用于检测人HLA-B*8基因的引物组、探针、试剂盒和方法与流程

用于检测人hla-b*8基因的引物组、探针、试剂盒和方法
技术领域
1.本技术涉及生物医药工程的技术领域，尤其是涉及一种用于检测人hla-b*8基因的引物组、探针、试剂盒和方法。


背景技术：

2.人类白细胞抗原(hla)是人类的主要组织相容性复合体(mhc)的基因簇编码产物，位于6号染色体的短臂上，其化学本质为糖蛋白，由一条被糖基化的α重链和一条β轻链非共价结合而成。多态性是hla分子的重要特征，按功能可分为hla
‑ⅰ
类分子和hla
‑ⅱ
类分子。其中，hla
‑ⅰ
类分子由位于6号染色体上的三个等位基因(hla-a、hla-b和hla-c)编码，分布在所有的有核细胞中，负责呈递由细胞溶质蛋白质降解而产生的肽至细胞表面，其在人体抵抗入侵病原体中以及识别癌细胞中起到重要的作用。
3.自身免疫性肝炎(aih)是一种具有自身免疫基础的慢性炎症坏死的肝脏疾病，其以存在血清自身抗体、γ-球蛋白浓度增高以及常伴有肝外自身免疫综合征为特点，发病率约为20-30/百万，占慢性肝炎的10％-20％，是慢性非病毒形肝炎中较常见的一种类型。
4.根据患者血清携带抗体的类型和遗传标志物不同，可将aih分为两种类型：ⅰ型(ana和/或sma阳性，部分抗肌动蛋白抗体阳性)和ⅱ型(lkm-1、抗细胞色素p450ⅱd6或抗核心序列254～271抗体阳性)。其中，ⅰ型又称为经典型，其hla单倍型为hla-a*1、hla-b*8、hla-dr3以及hla-dr4；ⅱ型中hla单倍型为hla-b*14、hla-dr3。对于不同类型的aih需要采取不同的治疗措施，但是，aih在病理学上以汇管去和小叶间隔周围肝细胞呈小碎片样坏死以及炎性细胞浸润为特征，单凭病理学检查较难对aih进行分型诊断，所以需要对血液中的hla单倍型进行分型，涉及到hla-b*8等基因的检测。
5.目前，对于hla-b*8基因的检测一般采用sanger测序法，sanger测序法利用因双脱氧核苷三磷酸(ddntp)缺乏pcr延伸所需的3
’‑
oh导致链延伸终止的原理。但是sanger测序法通过进行多次扩增得到多段dna片段，且需要对扩增得到的dna进行电泳，操作较为繁琐，检测所需要的时间长。


技术实现要素：

6.为了快速准确地对hla-b*8基因进行检测，本技术提供一种用于检测人hla-b*8基因的引物组、探针、试剂盒和方法。
7.第一方面，本技术提供一种用于检测人hla-b*8基因的检测引物组及其相应探针，采用如下的技术方案：一种用于检测人hla-b*8基因的检测引物组及其相应探针，包括根据hla-b*8等位基因特异位点设计的引物组和探针，所述探针的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述引物组包括seq id no：12所示的正向引物和seq id no：13所示的反向引物；或其互补序列。
8.第二方面，本技术提供了一种用于检测人hla-b*8等位基因的试剂盒，采用如下的技术方案：
一种试剂盒，包括上述所述用于检测人hla-b*8基因的检测引物组及其相应探针。
9.通过采用上述技术方案，本试剂盒中包括根据hla-b*8等位基因特异性位点设计的引物组和探针，能够实现对hla-b*8特异性位点的特异性扩增，同时探针会对hla-b*8特异性位点进行识别并结合，进而实现对hla-b*8等位基因的特异性检测，具有检测准确度高的优点优选的，还包括内标引物组和内标探针。
10.优选的，所述内标引物组和探针是根据hla基因上保守序列设计的。
11.优选的，所述内标探针的核苷酸序列如seq id no：16所示；所述内标引物包括seq id no：17所示的正向引物和seq id no：18所述的反向引物。
12.通过采用上述技术方案，hla基因上的保守序列指的是在hla这一大类基因中都存在的相同的序列，使用根据其设计的内标引物组和内标探针作为参照物，可以校正上样过程中存在的误差，保证检测体系的有效性，进而提高hla-b*8基因检测的准确性。
