一种牡丹花蕊蛋白粉的制备方法与流程

1.本发明涉及一种牡丹花蕊蛋白粉的制备方法，具体属于食品加工技术领域。


背景技术：

2.牡丹鲜花色泽艳丽，素有“花中之王”的美誉，我国自古就有食用牡丹花的习惯，现已形成多种地方特色名吃，2013年丹凤牡丹被国家卫生部列为一种新资源食品原材料，被众多研究者开发与利用。牡丹花蕊是牡丹之精华，碳水化合物和蛋白质含量高、脂肪酸构成较健康，能降低人体血压，具有较好的抗氧化效果，对人体生理代谢以及膳食结构的调节具有重要作用。牡丹花蕊作为药食同源的植物种子原料，蛋白质含量占干重的23.74％，氨基酸组成合理，其中必需氨基酸占比为38.26％，是优质的蛋白质资源。蛋白的溶解性和乳化性是非常重要的功能性质，可作为乳化剂在食品加工中得到应用，如在面包、蛋糕类食品中作为品质改良剂，防止面团老化、回生，促进起酥油的乳化、分散，改善组织和口感；在鱼肉糜、香肠等食品中使添加的油脂乳化、分散，提高组织的均质性，提高商品性和储存性；添加在乳饮品中，能使饮料中的油脂乳化，形成稳定的乳化体系，避免饮料分层，保证饮料良好的口感及感官性状。
3.溶解性是影响蛋白质功能性的重要指标，而蛋白的乳化性质需要溶解才能表现出来，所以蛋白的溶解性和乳化性息息相关。蛋白质乳化剂是一种表面活性剂，含有亲水基团和亲油基团，可以使水和油两相紧密地融合在一起。在食品工业加工中，蛋白质乳化剂不仅可以改善食品的感官性状、延长食品的货架期、提高产品质量、还便于食品的加工和保鲜，利于开发新型食品。而目前的现有技术中，没有同时提高牡丹花蕊蛋白溶解性和乳化性的方法，无法为牡丹花蕊的应用扩大范围。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种同时提高牡丹花蕊蛋白溶解性和乳化性的牡丹花蕊蛋白粉的制备方法。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
6.一种牡丹花蕊蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：将提取的牡丹花蕊蛋白进行蛋白酶酶解处理，对酶解产物进行糖基化处理，干燥，即得。
7.本发明的牡丹花蕊蛋白粉的制备方法，采用酶解处理与糖基化反应相结合的方法对牡丹花蕊蛋白进行改性，可提高牡丹花蕊蛋白粉的溶解性和乳化性，该方法安全性高，操作简单，易于进行大规模食品加工生产。
8.优选地，为了促进酶解反应，所述酶解处理在超声条件下进行。所述超声的功率为100w～300w。超声的温度为30℃～50℃。超声的时间为20min～40min。超声能够改善蛋白质的功能特性，超声波产生的空化作用能改变蛋白质分子结构，破坏蛋白质内键，其内部的疏水基团暴露出来，加快蛋白酶解和糖基化反应进程，有效提高蛋白质的溶解性和乳化性。
9.进一步地，所述酶解处理包括以下步骤：将牡丹花蕊蛋白的水分散液与蛋白酶混
合后进行酶解反应。所述牡丹花蕊蛋白的水分散液的制备方法包括以下步骤：将牡丹花蕊蛋白和水按1:(6～10)(g/ml)的比例混合。
10.优选地，为了降低成本，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶，是一种含巯基(-sh)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。
11.优选地，所述酶解处理的酶解反应的温度为50℃～65℃。所述酶解反应的ph控制在6.0～7.0范围。所述酶解处理的酶解反应的时间为60min～120min。木瓜蛋白酶的用量为所述牡丹花蕊蛋白的5～15wt％。通过合理调整和优化酶解的浓度、温度、ph和时间条件，提高酶解的效率，进一步促进蛋白的溶解。为了防止提取的蛋白被降解，所述酶解处理还包括以下步骤：对酶解后的体系进行灭酶处理。灭酶处理的温度90℃～100℃。灭酶处理的时间为15min～25min。
12.优选地，所述酶解处理还包括以下步骤：将灭酶处理后的体系进行离心处理，收集上清液得到酶解产物。灭酶处理后的离心的转速4000r/min～8000r/min，离心的时间为10min～20min。
13.糖基化法是将碳水化合物以共价键与蛋白质分子上氨基或羧基相结合的化学反应，该方法不添加任何化学试剂，是发生美拉德反应生成糖蛋白的过程，是一种天然、安全性高的蛋白改性方法。
