一种以干扰素-α为活性成分的双功能药物前体的制作方法

一种以干扰素-α
为活性成分的双功能药物前体
技术领域
1.本发明属于是生物医药领域，具体地本发明涉及一种以干扰素-α为活性成分的双功能药物前体。


背景技术：

2.ifns是一类重要的细胞因子，具有高活性、广谱的抗细胞增殖、抗病毒、提高免疫调节和高效的抗肿瘤等作用。经10多年的临床应用研究结果表明，干扰素是一种重要的抗病毒和抗肿瘤的治疗药物。迄今所知，包括人源在内的多种哺乳动物干扰素，根据其基因序列、染色体定位和受体特异性等特点可分为ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型ifns。
3.国内已上市的ifn-α产品分为两大类：普通干扰素，包括：rhifn-α(1b，2a，2b)；长效干扰素，主要由外资把控，包括：罗氏的peg-ifn-α-2a和默沙东的peg-ifn-α2b。普通干扰素在体内半衰期短，仅4个小时，为了保证能维持一定的治疗浓度需要每周注射3次。peg长效干扰素将干扰素的半衰期提升至40小时，用药频率从每周三次提升至每周一次。另外，除了peg化，还可以将ifn与fc融合，在fcrn的保护下，半衰期可以长达14天以上。但是，由于ifn-r的广谱性表达，单纯地延长ifn的半衰期，会增加ifn对机体的毒副作用，造成安全隐患。
4.然而单独抑制pd-1/pd-l1信号通路往往导致耐药性增加。
5.增加ifn的靶向性可以通过双功能抗体的技术来实现。双功能抗体是一个新兴的抗体药物研发领域，被视为肿瘤治疗的新策略，极具广阔的应用前景。其核心意义在于，含有两种结合位点，能在靶细胞和功能分子之间架起桥梁，产生靶向性的效应功能。在肿瘤治疗领域，由于ifn受体(ifnr)广谱表达于正常组织，中/高剂量的ifn会诱发严重的副反应，如：流感样症状、抑郁症、贫血、白细胞减少等症状，使ifn在肿瘤治疗领域的使用受限。
6.然而与单克隆抗体相比，双功能抗体在其技术和产业化上仍存在一定的技术难点。需要在产量、纯化难度、半衰期、稳定性、与抗原结合等核心性质进行突破。
7.还有，双功能抗体因其结构相比普通抗体做了较大的改构，如：分子量增大、不对称结构等，对下游表达与纯化工艺带来的极大的困难。另外，早期双功能抗体的结合活性评估尤为重要，与靶向位点结合过强，会影响双抗药物分布，如过强的cd3结合能力会导致t细胞参与的双抗(t cell-engaging bsab,bstce)富集在脾脏、淋巴结而到不了靶点组织。并且双功能抗体，因其分子量增大，对表达系统也有一定的挑战。
8.因此，本领域迫切需要开发一种具有活性一致、特异性强或副反应小的优点的新型多靶点、高效的抗肿瘤和免疫调节药物。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种具有活性一致、特异性强或副反应小的优点的新型多靶点、高效的抗肿瘤和免疫调节药物。
10.本发明的第一方面，提供了一种重组双功能融合蛋白，所述重组双功能融合蛋白
包含：
11.第一结构单元(d1)；和
12.第二结构单元(d2)；
13.其中，所述第一结构单元特异性结合靶分子肿瘤细胞标志物蛋白；
14.所述第二结构单元包括干扰素，
15.并且，所述d2从n-c端具有式i或式i’所示的结构：
16.z1-l-z2(式i)或
17.z2-l-z1(式i’)
18.其中，z1为干扰素或其活性片段；
19.l为第一连接元件；
20.z2为干扰素受体或其活性片段；
21.“-”
表示连接上述元件的肽键或肽接头。
22.在另一优选例中，所述肿瘤细胞标志物选自下组：pd-l1、egfr、psma、gpc3、gd2、her2、mesothelin(msln)、cea、、claudin18.2、mucin 1(muc1)、nkg2d配体、cd19、cd20、bcma、cd22、cd30、il3ra、cd38、cd138、或其组合。
23.在另一优选例中，所述干扰素包括干扰素α。
24.在另一优选例中，所述干扰素选自下组：ifnα1，ifnα2(包括ifnα2a，ifnα2b，ifnα2c)、ifnα4、ifnα5、ifnα6、ifnα7、ifnα8，ifnα10，ifnα13、ifnα14、ifnα17、ifnα21、ifnβ、ifnε、ifnκ、ifnω、ifnδ、ifnτ、或其组合，优选ifnα2b。
25.在另一优选例中，所述d1和d2之间通过第二连接元件相连。
26.在另一优选例中，所述第二连接元件具有如下结构：-(gly-gly-gly-ser)n-，其中，n为1-5，较佳地，1-3。
27.在另一优选例中，所述d1为特异性结合肿瘤细胞标志物蛋白的抗体或抗体片段。
28.在另一优选例中，所述d1为特异性结合pd-l1蛋白的抗体或抗体片段。
29.在另一优选例中，所述抗体片段包括fd片段。
30.在另一优选例中，所述融合蛋白还包括额外的fc片段。
31.在另一优选例中，所述d2与d1的重链恒定区的末端或所述融合蛋白的fc片段的末端相连。
32.在另一优选例中，所述fc片段来源于人或非人哺乳动物，更佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人。
33.在另一优选例中，所述fc片段为免疫球蛋白igg的fc片段，较佳地为igg1的fc部分。
34.在另一优选例中，所述fc片段包括天然的fc片段及fc突变体。
35.在另一优选例中，所述的fc片段的氨基酸序列如seq id no.:1所示。
36.在另一优选例中，所述的z1、l、z2中的任何两者以头-头、头-尾、尾-头或尾-尾方式相连。
37.在另一优选例中，所述的“头部”指多肽或其片段的n端，尤其是野生型多肽的或其片段的n端。