13.优选的，所述探针和/或内标探针为荧光探针。
14.优选的，所述探针和/或内标探针具有荧光基团，所述荧光基团独立地选自fam、tet、joe、hex、cy3、tamra、rox、texas red、vic、hex或rox。
15.优选的，所述探针和/或内标探针具有淬灭基团，所述淬灭基团独立地选自bhq-0、bhq-1、bhq-2、dabcyl、eclipse、或tamra。
16.通过采用上述技术方案，在探针和/或内标探针的5’端和3’端分别标记荧光基团和淬灭基团；当探针完整时，荧光基团的荧光信号被淬灭基团吸收；当进行pcr扩增时，探针与hla-b*8上的特异性位点结合，探针和/或内标探针上的荧光基团和淬灭基团被水解，使得荧光基团和淬灭基团分离荧光基团发出的荧光信号可被检测到，荧光基团起到指示作用，使得可根据荧光信号对检测体系中是否存在hla-b*8进行定性分析。
17.优选的，还包括用于pcr反应的扩增缓冲液、可溶性镁盐、dntp、taq酶以及ddh2o中的一种或多种。
18.通过采用上述技术方案，对hla-b*8基因进行检测时，将待测样品、扩增缓冲液、可溶性镁盐、dntp、taq酶以及ddh2o的一种或多种混合均匀后放入pcr仪器中进行扩增反应，简化了溶液配制的过程，进而实现简化hla-b*8基因检测操作的效果。
19.第三方面，本技术提供了一种用于检测人hla-b*8基因的非诊断目的的方法，采用如下的技术方案：用于检测人hla-b*8基因的非诊断目的方法：包括使用上述所述的试剂盒，并在合适的条件下进行实时荧光pcr。
20.通过采用上述技术方案，将待测样品以及上述的试剂放入荧光pcr管中混合均匀并离心后，放入荧光定量pcr仪器中进行扩增；在pcr扩增的过程中，如果探针与dna单链发生特异性结合，具有5
’‑3’
外切酶活性的taq酶将探针降解，使得荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光检测系统可以接受到荧光信号，即当pcr反应体系中存在与探针特异性结合的dna片段时，每扩增一条dna链就有一个荧光分子形成，根据荧光信号以及循环数形成的扩增曲线可判断循环体系中是否存在hla-b*8基因，实现对hla-b*8基因的快速检测。
21.综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：(1)本技术提供的检测人hla-b*8等位基因的引物组和探针的特异性高，并且所使
用到的探针为荧光探针，使用实时荧光pcr技术进行检测时，只有pcr扩增体系中存在的dna片段都与引物和探针发生特异性结合，在扩增体系中才会有荧光信号的发生；因此在pcr扩增的过程中通过对扩增体系荧光信号的采集，可对扩增体系内是否含有hla-b*8基因进行定性分析，检测所需的时间短，检测效率高；(2)本技术中的引物组和探针价格低廉，且在检测过程中不需要进行测序，实现了在节省检测成本的同时，大大缩短检测周期，提高检测效率的效果；(3)本技术中采用实时荧光pcr，可实现高通量检测。
附图说明
22.图1是实施例1中琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
23.本技术涉及的试剂或试剂盒及其来源如下：dna ladders(货号为d3687，merck公司)；taq dna聚合酶(货号为10101es80，翌胜生物公司)。
24.在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
25.以下结合附图1对本技术作进一步详细说明。
26.实时荧光pcr是由美国applied biosystems公司首先推出。real-time pcr指的是在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过荧光信号强度及循环圈数对未知模板进行定性分析的方法；其具有特异性好、灵敏度高、准确性高、检测范围宽、操作简单以及通量高等优点。
