黄柏酮在制备治疗常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用的制作方法

1.本发明提供了黄柏酮在制备治疗常染色体显性遗传性多囊肾病的药物应用，属于生物医药领域。


背景技术：

2.黄柏酮(obacunone)是一种存在于芸香科植物黄柏树皮以及柑橘类水果中的一种天然化合物，已被证明具有多种生物活性，包括抗氧化应激、抗炎和抗癌活性。历史研究表明，黄柏酮是一种良好的核因子e2相关因子2(nrf2)激动剂，可以通过激活nrf2来抑制氧化应激，从而抑制肝纤维化、糖尿病肾病等氧化应激相关疾病的发生和发展。此外，黄柏酮在结肠癌小鼠模型展现出良好的抗炎作用，且对caco2、sw480、hct-116、ht-29等多种结肠癌细胞系的异常增殖也具有显著的抑制作用。黄柏酮的化学结构如下：
[0003][0004]
常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，简称adpkd)是一种常见的严重威胁人类健康和生命的单基因遗传性肾病，发病率在4/10000～1/1000之间，目前它已经成为终末期肾病的第四大病因。adpkd主要表现为双肾进行性发展的多发性囊泡，囊泡会压迫肾实质，导致正常肾单位缺失。肾脏功能会随着疾病的进展逐渐丧失，约50％患者在60岁时会发展为终末期肾病(end stage renal disease，简称esrd)。adpkd的主要治疗方式是对症治疗、血液透析或肾移植，为患者和社会带来巨大的负担。
[0005]
截至目前，临床上仅有托伐普坦(tolvaptan)被批准上市用于adpkd的治疗。托伐普坦是一种血管紧张素ⅱ型受体(v2r)阻断剂，其可有效降低细胞内camp水平来下调pka信号通路，从而抑制囊泡的发展。但是随着研究的深入，托伐普坦存在的缺陷逐渐暴露。一方面，托伐普坦对囊泡的抑制作用仅局限于集合管，而对近曲小管来源的囊泡抑制作用较弱；另一方面，托伐普坦存在较多的副作用如多尿、肝毒性等，使得其在临床上的应用受限。因此，根据adpkd的发病机制，筛选毒性低、药效强的adpkd囊泡抑制剂，研发治疗adpkd的新型药物，目前仍是该领域的研究热点。


技术实现要素：

[0006]
发明目的：针对现有技术中的缺陷，本发明提供了黄柏酮在制备治疗常染色体显
性遗传性多囊肾病药物中的应用。
[0007]
技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0008]
黄柏酮在制备治疗常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。
[0009]
所述黄柏酮在制备治疗pkd1基因敲除引发的常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。
[0010]
所述黄柏酮在制备抑制mdck囊泡和胚胎肾囊泡形成及生长的药物中的应用。
[0011]
所述黄柏酮在制备抑制肾脏囊泡生成和/或生长的药物中的应用。
[0012]
所述黄柏酮在制备激活囊泡上皮细胞nrf2、抑制增殖信号通路药物中的应用。
[0013]
以上应用，在体pkd小鼠给药剂量为100mg/kg/d；离体实验剂量为3.125μm～50μm，优选剂量为12.5μm。
[0014]
本发明还提供了一种用于治疗常染色体显性遗传性多囊肾病的组合物，所述组合物中包括黄柏酮或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的辅料，例如载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂等。
[0015]
本发明最后提供了包含黄柏酮的组合物在制备治疗常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。
[0016]
优选的，所述常染色体显性遗传性多囊肾病为pkd1基因敲除引发的常染色体显性遗传性多囊肾病。
[0017]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
[0018]
本发明应用mdck囊泡模型从细胞水平证明黄柏酮能够抑制囊泡的形成和生长，应用胚胎肾囊泡模型从器官水平证明黄柏酮的肾内药理学活性，可以在不影响肾脏正常发育的情况下显著抑制囊泡的生长。最后在pkd1基因敲除的多囊肾小鼠模型中进一步证明，黄柏酮在小鼠体内可以有效抑制肾脏囊泡的发生和生长。