38.在另一优选例中，所述的“尾部”指多肽或其片段的c端，尤其是野生型多肽的或其
片段的c端。
39.在另一优选例中，所述干扰素来源于人或非人哺乳动物。
40.在另一优选例中，所述的干扰素包括野生型和突变型。
41.在另一优选例中，所述的干扰素包括全长的、成熟形式的干扰素，或其活性片段。
42.在另一优选例中，所述干扰素的序列如seq id no.:2所示。
43.在另一优选例中，所述干扰素受体包括ifnαra2、ifnαra1。
44.在另一优选例中，所述干扰素受体来源于人或非人哺乳动物，更佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人。
45.在另一优选例中，所述干扰素受体包括野生型和突变型。
46.在另一优选例中，干扰素受体包括全长的、成熟形式的干扰素受体，或其活性片段。
47.在另一优选例中，所述干扰素受体还包括干扰素受体的衍生物。
48.在另一优选例中，所述干扰素受体的衍生物包括经修饰的干扰素受体、氨基酸序列与天然干扰素受体同源且具有天然干扰素受体活性的蛋白分子、干扰素受体的二聚体或多聚体、含有干扰素受体氨基酸序列的融合蛋白。
49.在另一优选例中，所述经修饰的干扰素受体是peg化的干扰素受体。
50.在另一优选例中，所述“氨基酸序列与天然干扰素受体同源且具有天然干扰素受体活性的蛋白分子”是指其氨基酸序列与干扰素受体相比具有≥85％的同源性，较佳地≥90％的同源性，更佳地≥95％的同源性，最佳地≥98％同源性；并且具有干扰素受体活性的蛋白分子。
51.在另一优选例中，所述干扰素受体或其活性片段包括干扰素受体的胞外段。
52.在另一优选例中，所述胞外段的氨基酸序列如seq id no.:3所示。
53.在另一优选例中，所述第一连接元件的长度为0-20个氨基酸，较佳地，0-10个氨基酸。
54.在另一优选例中，所述第一连接元件的氨基酸序列如seq id no.:4所示。
55.在另一优选例中，所述第一连接元件包括酶切位点。
56.在另一优选例中，所述酶切位点被肿瘤微环境中特异性表达的蛋白水解酶(如基质细胞分泌的特定蛋白酶)识别。
57.在另一优选例中，所述肿瘤微环境中特异性表达的蛋白水解酶(如基质细胞分泌的特定蛋白酶)包括基质金属蛋白酶。
58.在另一优选例中，所述基质金属蛋白酶包括基质金属蛋白酶x。
59.在另一优选例中，d2的氨基酸序列如seq id no.5所示。
60.在另一优选例中，所述重组双功能融合蛋白为同源二聚体。
61.2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它编码如权利要求1所述的重组双功能融合蛋白。
62.在另一优选例中，所述的多核苷酸在所述突变蛋白或融合蛋白的orf的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6his)、或其组合。
63.在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：dna序列、rna序列、或其组合。
64.3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。
65.在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。
66.在另一优选例中，所述载体包括质粒、病毒载体。
67.在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：腺相关病毒(aav)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、sv40、痘病毒、或其组合。
68.在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
69.4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
70.在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。
71.在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。
72.在另一优选例中，所述酵母细胞选自下组的一种或多种来源的酵母：毕氏酵母、克鲁维酵母、或其组合；较佳地，所述的酵母细胞包括：克鲁维酵母，更佳地为马克斯克鲁维酵母、和/或乳酸克鲁维酵母。
73.在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、麦胚细胞，昆虫细胞，sf9、hela、hek293、293f细胞、cho、酵母细胞、或其组合。
74.5.一种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
75.在适合表达的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞，从而表达融合蛋白；和/或分离所述融合蛋白。
76.6.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物含有：
77.(a)如权利要求1所述的重组双功能融合蛋白；和
78.(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
79.在另一优选例中，所述偶联物部分选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
80.7.一种药物组合物，其特征在于，含有：
