一种基于外泌体内核酸检测的前列腺癌早期筛查的标志物、检测方法和试剂盒与流程

1.本发明涉及诊断试剂技术领域，尤其涉及一种基于外泌体内核酸检测的前列腺癌早期筛查的标志物、检测方法和试剂盒。


背景技术：

2.当前前列腺癌筛查主要通过血清中psa含量测定。而psa是组织特异性抗原而非癌症特异性抗原，其他泌尿生殖系疾病如良性前列腺增生、慢性前列腺炎等均可引起psa水平升高。导致了psa筛查前列腺癌的假阳性率较高，造成大量不必要的前列腺穿刺活检。
3.细胞外囊泡(extracellular vesicles,ev)根据形成方式不同分为外泌体(exosome)和微囊泡(ectosome),外泌体整体小于微囊泡，并与微囊泡含有不同的分子标志物。研究表明尿液中含有来源于前列腺肿瘤细胞的外泌体，并且这些外泌体中含有与肿瘤细胞中相近的表达谱。这些特定基因的表达变化可以反映受检者肿瘤的癌变程度，通过检测这些基因的表达量可以很好的预测受检者患癌风险，提前介入治疗或避免过度治疗，提高患者生存率的同时降低医疗资源浪费。
4.现有尿液外泌体核酸检测技术常基于peg沉淀和/或超滤膜过滤法，提取外泌体rna后使用荧光qpcr技术进行相对定量。当检测前列腺肿瘤来源外泌体时通常需要指检或前列腺按摩的方式增加尿液中外泌体含量，这极大降低了受检者的依从性，并且不利于居家环境的样本收集。但是若不经指检或前列腺按摩的方式，前列腺肿瘤来源的外泌体较少，普通荧光qpcr检测易出现假阴性情况，造成检测失败或假阴性问题。因此，现有的前列腺癌筛查方法还需进一步改进。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于外泌体内核酸检测的前列腺癌早期筛查的标志物、检测方法和试剂盒，以提高前列腺癌早期筛查的准确性。
6.为达到上述技术效果，本发明采用了以下技术方案：
7.第一方面，本发明提供的一种基于外泌体内核酸检测的前列腺癌早期筛查的标志物，包括pca3基因、erg基因、hoxc6基因、klk3基因。
8.同时，本发明还提供一种基于外泌体内核酸检测的前列腺癌早期筛查的标志物在前列腺癌诊断试剂中的应用，具体地，所述前列腺癌诊断包括前列腺癌的筛查、受试者发生前列腺癌的风险评估、前列腺癌的分型和/或预后预测。
9.第二发明，本发明提供一种基于外泌体内核酸检测的前列腺癌早期筛查的标志物的检测试剂盒，其特征在于：包括用于检测pca3基因的第一组合物、用于检测erg基因的第二组合物、用于检测hoxc6基因的第三组合物以及用于检测klk3基因的第四组合物。
10.具体地，所述第一组合物包括第一特异性引物和第一特异性探针，所述第一特异性引物和第一特异性探针的序列如下：
11.seq id no.1f:ttacccctggatgcagcgaatgaa；
12.seq id no.1r:gccgcgttaggtagcgattgaagtg；
13.seq id no.1p：fam-ccgctccgtagccgaccccact-bhq1；
14.所述第二组合物包括第二特异性引物和第二特异性探针，所述第二特异性引物和第二特异性探针的序列如下：
15.seq id no.2f:atttccagcccctttaaatatccac；
16.seq id no.2r:aacacatcaattcattttctaatgtcct；
17.seq id no.2p：vic-cctgtgcctggtcccgcttgtga-bhq1；
18.所述第三组合物包括第三特异性引物和第三特异性探针，所述第三特异性引物和第三特异性探针的序列如下：
19.seq id no.3f:tcgaaagctgctcaaccatct；
20.seq id no.3r:gaggaactgccaaagctggatctg；
21.seq id no.3p：fam-acgctggtcttcagttttgggcact-bhq1；
22.所述第四组合物包括第四特异性引物和第四特异性探针，所述第四特异性引物和第四特异性探针的序列如下：
23.seq id no.4f:tcatggacctgcccacccag；
24.seq id no.4r:acacgtcattggaaataacatggagg；
25.seq id no.3p：fam-acgctggtcttcagttttgggcact-bhq1。
26.进一步地，所述所述检测试剂盒还包括总外泌体提取试剂、逆转录试剂中的至少一种。
27.第三方面，本发明提供一种基于外泌体内核酸检测的前列腺癌早期筛查的标志物的检测方法，该方法通过采用上述检测试剂盒对外泌体中的pca3基因、erg基因、hoxc6基因、klk3基因表达量进行检测。
28.进一步地，上述检测方法具体包括以下检测步骤：
29.s1：采集受检者初尿段尿液，无需指检或前列腺按摩；
30.s2：富集尿液中外泌体并提取外泌体内总rna；
31.s3：利用试剂盒检测pca3基因、erg基因、hoxc6基因、klk3基因的表达量；
32.s4：根据pca3基因、erg基因、hoxc6基因与klk3基因的相对表达量评估前列腺癌风险。