[0019]
本发明还表明黄柏酮无细胞毒性，对肾脏细胞活力没有显著影响，即黄柏酮抑制囊泡的作用与细胞毒性无关；同时，黄柏酮激活肾脏细胞内nrf2、抑制增殖相关信号通路，是其抑制肾脏囊泡发生、生长的重要机制之一。
[0020]
以上结果表明：黄柏酮可以用于治疗常染色体显性遗传性多囊肾病。
附图说明
[0021]
图1为mdck细胞集落与囊泡示意图。
[0022]
图2为黄柏酮抑制mdck囊泡形成和生长的统计图及mdck囊泡的生长图；其中，上图为黄柏酮对囊泡生长的抑制图，下图为黄柏酮抑制mdck囊泡形成和生长的统计图。
[0023]
图3为小鼠胚胎肾囊泡模型示意图。
[0024]
图4为黄柏酮对小鼠胚胎肾囊泡生长抑制作用的生长图及统计图；其中，上图为黄柏酮对囊泡生长的抑制图，下图为黄柏酮抑制小鼠胚胎肾囊泡生长的统计图。
[0025]
图5为pkd1
flox/flox
；ksp-cre小鼠模型给药后小鼠肾脏照片及肾重指数统计图；其中，上图为pkd1
flox/flox
；ksp-cre小鼠模型给药后小鼠肾脏照片，下图为肾重指数统计图。
[0026]
图6为pkd1
flox/flox
；ksp-cre小鼠模型给药后肾脏组织切片he染色图及肾脏的囊性指数图。
[0027]
图7为黄柏酮对mdck细胞活力的影响示意图。
[0028]
图8为黄柏酮促进pkd1
flox/flox
；ksp-cre小鼠肾脏细胞中nrf2激活入核表达情况的western blot图。
[0029]
图9为黄柏酮对pkd1
flox/flox
；ksp-cre小鼠肾脏mapk、mtor信号通路以及pcna蛋白抑制作用的western blot图；其中上图为黄柏酮抑制pkd1
flox/flox
；ksp-cre小鼠肾脏细胞中mapk信号通路的western blot图，中图为黄柏酮抑制pkd1
flox/flox
；ksp-cre小鼠肾脏细胞中mtor信号通路的western blot图，下图为黄柏酮抑制pkd1
flox/flox
；ksp-cre小鼠肾脏细胞中pcna蛋白的western blot图。
具体实施方式
[0030]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下面描述的实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂、仪器等，若无特殊说明，均可从商业途径得到；所用的定量实验，均设置三次重复，结果取平均值。
[0031]
下述实例中的犬肾集合管上皮细胞(madin-darby canine kidney cells,mdck)从atcc细胞库中购得，编号为ccl-34。其中mdck囊泡和胚胎肾囊泡实验分别采用三个剂量3.125μm、12.5μm和50μm的黄柏酮。细胞毒性实验所用剂量为0.78125μm、3.125μm、12.5μm、50μm、200μm。
[0032]
实施例1黄柏酮对囊泡生长的抑制
[0033]
体外在三维基质胶(purecol collagen,inamed biomaterials fremont公司，货号5409)中培养mdck细胞。如图1，培养液a为在10xmem培养液中添加三维基质胶混合物，其中三维基质胶浓度为2.9mg/ml、hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)浓度为10mm、青霉素浓度为100u/ml、链霉素浓度为100μg/ml，ph为7.4。培养液b为含有fbs和毛喉素(forskolin，sigma公司，货号f6886)的dmem/f12培养液。其中fbs浓度为10％、毛喉素浓度为10μm。dmem/f12培养液为由dmem培养基(美国invitrogen公司，商品目录号12100-046)和f12培养基(美国invitrogen公司，商品目录号21700-075)等体积混合得到的液体。
[0034]
将mdck细胞混匀于400μl的培养液a中，加入24孔板的孔中，每孔细胞数相同，为800个/孔。将24孔板置于37℃、5％co2细胞培养箱中约90分钟，待三维基质胶凝固后，向每孔加入1.5ml培养液b，置于培养箱中培养，培养4天左右即可在显微镜下观察到单层上皮细胞包被的囊泡。此时在细胞培养孔中加入终浓度分别为3.125μm、12.5μm和50μm的黄柏酮继续培养，每个剂量重复3个孔。每12小时更换新鲜的含有黄柏酮和10μm毛喉素的培养液，每两天拍照记录每孔至少20个囊泡直径以评价不同浓度的黄柏酮对囊泡生长的抑制作用，共观察8天，培养12天时停止，作囊泡生长曲线。黄柏酮抑制囊泡形成实验中，待三维基质胶凝固后，向每孔加入1.5ml含有10μm毛喉素的培养液，其中黄柏酮浓度分别为3.125μm、12.5μm和50μm，每个剂量重复3个孔。每12小时更换新鲜的含有黄柏酮和10μm毛喉素的培养液，培养至第6天时，统计每孔囊泡数目，统计囊泡形成率。