81.(i)如权利要求1所述的重组双功能融合蛋白、或如权利要求6所述的免疫偶联物；以及
82.(ii)药学上可接受的载体。
83.在另一优选例中，所述药物组合物还包括其他用于抑制肿瘤活性的药物。
84.在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
85.8.一种如权利要求1所述的重组双功能融合蛋白、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的宿主细胞、或如权利要求6所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于治疗或预防肿瘤。
86.在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。
87.在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。
88.在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤,膀胱癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、食管癌、肺小细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、乳腺癌、或其组合。
89.9.一种体外非治疗性的抑制肿瘤生长的方法，其特征在于，包括步骤：在权利要求1所述的融合蛋白或如权利要求6所述的免疫偶联物的存在下，培养肿瘤细胞，从而抑制肿瘤生长。
90.在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。
91.在另一优选例中，所述肿瘤细胞来自于选自下组的一种或多种肿瘤：前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤,膀胱癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、食管癌、肺小细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、乳腺癌。
92.在另一优选例中，所述肿瘤细胞为体外培养的细胞。
93.10.一种治疗肿瘤的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用权利要求1所述的融合蛋白或如权利要求6所述的免疫偶联物。
94.在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。
95.在另一优选例中，所述的对象是人。
96.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
97.图1显示了本发明的融合蛋白的结构示意图。
具体实施方式
98.本发明人通过广泛而深入的研究，意外地获得一种重组双功能融合蛋白,由特异性结合靶分子肿瘤细胞标志物蛋白(如pd-l1蛋白)的第一结构单元(d1)和包含干扰素(如，干扰素α(ifnα))的第二结构单元(d2)串联而成。本发明的融合蛋白为同源二聚体。本发明的融合蛋白可特异性的仅在肿瘤微环境中发挥杀伤作用，在由pd-l1抗体介导的靶向性降低全身性使用时的毒性的同时，也增强了肿瘤组织附近的药物的有效浓度，激活有更强的t细胞毒性。具体地，本发明的融合蛋白利用肿瘤微环境，基质细胞分泌的特定蛋白酶识别linker上的特定序列，并且用特定的受体胞外结构蛋白做帽子保护，避免ifn非转一的结合毒性，增加肿瘤附近的有效浓度。在此基础上，本发明人完成了本发明。
99.在具体描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
100.除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域
的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
101.虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
102.如本文所用，除非另外说明，fc是指人免疫球蛋白的fc片段。术语“免疫球蛋白fc区”指免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，例如免疫球蛋白fc区可包括重链ch1、ch2、ch3的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合，在优选例中，所用的免疫球蛋白的fc区包括至少一个免疫球蛋白绞链区，一个ch2结构域和一个ch3结构域，优选缺少ch1结构域。
103.已知人免疫球蛋白有多种类别，如iga、igd、ige、igm及igg(包括igg1、igg2、igg3、igg4四个亚类)，从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白fc区是在本领域技术人员所掌握的范围之内的，在一个优选的实例中，免疫球蛋白fc区可选择包含有人免疫球蛋白igg4亚类fc区的编码序列，其中缺失一个免疫球蛋白重链1结构域(ch1)，但包括了铰链区以及ch2、ch3、二个结构域的编码序列。
104.如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”、和“由
……
构成”；“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”和“由
