殖的重
要抑癌功能。本发明为卵巢癌治疗提供了一个新的高效药物，具备很高的临床实际应用价值。
附图说明
16.图1为三组免疫gab2小干扰片段转染卵巢癌细胞的免疫印迹实验结果图；
17.图2为cck8实验结果图；
18.图3为transwelll迁移实验结果图；
19.图4为细胞emt和增殖相关基因的表达免疫印迹实验结果图。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
21.实施例1：gab2小干扰片段的构建及其鉴定
22.本发明针对gab2基因设计及合成的小干扰片段序列及阴性对照序列如下：
23.小干扰rna1：
[0024]5′‑
ggaacgagcaggugauaautt-3
′
，
[0025]5′‑
auuaucaccugcucguucctt-3
′
；
[0026]
小干扰rna2：
[0027]5′‑
ggacauucacucuggacaatt-3
′
，
[0028]5′‑
uuguccagagugaaugucctt-3
′
；
[0029]
小干扰rna3：
[0030]5′‑
cagcagaggaagugagauutt-3
′
，
[0031]5′‑
aaucucacuuccucugcugtt-3
′
；
[0032]
阴性对照：
[0033]5′‑
uucuccgaacgugucacgutt-3
′
，
[0034]5′‑
acgugacacguucggagaatt-3
′
。
[0035]
将上述小干扰片段转染到a2780卵巢癌细胞中，转染方法如下：
[0036]
(1)将卵巢癌细胞预先种在6孔板中，待细胞长到70％左右；
[0037]
(2)将细胞完全培养基换成不含血清的基础培养基；
[0038]
(3)在提前准备好的1.5ml离心管中，将500nm小干扰rna和4μl lipofectamine 2000脂质体分别加入到50μl opti-mem基础培养基中孵育5min，然后将它们混匀一起孵育20分钟后，加入细胞中进行无血清培养，放入co2培养箱；
[0039]
(4)6h后换成含有血清的完全培养基；
[0040]
(5)培养48h后，收集细胞并利用免疫印迹检测gab2的表达。如图1所示，小干扰rna3组与对照组和小干扰rna1，小干扰rna2组比差异极显著，为此，后续试验均用小干扰rna3组。
[0041]
免疫印迹方法如下：
[0042]
(1)蛋白的提取：将细胞用pbs洗1-2次后用0.25％胰酶消化并将细胞收集到1.5ml的离心管中，1000转离心弃上清，然后加入含1nmpmsf的蛋白裂解液后置冰上震荡20min待蛋白充分裂解，4℃以12,000
×
g的转速离心20min，取上清液至新的1.5ml的离心管中；
[0043]
(2)蛋白浓度的测定：用bca蛋白浓度测定试剂盒检测并计算蛋白的浓度，加入5
×
loading和1
×
loading备好待检测的蛋白；
[0044]
(3)实验相关试剂制备：
[0045]1×
电泳缓冲液：tris 3.03g甘氨酸18.8g sds 1.0g ddh2o 1l
[0046]1×
转膜缓冲液：tris 3.03g甘氨酸14.4g甲醇200ml ddh2o 1l
[0047]
tbst：tris2.6g氯化钠8.0g吐温-202ml ddh2o 1l
[0048]
封闭液：2.5g脱脂奶粉100ml tbst
[0049]
以上溶液配制时，需将各组分混合均匀，尽快使用。
[0050]
(4)sds-page凝胶的配置：清洗玻璃板，夹好配胶装置，首先验漏，
[0051]
根据目的分子量的大小，选取合适的下层胶浓度并且用异丙醇压胶防止下层胶的倾斜，待下层胶凝固后将异丙醇倒掉用纸吸干残余的异丙醇，配置上层胶，根据样本量的多少选取合适的梳子并插好；
[0052]
(5)上样：在样本的一边加好蛋白marker，接上电源，先用80v的电压，待样本跑至上下层胶的交界处后换成120v的电压；
[0053]
(6)转膜：待样本跑至合适的位置后转印在提前用甲醇激活的pvdf膜上，注意正负极，放置冰上，以300ma，2小时的电流转印；
[0054]
(7)封闭：将pvdf膜浸泡在提前用tbst配置5％的脱脂牛奶中2h；
[0055]
(8)孵育一抗：将pvdf膜的正面孵育在用5％的脱脂牛奶稀释的抗体中，4℃过夜；
[0056]
(9)孵育二抗：次日，将pvdf膜用tbst洗3次，每次5min，后室温孵育二抗2h；
[0057]
(10)显影：将pvdf膜用tbst洗3次，每次15min后准备显影，将ecl显影液均匀的覆盖在膜上获得影像资料。
[0058]