[0035]
黄柏酮对囊泡形成和生长的抑制作用结果如图2所示。
[0036]
上图为黄柏酮抑制mdck囊泡作用的生长图：对照组为不加黄柏酮的处理组。其中，第一排表示第5～12天用仅含10μm毛喉素的培养液培养，第二、三、四排表示第5～12天用分别含有3.125μm、12.5μm、50μm的黄柏酮和10μm毛喉素的培养液培养，第五排表示第5～7天
用含有50μm的黄柏酮和10μm毛喉素的培养液培养，第八天开始换用仅含有10μm毛喉素的培养液培养。可以看出，黄柏酮可以显著抑制囊泡的生长，且该抑制作用在去除黄柏酮刺激后是可逆的。
[0037]
下图左边为黄柏酮对囊泡形成抑制作用的统计图，右边为黄柏酮对囊泡生长抑制作用的曲线图：实心圆实线代表第5～12天用只含有10μm毛喉素的培养液培养，实心方块实线、实心正三角实线、实心倒三角实线分别代表第5～12天用含有3.125μm、12.5μm、50μm的黄柏酮加10μm毛喉素的培养液培养，实心圆虚线代表第5～7天用含有50μm的黄柏酮和10μm毛喉素的培养液培养，第八天开始换用仅含有10μm毛喉素的培养液培养。
[0038]
实施例2黄柏酮对小鼠胚胎肾囊泡生长的抑制
[0039]
将8周龄以上的icr小鼠(北京大学医学部实验动物中心)按照1∶1的数量进行雌雄同笼交配，第2天早上观察雌鼠是否有阴栓，若有阴栓则表示雌鼠已怀孕0.5天；若无阴栓，则先分笼，晚上再合笼，第二日再观察。将怀孕雌鼠继续单独喂养13天，第13天取胚胎肾。如图3，将胚胎肾置于transwell板(corning公司，货号3493)的上层小室中培养。下层培养孔中加入含有终浓度为100μm的8-br-camp(sigma公司，货号b-5386)的dmem/f12培养液进行培养，在8-br-camp的作用下，肾组织内会形成进行性生长的多发性囊泡，可以作为评价黄柏酮治疗adpkd的体外整体器官水平筛药模型。
[0040]
黄柏酮抑制小鼠胚胎肾囊泡作用结果见图4。
[0041]
其中，上图为黄柏酮抑制小鼠胚胎肾囊泡作用的生长图，第一列为胚胎肾在不含有8-br-camp的培养液中持续培养到第6天，第二列为胚胎肾在加入100μm 8-br-camp的培养液中持续培养到第6天，第三、四、五列为胚胎肾在含有100μm 8-br-camp的培养液的基础上，加入终浓度为3.125μm、12.5μm、50μm的黄柏酮进行培养，培养至第6天，每12h更换新鲜的相应的培养液。第六列为胚胎肾在100μm 8-br-camp刺激的基础上，在培养液中加入50μm的黄柏酮进行处理，培养至第4天，第5～6天在仅含有8-br-camp的培养液中培养，每天跟踪拍照记录肾脏的状况，实验重复三次。下图统计图表示不同剂量的黄柏酮对小鼠胚胎肾囊泡的抑制作用以及黄柏酮对胚胎肾囊泡抑制作用的可逆性。
[0042]
结果发现，黄柏酮明显抑制了胚胎肾囊泡的发展，并且其对胚胎肾囊泡的抑制作用呈剂量依赖关系。当第5～6天药物被去除后，囊泡又重新恢复生长。
[0043]
实施例3体内实验
[0044]
所用小鼠按照如下方法得到：将pkd1
flox/flox
小鼠和ksp-cre小鼠交配得到子一代pkd1
/-；ksp-cre小鼠，将pkd1
/-；ksp-cre小鼠的公鼠和母鼠交配，得到野生型小鼠pkd1
/
；ksp-cre和pkd1
flox/flox
；ksp-cre小鼠(kpkd小鼠)。其中，pkd1
flox/flox
小鼠和ksp-cre小鼠的遗传背景均为c57bl/6小鼠，见文献(wang w,li f,sun y,et al.aquaporin-1 retards renal cyst development in polycystic kidney disease by inhibition of wnt signaling.faseb j.2015；29(4):1551-1563.)。pkd1
flox/flox
小鼠为在c57bl/6小鼠背景下全肾特异性敲除pkd1基因的小鼠，其出生后即发生快速进行性发展的adpkd，在出生后第一天即可观察到肾脏囊泡，可存活10天左右。在小鼠出生后第一天进行基因鉴定，确定小鼠的基因型。pkd1