……
构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
105.如本文所用，除非另外说明，所述的融合蛋白是一种分离的蛋白，与其它蛋白、多肽或分子无联系，是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物。
106.双功能融合蛋白
107.本发明构建的双功能融合蛋白(包含特异性结合靶分子肿瘤细胞标志物蛋白(如pd-l1)的第一结构单元和包含干扰素(如，干扰素α(ifnα))的第二结构单元)通过肿瘤微环境中特异性表达的蛋白水解酶的底物来连接ifn receptor与ifn，目的是通过肿瘤微环境中特异性的蛋白水解酶将pdl1/ifn prodrug中的底物特异性的在肿瘤微环境被切开，在由pd-l1抗体介导的靶向性降低全身性使用时的毒性的同时，也增强了肿瘤组织附近的药物的有效浓度，激活有更强的t细胞毒性。
108.在一优选实施方式中，本发明的融合蛋白的结构如图1所示。
109.根据本发明，重组双功能融合蛋白可以是单个多功能多肽，或它可以是彼此共价或非共价结合的两个或更多个多肽的多聚体复合物。
110.如本文所用，“本发明的融合蛋白”、或“多肽”、或“本发明的双功能融合蛋白”均指本发明第一方面所述的融合蛋白。
111.如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的融合蛋白的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
112.本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6
×
his等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
113.一类优选的活性衍生物指与本发明的融合蛋白的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表a进行氨基酸替换而产生。
114.表a
[0115][0116][0117]
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与本发明的融合蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类
似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
[0118]
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
[0119]
第一结构单元
[0120]
本发明的重组双功能融合蛋白包含第一结构单元(d1)。在本发明中，第一结构单元特异性结合靶分子肿瘤细胞标志物蛋白(如pd-l1)，在本发明中，第一结构单元指能够特异性结合特定目的蛋白的任何肽、多肽、核酸分子、支架型分子、肽展示分子或含多肽的构建体。
[0121]
如本文所用，术语“特异性结合”等意指抗原结合结构域与以500pm或更小的解离常数(kd)为特征的特定抗原形成复合物，并且在普通测试条件下不结合其他不相关的蛋白。优选地，“不相关的蛋白”是彼此具有小于95％氨基酸同一性的蛋白质、肽或多肽。
[0122]
可以在本发明上下文中使用的抗原结合结构域的示例性分类包括抗体、抗体的抗原结合部分、与特定抗原特异性相互作用的肽(例如，肽体(peptibody))、与特定抗原特异性相互作用的受体分子，包含特异性结合特定抗原的受体的配体结合部分的蛋白质、抗原结合支架(例如，darpin，heat重复序列蛋白、arm重复序列蛋白、三角形四肽重复序列蛋白和基于天然存在性重复序列蛋白的其他支架等[见，例如，boersma和pluckthun,2011,curr.opin.biotechnol.22:849-857，和其中引用的参考文献])和适配体或其部分。
[0123]
用于确定两个分子彼此是否特异性结合的方法是本领域熟知的并且例如包括平衡透析法、表面等离子体共振法等。例如，如本发明上下文中所用，抗原结合结构域包括如在表面等离子体共振测定法中所述测量，以小于约500pm、小于约400pm、小于约300pm、小于约200pm、小于约100pm、小于约90pm、小于约80pm、小于约70pm、小于约60pm、小于约50pm、小于约40pm、小于约30pm、小于约20pm、小于约10pm、小于约5pm、小于约4pm、小于约2pm、小于约1pm、小于约0.5pm、小于约0.2pm、小于约0.1pm，或小于约0.05pm的kd结合特定抗原或其部分的多肽。
[0124]
如本文所用，术语“表面等离子体共振”指允许例如使用biacore
tm
系统(gehealthcare的biacorelifesciences部门，piscataway，nj)，通过检测生物传感器基质内部蛋白质浓度的改变来分析实时相互作用的光学现象。
[0125]
如本文所用，术语“k
d”意指特定蛋白质-蛋白质相互作用(例如，抗体-抗原相互作用)的平衡解离常数。除非另外指明，否则本文中公开的kd值指通过表面等离子体共振测定法在25℃确定的kd值。
[0126]
抗体和抗体的抗原结合片段
[0127]
如上文所示，第一结构单元(d1)可以包含抗体或抗体的抗原结合片段或由其组成。如本文所用，术语“抗体”意指包含与特定抗原(例如，pd-l1蛋白)特异性结合或与之相