实施例2：细胞学实验对gab2小干扰片段rna3抑制卵巢癌增殖功能的检测
[0059]
1：cck8实验证明小干扰片段细胞水平的抗肿瘤效应
[0060]
预先将卵巢癌细胞以2000个/孔的密度接种于96孔培养板，利用转染试剂将gab2小干扰片段和对照瞬时转染a2780细胞，分别在0，24，48和72小时弃去完全培养基，将rpim1640基础培养基与cck-8kit试剂按照9∶1的比例混合摇匀加至待测孔内，将待测96孔板放置co2培养箱内避光孵育2小时后至酶联免疫检测仪上按照波长450nm的标准读取吸光度值，记录结果。吸收值大小反映了细胞活性，根据实验数据，以时间为横坐标，吸收值为纵坐标作图。每个实验组设置3个复孔，实验重复3次。如图2所示，cck-8kit结果显示与对照组相比，小干扰实验组显著抑制了a2780细胞的增殖。
[0061]
2：transwelll迁移实验证明小干扰片段细胞水平的抗肿瘤效应
[0062]
将转染小干扰rna的卵巢癌细胞a2780，利用无血清的细胞培养液稀释细胞至100μl，加入到上室中，将含有10％血清的培养基600μl加入到下室中，放入37度培养箱中进行培养48小时，诱导细胞穿到下室。取出，将上室和下室的多余的液体吸出，并用pbs清洗上室(200μl)，下室(600μl)，清洗两遍。用4％多聚甲醛固定15分钟，用0.5％结晶紫染料进行染色20分钟，用pbs清洗小室3遍，清洗干净后进行拍照。结果如图3所示，gab2干扰组的细胞迁移效能力明显低于对照组。
[0063]
3：细胞emt和增殖相关基因的表达
[0064]
将小干扰rna3片段转染到a2780卵巢癌细胞中，转染方法如下：
[0065]
(1)将卵巢癌细胞预先种在6孔板中，待细胞长到70％左右；
[0066]
(2)将细胞完全培养基换成不含血清的基础培养基；
[0067]
(3)在提前准备好的1.5ml离心管中，将500nm小干扰rna3和4μl lipofectamine 2000脂质体分别加入到50μl opti-mem基础培养基中孵育5min，然后将它们混匀一起孵育20分钟后，加入细胞中进行无血清培养，放入co2培养箱；
[0068]
(4)6h后换成含有血清的完全培养基，培养细胞48h。
[0069]
免疫印迹方法如下：
[0070]
(1)蛋白的提取：将细胞用pbs洗1-2次后用0.25％胰酶消化并将细胞收集到1.5ml的离心管中，1000转离心弃上清，然后加入含1nmpmsf的蛋白裂解液后置冰上震荡20min待蛋白充分裂解，4℃以12,000
×
g的转速离心20min，取上清液至新的1.5ml的离心管中；
[0071]
(2)蛋白浓度的测定：用bca蛋白浓度测定试剂盒检测并计算蛋白的浓度，加入5
×
loading和1
×
loading备好待检测的蛋白；
[0072]
(3)实验相关试剂制备：
[0073]1×
电泳缓冲液：tris 3.03g甘氨酸18.8g sds 1.0g ddh2o 1l
[0074]1×
转膜缓冲液：tris 3.03g甘氨酸14.4g甲醇200ml ddh2o 1l
[0075]
tbst：tris2.6g氯化钠8.0g吐温-202ml ddh2o 1l
[0076]
封闭液：2.5g脱脂奶粉100ml tbst
[0077]
以上溶液配制时，需将各组分混合均匀，尽快使用。
[0078]
(4)sds-page凝胶的配置：清洗玻璃板，夹好配胶装置，首先验漏，
[0079]
根据目的分子量的大小，选取合适的下层胶浓度并且用异丙醇压胶防止下层胶的倾斜，待下层胶凝固后将异丙醇倒掉用纸吸干残余的异丙醇，配置上层胶，根据样本量的多少选取合适的梳子并插好；
[0080]
(5)上样：在样本的一边加好蛋白marker，接上电源，先用80v的电压，待样本跑至上下层胶的交界处后换成120v的电压；
[0081]
(6)转膜：待样本跑至合适的位置后转印在提前用甲醇激活的pvdf膜上，注意正负极，放置冰上，以300ma，2小时的电流转印；
[0082]
(7)封闭：将pvdf膜浸泡在提前用tbst配置5％的脱脂牛奶中2h；
[0083]
(8)孵育一抗：将pvdf膜的正面孵育在用5％的脱脂牛奶稀释的抗体中，4℃过夜；
[0084]
(9)孵育二抗：次日，将pvdf膜用tbst洗3次，每次5min，后室温孵育二抗2h；
[0085]
(10)显影：将pvdf膜用tbst洗3次，每次15min后准备显影，将ecl显影液均匀的覆盖在膜上获得影像资料。
[0086]
结果如图4所示，gab2干扰组中细胞emt和增殖相关基因bcl2基因、n-cadherin、vimentin、twist和snail的表达水平明显降低。