14.优选地，所述糖基化处理用的糖基化试剂为甘露低聚糖。甘露低聚糖是从酵母培养细胞壁中提取的一类新型抗原活性物质。不仅具有低热量、稳定、安全无毒等良好的理化性质，还具有保护肠道和提高免疫力等作用，可提高糖基化产物的溶解性和乳化性。甘露低聚糖作为双歧杆菌的增殖因子，可有效地使体内有益菌自然增殖、改善肠道菌群结构、调节肠道功能，因此，甘露低聚糖具有保肝、抗肿瘤、增强免疫力、加强肠道蠕动、降低胆固醇、抗衰老等生理活性，适用于各种肠道疾病，同时也适合于健康人特别是老年人和儿童的日常保健，再加上甘露低聚糖具有甜味，可以作为蔗糖的替代剂。而且，其价格便宜适合工厂大批量生产。
15.糖基化处理包括以下步骤：将酶解处理后得到的酶解产物与甘露低聚糖混合后进行糖基化反应，反应结束后的体系进行离心处理，收集上清液。糖基化处理后的离心的转速4000r/min～8000r/min，离心的时间为10min～20min。
16.优选地，所述糖基化处理的糖基化反应的温度为60℃～90℃。糖基化反应的ph控制在6.0～7.0范围。
17.优选地，为了防止尘土及异物进入，糖基化处理在密闭条件下进行。
18.优选地，所述糖基化处理的糖基化反应时间为90min～180min。甘露低聚糖的用量为所述牡丹花蕊蛋白的20～30wt％。
19.所述牡丹花蕊蛋白采用碱提酸沉法制得。碱提酸沉法具有蛋白质的提取率和纯度都较高、易操作、成本低等优点。
20.为了进一步促进酶解的顺利进行，所述碱提酸沉法包括以下步骤：将脱脂牡丹花蕊粉末与水混合后调节ph为9.0～9.5进行碱提处理，得到提取液，再用酸调节提取液的ph至3.5～4.0进行酸沉处理。提取液的ph过高会使蛋白质降解和变性，不利于蛋白质的提取。
21.碱提处理采用本领域常规的加入碱的方法调节ph。碱提处理采用的碱优选为氢氧
化钠溶液。进一步优选地，氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/l～0.5mol/l。
22.优选地，所述碱提处理的温度为30℃～50℃，碱提处理的时间为1h～3h。
23.进一步优选地，所述碱提酸沉法还包括以下步骤：对碱提处理后的提取液进行离心处理，收集上清液。碱提处理后的离心的转速4000r/min～8000r/min，离心的时间为10min～20min。
24.酸沉处理采用本领域常规的加入酸的方法调节ph。为了提高牡丹花蕊蛋白的营养价值，酸沉处理采用的酸优选为柠檬酸。柠檬酸为食用酸类，可增强体内正常代谢，适当的剂量对人体无害；在某些食品中加入柠檬酸后口感好，并可促进食欲，在中国，允许果酱、饮料、罐头和糖果中使用柠檬酸；用柠檬酸作ph调节剂，不但可以起到调味作用，还可保持其品质；柠檬酸所具有螯合作用和调节ph值的特性使其在速冻食品的加工中具有增加抗氧剂的性能，抑制酶活性，延长食品保存期。优选地，酸沉处理采用本领域常规的加入酸溶液的方法调节ph。进一步优选地，柠檬酸溶液的浓度为0.5mol/l～1mol/l。
25.优选地，所述酸沉处理的时间为60min～90min。
26.进一步优选地，所述酸沉处理还包括以下步骤：对酸沉处理后的提取液进行离心处理，酸沉处理后的离心的转速4000r/min～8000r/min，离心的时间为10min～20min。
27.为了进一步促进牡丹花蕊蛋白的溶解，所述脱脂牡丹花蕊粉末与水按照1:(20～30)(g/ml)的比例混合。
28.优选地，所述脱脂牡丹花蕊粉末的制备方法，包括以下步骤：将牡丹花蕊粉末和石油醚按照1:(5～8)(g/ml)的比例混合，干燥，即得。石油醚能够除去牡丹花蕊中的脂类物质，促进后续操作对牡丹花蕊蛋白的提取。优选地，所述干燥方式为自然风干。
29.优选地，所述牡丹花蕊粉末的细度为80～100目以细。进一步地，所述牡丹花蕊粉末的制备方法，包括以下步骤：将牡丹花蕊进行粉碎过筛，即得。牡丹花蕊粉末颗粒在80～100目以细时能使营养成分基本溶出，粉碎过粗不利用蛋白质溶出，导致提取率降低，粉碎过细则会使提取液中杂质含量增加。优选地，所述粉碎方式为机械粉碎。
30.进一步优选地，所述制备牡丹花蕊粉末的牡丹花蕊为新鲜且保留了牡丹花蕊上花粉类物质的牡丹花蕊。
31.优选地，所述糖基化处理之后的干燥方式为真空冷冻干燥。由于真空冷冻干燥在低温、低氧环境下进行，大多数生物反应停滞，且处理过程无液态水存在，水分以固体状态直接升华，使牡丹花蕊蛋白原有的结构和形状得到最大程度地保护，最终获得外观和内在品质兼备的优质干燥制品。