互作用的至少一个互补决定区(cdr)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括包含4条多肽链(由二硫键相互连接的两条重链(h)和两条轻链(l))的免疫球蛋白分子以及其多聚体(例如，igm)。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为hcvr或vh)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域：ch1、ch2和ch3。每条轻链包含轻链可变域(本文中缩写为lcvr或v
l
)和轻链恒定区。轻链恒定域包含一个结构域(c
l
1)。vh区和v
l
区可以进一步再划分为超变区，名为互补性决定区(cdr)，其间插有更保守的区域，名为框架区(fr)。每个vh和v
l
由从氨基端至羧基端按以下顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4排列的3个cdr和4个fr的组成。在本发明的不同实施方案中，本发明抗体的(或其抗原结合部分)的fr可以与人种系序列相同，或可以经天然或人工修饰。可以基于并排分析两个或更多个cdr限定氨基酸共有序列。
[0128]
本发明的重组双功能融合蛋白的d1组分可以包含完整抗体分子的抗原结合片段或由其组成。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成性或基因修饰的多肽或糖蛋白。可以使用任何合适的标准技术如蛋白酶解消化或涉及操作并表达编码抗体可变域和任选地抗体恒定域的dna的重组基因工程技术，例如，从完整抗体分子衍生抗体的抗原结合片段。这类dna是已知的和/或从例如商业来源、dna文库(包括例如，噬菌体抗体文库)轻易可获得或可以合成。可以对所述dna测序并化学地或通过使用分子生物学技术操作，例如以将一个或多个可变域和/或恒定域排列成合适布局，或以引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
[0129]
抗原结合片段的非限制性例子包括：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；(vi)dab片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，独立的互补性决定区(cdr)如cdr3肽)或受约束的fr3-cdr3-fr4肽。如本文所用，表述“抗原结合片段”内部也涵盖其他工程化分子，如结构域特异性抗体，单结构域抗体，结构域缺失抗体，嵌合抗体，cdr移植抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、微型抗体、纳米体(例如单价纳米体、双价纳米体等)、小模块免疫药物(smip)和鲨鱼可变ignar域。
[0130]
抗体的抗原结合片段一般将包含至少一个可变域。可变域可以具有任何尺寸或氨基酸组成并且通常将包含与一个或多个框架序列毗邻或符合可读框的至少一个cdr。在具有与v
l
结构域缔合的vh结构域的抗原结合片段中，vh和v
l
结构域可以按任何合适的排列彼此相对设置。例如，可变区可以是二聚体并含有v
h-vh、v
h-v
l
或v
l-v
l
二聚体。可选地，抗体的抗原结合片段可以含有单体性vh或v
l
结构域。
[0131]
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定域共价连接的至少一个可变域。可以在本发明抗体的抗原结合片段内部存的可变域和恒定域的非限制、示例性布局包括：(i)v
h-ch1；(ii)v
h-ch2；(iii)v
h-ch3；(iv)v
h-ch1-ch2；(v)v
h-ch1-ch2-ch3；(vi)v
h-ch2-ch3；(vii)v
h-c
l
；(viii)；)v
l-ch1；(ix)v
l-ch2；(x)v
l-ch3；(xi)v
l-ch1-ch2；(xii)v
l-ch1-ch2-ch3；(xiii)v
l-ch2-ch3；和(xiv)v
l-c
l
。在可变域和恒定域的任何布局中，包括上文所列的任何示例性布局，可变域和恒定域可以彼此直接连接或可以由完整或部分的铰链区或接头区连接。铰链区可以由在单个多肽分子中相邻可变域和/或恒定域之间产生柔性连接或半柔性连接的至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组
成。另外，抗原结合片段可以包含具有上文所列的任何可变域和恒定域布局的彼此和/或与一个或多个单体性vh或v
l
结构域(例如，通过二硫键))处于非共价缔合的同型二聚体或异二聚体(或其他多聚体)。
[0132]
本发明的重组双功能融合蛋白可以包含人抗体和/或重组人抗体或其片段或由其组成。如本文所用，术语“人抗体”包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。然而，人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的(例如在cdr和尤其cdr3中)的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不意在包括其中已经将从另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系衍生的cdr序列移植到人框架序列上的抗体。
[0133]