27.在pcr扩增的过程中，若样品dna上含有hla-b*8等位基因的序列，探针分子会与发生解链的dna单链分子发生特异性结合，且探针与单链dna分子的结合位置在正向引物和反向引物之间，当扩增延伸至单链dna分子上与探针分子结合的位置时，具有5’外切酶活性的taq dna合成酶会将探针分子5’端上的荧光基团水解，荧光基团和淬灭基团分离使得荧光基团发出荧光，从而使得荧光监测系统接收到荧光信号。
28.实施例1：引物和探针的设计引物是pcr特异性反应的关键，pcr产物的特异性取决于引物与模板dna互补的程度，所以引物设计的好坏决定了hla-b*8基因检测的准确性。目前，引物的设计通过引物设计软件来实现，例如premier 5.0、voligo6以及vdnasis等软件；在引物设计时，选取hla-b*8等位基因中的一条dna单链为基础设计正向引物和反向引物，在pcr扩增中通过正向引物和反向引物所合成的片段为扩增片段；其中，正向引物与位于扩增片段5’端上的一小段dna序列相同，反向引物与位于扩增片段3’端的一小段dna序列互补。
29.在本实施例中，根据美国国立生物技术信息中心ncbi的核酸序列数据库genebank公开的hla-b*8基因的参考序列(nm_000247.3)，采用abi公司的primer express 5.0软件设计检测hla-b*8等位基因的引物和探针；得到了一组引物和探针，其核苷酸序列如下所示：探针：seq id no：1；正向引物：seq id no：2；
反向引物：seq id no：3。
30.使用上述的引物组和探针对已知含有hla-b*8基因的dna样品进行实时荧光pcr检测，并未在扩增体系中检测到荧光信号；接着使用该引物组进行pcr扩增，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，发现并未得到特异性扩增条带，说明使用该组引物无法对hla-b*8基因的dna样品进行特异性扩增。
31.因此，发明人根据hla-b*8等位基因的核苷酸序列，手工设计了6组引物，其核苷酸序列如表1所示：表1表1接着使用上述6组引物对已知含有hla-b*8基因的dna样品进行pcr扩增，且对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
32.电泳结果如图1所示，1-6分别对应1-6号引物组；1、4以及6分别在367bp、230bp以及343处出现扩增条带，而2、3和5中并未出现扩增条带；说明使用2号、3号以及5号引物组并不能对含有hla-b*8基因的dna样品进行特异性扩增，使用1号、4号以及6号引物组可以对含有hla-b*8基因的dna样品进行特异性扩增，且4中条带最明显，4号引物组特异性扩增效果最佳。
33.使用4号引物组以及根据软件设计得到的探针对以及含有hla-b*8基因的dna样品进行实时荧光pcr，可实现对hla-b*8基因的检出。因此，最终确定hla-b*8基因检测的引物
组和探针的核苷酸序列如下所示：正向引物：seq id no：12；反向引物：seq id no：13；探针：seq id no：1。
34.为了保证pcr反应体系的有效性，本实施例选取hla-drb*1基因(参考序列为nm_001243965.1)上的一段保守序列，采用abi公司的primer express 5.0软件设计了内控引物组及内控探针。
35.最终确定实时荧光pcr的内标探针及内标引物如下所示：内标探针：seq id no：16；内标正向引物：seq id no：17；内标反向引物：seq id no：18。
36.在本实施例中，上述的探针和/或内标探针均为荧光探针，其5’端和3’端被分别标记上荧光基团和淬灭基团；其中，荧光基团可选用fam、tet、joe、hex、cy3、tamra、rox、texas red、vic、hex或rox中的一种，淬灭基团可选用bhq-0、bhq-1、bhq-2、dabcyl、eclipse、或tamra中的一种。
37.实施例2：引物的制备将设计好上述引物组、探针、内标引物组以及内标探针交由合成公司合成，并且提供合成检验合格报告。