32.进一步优选地，真空冷冻干燥具体为：在-80℃～-60℃下预冻4h～6h，然后在真空度≤40pa下处理18h～20h。
具体实施方式
33.以下结合实施例对本发明做进一步地说明。
34.实施例1
35.本实施例的牡丹花蕊蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
36.(1)选择新鲜且保留了牡丹花蕊上花粉类物质的牡丹花蕊作为原材料，机械粉碎过80目筛得到牡丹花蕊粉末，在室温下将牡丹花蕊粉末和石油醚按照1:5(g/ml)的比例混
合除去脂类物质，自然风干后得到脱脂粉末，密封，在4℃保存备用。
37.(2)将步骤(1)中脱脂粉末和去离子水按1:20(g/ml)的比例混合得到混合液，先加入0.1mol/l的氢氧化钠，调节混合液的ph至9.0，然后在30℃下水浴加热3h，反应结束后在4000r/min转速下离心20min，收集上清液(即碱提溶液)备用。
38.(3)将步骤(2)中得到的碱提溶液，用0.5mol/l柠檬酸溶液调节ph至3.5沉淀牡丹花蕊蛋白，沉淀时间为60min，沉淀反应结束后在4000r/min的转速下离心20min，收集牡丹花蕊沉淀蛋白备用。
39.(4)将牡丹花蕊沉淀蛋白和去离子水按1:6(g/ml)的比例混合得到分散液，对分散液进行超声处理，超声的功率设置为100w，超声的温度为30℃，超声的时间为40min，然后向分散液中加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的加入量为步骤(3)中的牡丹花蕊沉淀蛋白的5wt％，调节分散液的ph至6.0，然后在50℃下酶解120min。
40.(5)酶解反应结束后，在90℃下水浴加热25min进行灭酶反应处理，然后在8000r/min的转速下离心10min，取上清液。
41.(6)向步骤(5)得到的上清液在密闭条件中加入甘露低聚糖，甘露低聚糖的加入量为步骤(3)得到的牡丹花蕊沉淀蛋白的20wt％，先调节溶液的ph至6.0，然后在60℃温度下水浴加热180min，然后在8000r/min的转速下离心10min，取上清液。
42.(7)将步骤(6)得到的上清液在-80℃下预冻4h，然后在真空度40pa条件下干燥处理20h，即得。
43.实施例2
44.本实施例的牡丹花蕊蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
45.(1)选择新鲜且保留了牡丹花蕊上花粉类物质的牡丹花蕊作为原材料，机械粉碎过90目筛得到牡丹花蕊粉末，在室温下将牡丹花蕊粉末和石油醚按照1:6.5(g/ml)的比例混合除去脂类物质，自然风干后得到脱脂粉末，密封，在4℃保存备用。
46.(2)将步骤(1)中脱脂粉末和去离子水按1:25(g/ml)的比例混合得到混合液，先加入0.25mol/l的氢氧化钠，调节混合液的ph至9.3，然后在40℃下水浴加热2h，反应结束后在6000r/min转速下离心15min，收集上清液(即碱提溶液)备用。
47.(3)将步骤(2)中得到的碱提溶液，用0.8mol/l柠檬酸溶液调节ph至3.7沉淀牡丹花蕊蛋白，沉淀时间为75min，沉淀反应结束后在6000r/min的转速下离心15min，收集牡丹花蕊沉淀蛋白备用。
48.(4)将牡丹花蕊沉淀蛋白和去离子水按1:8(g/ml)的比例混合得到分散液，对分散液进行超声处理，超声的功率设置为200w，超声的温度为40℃，超声的时间为30min，然后向分散液中加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的加入量为步骤(3)中的牡丹花蕊沉淀蛋白的10wt％，调节分散液的ph至6.5，然后在58℃下酶解90min。
49.(5)酶解反应结束后，在95℃下水浴加热20min进行灭酶反应处理，然后在8000r/min的转速下离心10min，取上清液。
50.(6)向步骤(5)得到的上清液在密闭条件中加入甘露低聚糖，甘露低聚糖的加入量为步骤(3)得到的牡丹花蕊沉淀蛋白的25wt％，调节溶液的ph至6.5，然后在75℃温度下水浴加热135min，然后在8000r/min的转速下离心10min，取上清液。
51.(7)将步骤(6)得到的上清液在-70℃下预冻5h，然后在真空度30pa条件下干燥处
理19h，即得。
52.实施例3
53.本实施例的牡丹花蕊蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