33.进一步地，所述s2中的富集方法为：利用阳离子聚合物及二氧化钛磁珠富集尿液中外泌体。
34.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供一种试剂盒以及采用该试剂盒对前列腺癌进行早期筛查的方法，具体提供一种通过分离受检者尿液中的外泌体，提取rna后进行数字pcr检测特定的基因的引物、方法及试剂盒，该检测方法，检测方法简单、准确度较高、检出度高，且取样简单，受试者痛苦较小。
附图说明
35.图1为本发明一实施例提供的前列腺癌患者检测结果，图1a为pca3,erg检测结果，1b为hoxc6，klk3检测结果；
36.图2为本发明一实施例提供的健康人检测结果，2a为pca3,erg检测结果，2a为hoxc6，klk3检测结果；
具体实施方式
37.下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
38.实施例1
39.本实施例提供一种前列腺癌早期筛查的标志物的检测试剂盒，其中包括用于检测pca3基因的第一组合物、用于检测erg基因的第二组合物、用于检测hoxc6基因的第三组合物以及用于检测klk3基因的第四组合物，其中：
40.该第一组合物包括第一特异性引物和第一特异性探针，所述第一特异性引物和第一特异性探针的序列如下：
41.seq id no.1f:ttacccctggatgcagcgaatgaa；
42.seq id no.1r:gccgcgttaggtagcgattgaagtg；
43.seq id no.1p：fam-ccgctccgtagccgaccccact-bhq1。
44.该第二组合物包括第二特异性引物和第二特异性探针，所述第二特异性引物和第二特异性探针的序列如下：
45.seq id no.2f:atttccagcccctttaaatatccac；
46.seq id no.2r:aacacatcaattcattttctaatgtcct；
47.seq id no.2p：vic-cctgtgcctggtcccgcttgtga-bhq1。
48.该第三组合物包括第三特异性引物和第三特异性探针，所述第三特异性引物和第三特异性探针的序列如下：
49.seq id no.3f:tcgaaagctgctcaaccatct；
50.seq id no.3r:gaggaactgccaaagctggatctg；
51.seq id no.3p：fam-acgctggtcttcagttttgggcact-bhq1。
52.该第四组合物包括第四特异性引物和第四特异性探针，所述第四特异性引物和第四特异性探针的序列如下：
53.seq id no.4f:tcatggacctgcccacccag；
54.seq id no.4r:acacgtcattggaaataacatggagg；
55.seq id no.3p：fam-acgctggtcttcagttttgggcact-bhq1。
56.实施例2
57.本实施例提供一种采用实施例1提供的检测试剂盒对人外泌体中pca3基因、erg基因、hoxc6基因、klk3基因的表达量进行检测的方法，具体操作如下：
58.s1：采集受检者＞40ml初尿段尿液,4℃预冷保存2h以上但不超过72h；
59.s2：富集尿液中外泌体并提取外泌体内总rna，具体为：
60.取40ml尿液加入多聚赖氨酸，使其终浓度为0.5mg/ml；孵育30min；0.22μm滤膜过滤孵育后尿液，并用2ml 2m异硫氰酸胍漂洗滤膜，之后用2ml 5m异硫氰酸胍洗脱滤膜上外泌体，收集2ml洗脱液；加入包被tio2磁珠，室温振荡孵育10min，放置磁力架上，吸附磁珠，
去除上清液，加入1ml pbs漂洗，移除pbs后加入100μl 10％氨水重悬磁珠，回收上清液，即为分离后外泌体；
61.利用细胞总rna提取试剂盒(qiagen cat：74004)提取外泌体内rna；
62.s3：利用试剂盒检测pca3基因、erg基因、hoxc6基因、klk3基因的表达量，具体为：
63.取10μl提取后rna与引物、探针及ddpcr试剂(新羿生物，cat：23303)配置体系，进行自动化微滴生成。每次检测分为2个体系进行，其中体系1引物及探针组合为pca3和erg；体系2引物及探针组合为hoxc6及klk3；每种引物终浓度200nm，探针50nm。体系如下：
[0064][0065]
生成液滴后，进行反转及扩增反应，反应条件如下：
[0066][0067]
将扩增好体系加入到芯片扫描仪中进行自动检测，根据pca3、erg、hoxc6阳性液滴数与klk3阳性液滴数比值，可对前列腺癌风险进行评估。
[0068]
实施例3
[0069]
本实施例采用实施例1提供的一种检测试剂盒分别对前列腺癌患者和健康人外泌体中pca3基因、erg基因、hoxc6基因、klk3基因的表达量进行检测，检测结果如附图1-2所示。
[0070]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。