38.实施例3：样品dna的提取方法在hla-b*8的检测中，可从组织细胞或者血浆中提取待测dna。其中，从血浆中提取待测dna时，首先裂解红细胞离心收集白细胞；再通过离子型表面活性剂使得血浆中白细胞的膜蛋白及核蛋白变性，使得dna呈游离状态；接着通过蛋白沉淀剂使得变性蛋白沉淀，最后通过离心得到含有待测dna的上清液。
39.在本实施例中，使用含有上述试剂的dna提取试剂盒对血浆进行待测dna的提取。并且在提取完成后，使用genequant pro核酸蛋白浓度测定仪对提取得到的dna待测样品的浓度和纯度进行测定，其浓度需大于10ng/μl，且od
260nm
/od
280nm
的值应在1.7-2.0之间。
40.实施例4：pcr反应液的准备在pcr扩增之前，需配制检测人hla-b*8等位基因的反应液，pcr反应液中包含用于pcr反应的扩增缓冲液、可溶性镁盐、dntp以及taq dna聚合酶，本技术所述的试剂盒中含有上述试剂的一种或多种。
41.上述检测人hla-b*8等位基因的pcr反应液组分浓度信息如表2所示：表2.反应液组分浓度/体积扩增缓冲液10
×
可溶性镁盐1.5mmol4种dntp各200μmol/ltaqdna聚合酶3.5u在本实施例中，所选用的扩增缓冲液为ph值为8.9的10
×
tris-hcl缓冲液，可溶性镁盐所使用的为mgcl2。
42.实施例5：实时荧光pcr检测人hla-b*8基因的方法本实施例中通过实时荧光pcr(quantitative real-time pcr)对hla-b*8基因进行测序。
43.实时荧光pcr主要分为两类：探针类和染料类，由于探针类的扩增产物与具有靶序列的探针特异性结合，使得探针类的实时荧光pcr的特异性高于染料类。在本实施例中采用的方法为探针类实时荧光pcr，即探针和内标探针均为荧光探针，且探针5’端所连接的荧光基团为fam、3’端所连接的淬灭基团为bhq1，内标探针5’端所连接的荧光基团为rox、3’端所连接的淬灭基团为bhq1。
44.在实时荧光pcr的过程中，若待测dna样品上含有hla-b*8等位基因的序列，探针分子会与发生解链的dna单链分子发生特异性结合，且探针与单链dna分子的结合位置在正向引物和反向引物之间，当扩增延伸至单链dna分子上与探针分子结合的位置时，具有5
’‑3’
外切酶活性的taq酶会将探针分子5’端上的fam基团以及3’端上的bhq1基团水解，使得fam基团和bhq1基团分离使得fam基团发出荧光，从而使得荧光监测系统接收到荧光信号,若是pcr反应体系中接收到一定的荧光信号强度，证明该pcr反应体系中存在hla-b*8等位基因序列，即证明检测者携带hla-b*8基因。
45.实时荧光pcr检测人hla-b*8基因的方法包括以下步骤；第一步：准备待测dna样品根据实施例3所述的样品dna的提取办法提取待测者血液中的dna。
46.第二步：pcr反应体系的配制在实时荧光pcr专用的管子内按照表3配制pcr反应体系。
47.表3.pcr反应液2.5μl待测dna样品2.0μlddh2o加至25μl第三步：上机检测将配制好的pcr反应液放入pcr扩增仪中，按照表4所示的pcr反应程序进行反应；并且在step 3中的延伸步骤时设置fam、rox双通道进行荧光信号采集，同时以灭菌水作为阴性对照检测反应体系中是否存在污染。
48.表4.
第四步：检测结果分析在实时荧光pcr的过程中可得到扩增曲线，扩增曲线是以扩增循环数为横坐标，荧光强度为纵坐标；在扩增曲线上人为设定一个值作为阈值，通过读取pcr反应体系中荧光强度到达阈值的循环数(ct)，实现对扩增体系中是否存在hla-b*8基因做定性分析，检测结果的判读容易，并且整个检测仅需两至三个小时就可以完成，而目前最常使用的直接测序法则需至少一天的时间，本实施所述的实时荧光pcr检测人hla-b*8基因的方法有效缩短了检测时间。
49.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。