54.(1)选择新鲜且保留了牡丹花蕊上花粉类物质的牡丹花蕊作为原材料，机械粉碎过100目筛得到牡丹花蕊粉末，在室温下将牡丹花蕊粉末和石油醚按照1:8(g/ml)的比例混合除去脂类物质，自然风干后得到脱脂粉末，密封，在4℃保存备用。
55.(2)将步骤(1)中脱脂粉末和去离子水按1:30(g/ml)的比例混合得到混合液，先加入0.5mol/l的氢氧化钠，然后调节混合液的ph至9.5，然后在50℃下水浴加热1h，反应结束后在8000r/min转速下离心10min，收集上清液(即碱提溶液)备用。
56.(3)将步骤(2)中得到的碱提溶液，用1mol/l柠檬酸溶液调节ph至4.0沉淀牡丹花蕊蛋白，沉淀时间为90min，沉淀反应结束后在8000r/min的转速下离心10min，收集牡丹花蕊沉淀蛋白备用。
57.(4)将牡丹花蕊沉淀蛋白和去离子水按1:10(g/ml)的比例混合得到分散液，对分散液进行超声处理，超声的功率设置为300w，超声的温度为50℃，超声的时间为20min，然后向分散液中加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的加入量为步骤(3)中的牡丹花蕊沉淀蛋白的15wt％，调节分散液的ph至7.0，然后在65℃下酶解60min。
58.(5)酶解反应结束后，在100℃下水浴加热15min进行灭酶反应处理，然后在8000r/min的转速下离心10min，取上清液。
59.(6)向步骤(5)得到的上清液在密闭条件中加入甘露低聚糖，甘露低聚糖的加入量为步骤(3)得到的牡丹花蕊沉淀蛋白的30wt％，调节溶液的ph至7.0，然后在90℃温度下水浴加热90min，然后在8000r/min的转速下离心10min，取上清液。
60.(7)将步骤(6)得到的上清液在-60℃下预冻6h，然后在真空度20pa条件下干燥处理18h，即得。
61.对比例1
62.本对比例的牡丹花蕊蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
63.将实施例2步骤(3)中得到的牡丹花蕊沉淀蛋白在-70℃下预冻5h，然后在真空度30pa条件下干燥处理19h，即得。
64.对比例2
65.本对比例的牡丹花蕊蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
66.(1)将实施例2步骤(3)中得到的牡丹花蕊沉淀蛋白和去离子水按1:8(g/ml)的比例混合得到分散液，对分散液进行超声处理，超声的功率设置为200w，超声的温度为40℃，超声的时间为30min。
67.(2)将步骤(1)中超声处理后的分散液在-70℃下预冻5h，然后在真空度30pa条件下干燥处理19h，即得。
68.对比例3
69.本对比例的牡丹花蕊蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
70.(1)将实施例2步骤(3)中得到的牡丹花蕊沉淀蛋白和去离子水按1:8(g/ml)的比例混合得到分散液，向分散液中加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的加入量为步骤(3)中的牡丹花蕊沉淀蛋白的10wt％，调节分散液的ph至6.5，然后在58℃下酶解90min，超声处理，超声
的功率设置为200w，超声的温度为40℃，超声的时间为30min。
71.(2)酶解反应结束后，在95℃下水浴加热20min进行灭酶反应处理，然后在8000r/min的转速下离心10min，取上清液。
72.(3)将步骤(2)得到的上清液在-70℃下预冻5h，然后在真空度30pa条件下干燥处理19h，即得。
73.对比例4
74.本对比例的牡丹花蕊蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
75.(1)将实施例2步骤(3)中得到的牡丹花蕊沉淀蛋白和去离子水按1:8(g/ml)的比例混合得到分散液，在密闭条件中加入甘露低聚糖，甘露低聚糖的加入量为步骤(3)得到的牡丹花蕊沉淀蛋白的25wt％，调节溶液的ph至6.5，然后在75℃温度下水浴加热135min，然后进行超声处理，超声的功率设置为300w，超声的温度为40℃，超声的时间为30min，反应结束后在8000r/min的转速下离心10min，取上清液。