flox/flox
小鼠对应的野生型c57bl/6小鼠记为pkd1
/
小鼠。
[0045]
将野生型小鼠(pkd1
/
；ksp-cre)和kpkd小鼠(pkd1
flox/flox
；ksp-cre)均随机分为两组，空白对照组(ctrl)(空溶剂组，即注射含0.1％dmso的生理盐水)及给药组(oba)(小鼠
每千克体重每天给药剂量为100mg的黄柏酮)，每组小鼠6只。每只小鼠从出生后第1天开始，每24小时使用胰岛素注射器皮下注射给药，空白对照组(ctrl)每只小鼠每次注射25μl/g的含0.1％dmso的生理盐水，给药组(oba)每只小鼠每次注射25μl/g的黄柏酮溶液(黄柏酮浓度为4mg/ml，调节ph至7.0)，持续给药至出生后第5天。称重，处死，取组织。
[0046]
小鼠的肾脏大小及体重如图5，上图为pkd1
flox/flox
；ksp-cre小鼠模型给药后小鼠的肾脏照片，从肾脏大小来看，出生后第5天，基因敲除pkd小鼠中，肾脏明显有充液囊泡，体积变大，给予黄柏酮治疗以后，肾脏体积明显变小。而黄柏酮在此剂量对正常肾脏大小无明显影响。黄柏酮治疗显著降低了多囊肾小鼠的肾重指数(双侧肾重/体重)(图5下图)。小鼠肾脏切片h&e染色的结果显示，在pkd小鼠中，小鼠肾脏中有大量囊泡，给予黄柏酮后，小鼠肾脏囊泡明显减少变小，肾脏组织结构改善(图6)。
[0047]
实施例4细胞毒性实验
[0048]
通过cck-8法确定黄柏酮的细胞毒性
[0049]
将对数期的犬肾集合管上皮细胞(madin-darby canine kidney cells,mdck)悬液接种于96孔培养板中，每孔含有1
×
104个细胞，每孔给予100μl含有10％胎牛血清(fbs，荷兰gibco fisher scientific公司)的dmem培养基(美国invitrogen公司,商品目录号12100-046)，置于37℃的5％co2培养箱中培养24小时。去除培养液，加上无fbs的dmem培养液，血清饥饿24小时后，向细胞培养孔(给药孔)中加入含有不同浓度的黄柏酮的dmem培养液，每孔加入的体积均为100ul，黄柏酮的浓度分别为0.78125μm、3.125μm、12.5μm、50μm、200μm。每个浓度有5个重复孔，培养24小时后除去上清液，每孔加入80μl不含有血清的dmem培养液及20μl的5mg/ml的cck8溶液，置于培养箱中继续培养1.5小时，然后将96孔板置于酶标仪中，检测各孔od值(检测波长490nm)。实验设置调零孔(含有等量的培养基、cck-8和dmso，不含有黄柏酮，无细胞)和对照孔(含有等量的细胞、培养基、cck-8和dmso，不含有黄柏酮，即黄柏酮为0μm的给药孔)。按照下述公式计算细胞活力，细胞活力＝(给药孔-调零孔)/(对照孔-调零孔)
×
100％。实验重复3次。
[0050]
图7为黄柏酮对mdck细胞的细胞毒性实验结果图，结果显示:50μm及以下的黄柏酮给药组与对照组的od值之间无明显差异,不抑制mdck细胞的细胞活力，对mdck细胞无毒性作用，说明黄柏酮在有效剂量50μm及以下浓度抑制囊泡生长的作用与其细胞毒性无关。
[0051]
实施例5 western blot实验
[0052]
实验方法：分别取kpkd、wt对照及给黄柏酮注射小鼠全肾组织，提取蛋白，用western blot研究黄柏酮对肾脏nrf2信号通路、增殖信号通路表达水平的影响。
[0053]
western blot方法:用ripa裂解液处理肾脏组织，收取蛋白，用bca法进行蛋白定量。调整样品的蛋白量进行sds-page，将电泳分离的蛋白转移到pvdf膜上。tbst洗膜3次，每次5min。室温下用5％脱脂奶粉(tbst溶解)封闭pvdf膜2h。随后加入抗nrf2和增殖等信号分子抗体，4℃孵育过夜。第二天tbst洗脱3次，每次5分钟，加入相应的二抗，室温孵育1h，tbst漂洗3次。将pvdf膜用发光试剂ecl显色，bio-rad凝胶成像胶采集图像，用imagej对图像进行灰度分析。上述实验均重复3次。
[0054]
实验结果：图8为黄柏酮对小鼠肾脏nrf2信号的影响示意图，图9为黄柏酮对小鼠肾脏增殖信号的影响示意图，结果表明：黄柏酮可以明显激活肾脏中的nrf2并抑制肾脏增殖信号分子的表达水平，包括erk1/2、s6、pcna等。
[0055]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。