本发明的重组双功能融合蛋白可以包含重组人抗体或其抗原结合片段或由其组成。如本文所用，术语“重组人抗体”意在包括通过重组手段所制备、表达、产生或分离的全部人抗体，如使用转染至宿主细胞(在下文进一步描述)中的重组表达载体表达的抗体、从重组人抗体组合文库(在下文进一步描述)分离的抗体、从相对于人免疫球蛋白基因而言转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(见例如，taylor等人,(1992)nucl.acidsres.20:6287-6295)或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他dna序列的任何其他手段所制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体经历体外诱变(或，使用就人ig序列而言为转基因的动物时，经历体内体细胞诱变)并且因此重组抗体的vh和v
l
区的氨基酸序列是尽管衍生自人种系vh和v
l
序列并且与之相关，但可能在体内人抗体种系库内部不天然存在的序列。
[0134]
肿瘤靶向作用
[0135]
在本发明的另一个方面，重组双功能融合蛋白可用于靶向肿瘤细胞(如实体瘤细胞)。
[0136]
本发明的重组双功能融合蛋白可以与药物、毒素、放射性同位素或有损细胞生存力的其他物质缀合(偶联)。可选地，药物或毒素可以是不直接杀伤细胞，但使细胞更易遭其他外部物质杀伤的物质。在涉及肿瘤靶向作用的另外的其他实施方案中，本发明的重组双功能融合蛋白本身不与药物、毒素或放射性同位素缀合，但是与其它抗原结合分子(本文中称作“协从分子”)组合施用，如其它的抗肿瘤抗体。
[0137]
根据本发明的肿瘤靶向方面的某些实施方案，重组双功能融合蛋白(或协从抗体)可以与选自以下的一种或多种细胞毒药物缀合：刺孢霉素、埃斯波霉素、甲氨蝶呤、多柔比星、美法仓、苯丁酸氮芥、ara-c、长春地辛、丝裂霉素c、顺铂、依托泊苷、博来霉素、5-氟尿嘧啶、雌氮芥、长春新碱、依托泊苷、多柔比星、紫杉醇、拉罗他赛、替司他赛、奥他赛(orataxel)、多西紫杉醇、多拉司他汀10、澳瑞司他汀e、澳瑞司他汀phe和基于美坦辛的化合物(例如，dm1、dm4等)。重组双功能融合蛋白(或协从抗体)还可以或可选地与毒素缀合，如白喉毒素、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)外毒素a、蓖麻毒蛋白a链、相思豆毒蛋白a链、蒴莲根毒蛋白a链、α-帚曲菌素、油桐(aleuritesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(phytolacaamericana)蛋白等。重组双功能融合蛋白(或协从抗体)还可以或可选地与选自以下的一种或多种放射性同位素缀合：
225
ac、
211
at、
212
bi、
213
bi、
186
rh、
188
rh、
177
lu、
90
y、
131
i、
67
cu、
125
i、
123
i、
77
br、
153
sm、
166
ho、
64
cu、
121
pb、
224
ra和
223
ra。因此，本发明的这个方面包括
作为抗体-药物缀合物(adc)或抗体-放射性同位素缀合物(arc)的重组双功能融合蛋白。
[0138]
药物组合物和施用方法
[0139]
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有本发明的重组双功能融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
[0140]
本发明的药物组合物可用于预防和治疗肿瘤(如实体瘤)。此外，还可同时使用其他治疗剂。
[0141]
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的特异性结合分子(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
[0142]
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0143]
本发明的主要优点包括：
[0144]
(a)本发明融合蛋白可同时靶向pd-l1和ifn受体。
[0145]
(b)本发明通过fc片段的融合，提高了ifn的半衰期。
[0146]
(c)本发明对fc结构域进行优突变，使之降低fc介导的功能；
[0147]
(d)为了使融合蛋白的生物活性与普通ifn相当，将双功能融合蛋白的结构设计为，两个结合位点双价分布于fc片段的两端。既能保证ifn的活性，又能使两个结合位点之间的距离最大化，尽可能的减少空间结合位阻。
[0148]
(e)本发明的融合蛋白通过肿瘤微环境中特异性表达的蛋白水解酶的底物来连接ifn receptor与ifn，目的是通过肿瘤微环境中特异性的蛋白水解酶将pdl1/ifn prodrug中的底物特异性的在肿瘤微环境被切开，在由pd-l1抗体介导的靶向性降低全身性使用时的毒性的同时，也增强了肿瘤组织附近的药物的有效浓度，激活有更强的t细胞毒性。
[0149]
(f)下游纯化工艺方法相对简单，利于产业化生产。
[0150]
(g)考虑到随分子量的增加，通过哺乳动物瞬转表达量的蛋白量减少的问题，本发明同时开发了适合于较大分子的瞬时表达系统，减少了早期制备的难度。
[0151]
(h)本发明的靶向性双功能融合蛋白具有长效、靶向肿瘤微环境降低用药量和减少毒副作用、有利于工业化生产等优点，具有较强的市场竞争力和广阔的应用前景。
[0152]
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,
1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0153]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。