76.(2)将步骤(1)得到的上清液在-70℃下预冻5h，然后在真空度30pa条件下干燥处理19h，即得。
77.对比例5
78.本对比例的牡丹花蕊蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
79.(1)将实施例2步骤(3)中得到的牡丹花蕊沉淀蛋白和去离子水按1:8(g/ml)的比例混合得到分散液，对分散液进行超声处理，超声的功率设置为200w，超声的温度为40℃，超声的时间为30min，然后向分散液中加入中性蛋白酶，中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，利用中性蛋白酶的酶促反应，可把动植物的大分子蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，可用于各种蛋白质水解处理，中性蛋白酶的最适温度为45℃～50℃，最适ph为6.8～7.0，中性蛋白酶的加入量为步骤(3)中的牡丹花蕊沉淀蛋白的10wt％，调节分散液的ph至6.8，然后在50℃下酶解90min。
80.(2)酶解反应结束后，在95℃下水浴加热20min进行灭酶反应处理，然后在8000r/min的转速下离心10min，取上清液。
81.(3)向步骤(2)得到的上清液在密闭条件中加入甘露低聚糖，甘露低聚糖的加入量为步骤(3)得到的牡丹花蕊沉淀蛋白的25wt％，调节溶液的ph至6.5，然后在75℃温度下水浴加热135min，然后在8000r/min的转速下离心10min，取上清液。
82.(4)将步骤(3)得到的上清液在-70℃下预冻5h，然后在真空度30pa条件下干燥处理19h，即得。
83.对比例6
84.本对比例的牡丹花蕊蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
85.(1)向实施例2步骤(5)中得到的上清液在密闭条件中加入壳聚糖，壳聚糖为天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物，具有生物降解性、生物相容性、无毒性、抑菌、抗癌、降脂、增强免疫等多种生理功能，广泛应用于食品添加剂，壳聚糖的最适ph为6.5～8.5，壳聚糖的加入量为步骤(3)得到的牡丹花蕊沉淀蛋白的25wt％，调节溶液的ph至6.5，然后在75℃温度下水浴加热135min，然后在8000r/min的转速下离心10min，取上清液。
86.(2)将步骤(1)得到的上清液在-70℃下预冻5h，然后在真空度30pa条件下干燥处理19h，即得。
87.实验例
88.将实施例1～3和对比例1～6制备牡丹花蕊蛋白粉的进行溶解性和乳化性测试，测试结果见表1，具体的测试和计算方法如下：
89.测定牡丹花蕊蛋白粉的溶解性的方法为：取0.25g花蕊蛋白粉，用蒸馏水定容至25ml，为使样品混合均匀，室温下涡旋20min，在12000r/min转速下离心10min，然后收集上清液经适度稀释采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量以牛血清白蛋白为标准物绘制标准曲线。蛋白质的溶解度为上清液蛋白质量浓度占总蛋白质量浓度的百分比。
90.测定牡丹花蕊蛋白粉的乳化性的方法为：配置18ml浓度为1％的牡丹花蕊蛋白粉的水分散液，加入6ml大豆油进行混合，在10000r/min条件下均质2min，立即从烧杯底部吸取100微升乳状液于玻璃试管中，并加入4.9ml的浓度为0.1％的十二烷基硫酸钠(sds)溶液进行稀释，混匀后用紫外可见分光光度计在500nm下测定吸光值(a0)。
[0091][0092]
式中：n为稀释倍数；c为蛋白质的质量浓度，单位是g/ml；φ为溶液中加入油的体积比；a0为0时吸光值。
[0093]
表1本发明实施例1～3和对比例1～6制备的牡丹花蕊蛋白粉的溶解性和乳化性
[0094]
样品溶解性/％乳化性/(m2/g)实施例182.9268.41实施例287.1270.75实施例379.7163.39对比例135.7215.28对比例246.2927.56对比例377.3141.02对比例468.5845.72对比例578.9660.37对比例675.2159.52
[0095]
由表1中数据可知，对牡丹花蕊蛋白进行酶解处理、超声处理、超声化处理后，可以看到牡丹花蕊蛋白的溶解性和乳化性出现了大幅地提升。